• Share
  • Email
  • Embed
  • Like
  • Save
  • Private Content
Bai giang th._hoa_sinh_moi_nhat
 

Bai giang th._hoa_sinh_moi_nhat

on

  • 9,497 views

 

Statistics

Views

Total Views
9,497
Views on SlideShare
9,497
Embed Views
0

Actions

Likes
0
Downloads
42
Comments
0

0 Embeds 0

No embeds

Accessibility

Categories

Upload Details

Uploaded via as Adobe PDF

Usage Rights

© All Rights Reserved

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Processing…
Post Comment
Edit your comment

    Bai giang th._hoa_sinh_moi_nhat Bai giang th._hoa_sinh_moi_nhat Document Transcript

    • TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------BÀI GIẢNG THỰC HÀNH HÓA SINH TS. Nguyễn Hoài Hương CN. Bùi Văn Thế Vinh Dùng cho sinh viên ngành Môi trường và Công nghệ Sinh học Năm xuất bản: 2009
    • MỤC LỤC Trang Giới thiệu môn học 4 Quy tắc làm việc trong phòng thí nghiệm Hóa 5 sinh 1. An toàn khi làm việc với axit và kiềm 5 2. Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm 6Bài 1 Cách pha chế các dung dịch dùng trong thí 8 nghiệm Hóa sinhI Lý thuyết 8 1. Dung dịch 8 2. Dung dịch đệm 14II Thực hành 20III Bài nộp 20Bài 2 Định lượng đường khử bằng phương pháp Acid 21 dinitro-salicylic (DNS)I Lý thuyết 21 1. Định nghĩa 21 2. Nguyên tắc 21 3. Xử lý mẫu 21II Thực hành 22 1. Dụng cụ - hóa chất 22 2. Tiến hành thí nghiệm 23 3. Tính kết quả 24III Bài nộp 24Bài 3 Định lượng Nitơ tổng số bằng phương pháp 25 KjeldahlI Lý thuyết 25 1. Định nghĩa 25 2
    • 2. Nguyên tắc 26II Thực hành 26 1. Dụng cụ - hóa chất 26 2. Tiến hành thí nghiệm 27 3. Tính kết quả 28III Bài nộp 28Bài 4 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford 30I Lý thuyết 30 1. Định nghĩa 30 2. Nguyên tắc 30II Thực hành 31 1. Dụng cụ - hóa chất 31 2. Tiến hành thí nghiệm 31 3. Tính kết quả 32III Bài nộp 32Bài 5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 33I Lý thuyết 33 1. Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme 33 2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 34 3. Enzyme amylase và phương pháp xác định hoạt 35 tínhII Thực hành 36 1. Dụng cụ - hóa chất 36 2. Tiến hành thí nghiệm 36 3. Tính kết quả 38III Bài nộp 38 Tài liệu tham khảo 39 3
    • GIỚI THIỆU MÔN HỌC Bài giảng “Thực hành sinh hoá” dành cho sinh viên năm thứ hai khoa Môitrường & Công nghệ Sinh học, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. Với thời lượng 30 tiết và tuỳ thuộc điều kiện, cơ sở vật chất của phòng thínghiệm cho phép, sinh viên tiến hành làm 5 bài thực hành gồm các nội dung chính củahọc phần lý thuyết hóa sinh cơ sở. 1. Giới thiệu phòng thí nghiệm hóa sinh, cách pha chế các dung dịch dungtrong thí nghiệm hóa sinh ; 2. Định lượng đường khử bằng phương pháp acid dinitro-salicylic (DNS); 3. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl; 4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford; 5. Xác định hoạt tính enzyme amylase. 4
    • QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM HÓA SINHI. An toàn khi làm việc với axit và kiềm 1. An toàn khi làm việc với axit: Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phảnứng với các hơi axit tự do. Khi pha loãng, luôn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng trực tiếp. Giữ để axit không bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu trang, găng tay vàkính bảo vệ mắt. Nếu làm văng lên da, lập tức rửa ngay bằng một lượng nước lớn. Luôn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng. H2SO4: Luôn cho acid vào nước khi pha loãng, sử dụng khẩu trang và găng tayđể tránh phòng khi văng acid Các acid dạng hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay, kính bảo hộ. 2. An toàn khi làm việc với kiềm Kiềm có thể làm cháy da, mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấp. Mang găng tay cao su, khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm đặc. Thao tác trong tủ hút, mang mặt nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm. Amoniac: là một chất lỏng và khí rất ăn da, mang găng tay cao su, khẩu trang,thiết bị bảo vệ hệ thống hô hấp. Hơi amoniac dễ cháy, phản ứng mạnh với chất oxyhoá, halogen, axit mạnh. Amoni hydroxyt: chất lỏng ăn da, tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kim loại nặng: Ag,Pb, Zn ... và muối của chúng. Kim loại Na, K, Li, Ca: phản ứng cực mạnh với nước, ẩm, CO2, halogen, axitmạnh, dẫn xuất clo của hydrocacbon. Tạo hơi ăn mòn khi cháy. Cần mang dụng cụbảo vệ da mắt. Chỉ sử dụng cồn khô khi tạo dung dịch natri alcoholate, cho vào từ từ.Tránh tạo tinh thể cứng khi hoà tan. Tương tự khi hoà tan với nước, đồng thời phảilàm lạnh nhanh. Oxit canxi rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước, cần bảo vệ da mắt, đườnghô hấp do dễ nhiểm bụi oxit. 5
    • Natri và kali hydroxyt: rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước. Các biện phápan toàn như trên, cho từng viên hoặc ít bột vào nước chứ không được làm ngược lại.II. Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm 1. Hoá chất thí nghiệm:Các hoá chất dùng để phân tích, làm tiêu bản, tiến hành phản ứng, ... trong phòng thínghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm.Hoá chất có thể ở dạng rắn (Na, MgO, NaOH, KCl, (CH 3COO)2...; lỏng (H2SO4,aceton, ethanon, chloroform, ...) hoặc khí (Cl2, NH3, N2, C2H2 ...) và mức độ tinh khiếtkhác nhau: - Sạch kỹ thuật (P): độ sạch > 90% - Sạch phân tích (PA): độ sạch < 99% - Sạch hóa học (PC): độ sạch > 99%Hóa chất có độ tinh khiết khác nhau được sử dụng phù hợp theo những yêu cầu khácnhau và chỉ nên sử dụng hóa chất còn nhãn hiệu. 2. Nhãn hiệu hoá chất: Hóa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có nhãn ghitên hoá chất, công thức hóa học, mức độ sạch, tạp chất, khối lượng tịnh, khối lượngphân tử, nơi sản xuất, điều kiện bảo quản. 3. Cách sử dụng và bảo quản hoá chất:Khi làm việc với hóa chất, nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết sứccẩn thận, tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và cho mọi người. Những điềucần nhớ khi sử dụng và bảo quản hóa chất được tóm tắt như sau: - Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu ơ, vô cơ,muối, acid, bazơ, kim loại, ...) hay theo một thứ tự a, b, c để khi cần dễ tìm. - Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi, phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất trướckhi dùng, dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu. - Chai lọ hóa chất phải có nắp. Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch nắp,cổ chai, tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai. - Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong chailọ màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối. 6
    • - Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa ngay,không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất. - Khi làm việc với chất dễ nổ, dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa. Khicần sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi, có mùi,... phải đưa vào tủ hút, chú ý đậy kín nắpsau khi lấy hóa chất xong. - Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ, không ngửi hay nếmthử hóa chất. - Khi làm việc với acid hay base mạnh: Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha loãng (không được đổ nướcvào acid hay base); Không hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như ốngbóp cao su. Trường hợp bị bỏng với acid hay base rửa ngay với nước lạnh rồi bôi lên vếtbỏng NaHCO3 1% (trường hợp bỏng acid) hoặc CH3COOH 1% (nếu bỏng base). Nếubị bắn vào mắt, dội mạnh với nước lạnh hoặc NaCl 1%. Trường hợp bị hóa chất vào miệng hay dạ dày, nếu là acid phải súc miệng vàuống nước lạnh có MgO, nếu là base phải súc miệng và uống nước lạnh có CH3COOH1%.Lưu ý các kí hiệu cảnh báo nguy hiểm: 7
    • BÀI 1: CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH DÙNG TRONG THÍ NGHIỆM HÓA SINHI. Lý thuyết1.1. Dung dịch Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau vềmặt vật lý và hóa học. Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi. Nếu chấthòa tan ở dạng rắn thì gọi là chất tan, nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất. Tùy theo tính chất của dung môi mà phân thành dung dịch nước và dung dịchkhan. Phần lớn các dung dịch acid, base, muối trong phòng thí nghiệm là dung dịchnước, dùng dung môi là nước. Một số chất khác tan trong dung môi hữu cơ. Hàm lượng chất hòa tan trong dung dịch thể hiện ở nồng độ dung dịch. Cónhiều cách biểu thị nồng độ khác nhau. Mỗi cách sẽ tiện dụng trong chuẩn bị, phântích và tính toán khác nhau.1.1.1. Các đơn vị nồng độ dung dịch a) Nồng độ phần trăm, (%) i) Nồng độ phần trăm khối lượng - khối lượng, % (w/w): là số gam chất tan cótrong 100g dung dịch.Ví dụ: dung dịch NH4Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch có chứa 5g NH4Cl ii) Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dungdịch.Ví dụ: dung dịch CuSO4 10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO4 iii) Nồng độ phần trăm thể tích - thể tích, % (v/v): là số ml dung chất có trong100ml dung dịch.Ví dụ: dung dịch glycerine 10% (v/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10ml glycerine. b) Nồng độ gam-lit, (g/L): là số gam chất tan có trong 1 lít dung dịch. c) Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol, (Mol/L) hay M: là số phân tử gam(hay số mol) chất tan trong 1 lít dung dịch.Ví dụ: Dung dịch KH2PO4 M/15 là trong 1000ml dung dịch chứa M/15 phân tử gamKH2PO4. 8
    • d) Nồng độ đương lượng (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1lit dung dịch. Số đương lượng chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z) Hệ số đương lượng (z): phụ thuộc vào bản chất của chất đó và phản ứng màchất đó tham gia. i) Nếu phản ứng là phản ứng acid, base: z là số ion H+ hay OH- mà 1 phân tử,ion của chất đó tác dụng vừa đủ.Ví dụ: Phản ứng giữa HCl và NaOH H2SO4 + 2 NaOH → Na2SO4 + 2 H2O H2SO4 → 2 H+ z=2 - NaOH → 1 OH z=1 ii) Nếu phản ứng là phản ứng ôxy – hóa khử: z là số electron mà 1 phân tử, ioncủa chất đó cho hay nhận.Ví dụ: 2 Na2S2O3 + I2 → Na2S4O6 + 2 NaI I + 1e → I- z=1 S2+ - 1e → S+ z=1 e) Nồng độ dung dịch bão hòa: là nồng độ dung dịch khi tối đa chất hòa tancó mặt trong dung dịch. f) Đơn vị nồng độ dùng trong các phép phân tích vi lượng : - Nồng độ mg/mL: số mg chất tan trong 1mL dung dịch - Miligam phần trăm, mg%: mg chất hòa tan trong 100g dung dịch. - Microgam phần trăm, µg%: là số µg chất hòa tan trong 100g dung dịch. - Phần nghìn, 0/00: số g chất hòa tan trong 1000g dung dịch. - Phần triệu, ppm: số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lít dung dịch. - Phần tỷ, ppb: số µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch.1.1.2. Cách pha dung dịch có nồng độ xác định a) Pha dung dịch có nồng độ phần trăm theo khối lượng, % (w/w) i) Chất tan là chất rắn khan:Ví dụ: Pha 500g dung dịch NaOH 40% (w/w) 100g dung dịch cần 40g NaOH 500g dung dịch cần X g? 9
    • Lượng NaOH cần để pha dung dịch : X= (40*500)/100= 200g Lượng nước cần thiết: 500-200=300g (hay 300ml) Vậy, cân 200g NaOH và đong 300 ml nước cất, hòa tan ta được 500g dung dịch NaOH 40% ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.5H2O; Na2HPO4. 12H2O;...) Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn.Ví dụ: Pha 320g dung dịch CuSO4 10% (w/w) từ CuSO4.5H2O M(CuSO4) = 160 và M(CuSO4.5H2O) = 250 Lượng CuSO4 khan để pha dung dịch là: X = (10*320)/100 = 32g Lượng CuSO4.5H2O cần dùng: Y = (250*32)/160 = 50g Lượng nước cất thêm vào: 320 -50 = 270g (hay ml) Vậy, cân 50g CuSO4.5H2O, đong 270ml nước cất, hòa tan ta được 320g dung dịch CuSO4 10%. b) Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn:Ví dụ: Pha 500g dung dịch NaOH 5% từ dung dịch NaOH 10% Lượng NaOH cần để pha dung dịch 5% là: X = (5*500)/100 = 25g Lượng dung dịch NaOH 10% cần dùng là: Y = (100*25)/10 = 250g Lượng nước cất thêm vào: 500-250 = 250g Vậy, đong 250ml nước cất và 250g dd NaOH 10%, hòa tan ta được 500g NaOH 5% c) Pha dung dịch bão hoà: Lấy chất tan cần pha vào becher, thêm một ít nước cất và khuấy cho tan. Nếusau khi khuấy, chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dungdịch bão hòa. Nếu chất tan tan hết, thêm chất tan và tiếp tục khuấy, cứ như thế chođến khi chất tan không còn tan được nữa. d) Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích i) Chất tan là chất rắn khan Cân lượng chất tan cần thiết, chuyển sang bình định mức, dùng nước cất hòatan và định mức đến thể tích đúng.Ví dụ: Pha 1 lít dung dịch NaCL 5% (w/v) Lượng NaCl cần để pha dung dịch: X = (5*1000)/100 = 50g 10
    • Vậy, cân 50g NaCl, hòa tan và định mức thành 1 lít bằng nước cất, ta được 1 lít dung dịch NaCl 5%. ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.5H2O; Na2HPO4. 12H2O;...) Khi pha dung dịch ta cần phải tính đến lượng nước kết tinh có sẵn giống như ởphần a. iii) Chất tan dạng lỏng: Một số chất tan ở dạng lỏng như HCl, H2SO4 ... Việc cân không thuận lợi, có thể đưa về đơn vị thể tích theo công thức V = M/d V: Thể tích chất lỏng; M: khối lượng chất lỏng cần cân; d: tỷ trọng chất lòng Chú ý: Các hóa chất lỏng bán trên thị trường thường không ở dạng nguyên chấtmà là các dung dịch đậm đặc. Giới hạn hòa tan tối đa được tính bằng % thể tích vàthay đổi tùy theo loại hóa chất. Ví dụ như H2SO4: 95-98%; HCl: 37%; H3PO4: 65-85%; NH4OH: 25%. Do đó khi pha các dung dịch từ các loại hóa chất này ta phải chúý đến nồng độ của dung dịch đậm đặc.Ví dụ: Pha 440ml dung dịch HCl 1% từ dung dịch HCl 37% (d=1,19g/ml) Lượng HCl cần để pha dung dịch 1% là: X= (1*440)/100 = 4,4g Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = (100*4,4)/37 = 11,9g = 11,9/1,19 = 10 ml Lượng nước cất thêm vào:440-10 = 430ml Vậy, dùng ống đong lấy 10ml dung dịch HCl37%, và 430ml nước cất ta được 440 ml HCl 1% Do việc sử dụng các loại bình định mức làm cho việc pha chế dung dịch thínghiệm trở nên đơn giản và chính xác vì vậy ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệmđược pha chế theo nồng độ khối lượng - thể tích (w/v). e) Pha dung dịch nồng độ phân tử gam i) Chất tan là chất rắn khan Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó, ta tính khối lượng phântử chất đó (hoặc tra bảng) theo đơn vị gam. Cân chính xác lượng chất tan, qua phễucho vào bình định mức có dung tích 1 lít. Cho vào từng lượng nước cất nhỏ, lắc đểhòa tan hoàn toàn và đưa nước cất tới mức. Chuyển dung dịch sang bình chứa, lắc đểtrộn đều đồng nhất. 11
    • Khi phải đun nóng dung dịch để hòa tan, hoặc quá trình hòa tan có toả nhiệt thìphải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm nước tới vạchđịnh mức.Ví dụ: Pha 1 lít dung dịch KOH 1M Phân tử lượng của KOH: MKOH = 39 +16 +1 =56 Lượng KOH để pha 1 lít dung dịch 1M là: 56g Vậy, cân 56g KOH, hòa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức 1000. Đây là phản ứng tỏa nhiệt, cần làm nguội dung dịch trước khi định mức thành 1 lít. Nếu muốn pha dung dịch 2M; 3M hay 0,1M; 0,05M ta cũng tiến hành tương tựvới lượng cân tương ứng.Ví dụ: Pha 500ml dung dịch KCl 3M Phân tử lượng của KCl: MKCl = 39 +35,5 = 74,5 Lượng KCl để pha 500ml dung dịch 3M là: X= (74,5 *3*500)/1000 = 111,75g Vậy, cân 111,75g KCl, hòa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức 500,định mức đến vạch. ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước: khi tính lượng chất tan cần cân phải tínhluôn cả khối lượng các phân tử nước. iii) Chất tan dạng lỏng: nếu chất tan là dung dịch, ta phải tính toán dựa vàonồng độ dung dịch đó.Ví dụ: 8) Pha 1 lít dung dịch HCl 1M từ HCl 37% Phân tử lượng HCl: MHCl = 1+35,5 = 36,5 Lượng HCl 37% để pha dung dịch 1M là: X = (36,5*100)/37 = 98,65g Hay 98,65/1,19 = 83ml Vậy, đong 83ml HCl 37% cho vào bình định mức 1000 có sẵn 1 ít nước. Định mứ c thành 1 lít. Tiến hành pha trong tủ Hotte vì hơi acid bay lên rất độchại. f) Pha nồng độ đương lượng (N) Việc pha dung dịch nồng độ đương lượng gam (N) cũng tương tự với cách phadung dịch nồng độ phân tử gam (M).1.1.3. Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch 12
    • Khi pha hóa chất, có nhiều nguyên nhân làm cho nồng độ dung dịch khôngchính xác như việc cân đong không chính xác, các hóa chất không tinh khiết hay bịhút ẩm. Thời gian tàng trữ lâu nên chất tan bị thăng hoa, bị oxy hóa, dung môi bayhơi, vì vậy phải kiểm tra nồng độ thực của các dung dịch pha sẵn dựa vào các dungdịch có nồng độ chính xác được gọi là dung dịch chuẩn (fixanal) a) Dung dịch chuẩn Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn, đảm bảo chính xác vàđược dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm. Các chất dùngtrong dung dịch chuẩn phải khá bền vững sao cho nồng độ của chúng không thay đổinhanh chóng theo thời gian. Pha dung dịch chuẩn, ta phải dùng ống chuẩn. Ống chuẩn là một ống ampunthủy tinh hay nhựa đóng kín. Bên trong chứa một lượng cân chính xác chất tan hoặcdung dịch chất tan. Khi chuyển hết lượng chất tan trong ống vào bình định mức và phathành 1 lít ta được dung dịch chuẩn có nồng độ đã ghi trên nhãn ngoài ống. Cách pha dung dịch chuẩn từ ống chuẩn : - Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định mức,dùng bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit, vừa thêmnước cất vừa lắc và đưa nước cất tới vạch mức. - Đối với các hợp chất bền vững, có thành phần không thay đổi như NaCl,AgNO3, acid oxalic, ... có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xácchất cần pha, pha loãng và định mức tới thể tích đúng. - Đối với các chất như NaOH, HCl, Na2S2O3, ... không thể pha ngay được dungdịch chuẩn, do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần, vì vậysau khi pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ. Ví dụ: NaOH thường nhiễm một lượng Na2CO3 rất dễ chảy nước, HCl dễ bayhơi, Na2S2O3 dễ bị mất nước tinh thể khi để ngoài không khí. b) Phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha dungdịch có nồng độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đó hiệu chỉnhnồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp. 13
    • Ví dụ: Pha dung dịch NaOH 0,1 N từ NaOH rắn và dùng dung dịch chuẩnH2SO4 0,1N để chuẩn độ lại. Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản, mỗi lần sử dụng lạiphải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Xét một phản ứng trung hòa acid - base, 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1 iongam OH-. Do đó: C1V1 = C2V2 Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dung dịchta có hệ số hiệu chỉnh K: K= Cp/Ct = Vp/Vt Ví dụ: Dung dịch chuẩn là H2SO4 0,1N, dung dịch định pha là NaOH 0,1N. Lấy 10ml H2SO4 0,1N cho vào erlen, thêm ba giọt chỉ thị màu phenolphtalien,dùng burette chuẩn độ bằng NaOH được 11 ml NaOHVậy nồng độ thực tế NaOH đã pha là : Ct = (10*0,1)/11 = 0,091 N Hệ số điều chỉnh K: K= 0,091/0,1 = 10/11 = 0,911.2. Dung dịch đệm: 1.2.1. Định nghĩa dung dịch đệm pH môi trường làm thay đổi cấu trúc không gian protein vì một số amino acidcó mạch nhánh phân ly (COO- và NH4+ tạo liên kết ion). Họat động tối ưu của proteinphụ thuộc vào cấu trúc không gian nhất định trong môi trường, nghĩa là phụ thuộc vàotỉ lệ phân ly của mạch nhánh thành ion, hay nói tóm lại là phụ thuộc vào pH môitrường. Dung dịch đệm là dung dịch có pH không thay đổi nhiều lắm khi một lượngnhỏ acid (H+) hoặc base (OH-) được thêm vào. Như vậy, dung dịch đệm bao gồm mộtcặp acid base liên hợp (acid yếu và muối của acid yếu này hoặc base yếu và muối củabase này) và tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch. Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp acid – base có hằng sốphân ly pK A/B gần với pH đệm muốn pha và phối trộn chúng với số mol bằng nhau.Thí dụ, để có đệm pH ở giá trị 4.75, chọn cặp acid - base CH3COOH(0,1M)/CH3COONa (0,1M). Nếu thêm vào dung dịch 0.001 mol HCl thì pH của hệvẫn chỉ ở mức 4.748 gần bằng 4.75. Nghĩa là pH thay đổi rất ít. 14
    • Trong cơ thể sống, dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng, ví dụ như ổn địnhpH của máu bằng các hệ đệm carbonate và phosphate. Về nguyên tắc thì phối hợp các loại đệm có các khoảng đệm khác nhau thành 1dung dịch là không có vấn đề gì. Tuy nhiên sử dụng các đệm nào còn tùy thuộc vàoứng dụng sao cho thành phần của đệm không phản ứng với các cấu tử trong hệ phảnứng khảo sát theo chiều hướng có hại. Các phản ứng thường thấy là phản ứng tạo kếttủa hay tạo phức hoặc oxy hóa khử. Có dung dịch chứa hỗn hợp 1 acid yếu (Ví dụ: acid acetic) với muối của nó (Vídụ: muối natri acetate), dung dịch sẽ cân bằng dạng như sau: CH3COOH + H2O -----> CH3COO- + H3O+ Có dung dịch khác chẳng hạn, chứa hỗn hợp base yếu (Ví dụ: ammoniac) vớimuối của nó (Ví dụ: muối amoni clorua),trong dung dịch cân bằng có dạng sau: NH3 + H2O ----------> NH4+ + OH- Dung dịch đệm có pH thay đổi rất ít khi thêm một lượng acid hoặc base.Khi thêm một lượng acid mạnh (H3O+), base liên hợp kết hợp với nó cho acid yếu(cân bằng chuyển dịch theo chiều nghịch) pH của dung dịch giảm không đáng kể. Trái lại, khi thêm một lượng base mạnh (OH-), acid điện li cho H3O+ (cân bằngchuyển dịch theo chiều thuận), ion hidroni H3O+ trung hòa OH- cho base yếu H2O. Kếtquả pH của dung dịch tăng không đáng kể. Khả năng đệm của hỗn hợp đệm phụ thuộc vào hàm lượng acid và base liênhợp có trong hỗn hợp.1.2.2. Cách pha một số dung dịch đệm thường dùng a) Dung dịch đệm borat: - Dung dịch acid boric (a): 12,404 g H3BO3 hòa tan và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch borat (b): 19,108 g Na2B4O7.10H2O hòa tan và định mức đến 1000ml Dung dịch đệm borat có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) vàdung dịch (b) theo bảng dưới đây: A b pH a b pH 15
    • 9,80 0,2 6,60 6,50 3,50 8,20 9,70 0,6 6,77 6,00 4,00 8,31 9,40 0,6 7,09 5,50 4,50 8,41 9,00 1,0 7,36 5,00 5,00 8,51 8,75 1,25 7,50 4,50 5,50 8,60 8,50 1,50 7,60 4,00 6,00 8,69 8,00 2,0 7,78 3,00 7,00 8,84 7,70 2,30 7,88 2,00 8,00 8,98 7,50 2,50 7,94 1,00 9,00 9,11 7,00 3,00 8,08 0,00 10,0 9,24 b) Dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 6,2) - Dung dịch acid citric 0,1M (a): 21,01 g C6H8O7.H2O hòa tan và định mức đến1000 ml. - Dung dịch trinatri citrate 0,1M (b): 29,41 g C6H5O7Na3.2H2O hòa tan và dẫnnước đến 1000 ml. Dung dịch đệm citrate có giá trị pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch(a) và số ml dung dịch (b) theo bảng sau: A b pH A b pH 46,5 3,50 3,0 23,0 27,0 4,8 43,8 6,20 3,2 20,5 29,5 5,0 40,0 10,0 3,4 18,0 32,0 5,2 37,0 13,0 3,6 16,0 34,0 5,4 35,0 15,0 3,8 13,7 36,3 5,6 33,0 17,0 4,0 11,8 38,2 5,8 31,0 19,0 4,2 9,5 40,5 6,0 28,0 22,0 4,4 7,2 42,8 6,2 25,5 24,5 4,6 - - - 16
    • c) Dung dịch đệm phosphate (pH = 5,7 – 8,0) - Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M (a): 27,8 g NaH2PO4 hòa tan vàđịnh mức đến 1000 ml. - Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M (b): 53,05 g Na2HPO4.7H2O hoặc71,7 g Na2HPO4.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml. Dung dịch đệm phosphate có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a)và số ml dung dịch (b) định mức đến 200 ml. a b pH A b pH 93,5 6,50 5,6 45,0 55,0 6,9 92,0 8,00 5,8 39,0 61,0 7,0 90,0 10,0 5,9 33,0 67,0 7,1 87,7 12,3 6,0 28,0 72,0 7,2 85,0 15,0 6,1 23,0 77,0 7,3 81,5 18,5 6,2 19,0 81,0 7,4 77,5 22,5 6,3 16,0 84,0 7,5 73,5 26,5 6,4 13,0 87,0 7,6 68,5 31,5 6,5 10,5 89,5 7,7 62,5 37,5 6,6 8,50 91,5 7,8 56,5 53,5 6,7 7,00 93,0 7,9 51,0 49,0 6,8 5,30 94,7 8,0 d) Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (pH = 5,0 – 8,0) - Dung dịch dinatri hydrophosphate 1/15M (a): 23,9 g Na2HPO4.12H2O hòa tanvà định mức đến 1000 ml. - Dung dịch kali dihydrophosphate 1/15M (b): 9,07 g KH2PO4 hòa tan và địnhmức đến 1000 ml. Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số mldung dịch (b). 17
    • a b pH a b pH 10 990 5,0 372 628 6,6 18 982 5,2 492 508 6,8 30 970 5,4 612 388 7,0 49 951 5,6 726 274 7,2 79 921 5,8 818 182 7,4 121 879 6,0 885 115 7,6 184 816 6,2 936 64 7,8 264 736 6,4 969 31 8,0 e) Dung dịch đệm Glycine – HCl (pH = 2,2 – 3,6) - Dung dịch glycine 0,2 M (a): 15,01g glycine hòa tan và định mức đến 1000ml. - Dung dịch HCl 0,2 M (b): 16,8 ml HCl đặc (37%) pha thành 1000 ml. Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X mldung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml. X pH X pH 5,0 3,6 16,8 2,8 6,4 3,4 24,2 2,6 8,2 3,2 32,4 2,4 11,4 3,0 44,0 2,2 f) Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8,6 – 10,6) - Dung dịch glycine 0,2 M (a): 15,01g glycine hòa tan và định mức đến 1000ml. - Dung dịch NaOH 0,2 M (b): 8 g NaOH hòa tan và định mức đến 1000 ml. Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X mldung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml. 18
    • X pH X pH 4,0 8,6 22,4 9,6 6,0 8,8 72,2 9,8 8,8 9,0 32,0 10,0 12,0 9,2 38,6 10,4 16,8 9,4 45,5 10,6 g) Dung dịch đệm acetate (pH = 3,6 – 5,6) - Dung dịch acid acetic 0,2M (a): 11,55 ml CH3COOH đặc và định mức đến1000 ml. - Dung dịch natri acetate 0,2M (b): 16,4 g CH3COONa hoặc 27,2 gCH3COONa.3H2O được hòa tan và định mức đến 1000 ml. Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và Y mldung dịch (b) và định mức đến 100 ml. a b pH A b pH 46,3 3,7 3,6 20,0 30,0 4,8 44,0 6,0 3,8 14,8 35,2 5,0 41,0 9,0 4,0 10,5 39,5 5,2 36,8 13,2 4,2 8,8 41,2 5,4 30,5 19,5 4,4 4,8 45,2 5,6 25,5 24,5 4,6 h)Dung dịch đệm vạn năng 0,1M - Dung dịch acid acetic 0,1M (a): 5,7 ml CH3COOH đặc và định mức bằngnước cất đến 1000 ml. - Dung dịch acid phosphoric 0,1M (b): 6,45 ml H3PO4 đậm đặc và định mứcbằng nước cất đến 1000 ml. - Dung dịch acid ortho-boric 0,1M (c): hòa tan 6,18 g acid ortho-boric trongnước cất và định mức đến 1000 ml. 19
    • - Dung dịch natri hydroxide 1N (d): hòa tan 40 g NaOH trong nước cất và địnhmức đến 1000 ml. Trộn lẫn các dung dịch (a), (b), (c) với thể tích bằng nhau nhận được dung dịchđệm 0,1M có pH = 1,8. Điều chỉnh giá trị pH của dung dịch đệm trong khoảng pH =1,8 đến pH = 12,0 bằng cách bổ sung dung dịch NaOH 1N (d). Các dung dịch đệmvạn năng nồng độ khác được chuẩn bị tương tự.II. Thực hành Sinh viên pha dung dịch đệm và một số dung dịch sử dụng trong các bài thínghiệm sau theo hướng dẫn của giảng viên.III. Bài nộp1. Ghi chép phương pháp pha các dung dịch thực chuẩn bị.2. Làm các bài tập sau: 1. Pha 1 L dung dịch NaOH 40% (w/v): cân …..g NaOH khô 2. Pha 0,5 L dung dịch H2SO4 2M cần bao nhiêu ml H2SO4 đậm đặc, biết rằng H2SO4 đđ là acid 97% có M=98 g/mol, tỉ trọng d=1,84 g/ml. Nồng độ mol của H2SO4 đđ là: Thể tích H2SO4 cần sử dụng là: Lượng nước cần bổ sung là : 3. Pha 250 ml dung dịch CuSO 4 1 M, cân …….g CuSO4.5H2O 4. Pha 1 L dung dịch H2SO4 0.1N từ dung dịch H2SO4 2M: 5. Pha 500 g dung dịch NaOH 10% từ dung dịch NaOH 40% Lượng NaOH cần để pha dung dịch 10% là: X = Lượng dung dịch NaOH 40% cần dùng là: Y = Lượng nước cất thêm vào: 6. Pha 500 ml dung dịch HCl 2% từ dung dịch HCl 37% (d=1,19g/ml) Lượng HCl cần để pha dung dịch 2% là: X= Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = Lượng nước cất thêm vào: 20
    • BÀI 2. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ACID DINITRO - SALICYLIC (DNS)I. Lý thuyết1. Định nghĩa Đường khử là các đường chứa nhóm aldehyde (-CHO) hoặc ketone (-CO) nhưglucose, fructose, arabinose, maltose, lactose; trong khi đó saccharose, trehalosekhông phải đường khử.2. Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốcthử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận vớinồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở bước sóng540nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tínhđược hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS acid:Acid dinitrosalicylic 3-amino, 5- dinitrosalicylic acid3. Xử lý mẫu Tùy vào đối tượng nghiên cứu (hạt, quả,...) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiêncứu dùng để định lượng đường có khác nhau đôi chút, nhưng nguyên tắc chung nhưsau: - Trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặcinulin, có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước. Cân và cho vào cối sứ 1 gnguyên liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây, lá hoặc quả khô,... đãđược nghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi). Nếu là nguyên liệu tươi (nhưhoa, quả tươi) thì cân 5 – 10 g. Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30 21
    • ml nước cất nóng 70 – 80oC. Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức dung tích1000 ml. Đun cách thủy 70 – 80oC trong 35 – 40 phút, kết tủa protein và các tạp chấtbằng dung dịch chì acetate [Pb(C2H2O2)2.3H2O] hoặc chì nitrate [Pb(NO3)2] 10%.Tránh dùng quá dư chì acetate (dùng 2 – 5 ml chì acetate). Sau đó loại bỏ lượng chìacetate dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa, để yên hỗn hợp 10 phút. Tiếp đó thêmnước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô. Nước lọc dùnglàm dung dịch thí nghiệm. - Trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang,sắn, khoai tây,... cần chiết đường bằng rượu 70 – 80oC, đun hỗn hợp cách thủy trongbình cách thủy có lắp ống làm lạnh không khí. Trong trường hợp này không cần kếttủa protein bằng chì acetate vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều. - Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ như cà chua, dứa, chanh,khế,... cần chú ý là trong quá tình đun khi chiết, đường saccharose có thể bị thủy phânmột phần. Do đó cần xác định riêng đường khử và riêng saccharose. Trước khi đuncách thủy hỗn hợp phải trung hòa acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 6,4 –7,0.II. Thực hành1. Dụng cụ - hóa chất:a) Dụng cụ, thiết bị- Máy so màu hoặc quang phổ kế- Cuvette d= 1 cm, V = 4 ml- Ống nghiệm có nắp và các dụng cụ thủy tinh thông thường khác- Bếp điệnb) Hóa chất - nguyên liệu- Mẫu rau quả chứa đường (rau cải ngọt, dứa)- Thuốc thử DNS Caân 5g DNS vaø 300 ml nöôùc caát vaøo coác, hoøa tan ôû 500C, sau ñoù cho theâm 5ml dung dòch NaOH 4M. Cuoái cuøng cho theâm 150g muoái tartrat keùp hoøa tan roài cho vaøo bình ñònh möùc vaø theâm nöôùc caát ñuû 500ml, ñöïng trong loï thuûy tinh saãm maøu. Chuaån 3 ml thuoác thöû DNS bằng HCl 0.1N vôùi chæ thò laø phenolphtalein, neáu heát 5 - 6 ml HCl laø ñöôïc. 22
    • - Dung dịch glucose chuẩn: pha sẵn dung dịch glucose chuẩn 10 mg/ ml (bảo quản tủlạnh vài ngày).2. Tiến hành a) Chiết xuất đường trong thực vật- 5g rau cải ngọt → nghiền nhỏ → cho vào becher 100ml + 10ml cồn 900 → đun cáchthủy (sôi 3 lần) → khuấy đều bằng đũa thủy tinh → để nguội → lọc (chỉ gạn lấy phầntrong).- Cho tiếp 10ml cồn 800 vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun sôi 2 lần trên nồi đun cáchthủy→ Để nguội → lọc (lặp lại 2 lần)- Đưa phần bã lên lọc và rửa bằng rượu nóng (800)- Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong phòng hoặc trên nồi cách thủy đun nhẹ. Saukhi cho bay hơi rượu, mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm.- Cặn khô trong cốc được pha loãng thành thể tích V = 50ml với nước cất ta đượcdung dịch đường gốc. Pha lõang dung dịch đường gốc với một hệ số pha lõang n thíchhợp. b) Dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng đường- Cho vào 6 ống nghiệm sạch với các chất có thể tích như bảng sau: Hoá chất Ống Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 ĐC Glucose 10 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 mg/ml (ml) Nước cất (ml) 10 9.8 9.6 9.4 9.2 9.0 Nồng độ (mg/ml) OD540nm (Sinh viên điền nồng độ glucose chuẩn vào bảng trên)- Từ các ống nghiệm trên lấy 1ml ở mỗi ống vào 6 ống nghiệm khác và thêm vào mỗiống 3ml thuốc thử DNS.- Đun sôi đúng 5 phút (có đậy nút). 23
    • - Làm lạnh đến nhiệt độ phòng.- Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm với mẫu trắng pha từ ống đối chứng.Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang (OD540nm), trục hoành là nồngđộ glucose. Tìm phương trình biểu diễn đường chuẩn dạng y = ax + b với y =OD540nm; x = [glucose] (mg/ml) và hệ số tương quan R2 nhờ phần mềm Excel.- Tương tự hút 1 ml dung dịch đường pha lõang X cho vào ống nghiệm, thêm 3 mlDNS, đun sôi 5 phút. Sau khi để nguội đo mật độ quang (OD), sử dụng mẫu trắng ởtrên.Chú ý: tiến hành các mẫu dựng đường chuẩn và mẫu thí nghiệm đồng thời.3. Tính kết quả:- Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được X mg/ml đường khử trong dungdịch đường pha lõang.- Nhân với hệ số pha lõang n để được lượng đường trong 1 ml dung dịch gốc.- Chọn hệ số pha lõang n sao cho OD nằm trong giới hạn đường chuẩn.- Tính hàm lượng đường trong nguyên liệu (mg/g) =V = thể tích dịch đường gốc (ml)m = khối lượng mẫu cân (g)III. Bài nộp:1. Vẽ đường chuẩn glucose2. Viết phương trình đường chuẩn y = ax + b3. Tính R2 =4. Biện luận các hệ số pha lõang. 24
    • BÀI 3. ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHLI. Lý thuyết1. Định nghĩa Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số.Nitơ có trong thành phần amino acid của protein là nitơ protein. Nitơ không có trongthành phần protein như của các muối vô cơ, acid nitric, các amino acid tự do, cácpeptide, urea và các dẫn xuất của urea, các alkaloid, các base purine và pyrimidine,...là nitơ phi protein. Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein Đạm tổng số hay protein tổng số là nitơ tổng số nhân với hệ số chuyển đổi. Hệsố này phụ thuộc vào hàm lượng nitơ trong protein. Thông thường nitơ chiếm 16%protein nên hệ số chuyển đổi thường được sử dụng là 100/16 = 6.25. Đạm tổng số = Nitơ tổng số x hệ số chuyển đổi Bảng dưới đây biểu diễn hệ số chuyển đổi cụ thể cho nhiều đối tượng mẫu khácnhau. Mẫu Hệ số chuyển đổi Nguồn gốc động vật 6.25 Hạt bông 5.30 Đậu phộng 5.46 Đậu nành 5.71 Hạt hướng dương 5.3 Cơm dừa 5.3 Hạt mè 5.3 Bắp 6.25 Gạo 5.95 Lúa mì 5.83 25
    • 2. Nguyên tắc a) Vô cơ hóa mẫu - Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúctác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau: 2H2SO4 → 2H2O +2SO2↑+ O2 - Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tửchứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phânthành acid amine; carbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O; còn nitơđược giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trongdung dịch 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 Các nguyên tố P, K, Ca, Mg,... chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO,MgO,... b) Chưng cất đạm: - Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH (NH4)2SO4 + 2 NaOH = Na2SO4 +H2O + 2NH3↑ - NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng, bìnhhứng chứa H2SO4 0.1N 2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dư c) Chuẩn độ H2SO4 dư - Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0.1N H2SO4 dư + NaOH → Na2SO4 + H2OII. Thực hành1. Dụng cụ - hóa chất a) Dụng cụ - Bình phá mẫu - Bếp đun - Bộ chưng cất Kjeldahl định lượng Nitơ gồm: Bình cất đạm (bình Kjeldahl) Ống dẫn khí Ống sinh hàn 26
    • Bình hứng (becher 250ml) Bi thủy tinh - Pipet 20ml; pipet 10ml - Erlen 250ml Bộ chưng cất Kjeldahl b) Hóa chất + nguyên liệu - Bột đậu nành (0.1g), nước tương 1-2 ml - H2SO4 đậm đặc - NaOH 40% - H2SO4 0.1N chuẩn - NaOH 0.1N chuẩn - Thuốc thử Tashiro - Chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3:1)2. Tiến hành a) Vô cơ hóa mẫu - Cân 100mg bột đậu nành đã sấy khô tuyệt đối cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp5ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi hóa).Cho thêm vào 200mg chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặt bìnhKjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh. Lưu ý giai đoạn này phải thực hiện trong tủ Hotte, đặt bình hơi nghiêng trênbếp, tránh trường hợp khi sôi mạnh hóa chất bắn ra ngoài, khi đã sôi giữ nhiệt độ bếpđun vừa phải để tránh hóa chất trào ra ngoài và không bị bay mất ammoniac. 27
    • - Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khithấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trênthành bình còn chưa bị oxi hoá vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dungdịch trong hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức100 ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch. b) Cất đạm - Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tím hồng. Tiếptục cho vào bình cất 20ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sangmàu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hếtsang màu xanh lá mạ). - Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0.1N và 3giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đầuống sinh hàn. Bật công tắc cất đạm. Kiểm tra xem hơi ra từ đầu ống sinh hàn có làmxanh giấy quỳ không, nếu không thêm NaOH 40%. - Sau khi cất đạm 20-25 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không,dùng giấy qùy thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy qùy không đổi sang màu xanh làđược. Ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa. c) Chuẩn độ: - Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất màutím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0.1 N sử dụng.3. Tính kết quả: Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo công thức N (mg%) = {1,42 * (V1-V2)*100/a}*2 V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng V2: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độ a số miligam nguyên liệu 1,42: hệ số, cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42 mg NitơIII. Bài nộp1. Giải thích ý nghĩa các bứơc trong thí nghiệm. 28
    • 2. Thảo luận các yếu tố dẫn đến sai số.3. Nếu thay H2SO4 trong bình hứng bằng acid boric thì kết quả có gì thay đổi không ? 29
    • BÀI 4. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORDI. Lý thuyết1. Định nghĩa Protein được định lượng bằng phương pháp Bradford là protein tan trong dungdịch. Vì vậy, muốn xác định hàm lượng protein một mẫu ta phải trích ly protein. Hàmlượng protein xác định sẽ phụ thuộc vào hiệu quả trích ly (khả năng hòa tan củaprotein trong dung môi trích ly).2. Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốcnhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mangtính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm.Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein. Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn vớidung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường làbovine serum albumin (BSA). Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốcnhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo mật độ quang hỗnhợp dung dịch bằng máy quang phổ kế. Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250 30
    • II. Thực hành1. Dụng cụ - hóa chất a) Dụng cụ - Máy đo quang phổ - Ống nghiệm (14) - Pipette 5ml, 1ml (có thể thay bằng pipetteman) - Đồng hồ bấm giây - Giấy thấm - Giá để ống nghiệm - Bình tia đựng cồn b) Hóa chất - Cồn 900 - Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin bằng cân phân tích, pha trong 1ml nước cất, lắc đều cho tan. Giữ ở -200C. Khi dùng pha loãng ra 100 lần, được dungdịch có nồng độ 0,1 mg/ml. - Dung dịch thuốc thử Bradford: dung dịch thuốc thử có thành phần trong 1 lnhư sau: Coomassie Brilliant Blue: 0,05g Methanol: 50 ml Phosphoric acid 85%: 100 mlPhẩm màu Coomasie Brilliant Blue 0,1 g được làm tan trong 50 ml methanol, phalõang với nước cất thành 500 ml để dược dung dịch (1)đựng trong chai màu tối cónắp, 100 ml H3PO4 85% pha lõang thành 500 ml được dung dịch (2). Khi cần sử dụnghòa 1 V (1) và 1V (2) rồi lọc lấy dịch trong.2. Tiến hành - Thu dịch trích ly protein như trong bài enzyme (10 g malt trích ly bằng nướcthu được V = 100 ml). Pha lõang mẫu với hệ số pha lõang n lần để được mẫu phântích (mẫu X) (n=1, 2 đối với malt). - Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫucần phân tích X 31
    • - Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ốngnghiệm 0, lắc đều để yên. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1,lắc đều để yên,... cứ tiếp tục cho đến hết. Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 X Nước cất, ml 1 0.9 0.9 0.7 0.6 0.5 - Albumin chuẩn (0,1mg/ml), 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 - ml TT Bradford, ml 5 5 5 5 5 5 5 Nồng độ Albumin (µg/ml) ? OD595nm (Sinh viên điền nồng độ albumin (µg/ml) vào bảng trên) - Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ởbước sóng 595 nm. Ta có giá trị OD0, ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD1),... tương tựcứ cách một phút đo cho hết các ống. Ghi lại giá trị OD.3. Tính kết quả: - Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 - Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mậtđộ quang OD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein P ở trong mẫu phân tích X. P = X*n Để tính tóan hàm lượng protein trong 1g mẫu cân: Protein (mg/g) = P x V/m V = thể tích dung dịch trích ly, ml m = khối lượng mẫu, g.III. Bài nộp1. Vẽ đường chuẩn protein theo Bradford2. Tìm phương trình đường chuẩn y = ax +b3. Tính R2 =4. Tính tóan kết quả thí nghiệm, chọn hệ số pha lõang nào? 32
    • BÀI 5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYMEI. Lý thuyết1.1. Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme a) Định nghĩa Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao.Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định. Hoạt độnghay hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượngsản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. Vì vậy có thể đánh giá hoạttính xúc tác của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độtích lũy sản phẩm phản ứng.Về nguyên tắc có thể hai nhóm phương pháp chính sau: - Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thờigian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định. - Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chấthay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định. Để thực hiện được mục đích trên, nhiều phương pháp phân tích khác nhau đượcsử dụng: phương pháp đo quang phổ, đo độ phân cực, áp suất, độ nhớt, phương phápsắc ký và phương pháp hóa học. b) Đơn vị hoạt tính enzyme Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính. Một đơn vịhọat tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp. i) Đơn vị đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U) do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB) định nghĩa: Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được1 mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn. 1 U = 1 mol sản phẩm = 1 mol cơ chất (10-6 mol)/phút ii) Katal: Năm 1979, Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo nên sử dụng Katal làm đơn vị cơ bản của hoạt tính enzyme. 33
    • Một Katal là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 giâyở điều kiện tiêu chuẩn. 1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây = 60 mol/ phút = 60 x 106 mol/ phút = 6 x 107 U 1 U = 1/60 x 10-6 Kat = 16,67 nKat (nanokatal) Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI). iii) Đơn vị tự đặt: đơn vị hoạt tính dựa vào sự thay đổi đặc tính hỗn hợp phảnứng, ví dụ sự thay đổi độ đục, độ nhớt ...trong một đơn vị thời gian. Trường hợp cơchất và sản phẩm là một hỗn hợp phức tạp thì áp dụng đơn vị hoạt tính này. N h ư vậ y , c ó n h iề u đơ n vị h o ạ t tín h e n z y m e . Đ iề u q u a n tr ọ n g n h ấà lcầ n đ ịn h tn g hĩa rõ rà n g đ ơ n vị h o ạ t tín h . c) Hoạt tính riêng (specific activity) của enzyme Hoạt tính riêng của một chế phẩm enzyme đặc trưng cho độ tinh sạch của chếphẩm enzyme. Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị enzyme/mg proteinprotein (U/mg protein) hoặc Kat/kg protein, trong đó hàm lượng protein được xácđịnh theo phương pháp Lowry hoặc Bradford.1.2. Phương pháp xác định họat tính enzyme Khi tiến hành thí nghiệm đo họat tính enzyme cần chú ý những điểm sau: - C ầ n trá n h n h ữ n g y ế u tố c ó th ể b iế n tín h p r o te in e n z y m e . - C á c th ô n g số n h iệ t đ ộ , p H , n ồ n g đ ộ io n àv th à n h p hầ n d u n g d ịc h đ ệ m ả n h ư ở n g hlê n h oạ t tín h e n z y m e . T h h o ạ t tín h e n z y m e p h ả i ư ợ c tiế n hà n h tr o n g đ i u k iệ n th íc h ử đ ềh ợ p n hư đ iề u k iệ n s in h lý , đ iề u k iệ n tồ n trữ th ự c p h ẩ m h o ặ c đ iề u k iệ n moạ t lự c c ó à hthể đ ạ t tố i ư u . - V ớ i n h ữ n g e n z y m e c ầ n c ó c h ấ t h o ạ t h ó a h o ặ c c h ấ t ổ n đ ịn hì thhả i c h o c á c c h ấ t pn à y v à o e n z y m e trư ớ c k h i c h o cơ c hấ t và o hỗ n h ợ p p h ả n ứ n g . - N ồ n g đ ộ cơ c hấ t tro n g p h ả n ứ n g e n z y m e p h ả i ở tro n g g iớ i h ạ n th íc h h ợ p , đ ủthừ a đ ể bã o e n z y m e , n h n g k h ô n g q u á c a ođ ể kìm h ã m e n z y m e . S a u k h i ừdn g p h ả n ưứ n g lư ợ n g cơ c hấ t đư ợ c c h u y ể n h ó a 2 0 0 % . -3 - T hờ i g ia n x á c đ ịn h h oạ t tín h thư ờ n g 5-3 0 p h ú t. Tố t n h ấ t là x á c đ ịn h tố c đ ộ b a nđ ầ u c ủ a p h ả n ứ n g (3 0 6 0 g iâ y ), v ì g ia iđ o ạ n nà y tố c đ ộ p h ả n ứ n g lớ n n h ấ t, s a uđ ó bắ t -đ ầ u g iả m (Hìn h 1 ). 34
    • - K h i x á c địn h h o ạ t tín h p h ả i à m mẫ u đ ố i c h ứ n g s o n g s o n g v ớ i m ẫ u th í n g h iệ m . lT r o n g mẫ u đ ối c hứ n g e n z y m e p h ả i b ị b ấ t h o ạ t ư ớ c k h i tiế p x ú c v ớ i c c hấ t. tr ơ Hình 1. Động học phản ứng enzyme1.3. E n zy m e a m y la se v à p h ư ơ n g p h áp xác đn h h oạt tín h ị a ) K h a i q u á t về en zy m e am ylase A m y la s e là c á c e n z y m e x ú c tá c c h o c á c p n ứ n g th ủ y p h â n tin h b ộ t, g ly c o g e n , ảhv à c á c p o ly s a c c h a rid e tư ơ n g ựt. A m y la s e c h ia à m 3 loạ i c h ín h : l - -a m y la s e (Endo -1,4-glucanase; E C 3 .2 .1 .1 ) c ó tr o n g ư ớ c b ọ t, h ạ t hò a thả o n n ả y m ầ m , tụ y tạ n g , n ấ m m ố c , v i k h u ẩ n . E n z y m à y n p h â n g ả i liê n kế t 1 ,4- e i g ly c o s id e ở g iữ a c h u ỗ i p o ly s a c c h a rid e ( h o ạ t tín h e n d o a m y la s e ) tạ à n hth o m a lto s e , d e x tr in p h â n ửt th ấ p . Dư ớ i tá c d ụ n g c ủ a e n z y m e àny , du n g dịc h tin h b ộ t n h a n h c h ó n g b ị m ấ t k h ả n ă n g tạ o à u vớ i d u n g d ịc h io d v à bị g iả m đ ộ n h ớ t. m -a m y la s e bề n v ớ i n h iệ t, n h n g k é m bề n v ớ i a c id . ư - -a m y la s e (Exo -1,4-glucanase; EC 3.2.1.2) có nhiều ở thực vật (hạt, củ), xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1,4-glycoside từ đầu không khử tạo thành maltose và dextrin phân tử lớn. Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC, nhưng bền với acid hơn -a m y la s e . - Glucoamylase (Exo -1,4-g lu c a n a s e; EC 3.2.1.3) xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1,4- và 1,6-glycoside từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Sản phẩm chủ yếu là glucose và dextrin. Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC. Nhiều glucoamylase hoạt động mạnh ở pH 3,5-5,5. b ) C á c p hư ơ n g p h á p đ o h oạt tín h en zym e -a m ylase 35
    • N g u y ê n tắ c c h u n g dự a trê n c ơ sở th ủ y p h â n tin h b ộ t b ở i e n z y m e tro n g d u n g d ịc he n z y m e n g h iê n c u thà n h c á c d e x trin c ó p h â n ửt lư ợ n g k h á c n h a u . Đ o ư ờ n g đ ộ mà u ứ ctạ o thà n h g iữ a tin h b ộ t và c á c sả n p h ẩ m th ủ y p h â n c ủ a n ó v ớ i io d n g m á y s o mà u sẽ bằtín h đ ượ c h o ạ t tín h e nz y m e . Đ ơ n vị a m y la s e (th e o S m ith v à R o e )là lượ n g e n z y m e c ầ n th iế t đ ể th ủ y p h â nh o à n to à n 1 0 m g tin h b t s a u th ờ i g ia n p h ả n ứ n g 3 0 p h ú t tro n g đ iề u k iệ n th í n g h iệ m . ộII. T hự c hà n h1. H óa chấ t – D ụ n g cụ a) H ó a chấ t - D u n g dịc h đ ệ m - D u n g dịc h đệ m a c e ta te p H = 4 ,7 ( x á c đ ịn h h o ạ t tín h e n z y m e n ấ m m ố c ): tr ộ n 1 th ểtíc h C H3 C O O H 1 N vớ i 1 th ể tíc h C H3 C O O N a 1 N . K ể m tra p H . i - D u n g dịc h đ ệ m p h o s p h a te p H = 4 ,9 (x á c đ ịn h h o ạ t tín h e n z y m e c ủ a m a lt): tr ộ n 1 0m l d u n g dịc h N a2 H P O 4 1 /1 5 M vớ i 9 9 0 m l d u n g d ịc hK H 2 P O 4 1 /1 5 M n hậ n đư ợ c 1 ld u n g dịc h đ ệ m p h o s p h a te p H = 4 ,9 4 . K iể m tra p H . - D u n g dịc h đ ệ m g ly c in e – N a O H 0 ,1 M p H = 1 0 (d ù n g ể đ x á c đ ịn h h o ạ t tín h -a m y la s e k iề m . - D u n g dịc h H C l 0 ,1 N. - D u n g dịc h io d : hò a ta n 3 0 m g K I v à 3 m g I 2 ớ i m ộ t lư ợ n g n h ỏ nư ớ c cấ t. L ắ c n h ẹ vh ỗ n h ợ p đ ể hò a ta n h o à n to à n , s a uđ ó c h u yể n d u n g d ịc h s a n g bn h đ ịn h m ứ c 1 0 0 0 m l, ìb ổ s u n g nư ớ c c ấ t đ ế n v ạ c h m ứ c . B ả o q u ả n d u n g d ịc h tr o n gìn h m à u n â u đ ể c h ỗ tố i. b - D u n g dịc h tin h b ộ t 1 % : h a ta n 1 g tin h b t (th e o c h ấ t k h ô tu y ệ t đ ố i) v ớ i 5 0 l ò ộ mn ư ớ c c ấ t tro n g bìn h đ ịn h m ứ c 1 0 0 m l, lắ c đ ề u . Đ ặ t àvo bế p c á c h th ủ y đ a n g s ô i, lắ c ê n litụ c c h o đ ế n k h i tin h b ộ t ta n hà n to à n . S a u đ ó là m n g ộ i và bổ s u n g 1 0 m l đ ệ m a c e ta te o up H = 4 ,7 (h oặ c 1 0 m l d u n g d ịc h đ ệ m p h o s p h a te p H = 4 ,9 ) b ổ s u n g ớnc c ấ t đ ế n v ạ c h ưm ứ c , lắ c đ ề u . D u n g d ịc h đ ợ c c h u ẩ n b ị tro n g n g y sử d ụ n g . ư à - D u n g dịc h e n z y m e g ố c2. T iến hà n h : a ) T ríc h ly e n zy m e : e n z y m e đ ượ c tríc h ly từ c h ế p h ẩ m h a y tế àbo , m ô độ n g th ự cv ậ t b ằ n g d u n g d ịc h đ ệ m c ó p H th íc h h ợ p . i) Trích ly enzyme từ vi khuẩn: C â n m = 0 ,1 g c hế p h ẩ m n g h ê n cứ u , dù n g đũ a i 36
    • thủ y tin h c hà cẩ n th ậ n c h ế p h ẩ m tro n g m ộ t c ố c th ủ y tin h d u n g tíc h 5 0 m l v ớ i m ư ợ n g ột ln ư ớ c n h ỏ . S a u đ ó c h u y ể n ton bộ h ỗ n h ợ p v o b ìn h đ ịn h m ứ c d u n g tíc h 1 0 0 m l, b ổ à às u n g n ướ c c ấ t tớ i v ạ c h m ứ c . L ọ c à th u hồ i d ịc h tríc h y e n z y m e . Bả o q u ả n d u n g d ịc h v le n z y m e gố c ở 2 – 4 o C tro n g thờ i g ia n 1 n gà y . ii) Trích ly enzyme nấm mốc: C â n m = 5 g c h p h ẩ m e n z y m e th ô ã n g h iề n sơ ế đb ộ , dù n g đũ a th ủ y tin h c h cẩ n th ậ n c h ế p h ẩ m tro n g m ộ t c ố c d u n g tíc h 5 0 m l. S a u đ ó àc h u yể n toà n bộ c h ế p h ẩ m v à o b ìn h ta m g iá c d u n g tíc h 2 5 0 m l,ổb s u n g 5 0 m l n ướ c c ấ tv à 1 0 m l d ịc h đ ệ m a c e ta te p H = 4 ,7 . G iữ h ỗ n h ợ p ở n h iệ t đ ộ o3 0 tro n g thờ i g ia n 1 g iờ Cc ó k h uấ y đ ả o đ ịn h k ỳ . L ọ ,c rử a th u hồ i d ịc h tríc h ly e n z y m es a o c h o V = 1 0 0 m. l Bả oq uả n d u n g d ịc h e n z y m e g c ở 2 – 4 o C tr o n g thờ i g ia n 1 n gà y . ố iii) Trích ly enzyme từ malt: C â n m = 5-1 0 g m a lt đã n g h iề n n h ỏ , c h o v o b ìn h àn ó n d u n g tíc h 2 5 0 m l, ổ s u n g 5 0 m l n ướ c c ấ t và 1 0 m l d u n g d h đ ệ m p h o s p h a te p H = b ịc4 ,9 . G iữ h ỗ n h ợ p ở n h iệ t đ ộ 3 o C tro n g thờ i g ia n 1 g iờ c k h uấ y đ ả o đ ịn h k ỳ . L ọ c rử a 0 ó ,th u hồ i d ịc h tríc h ly e n z y m es a o c h o V = 1 0 0 m.l B ả o q u ả n d u n g d ịc h e n z y m e g ố c ở 2– 4 o C tro n g thờ i g ia n 1 n gà y . b ) P h a lõ a n g e n zy m e P h a lo ã n g d u n g dc h e n z y m e g ố c (h ệ s ố p h a lon g n = 25, 50, 100) bằ n g d u n g ị ãd ịc h đ ệ m s a o c h o tr o n g 1 m l d u n g d ịc h e n z y m e p h â n tíc h c ó c h ứ a mưộợtn lg e n z y m eđ ủ đ ể th ủ y p h â n 2 0 %- 3 0 % tin h bộ t tro n g d u n g d ịc h ở đ iề u k iệ n x á c đ ịn h . N hvậ y , đ ộ ưp h a lo ã n g p hụ th u ộ c và o h oạ t tín h c h ế p h ẩ m e n z y m e c ầ n p h â n tíc h . c ) X á c địn h h ọ a t tín h C h uẩ n b ị m ẫ u th í n g h iệ m , m ẫ u đ ố i c h ứ n g àvm ẫ u trắ n g th e o bả n g s a u : M ẫ u th í n g h iệ m M ẫ u đ ố i c h ứ n g M ẫ u trắ n gD u n g dịc h tin h b ộ t 1 % 2 ml 2 ml 0N ướ c c ấ t 0 0 2 mlĐệm 1 ml 1 ml 1m lD u n g dịc h N a C l 3 % 0 ,5 m l 0 ,5 m l 0 ,5 m l Ủ 4 0o C , 1 0 p h ú t để đ ạ t n h iệ t đ ộD u n g dịc h e n z y m e 1 ml 0 0 Ủ 4 0o C , 3 0 p h ú t để x ả y ra p h ả n ứ n g 37
    • H Cl 1N 1 ml 1 ml 1 mlE nzym e 0 1m l 1 ml C h u yể n s a n g bìn h đ ịn h m ứ c 1 0 0 m lN ướ c c ấ t Đ ế n vạc h Đến vạch Đến vạchIo d e 0 ,5 m l 0 ,5 m 1 0 ,5 m 1 - D u n g dịc h đ ố i c hứ n g c ó m à u x a n h - D u n g dịc h thí n g h iệ m c ó mà u tím vớ i cư ờ n g đ ộ k h á c n h a u ù y v à o lư ợ n g tin h t b ộ t c hư a bị th ủ y p h â n . - Đ o mậ t đ ộ q u a n g (O D ) c ủ a c á c d u n g d ịc h ở ư ớ c s ó n g = 6 2 0 n m s o v i m ẫ u b ớ trắ n g .3. T ín h kết q u ả :S ố m g tin h bộ t b ị th ủ y p h â n S = x 20 S  n VHoạt tính tòan phần (đơn vị họat tính/g)= 10  mHọat tính riêng (đơn vị họat tính/mg protein) = họat tính toàn phần/mg protein(Bradford).trong đó:n = hệ số pha loãngV = thể tích dịch trích ly, mlm = khối lượng enzyme, gIII. Bài nộp1. Đơn vị họat tính enzyme amylase trong bài là gì ?2. So sánh các hệ số pha lõang, chọn hệ số pha lõang nào ?3. Có thể sử dụng phương pháp đo đường khử bằng DNS acid để đo họat tính enzymeamylase không ? Tại sao ? 38
    • TÀI LIỆU THAM KHẢO1. Nguyễn Văn Mùi. Hóa sinh học. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà nội, 20012. Holtzhauer M. Basic Methods for the Biochemical Lab. Springer, 2006.3. Ronald E. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. John Wiley & Sons, Inc., 20034. Smith B, Roe J. A photometric method for the determination of α-amylase in blood and urine, with the use of the starch-iodine color. J. Biol. Chem. 179, 53 (1949). 39