Your SlideShare is downloading. ×
0
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Thanks for flagging this SlideShare!

Oops! An error has occurred.

×
Saving this for later? Get the SlideShare app to save on your phone or tablet. Read anywhere, anytime – even offline.
Text the download link to your phone
Standard text messaging rates apply

Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)

5,883

Published on

Published in: Education
0 Comments
2 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total Views
5,883
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
91
Comments
0
Likes
2
Embeds 0
No embeds

Report content
Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
No notes for slide

Transcript

  • 1. Universidad de La Serena Facultad de Ciencias Departamento de Biología Laboratorio Bioquímica General Ingeniería en Alimentos Alumna: Natalia Vargas Guzmán Profesora: Carla Maturana Valdivia I Semestre 2013
  • 2. La concentración de sustrato determina la actividad enzimática medida como la velocidad de la catálisis enzimática. Si la concentración de la enzima se mantiene saturada, la producción de producto será a una velocidad máxima.
  • 3. Gráfica Michaelis-Menten: Ecuación Michaelis-Menten:
  • 4. Gráfica Lineweaver-Burk: Ecuación Lineweaver-Burk:
  • 5. Gráfica Eadie-Hofstee: Ecuación Eadie-Hofstee:
  • 6. Gráfica Hanes-Woolf: Ecuación Hanes-Woolf:
  • 7. Velocidad de reacción enzimática Inhibidores Irreversible Reversible Competitiva No competitiva Acompetitiva Activadores La forma de representar la inhibición gráficamente es con la doble reciproca
  • 8. En la inhibición competitiva, el inhibidor compite con el sustrato por el sitio activo. Km Aument a Vmax Constant e
  • 9. En la inhibición no competitiva el inhibidor se une a la enzima en otro lado, no es su sitio activo Km Vmax Constant e Disminuy e
  • 10. En la inhibición acompetitiva el inhibidor se une al complejo enzima-sustrato ya conformado. Cambio proporcional en Km y Vmax
  • 11. Objetivos: - Estudiar la influencia de la concentración de sustrato en la velocidad de una reacción enzimática. - Calcular la constante de Michaelis-Menten. Fundamento: Determinar de la actividad enzimática de una preparación de β-fructofuranosidasa en presencia de diferentes concentraciones de sacarosa como sustrato.
  • 12. Materiales: • 8 tubos de ensayo • Pipeta • Baño termorregulador a 27°C • Espectrofotómetro • 8 Cubetas de espectrofotómetro Reactivos: • Solución Glucosa-Fructosa 0,01M • Soluciones de sacarosa (distintas concentraciones) • Reactivo DNS (inhibe o detiene la act. Enzimática) • Buffer acetato • Solución extracto de β-fructofuranosidasa con una dilución que asegure un producto 5 moles/min.
  • 13. Procedimientos: 1. Disponer serie de 6 tubos de ensayo con concentración creciente de sacarosa. 2. Luego agregar : - 1,5 mL Buffer acetato - 0,5 mL solución enzima 1/2000. 3. Equilibrar a 27°C por 3 minutos (Agregar sacarosa 1 mL). 4. Dejar en baño a 27°C por 40 minutos. 5. Agregar 2 mL de DNS, enfriar. 6. Agregar 15 mL de Agua destilada 7. Medir absorbancia (540nm).
  • 14. Resultados y Conclusiones Para calcular la concentración de glucosa usaremos la ecuación de la recta obtenida por la curva de calibración: y = 0,183x - 0,0085 r² = 0,9992 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Absorbanciaa540nm Concentración Glucosa (mM) Curva de calibración Glucosa-Fructosa por el Método DNS Abs =0,183 [Glucosa]-0,0085 [Glucosa] = Abs+0,0085 0,183
  • 15. Abs =0,183 [Glucosa]-0,0085 [Glucosa] = Abs+0,0085 0,183 Reemplazamos la absorbancia de cada tubo para calcular la concentración de glucosa. Calcular concentración de sacarosa en reacción para cada tubo: C1 x V1 = C2 x V2 Concentración del tubo 1: 0,45M x 1 mL = C2 x 3 mL C2 = 0,15 M Sacarosa en reacción Para calcular la velocidad de la reacción: V= [glucosa] tiempo de reacción: 40 minutos tiempo reacción
  • 16. Tabla: Valores obtenidos Tubo [sacarosa] M Absorbanci a [Sacarosa en reacción] M [Glucosa] Velocidad de reacción (M/min) 1 0,45 2,95 0,15 16,1 0,40 2 0,3 3,07 0,1 16,8 0,42 3 0,2 3,01 0,066 16,49 0,41 4 0,1 2,04 0,033 11,2 0,28 5 0,05 1,42 0,0166 7,8 0,19 6 0,03 1,14 0,01 6,27 0,15 P 0,45 0,57 0,15 3,17 0,079
  • 17. [sacarosa] M Velocidad de reacción (M/min) 0,45 0,40 0,3 0,42 0,2 0,41 0,1 0,28 0,05 0,19 0,03 0,15 Tabla datos gráfico Michaelis-Menten Vmax Km= Vmax 2 Vmax = 0,21 (M/min) 2 Km = 0,02 M
  • 18. 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 Velocidad(M/min) Concentración sacarosa (M) Grafico Michaelis-Menten: Influencia de la concentración de sacarosa sobre la velocidad de reacción catalizada por la -fructofuranosidasa Km Vmax Vmax 2
  • 19. y = 0,0484x + 2,0082 R² = 0,9818 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 20 40 60 80 100 120 1/v(M/min) 1/[S] (M) Grafico Lineweaver-Burk: Influencia de la concentración de sacarosa sobre la velocidad de reacción catalizada por la -fructofuranosidasa
  • 20. 1/s 1/v 6,67 2,5 10 2,38 15,15 2,44 30,30 3,57 60,24 5,26 100 6,67 Tabla datos gráfico Lineweaver-Burk y = 0,0484x + 2,0082 1 = 2,0082 (M/min) Vmax Km = 0,0484 Vmax Vmax = 0,4979 (M/min) 1 = 41,49 (M) Km Km = 0,0241 (M)
  • 21. v/s v 2,67 0,4 4,2 0,42 6,21 0,41 8,48 0,28 11,45 0,19 15 0,15 Tabla datos gráfico Eadie-Hofstee: y = -0,0245x + 0,5043 Km = 0,0245 (M) Vmax = 0,5043 (M/min)
  • 22. Grafico Vmax (M/min) Km (M) Michaelis-Menten 0,42 0,02 Lineweaver-Burk 0,49 0,024 Eadie-Hofstee 0,50 0,024 Observamos que los resultados obtenidos son muy similares, gracias a los diferentes gráficos podemos calcular la actividad enzimática y su valores de Km y Vmax. A mi parecer el gráfico mas eficiente es el de Lineweaver-Burk ya que la actividad enzimática representada de forma lineal facilita los cálculos.
  • 23. Objetivos: - Estudiar la acción de inhibidores no competitivos sobre la velocidad de una reacción enzimática. Fundamento: Determinar la velocidad de la hidrólisis de sacarosa a diferentes concentraciones por la β- fructofuranosidasa en presencia de una concentración constante de yodo acetato.
  • 24. Materiales: • 14 tubos de ensayo • Pipeta Reactivos: • Yodo acetato 0,001M • Solución de Glucosa - Fructosa 0,01M • Solución de sacarosa a diferentes concentraciones • Reactivo DNS (inhibe o detiene la actividad enzimática) • Buffer acetato pH=4,7 0,05 M • Solución extracto β-fructofuranosidasa
  • 25. Procedimientos: Luego agregar: - 1 mL Buffer acetato Equilibrar a 27°C por 3 minutos. Agregar 0,5 mL solución enzima 1/250. Dejar en baño a 27°C por 5 minutos. Agregar 2 mL de DNS a 100°C por 5 minutos (enfriar). Agregar 15 mL de Agua destilada Medir absorbancia (540nm). Con inhibidor Sin inhibidor
  • 26. Abs =0,183 [Glucosa]-0,0085 [Glucosa] = Abs+0,0085 0,183 Reemplazamos la absorbancia de cada tubo para calcular la concentración de glucosa. Calcular concentración de sacarosa en reacción para cada tubo: C1 x V1 = C2 x V2 Concentración del tubo 1: 0,45M x 1 mL = C2 x 3 mL C2 = 0,15 M Sacarosa en reacción Para calcular la velocidad de la reacción: V= [glucosa] tiempo de reacción: 40 minutos tiempo reacción Resultados y Conclusiones Haremos los mismos procedimientos pero ahora calcularemos velocidad con y sin inhibidor
  • 27. Tabla valores obtenidos SIN INHIBIDOR CON INHIBIDOR Tubo [sacarosa]M [Sacaros a en reacción ] M Abs [Glucosa ] M Velocida d (M/min) Abs [Glucos a] M Velocida d (M/min) 1 0,45 0,15 2,46 13,51 2,70 2,95 9,85 1,97 2 0,3 0,1 2,05 11,25 2,25 3,07 8,10 1,62 3 0,2 0,066 1,67 9,19 1,83 3,01 6,88 1,37 4 0,1 0,033 0,87 4,77 0,95 2,04 4,67 0,93 5 0,05 0,0166 0,56 3,10 0,62 1,42 3,12 0,62 6 0,03 0,01 0,45 2,48 0,49 1,14 2,30 0,46
  • 28. [Sacarosa] M Velocidad C.I. M/min 0,15 1,97 0,1 1,62 0,066 1,37 0,033 0,93 0,0166 0,62 0,01 0,46 [Sacarosa] M Velocidad S.I. M/min 0,15 2,70 0,1 2,25 0,066 1,83 0,033 0,95 0,0166 0,62 0,01 0,49 Tablas para gráfico Michaelis-Menten
  • 29. CON INHIBIDORSIN INHIBIDOR Vmax = 2,7 (M/min) Vmax = 1,35 (M/min) 2 Km = 0,04 (M) Vmax = 1,97 (M/min) Vmax = 0,985 (M/min) 2 Km = 0,028 (M) Vmax = Km 2
  • 30. 1/[S] M 1/v S.I. (M/min) 6,67 0,507 10 0,617 16,67 0,729 33,33 1,075 62,5 1,613 100 2,174 1/[S] M 1/v C.I. (M/min) 6,67 0,370 10 0,444 16,67 0,546 33,33 1,052 62,5 1,612 100 2,040 Tablas para gráfico Lineweaver-Burk
  • 31. SIN INHIBIDOR CON INHIBIDOR Km = 0,0186 Vmax 1 = 0,3016 (M/min) Vmax 1 x 1 = 1 Vmax 0,0186 Km 1 = 16,21 (M) Km Km = 0,0178 Vmax 1 = 0,4385 (M/min) Vmax 1 x 1 = 1 Vmax 0,0178 Km 1 = 24,63 (M) Km
  • 32. Gráfico Michaelis-Menten: Vmax (M/min) Km (M) Sin inhibidor 2,70 0,040 Con inhibidor 1,97 0,028 Observamos que en presencia del Inhibidor yodo acetato , la Vmax y Km disminuye. Estamos en presencia de un inhibidor acompetitivo ya que el resultado es un cambio proporcional en la Vmax y Km Gráfico Lineweaver-Burk: Vmax (M/min) Km (M) Sin inhibidor 3,32 0,061 Con inhibidor 2,28 0,040

×