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Ethanol Exposure Alters Protein Expression in a Mouse Model of

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  • 1. Ethanol Exposure Alters Protein Expression in a Mouse Model ofFetal Alcohol Spectrum Disorders Stephen Mason Bruce Anthony Natalia Zapata Zuluaga Steven Olaya Ramírez Tercer Semestre Medicina Universidad Pontificia Bolivariana
  • 2. INTRODUCTION• Ethanol: Ethanol is the systematic name defined by the IUPAC nomenclature of organic chemistry for a molecule with two carbon atoms (prefix "eth-"), having a single bond between them (suffix "-ane"), and an attached -OH group (suffix "-ol"). Ethanol is produced both as a petrochemical, through the hydration of ethylene and, via biological processes, by fermenting sugars with yeast.
  • 3. INTRODUCTION• Animal model (The Mouse): The Mice (Mus Musculus) are the perfect animal model for this research for some reasons: primarily because they are mammals, and also because they share a high degree of homology with humans, and virtually all mouse genes have human homologs. Mice are small, inexpensive, easily maintained, and can reproduce quickly; several generations of mice can be observed in a relatively short period of time. Mice have the same organs in the same places than humans, just different proportions.
  • 4. INTRODUCTIONDisorders with alcohol (Ethanol):• Alcohol exposure during development can result in variable growth retardation and facial dysmorphology known as fetal alcohol spectrum disorders (FASD).• Aberrant changes in gene expression and in the epigenome of embryos.• The teratology induced in the embryos is expressed in the neurulation process.• Alteration of proteins with roles in cellular function, cell cycle, and the ubiquitin- proteasome pathway was induced by alcohol.• Researchers have found aberrant DNA methylation results in the misexpression of neurospecification genes Ngn and Sox5.
  • 5. INTRODUCTION• Relationship about all This research was made about the disorders that ethanol can cause in the development of the embryo. Because the components of ethanol, this can be dangerous to the genome of the embryo by causes such as DNA methylation and the shackles of neurogenesis, to study the above, an animal model was selected that met certain characteristics mentioned above, the mouse (mus musculus) is a specimen easy to handle and gives very good results for such projects.
  • 6. OVERALL OBJECTIVE• Recognize the obvious and not obvious alterations phenotypically that ethanol can cause in embryogenesis (especially FASD) to certain proteins using different tests to analyze and compare proteic features; in addition to confirm the alterations already nominated and hypotheses proposed by other researchers.
  • 7. MATERIALES Y MÉTODOSCultivo Embrionario• El útero grávido se separó y se colocó en un buffer que contiene solución salina (PBS) a 37°C.• Tres embriones que llevan de 3 a 6 somitas fueron colocados en un frasco de cultivo (20 ml) conteniendo el cultivo medio.• Después del período de precultivo (2-4 horas; máximo, 4 horas), la exposición al alcohol se inició mediante la transferencia de los embriones en el medio que contiene 6 μl/ml de 95% etanol (aproximadamente 400 mg / dl).• La concentración de etanol en 24h fue medida en 0, 12 y 22h.
  • 8. MATERIALES Y MÉTODOS Análisis Gel 2D• Permite la separación de cientos o miles de proteínas (“spots”) en un único gel, mostrando un patrón característico.• Se provoca la desnaturalización de las proteínas por ruptura de puentes de hidrógeno y disulfuro.• Isoelectroenfoque Punto Isoeléctrico, pH.• Peso Molecular Electroforesis en gel de acrilamida con SDS.• Coloración con Coomasie Blue.• Evaluación de Imágenes.
  • 9. MATERIALES Y MÉTODOS Ingenuity Pathways Analysis (IPA)• IPA se basa en redes basadas en la información extraída de la literatura científica y se deposita en el Ingenuity Knowledge Base. IPA proporciona una evaluación de la señalización y las rutas metabólicas, redes moleculares y procesos biológicos que están más significativamente perturbados en la condición experimental.
  • 10. MATERIALES Y MÉTODOS Western Blot• Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular en este caso. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (nitrocelulosa) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella. Finalmente, se detecta la unión antígeno- anticuerpo por actividad enzimática o fluorescencia.
  • 11. MATERIALES Y MÉTODOS Análisis Inmunohistoquímico• En este análisis las muestras de tejido se seccionan en pequeñísimas partes (en este caso de 40 micras). Todas las secciones se lavan con PBS y se incuban en peróxido de hidrógeno, además de los anticuerpos 1 para las proteínas a evaluar. Luego se incuban con anticuerpos 2, seguido por un complejo de peroxidasa; se deben lavar las muestras con PBS entre las incubaciones 1 y 2. En el caso de esta investigación, se dio una coloración marrón producida por una solución añadida que reveló la actividad peroxidasa.• La aplicación directa de anticuerpos sobre secciones tisulares permite la localización microanatómica de su expresión y su correlación con los parámetros morfológicos.
  • 12. RESULTADOS Retardo del crecimiento embrionario y anormalidades.Solo los embriones cultivados que mantuvieron activos los latidos del corazón y lacirculación activa (95%) fueron utilizados para los análisis.En los embriones que se encontraron expuestos al alcohol, se observo un cambio grandeen su desarrollo, en comparación con los embriones de control.- Retraso en el crecimiento- Anomalías del cerebro- Anomalías en el corazón- Defectos del tubo neural- Ojos pequeños- Morfología anormal- Cola sin giro- Reducido sistema vascular
  • 13. Figura 1: El alcohol inducida dismorfología deldesarrollo embrionario.-FB: Cerebro anterior-MB: Cerebro medio-HB: Romboencéfalo-H: Anomalías del corazón-Flechas negras: Ojos pequeños encomparación con el de la derecha.-Menor coloración roja: Reducido sistemavascular-Alcohol-NTC: Tubo neural cerrado pero conretrazo en el desarrollo- Alcohol-NTO: Tubo neural abierto(Flechas Rojas)
  • 14. Análisis en gel 2DSe muestran las proteínas y los genes implicados en laproliferación, diferenciación, apoptosis, el crecimiento deltejido, remodelación, crecimiento neuronal y supervivencia, que sufrieroncambios a causa de la exposición al alcohol.-El número total de puntos de gel detectado fueron 2.050. Cuarenta puntos degel con un peso significativo (P < 0,01)-De los restantes 32 puntos, 24 fueron downregulated y 8 upregulated en losembriones expuestos a alcohol.-Para dar prioridad a el estudio, sólo los puntos con una parte muy significativa(p < 0,007) fueron seleccionados para análisis. - 5 upregulated y 4 downregulated se les aplico LC-MS/MS (cromatografíalíquida acoplada a la espectrometría de masas) para evaluar la toxicidadcausada por el tratamiento con alcohol.
  • 15. En la siguiente tabla se muestran las proteínas expresadas a partir del análisis 2D, están agrupadas en up- or downregulated.
  • 16. Nueve proteínas con unaexpresión diferente debido altratamiento con alcohol sedestacan con una "x" blancay están marcados con elnombre de los genes.
  • 17. Análisis de Western BlotTécnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestramediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterioque se desee y posteriormente se buscan con anticuerpos específicos para ella.Las proteínas que marcaron un upregulation fueron:- Serotransferrina (Tf) ( Transporte de hierro)- Triosa fosfato isomerasa (TPI1) ( Implicada en la glucolisis )Las proteínas que marcaron downregulation fueron:- Proteína de unión 1 (Pcbp1)- Ubiquitina-conjugación (Ube2N) ( dirige el reciclaje de proteínas )Pero estas ultimas no fueron estadísticamente significativas.
  • 18. En esta grafica se comprueba que la serotransferrina (Tf) y triosa fosfato isomerasa(TPI1) tuvieron un upregulation significativo (P ≤ 0,05), mientras que la proteína deunión 1 (Pcbp1) y la ubiquitina-conjugación (Ube2N) tuvieron un downregulationpero no muy significativo.
  • 19. InmunohistoquímicaLa inmunohistoquímica (IHQ) es un estudio histopatológico utilizado parademostrar la presencia o no de un determinado antígeno (Ag) en una muestra detejido.Este estudio nos permite identificar con exactitud los tipos celulares presentes enuna muestra, ya que existen multitud de Ag diferentes que son característicos dedistintas líneas de diferenciación y funcionalismo celular.La IHQ se basa en la utilización de anticuerpos (Ac) específicos frente al Ag cuyapresencia se quiere probar, y los cuales, los Ac, han sido previamente marcado.Los genes que expresaron upregulation fueron:-Tf : El cual esta localizado en el corazón, los arcos branquiales y somitasde los embriones tratados con alcohol.-Tpi1 : Se incrementó de manera difusa.
  • 20. Análisis de Ingenuity PathwaysLas nueve proteínas identificadas por LC-MS/MS (cromatografíalíquida acoplada a la espectrometría de masas) se presentaron a la API paraevaluar los cambios biológicos causados por la exposición al alcohol.El mayor reporte de cambios en ciclos se dio en : el ciclo celular, muerte celular,la expresión de genes y el desarrollo del aparato reproductor.El mayor reporte de cambios en las funciones biológicas se dio en: el ciclocelular, señalización celular, la función celular, el mantenimiento de lahematopoyesis, y el tráfico de células inmunes.El mayor reporte de cambio en las vías principales se dio en: la endocitosismedida por clatrina y clathrin endocitosis mediada por la señalización y la víaproteasomal ( Encargada de degradar proteínas innecesarias por proteólisis)
  • 21. DISCUSSION
  • 22. I agree Author What does he/she said Yes No Y. Liu The effects on protein regulation may parallel the growth x delay and developmental abnormalities including brain, neural tube, eye, heart, blood cells, and embryonic vascularization.Y. Peng, B. M. Altura, The transcription factor NF- κB (Tumor necrosis Fractor) x M. J. Druse, P. protects cells against DNA damage-induced cell death Mandrekar and may play a role in the immune response. Alcohol differentially regulates NF-κB activity in various tissues Ethanol activates NF-κB in cerebral vascular muscle cells, in contrast, ethanol diminishes NF-κB target gene expression in fetal rhombencephalic neurons via a 5- HT(1A) (serotonin) mediated pathway [42]. Ethanol also interferes with inflammatory cytokine production by downregulating NF-κB in monocytes, resulting in impaired immunity
  • 23. I agree Author What does he/she said Yes NoD. R. Armant and D. Ethanol can induce release of intracellular calcium that x E. Saunders. stimulates the cell cycle and the expression of Myc proteins associated with cell proliferation. Increased proliferation is advantageous during reimplantation, but ethanol interference with terminal differentiation during organogenesis may underlie alcohol teratogenicityJ. R. Connor, T. D. Tran Tf transports iron from tissue sites of absorption to sites of x et al. storage or utilization and has a role in stimulating cell proliferation . Because iron is an essential cofactor in neurotransmitter synthesis and myelination, maternal iron status is an important modulator of fetal alcohol-induced neurobehavioral damage
  • 24. CONCLUSIONS As alcohol affects the embryos of mice, can also affect human embryos, causingdamage to the genome. Alcohol is a major cause of methylation of DNA and proteins responsible for the cellcycle regulation, one of the leading causes of mutation. The different tests that were performed for proteins, were essential to compareembryos exposed to ethanol and the controls, to so identify the alterations. In embryo culture is very important to take good care to pregnant mice, both at thetime to care it, and at the time of removal off the embryo, so that it can make a goodtesting.
  • 25. Natalia Zapata Zuluaga
  • 26. Steven Olaya Ramírez

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