Preverjanje izražanja gena za β-aktin v embriju cebrice (izolacija celotne RNA embrija cebrice → spektrofotometrično preverjanje uspešnosti izolacije → reverzna transkripcija mRNA za gen β-aktin → pomnoževanje cDNA v PCR → preverjanje na gelu)

1. UNIVERZA V LJUBLJANI
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ODDELEK ZA BIOLOGIJO
2014, Ljubljana
PREVERJANJE IZRAŽANJA GENOV
BLATNIK Eva, BURJEK Mateja, DRAGANJEC Nejc, FERK Kaja,
GLINŠEK Katja, GOMBOC Marko, JURKOVIĆ Ivana, KRANJC Nace,
MIHELIČ Tina, PEZIČ Tamara, POLAK Tjaša, POTOČNIK Tjaša, PROJ
Sonja, ŠKORJA Nives, ZALOKAR Danijela

2. Namen vaje
● Preverjanje izražanja gena za β-aktin v embriju
cebrice (izolacija celotne RNA embrija cebrice →
spektrofotometrično preverjanje uspešnosti izolacije →
reverzna transkripcija mRNA za gen β-aktin →
pomnoževanje cDNA v PCR → preverjanje na gelu)
● Osvežitev znanja o različnih bioinformacijskih
orodjih in brskalnikih

3. Cebrica (Danio rerio)
● Plitve, počasi tekoče in stoječe vode Indijskega
podkontinenta
● Odličen raziskovalni model
● majhne in robustne
● razmnoževanje skozi celo leto
● kratek generacijski čas (za vretenčarja)
● velika in transparentna jajčeca (enostavno
opazovanje)
somersault1824.com/library-of-science-illustrations/

4. ● Telolecitalno jajce; meroblastično, diskoidalno
brazdanje
● V mid-blastula transition (MBT) se aktivira
genom
● sestavljen iz 25 kromosomov
● 42422 genov in 43342 proteinov
● Beta aktin 2 (actb)
Embrionalni razvoj
Razvojni stadiji cebrice: 1-cell (0,2h); High (3,3h); Gastrula epiboly (5,3h); 10-somite (14h); hatching ( 72h)
cellimagelibrary.org/

5. ● citoskeletni aktin
● pomemben za gibanje, strukturo in integriteto
celice
● bactin1 in bactin2
● odsotnost ali pomanjkanje aktina povzroči
zgodnjo smrt
VLOGA:
● embrionalni razvoj, celjenje ran in imunološki
odgovori
● celična rast in celična delitev
β-aktin
uscnk.com/directory/Actin-Beta(ACTB)-1340.htm

6. ● mikrocentrifugirka
● centrifuga
● mešalo
● 70% etanol
● “RNeasy MINI” komplet za izolacijo RNA:
● kolona »RNeasy spin«
● zbiralna mikrocentrifugirka (1,5 ml)
● zbiralna mikrocentrifugirka (2 ml)
● pufer RLT
● pufer RW1
● pufer RPE
● voda brez RNaze
1. dan: izolacija RNA - MATERIALI

7. ● RNA izolirana iz embrijev cebric
● “RNeasy MINI” komplet
● RNAze (katalizirajo razgradnjo RNA) → ASEPTIČNO DELO!
Rokavice, hitro delo, sobna temperatura (tudi pri
centrifugiranju), nastavki za avtomatske pipete s filtri.
● Izolirano RNA smo do naslednje vaje hranili
pri -20 °C
1. dan: izolacija RNA - METODE
somersault1824.com/library-of-science-illustrations/

8. Shema izolacija RNA:
somersault1824.com/library-of-science-illustrations/
5 min
1600 rpm
odstraniš
ves
supernatant
dodaš 350 µl
pufra RTL
celice razrahljaš
s krcanjem
vrtinči dokler se celice ne
resuspendirajo in nato še 1 minuto
dodaj 350 µl
70 % etanola
prenesi 700 µl, vključno s
percipitatom v kolono RNeasy
RNeasy kolono namesti
v 2-ml mikrocentrifugirko
15 sekund
13.000 rpm
zavrzi tekočino v
mikrocentrifugirki
ponovno namesti kolono
v zbiralno centrifugirko
dodaj 700 µl
pufra RW1
15 sekund
13.000 rpm
zavrzi VSO tekočino v zbiralni
mikrocentrifugirki, pomagaš si
lahko s pipeto

9. Shema izolacija RNA:
ponovno namesti kolono v
zbiralno mikrocentrifugirko
15 sekund
13.000 rpm
zavrzi v mikrocentrifugirki
zbrano tekočino
ponovno namesti kolono v
zbiralno mikrocentrifugirko
dodaj 500 µl
pufra RPE
2 minuti
13.000 rpm
zavrzi VSO tekočino v
zbiralni mikrocentrifugirki.
ponovno namesti kolono v
zbiralno mikrocentrifugirko
1 minuta
13.000 rpm
kolono prenesi v 1,5
ml mikrocentrifugirko
dodaj 30 µl vode brez RNaze na
sredo membrane v koloni
1 minuta
13.000 rpm do uporabe shrani na - 20 °C
1. Vsi koraki so izvedeni pri sobni temperaturi
2. Delaj hitro
3. Skozi ves postopek uporabljaj rokavice
4. Centrifugiraj pri 20 - 25 °C

10. Spektrometrično določanje količine in čistosti:
● kvarčne kivete
● A pri 260 in 280 nm
● A max NK je pri 260 nm → določanje
koncentracije NK v ekstraktih
● Proteini A max pri 280 nm → razmerje med
(A260
/A280
) nam pove čistost izolirane RNA (1,9 -
2,1).
● Izračun koncentracije A260
= 1 → 44 µg RNA v 1
ml.
Preverjanje uspešnosti izolacije RNA

11. ● mikrocentrifugirka
● sterilni 10 mM TrisCl pH 7,0
● izolirana RNA
● kvarčna kiveta
Materiali: 1. 990 µl sterilnega
10mM TrisCl pH 7,0
2. 10 µl izolirane
RNA
dobro premešaj
tako redčeno RNA
prenesi v kvarčno
kiveto

12. ● Prepis RNA v komplementarno DNA (cDNA)
● encim: reverzna transkriptaza - imajo jo retrovirusi
● cDNA:
● brez intronov
● enojna veriga (ss)
● lahko jo pomnožimo s PCR
MATERIALI:
● komplet »High Capacity cDNA Reverse
Transcription«
● izolirana celokupna RNA embrijev cebric
(Danio rerio), do 2 µg
● rokavice
● pincete
● etanol
● gorilniki
● mikrocentrifugirke
● avtomatske pipete in pipetni nastavki
● ciklični termostat
2. dan: Reverzna transkripcija RNA v cDNA

13. Shema RT RNA v cDNA:
1x 25 °C 10 min
37 °C 20 min
2 x 37 °C 20 min
37 °C 20 min
1x 85 °C 5 min
1x 4 °C ∞
1. 4,2 µl H2O brez nukleaz
2. 2,0 µl 10 × pufra RT
3. 0,8 µl 25 × zmesi
dNTPjev (100 mM)
4. 2,0 µl 10 × RT-naključnih
začetnih oligonukleotidov
5. 1,0 µl reverzne
transkriptaze »MultiScribe«
dobro premešamo 10 µl 2 × RT-zmesi
10 µl izolirane RNA
(do 2 g RNA)
premešaj s pipetiranjem
na kratko
pocentrifugiraj
ciklični termostatreverzna transkriptazassDNA

14. ● PCR - verižna reakcija s polimerazo oz.
“Polymerase chain reaction”
● za eksponentno pomnoževanje segmentov DNA
● nujno poznati vsaj del zaporedja - začetni
oligonukleotidi
● Taq-polimeraza - iz Thermus aquaticus
● cikel korakov pri različnih T
PCR cDNA embrijev cebric

15. ● rokavice
● pincete
● etanol
● gorilniki
● mikrocentrifugirke
● avtomatske pipete in pipetni nastavki
● ciklični termostat
Reakcijska mešanica:
● dH2
O
● pufer za Taq-polimerazo
● MgCl2
● dNTP
● začetni oligonukleotidi za ß aktin (bactin2-1 in bactin2-2)
● Taq-polimeraza
● vzorec cDNA iz RT
KONTROLI
● dH2
O + reakcijska zmes
● izolirana RNA + reakcijska zmes
Materiali:

16. Shema PCR cDNA:
1. 15,5 µl dH2O (MiliQ)
2. 2,5 µl 10 × pufra za Taq-polimerazo
3. 2,5 µl 25 mM MgCl2
4. 0,5 µl 10 mM dNTP
5. 0,5 µl 20 M začetnega
oligonukleotida bactin2-1
(5’-
GCAGAAGGAGATCACATCCCTGGC-
3')
6. 0,5 µl 20 M začetnega
oligonukleotida bactin2-2
(5’-CATTGCCGTCACCTTCACCGTTC-
3’)
7. 2,5 µl vzorca cDNA iz reverzne
transkripcije
8. 0,5 µl Taq-polimeraze (2,5 U/l)
1x ZAČETNA DENATURACIJA 94 °C 2 min denaturacija DNA vzorca
DENATURACIJA 94 °C 30 sec prekinitev procesa polimerizacije in dentauracija dsDNA v ssDNA
30
x
VEZAVA ZAČETNIH
OLIGONUKLEOTIDOV
64 °C 30 sec optimalna T za vezavo začetnih oligonukleotidov
PODALJŠEVANJE VERIGE DNA 72 °C 30 sec Taq-polimeraza sintetizira komplementarni verigi DNA
1x ZAKLJUČNO PODALJŠEVANJE 72 °C 7 min dokonča sintezo začetih produktov PCR
1x TERMINACIJA PODALJŠEVANJA 4 °C ∞ konec PCR
odpipetiraj v vrstnem redu v mikrocentrifugirko za PCR: ciklični termostat PCR dsDNA PCR ssDNA
začetna denaturacija
30 ciklov sestavljenih iz 3 fazzaključno podaljševanjeterminacija

17. 3. dan: Priprava agaroznega gela in gelska
elektroforeza
MATERIALI:
● 0,5 x TBE pufer
● agaroza
● etidijev bromid (10 mg/mL)
● nanašalno barvilo
● standard (1-kb)
● rokavice
● avtomatske pipete in nastavki
● erlenmajerica
● mikrovalovna pečica
● nosilec za gel in glavniki
● elektroforetska banjica
● vzorci cDNA iz PCR reakcije
● kontroli iz PCR reakcije:
● reakcijska zmes + dH2
O
● izolirana RNA (DNA) + reakcijska zmes

18. Shema priprave agaroznega gela in gelske elektroforeze:
30 ml 0,5 x TBE
0,3 g agaroze
segrevamo dokler se agaroza ne raztopi ohladimo na 60 °C
dodamo 1,3 µl
etidijevega bromida
vsebino premešamo, zlijemo na
uravnan nosilec za gel, dodamo
glavnik in počakamo da polimerizira
vzorec iz PCR
prelijemo z 0,5 x TBE
iz polimeriziranega gela
odstranimo glavnika in
prestavimo v banjico
dodamo nanašalni pufer
v vsako jamico nanesemo
10 µl mešanice
banjico pokrijemo in priključimo na 120 V. Po
končani elektroforezi rezultat preverimo pod UV.

19. REZULTATI
VZORCI
ŠTEVILO
EMBRIJEV OD 260
OD 280
RNA(ng/µL) ČISTOST
1. 4 0,0102 0,0051 45 2
2. 3 0,0085 0,0072 37 1,2
3. 3 0,0056 0,0036 25 1,6
4. 5 0,0081 0,0048 35 1,7
5. 3 0,0132 0,0104 58 1,3
6. 5 0,0230 0,0168 101 1,4
7. 4 0,0065 0,0050 29 1,27
8. 6 0,0084 0,0050 37 1,68
Tabela 1: Izolacija RNA iz embrijev cebric. Kocentracija in čistost RNA v vzorcu
(spektrofotometrična metoda).

22. Iz rezultatov, ki so pridobljeni spektrofotometrično in računsko
(koncentracija RNA in čistost) je razvidno;
● vse skupine so izolirale nukleinske kisline
● povprečna količina izolirane RNA = 45,87ng/µl
● povprečna čistost RNA = 1,52 (kar je izven optimalnega razpona
1,9-2,1 )
● v izolatu so tudi nečistoče (proteini)
Iz spektrofotometričnega določanja čistosti RNA je razvidno, da
večina naših vzorcev ne dosega dovolj visoke vrednosti kar bi v
nadaljevanju lahko motilo proces reverzne transkripcije in PCR.
DISKUSIJA

23. DISKUSIJA
● Dobili smo samo en fragment enake dolžine pri večini vzorcev,
za katerega predvidevamo, da je DNA, cDNA pa ni prisotna.
● Morala bi se opaziti dva fragmenta, če bi imeli v vzorcih poleg
DNA tudi cDNA.
● Mogoči razlogi:
● prisotnost RNAz zaradi nepravilnega rokovanja
● napaka pri reverzni transkripciji ali PCR reakciji, ko smo
pomnoževali cDNA