Ntc4458 rto coliformes y e. coli

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Ntc4458 rto coliformes y e. coli

  1. 1. NORMA TÉCNICA NTCCOLOMBIANA 4458 2007-12-12MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOSPARA ANIMALES.MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DECOLIFORMES O Escherichia coli O AMBOS. TÉCNICADE RECUENTO DE COLONIAS UTILIZANDO MEDIOSFLUOROGÉNICOS O CROMOGÉNICOSE: MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING STUFFS. HORIZONTAL METHOD FOR THE ENUMERATION OF COLIFORMS AND/OR ESCHERICHIA COLI. COLONY COUNT TECHNIQUE USING FLUOROGENIC OR CHROMOGENIC CULTURE MEDIA.CORRESPONDENCIA:DESCRIPTORES: método horizontal; método de análisis; microbiología; análisis microbiológico; recuento; recuento en placa; escherichia coli; coliformes; alimentación animal.I.C.S.: 07.100.30Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435Prohibida su reproducción Primera actualización Editada 2007-12-21
  2. 2. PRÓLOGOEl Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismonacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamentalpara brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con elsector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas enlos mercados interno y externo.La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnicaestá garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este últimocaracterizado por la participación del público en general.La NTC 4458 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2007-12-12.Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda entodo momento a las necesidades y exigencias actuales.A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma através de su participación en el Comité Técnico 25 Microbiología.ACEGRASAS S.A. JHONSON DIVERSEY COLOMBIA LTDA.ALIMENTOS POLAR COLOMBIA S.A. KOYOMAD S.A.ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A. LA CAMPIÑA S.A.ANNAR DIAGNOSTICA IMPORT LTDA. LABCONTROL E.U.ARCHIVO DE BOGOTÁ LABFARVE LABORATORIO DEASBIOQUIM LTDA. FARMACOLOGÍA VEGETALASEBIOL LABORATORIO LTDA. LABORATORIO DE GENÉTICA YASINAL LTDA. BIOLOGÍA MOLECULARASOCIACIÓN COLOMBIANA DE CIENCIA Y LABORATORIO EMICAL LTDA.TECNOLOGÍA COSMÉTICA -ACCYTEC- LABORATORIOS GRAM LTDA.ASOCIACIÓN DE MICROBIÓLOGOS LABORATORIOS MICROLAB LTDA.JAVERIANOS LESNIAK E.U.AVESCO KOKORICO S.A. MERCADEO DE ALIMENTOS DEBIANALISIS COLOMBIA S.A.BIOCONTROL LTDA. MERCK S.A.BIOMERIEUX COLOMBIA S.A. MICROBIÓLOGOS ASOCIADOS LTDA.BIOQUILAB LTDA. NULAB LTDA.CALIDAD INDUSTRIAL LTDA. PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOSCARULLA VIVERO S.A. LTDA.COLOMBINA S.A. QUIK LTDA.COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. SOLUCIONES INTEGRALESCREPES & WAFLES S.A. MICROBIOLÓGICAS E.U. -SIM-DON MAÍZ S.A. SUIZO S.A.ENZIPÁN DE COLOMBIA LTDA. UNIVERSIDAD DE LOS ANDESFRIGORÍFICOS COLOMBIANOS S.A. UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁNFRIGORÍFICOS GUADALUPE S.A. UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIAIVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.
  3. 3. Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de lassiguientes empresas:3M COLOMBIA S.A. LA CONSTANCIA COLOMBIA S.A.ALGARRA S.A. LABORATORIO MICROBIOLÓGICO SISAQUALAB LABORATOTORIO MICROBIOLÓGICO DEASOCIACIÓN COLOMBIANA DE BARRANQUILLAMICROBIOLOGÍA LARKIN LTDA.BAVARIA S.A. LEVAPÁN S.A.BIOTRENDS LABORATORIOS LLOREDA GRASAS S.A.CASA LUKER S.A. MEDIIMPLANTES LTDA.CENICAÑA MICROLABY LTDA.CENTROAGUAS S.A. E.S.P. MINISTERIO DE LA PROTECCIÓNCERCAL LTDA. SOCIAL.CERVECERÍA LEONA S.A. NESTLÉ DE COLOMBIA S.A.CONGELAGRO PASIFLORA COLOMBIANA S.A.CONSULTORA BLANCA USECHE PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANACOOPERATIVA DE GANADEROS DE PRODUCTORA DE CONCENTRADOS YCARTAGENA LTDA. JUGOS DE FRUTADU PONT QUALICON COLOMBIA S.A. QUALA S.A.EMPRESA DE ACUEDUCTO Y QUIOS LTDA.ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ REPRESENTACIONESFABRICA DE ESPECIAS Y BIOTECNOLÓGICAS LTDA.CONDIMENTOS EL REY S.A. RICA RONDO, INDUSTRIA NACIONAL DEFRUGAL S.A. ALIMENTOS S.A.HOSPITAL DEPARTAMENTAL DE SCHERING COLOMBIANA S.A.VILLAVICENCIO SECRETARÍA DISTRITAL DE SALUD DEINGENIO PICHICHI S.A. BOGOTÁINGENIO RIOPAILA TECNIMICRO LABORATORIO DEINSTITUTO COLOMBIANO ANÁLISISAGROPECUARIO ICA UNIVERSIDAD CATÓLICA INGECALINSTITUTO NACIONAL DE SALUD -INS VIKINGOS S.A.INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIADE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS -INVIMA-ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesadosnormas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados. DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
  4. 4. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización) CONTENIDO Página1. OBJETO .......................................................................................................................12. REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................13. TÉRMINOS Y DEFINICIONES .....................................................................................24. PRINCIPIO....................................................................................................................24.1 BACTERIAS COLIFORMES FRENTE A UN MEDIO CROMOGÉNICO .....................24.2 Escherichia coli FRENTE A UN MEDIO FLUOROGÉNICO .....................................24.3 Escherichia coli FRENTE A UN MEDIO TRIPTONA BILIS X-GLUCORÓNIDO .......34.4 GENERALIDADES .......................................................................................................35. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTE .......................................................................35.1 GENERALIDADES ......................................................................................................35.2 DILUYENTE..................................................................................................................35.3 MEDIO SELECTIVO SÓLIDO: AGAR - LACTOSA - BILIS - ROJO NEUTRO - CRISTAL VIOLETA, VRBL - PARA COLIFORMES....................................................35.4 MEDIO SELECTIVO SÓLIDO: AGAR-LACTOSA-BILIS-ROJO NEUTRO-CRISTAL VIOLETA, + MUG – PARA COLIFORMES Y E COLI.................45.5 MEDIO SELECTIVO SÓLIDO: AGAR CON TRIPTONA BILIS X GLUCORÓNIDO ...56. EQUIPO Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO…………………………...66.1 APARATO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN EN HÚMEDO (AUTOCLAVE) ......................................................................................66.2 INCUBADORA..............................................................................................................6
  5. 5. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización) Página6.3 CAJAS DE PETRI .......................................................................................................66.4 PIPETAS DE SUMINISTRO TOTAL O MICROPIPETAS ............................................66.5 BAÑO DE MARÍA ........................................................................................................66.6 EQUIPO DE RECUENTO DE COLONIAS ...................................................................66.7 MEDIDOR DE pH .........................................................................................................67. MUESTREO..................................................................................................................68. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO.......................................................69. PROCEDIMIENTO........................................................................................................79.1 SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES ......................................................................79.2 INOCULACIÓN E INCUBACIÓN .................................................................................79.3 RECUENTO DE LAS COLONIAS................................................................................710. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS ........................................................................810.1 Escherichia coli - MEDIO FLUOROGÉNICO .............................................................810.2 Escherichia coli – MEDIO CROMOGÉNICO ..............................................................810.3 Escherichia coli – MEDIO AGAR CON TRIPTONA BILIS X GLUCORÓNIDO 5-BROMO-4-CLORO-3-INDOLIL-D-GLUCURONIDO .................811. MÉTODO DE CÁLCULO..............................................................................................811.1 CASO GENERAL .........................................................................................................811.2 CASO EN EL QUE CADA CAJA CONTIENE MENOS DE 15 COLONIAS CARACTERÍSTICAS....................................................................................................911.3 ESTIMACIÓN DE NÚMEROS PEQUEÑOS……………………………………………….911.4 COLONIAS NO CARACTERÍSTICAS .......................................................................10
  6. 6. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización) Página12. PRECISIÓN ................................................................................................................1012.1 CAJAS QUE CONTENGAN ENTRE 15 Y 150 COLONIAS CARACTERÍSTICAS..................................................................................................1012.2 CADA CAJA CONTIENE MENOS DE 15 COLONIAS CARACTERÍSTICAS ...........1013. INFORME DEL ENSAYO ...........................................................................................10ANEXOSANEXO A (Normativo)LÍMITES DE CONFIANZA PARA LA ESTIMACIÓN DE NÚMEROS PEQUEÑOSDE COLONIAS.......................................................................................................................11ANEXO B (Informativo)BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................12
  7. 7. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES.MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE COLIFORMESO Escherichia coli O AMBOS. TÉCNICA DE RECUENTO DE COLONIASUTILIZANDO MEDIOS FLUOROGÉNICOS O CROMOGÉNICOS1. OBJETOEsta norma da directrices generales de un método horizontal para el recuento de coliformes,Escherichia coli, o ambos, presentes en productos destinados al consumo humano oalimentación de animales, por medio de la técnica de recuento de colonias en un medio sólidocromogénico o fluorogénico después de su incubación a 35 °C ± 1 °C.NOTA Esta norma no aplica para la detección de E. coli H7 O157 (véase la NTC 4899).2. REFERENCIAS NORMATIVASLos siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicación deeste documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada.Para referencias no fechadas, se aplica la última edición del documento normativo referenciado(incluida cualquier corrección).NTC 4206, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas Generales paralos análisis microbiológicos (ISO 7218).NTC 4491-1, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Preparación de muestraspara ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para análisis microbiológico. Parte 1.Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y de diluciones decimales.NTC 4491-2, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Preparación de muestraspara ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para análisis microbiológico. Parte 2.Reglas específicas para la preparación de carne y productos cárnicos.NTC 4491-3, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Preparación de muestraspara ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para análisis microbiológico. Parte 3.Reglas específicas para la preparación de pescado y productos de la pesca.NTC 4491-4, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Preparación de muestraspara ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para análisis microbiológico. Parte 4.Reglas específicas para la preparación de productos diferentes de leche, productos lácteos,carne, productos cárnicos, pescados y productos de la pesca. 1 de 12
  8. 8. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)3. TÉRMINOS Y DEFINICIONESPara los propósitos de esta norma se aplican las siguientes definiciones:3.1 Coliformes. Grupo de bacterias que presentan ciertas características bioquímicas encomún e importancia relevante como indicadores de contaminación del agua y los alimentos.Se encuentran comúnmente en las plantas, el suelo y los animales, incluyendo a los humanos.El grupo coliforme está conformado por los siguientes géneros tales como Escherichia,Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter.NOTA Se define como coliformes fecales, aquellos microorganismos que fermentan la lactosa a 44,5 °C - 45,5 °C,análisis que permite descartar a Enterobacter, puesto que ésta no crece a esa temperatura. Si se aplica este criteriocrecerán en el medio de cultivo principalmente E. coli (90 %) y algunas bacterias de los géneros Klebsiella yCitrobacter. La prueba de coliformes fecales positiva indica un 90 % de probabilidad de que el coliforme aislado seaE. coli. Sirven como indicadores de contaminación fecal.3.2 Escherichia coli. Bacilo corto gram negativo que forma parte de la flora normal deintestino de animales de sangre caliente. Es aerobio facultativo, de metabolismo fermentativo,O-Nitrofenli-β-D- galactopiranósido positivo y su crecimiento óptimo es a 37 °C. Algunas cepaspueden producir enterotoxinas y tiene otros factores de virulencia de colonización e invasiónpor lo cual pueden causar enfermedades diarreicas, así como infecciones urinarias ynosocomiales.4. PRINCIPIO4.1 BACTERIAS COLIFORMES FRENTE A UN MEDIO CROMOGÉNICOCuando se utiliza la técnica enzimática, el grupo coliforme se define como toda bacteria queposea la enzima β-D galactosidasa; la cual tiene la propiedad de actuar sobre el substratocromogénico, formado en la liberación del cromógeno.4.2 Escherichia coli FRENTE A UN MEDIO FLUOROGÉNICOCuando se utiliza la técnica enzimática, la Escherichia coli es definida, como toda bacteria queda respuesta positiva al grupo coliforme y posee además la enzima B-Glucoronidasa, la cualtiene la propiedad de abrir el substrato fluorogénico, resultando en la liberación del fluorógeno.Un substrato fluorogénico tal como 4-metil-umbeliferil-β-D-glucorónido (MUG) es utilizado paradetectar la enzima B-glucoronidasa la cual es producida por E. coli.La enzima B-glucoronidasa hidroliza el substrato y da un producto fluorescente cuando esrevelado bajo luz ultravioleta de onda larga (366 nm). La presencia de fluorescencia indica unaprueba positiva para E.coli.El medio de cultivo utilizado se basa en la tecnología del substrato definido, el cual empleanutrientes - indicadores que producen color, fluorescencia, o ambos, al ser metabolizados porlos microorganismos coliformes y E. coli; los cuales son detectados simultáneamente.El reactivo proporciona dos nutrientes-indicadores específicos: ONPG (O- nitrofenil -β-d-galactopiranósido) y MUG (4-metil-umbeliferil-β- d- glucorónido). Durante la metabolización deéstos nutrientes por la enzima Coliforme β-D galactosidasa y β- glucoronidasa de E. coli, seproduce un color amarillo (del ONPG) y fluorescencia (del MUG). Con lo cual queda confirmadala presencia de coliformes y de E. coli respectivamente. 2
  9. 9. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)NOTA Definiciones tomadas de la NTC 4772 coliformes en agua SM 9221F.4.3 Escherichia coli FRENTE A UN MEDIO TRIPTONA BILIS X-GLUCORÓNIDOLa presencia de la enzima β-D-glocoronidasa diferencia la E. coli de los otros coliformes. E. coliabsorbe el sustrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-glocorónido (X-β-D-glocorónido).La enzima β-glucoronidasa rompe los enlaces entre el 5-bromo-4-cloro-3-indolil cromóforo y elβ-D-glocorónido. Las colonias de E. coli se tornan de color verde azuloso.La flora acompañante de microorganismos gram positivos, es inhibida por el uso de salesbiliares y la incubación a una temperatura de 44 °C.4.4 GENERALIDADES4.4.1 Se realizan siembras utilizando un medio de cultivo selectivo y empleando una cantidadespecificada de la muestra de ensayo si el producto inicial es líquido, o una cantidadespecificada de una suspensión inicial en el caso de otros productos.Se realizan otras siembras en las mismas condiciones, usando diluciones decimales de lamuestra de ensayo o de la suspensión inicial.4.4.2 Se incuban las placas a 35 °C ± 1 °C durante 24 h.NOTA Para productos lácteos la incubación de los coliformes debe hacerse a 32 ± 1 °C durante 24 ± 2 h.4.4.3 Se calcula el número de coliformes y E. coli por mililitro o por gramo de muestra a partirdel número de colonias obtenido en las cajas seleccionadas (véase el numeral 10).5. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTE5.1 GENERALIDADESPara los procedimientos de laboratorio corrientes, véase la NTC 4206 (ISO 7218).5.2 DILUYENTEVéanse las normas NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3, NTC 4491-4 y la norma específicarelacionada con el producto sometido a análisis.5.3 MEDIO SELECTIVO SÓLIDO: AGAR - LACTOSA - BILIS - ROJO NEUTRO - CRISTAL VIOLETA, VRBL - PARA COLIFORMESNOTA Se utiliza el medio VRBL o cualquier otro similar preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.5.3.1 Composición del medio VRBLPeptona 7,0 gExtracto de levadura 3,0 gLactosa 10,0 gCloruro de sodio 5,0 g 3
  10. 10. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)Sales biliares 1,5 gRojo neutro 0,03 gCristal violeta 0,002 gAgar 12 g a 18 g 1Agua destilada o desionizada 1 000 ml5.3.2 PreparaciónSe procede como se indica a continuación, para conservar la capacidad selectiva yespecificidad del medio.Se mezclan muy bien en agua, los componentes o el medio completo deshidratado, y sedejan reposar durante varios minutos. Se verifica el pH después del calentamiento, este debeser 7,4 ± 0,2 a 25 °C.Se permite que ebulla hasta su disolución y se enfría inmediatamente el medio en un baño demaría (véase el numeral 6.5) a 45 °C ± 1 °C.Verificar la preparación según las instrucciones del fabricante.En consecuencia, no se debe esterilizar en autoclave y se debe verificar la esterilidad delmedio en el momento de su uso (véase el numeral 9.2.2).El medio se debe usar dentro de un lapso máximo de 3 h desde el momento de su preparación.Verificar si hay evidencia que después de las tres horas se ven afectados los recuentos.5.4 MEDIO SELECTIVO SÓLIDO: AGAR-LACTOSA-BILIS-ROJO NEUTRO-CRISTAL VIOLETA, + MUG – PARA COLIFORMES Y E. coli5.4.1 Composición del medio VRBL + MUGPeptona 7,0 gExtracto de levadura 3,0 gLactosa 10,0 gCloruro de sodio 5,0 gSales biliares 1,5 gRojo neutro 0,03 gCristal violeta 0,002 g4 metilumbeliferil β-D glucorónido MUG 0,1 g1 De acuerdo con la resistencia del gel del agar. 4
  11. 11. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)Agar 12 g a 18 g 2Agua destilada o desionizada 1 000 ml5.4.2 PreparaciónSe procede como se indica a continuación, para conservar la capacidad selectiva yespecificidad del medio.Se mezclan muy bien en agua, los componentes o el medio completo deshidratado, y se dejanreposar durante varios minutos. Se verifica el pH después del calentamiento, este debe ser de7,4 ± 0.2 a 25 °C.Se permite que ebulla hasta su disolución y se enfría inmediatamente el medio en un baño demaría (véase el numeral 6.5) a 45 °C ± 1 °C.Se debe evitar el calentamiento excesivo del medio. En consecuencia, no se debe esterilizar enautoclave y se debe verificar la esterilidad del medio en el momento de su uso (véase elnumeral 9.2.2).El medio se debe usar dentro de un lapso máximo de 3 h desde el momento de su preparación.5.5 MEDIO SELECTIVO SÓLIDO: AGAR CON TRIPTONA BILIS X GLUCORÓNIDO5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-glucuronido5.5.1 Composición del medioPeptona 20,0 gSales biliares 1,5 gX B-D glucorónido 0,075 gAgar 15,0 gAgua destilada o desionizada 1 000 ml5.5.2 PreparaciónSe mezclan muy bien en agua, los componentes o el medio completo deshidratado, y sedejan reposar durante varios minutos. Se verifica el pH después del calentamiento, este debeser 7,4 ± 0,2 a 25 °C.Se permite que ebulla hasta su disolución y se enfría inmediatamente el medio en un baño demaría (véase el numeral 6.5) a 45 °C ± 2 °C.Autoclavar a 121 °C por 15 min o según las directrices de la casa comercial.NOTA La determinación de coliformes, E. coli o ambos puede realizarse también por los siguientes métodos:siembra en membranas hidrofóbicas con MUG, PCR ó inmunoprecipitación (VIP), enzimoinmunoensayos (EIA).2 De acuerdo con la resistencia del gel del agar. 5
  12. 12. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)6. EQUIPO Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIONOTA El equipo y material desechable es una alternativa aceptable frente al material de vidrio reutilizable sicumple con las especificaciones adecuadas.Se utiliza el equipo y material usual de laboratorio microbiológico y, en especial, lo siguiente.6.1 APARATO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN EN HÚMEDO (AUTOCLAVE)Véase la NTC 4206 (ISO 7218).6.2 INCUBADORACon capacidad de operar a 35 °C ± 1 °C.6.3 CAJAS DE PETRIDe vidrio o plástico, con diámetro de 90 mm a 100 mm.6.4 PIPETAS DE SUMINISTRO TOTAL O MICROPIPETASCon capacidad nominal de 1 ml.6.5 BAÑO DE MARÍAO equipo similar, con capacidad de operar a 45 °C ± 2 °C (para mantener los medios de cultivoantes de la siembra).6.6 EQUIPO DE RECUENTO DE COLONIASConsistente en una base iluminada y un contador digital mecánico o electrónico.6.7 MEDIDOR DE pHCon aproximación a ± 0,1 unidad de pH a 25 °C.7. MUESTREOEl muestreo se debe haber efectuado de acuerdo con la norma específica apropiada para elproducto que se estudia ó de acuerdo con la AOAC (Oficial Methods of Análisis of AOACInternational). Si no existe una norma específica, se recomienda que las partes interesadaslleguen a un acuerdo sobre este aspecto.8. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYOLa muestra de ensayo se debe preparar de acuerdo con las normas de la colección NTC 4491para muestras microbiológicas o normas que traten acerca del producto que interese. Si noexiste norma específica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobreeste punto. 6
  13. 13. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)9. PROCEDIMIENTO9.1 SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONESVéanse las normas NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3, NTC 4491-4 y la norma específicaapropiada para el producto que interese.9.2 INOCULACIÓN E INCUBACIÓN9.2.1 Se toman dos cajas de Petri estériles (véase el numeral 6.3). Usando una pipeta estéril(véase el numeral 6.4), se transfiere a cada caja 1 ml de la muestra de ensayo, si el productoes líquido o 1 ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos (véase el numeral 9.1).Se toman otras dos cajas de Petri estériles. Usando otra pipeta estéril, se transfiere a cadacaja 1 ml de la primera dilución decimal (10-1) de la muestra de ensayo, si el producto eslíquido o 1 ml de la primera dilución decimal (10-2) de la suspensión inicial en el caso de otrosproductos.Se repite el procedimiento descrito con las diluciones adicionales, usando una pipeta estérilpara cada dilución decimal.9.2.2 Se vierten aproximadamente entre 10 ml a 15 ml del medio (véase el numeral 5.3), a45 °C ± 2 °C, en cada caja de Petri. El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de lasuspensión inicial (o de la dilución 10-1 si el producto es líquido) y el momento en que el medio(véase el numeral 5.3) se vierte en las cajas no debe ser mayor de 20 min.Cuidadosamente se mezcla el inóculo con el medio y se deja solidificar la mezcla, estando lascajas de Petri sobre una superficie horizontal fría.9.2.3 Después de que se complete la solidificación, se vierten aproximadamente 4 ml demedio de cultivo que cubra la superficie (véase el numeral 5.3, 5.4, 5,5) a 45 °C ± 2 °C, sobre lasuperficie del medio inoculado. Se deja solidificar como se describió anteriormente. Sepretende dejar una doble capa para visualizar mejor las colonias.9.2.4 Se invierten las cajas preparadas y se incuban a 35 °C ± 1 °C durante 24 h ± 2 h.9.2.5 Si el objeto del análisis es solo la determinación de E. coli, para una mejorrecuperación de bacterias injuriadas, incubar a 35 °C ± 1 °C (si son productos lácteos incubara 30 °C ± 1 °C) las primeras 4 horas y después incubar a 44 °C ± 1 °C por 18 h a 20 h.9.3 RECUENTO DE LAS COLONIASDespués del período especificado de incubación (véase el numeral 9.2.4), se cuentan lascolonias coliformes características en cada caja que contenga no más de 150 colonias3, yasean características o no, usando el equipo para el recuento de colonias.Mediante la utilización de una lámpara de fluorescencia de 360 nm a 366 nm hacer la lecturade las bacterias E. coli fluorescencia positiva.NOTA Después de la incubación durante 24 h, las colonias características son de color rojo púrpura con undiámetro de 0,5 mm o mayor, y algunas veces están rodeadas de una zona rojiza de bilis precipitada.3 Por encima de este número existe el riesgo de que las colonias coliformes tengan una apariencia atípica. 7
  14. 14. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)10. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOSDespués del periodo especificado de incubación (véanse los numerales 9.2.4 para coliformes y9.2.5 para E.coli), realizar el conteo de coliformes, incluyendo la E. coli y expresarindependiente el conteo de bacterias coliformes del conteo de bacterias E. coli glucoronidasapositivas, utilizando el equipo para el recuento de colonias (véase el numeral 6.6).10.1 Escherichia coli - medio fluorogénicoExaminar las cajas de petri usando una lámpara de luz ultravioleta (preferiblemente de 6 watios,de onda larga (366 nm)).La presencia de fluorescencia es una prueba positiva para E. coli.Si la fluorescencia es cuestionable incubar por un periodo adicional de 4 h para la prueba conONPG y hasta por un periodo adicional de 20 h para verificar la fluorescencia intensificadacomo prueba de resultado positivo.10.2 Escherichia coli – medio cromogénicoExaminar las cajas de petri que presentan colonias de color azul verdosas (T,B,X, Dglucorónido). Se presume que la prueba es positiva para la presencia de E. coli.10.3 Escherichia coli – medio agar con triptona bilis x glucorónido 5-bromo-4-cloro-3- indolil-D-glucuronidoExaminar las cajas de petri que presentan colonias de color verde azuladas (D-glucorónido). Sepresume que la prueba es positiva para la presencia de E. coli.11. MÉTODO DE CÁLCULO11.1 CASO GENERALCajas que contengan entre 15 colonias y 150 colonias características.Se seleccionan las cajas que contengan no más de 150 colonias características en dosdiluciones consecutivas. Es necesario que una de estas cajas contenga al menos 15 coloniascaracterísticas.Se calcula el número N de colonias por mililitro o por gramo de producto, dependiendo delcaso, usando la siguiente ecuación: ∑C N= (n1 + 0,1 n2 )den donde ΣC = es la suma de colonias contadas en todos los cajas retenidos; n1 = es el número de cajas retenidos en la primera dilución; n2 = es el número de cajas retenidos en la segunda dilución; d = es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución. 8
  15. 15. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)Se redondea el resultado calculado con dos cifras significativas.Se toma como resultado el número de unidades formadoras de colonias, UFC/ml o UFC/g deproducto, expresado como un número entre 1,0 y 9,9 multiplicado por 10x donde x es lapotencia apropiada de 10.EJEMPLO Un recuento de coliformes dio los siguientes resultados: -2 - en la primera dilución seleccionada (10 ): 83 y 97 colonias -3 - en la segunda dilución seleccionada (10 ): 13 y 8 colonias ∑C 83 + 97 +13 + 8 201 N= = = = 9136 (n1 + 0,1 n2) d (2 + 0,1 x 2 ) x 10 − 2 0,022Al redondear el resultado como se indicó antes, se obtiene 9 100 ó 9,1 x 103 UFC/ml o UFC/gde producto.11.2 CASO EN EL QUE CADA CAJA CONTIENE MENOS DE 15 COLONIAS CARACTERÍSTICASSi cada una de las cajas seleccionadas, contiene menos de 15 de colonias características, secalcula el número estimado NE de coliformes usando la ecuación presentada en el numeral 11.1.EJEMPLO Un recuento de colonias de coliformes dio los siguientes resultados: - En una dilución de 10-4 : 140 y 145 colonias, de las cuales 5 y 3 respectivamente fueron características. -5 - En una dilución de 10 : 11 y 8 colonias, de las cuales 0 y 1 respectivamente fueron características. 5 + 3 + 0+1 9 NE = = = 40 000 (2 + 0,1 x 2) x 10 −4 2,2 x 10 −4Al redondear el resultado como se especificó en el numeral 10.1.1, da 4,0 x 10-4 UFC/ml oUFC/g del producto.11.3 ESTIMACIÓN DE NÚMEROS PEQUEÑOSSi las dos cajas, correspondientes a la muestra de ensayo (productos líquidos) o a lasuspensión inicial (otros productos) contienen menos de 15 colonias características, losresultados se reportan así:- < 15 UFC/ml (productos líquidos);- < 15 x 1/d UFC/g (otros productos), en donde d es el factor de dilución de la suspensión inicial. 9
  16. 16. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)11.4 COLONIAS NO CARACTERÍSTICASSi las dos cajas correspondientes a la muestra de ensayo (productos líquidos) o a lasuspensión inicial (otros productos) no contienen colonias características, se informa elresultado como sigue:- <1 UFC/ml (productos líquidos);- <1 x 1/d UFC/g (otros productos), donde d es el factor de dilución de la suspensión inicial.12. PRECISIÓN12.1 CAJAS QUE CONTENGAN ENTRE 15 Y 150 COLONIAS CARACTERÍSTICAS (véase el numeral 11.1)Solamente por razones estadísticas, en el 95 % de los casos los límites de confianza deeste método varían desde ± 16 % hasta ± 52 % (Cowell y Morisetti, J. Sci. Fd. Agric., 1969,Vol. 20, p. 573). En la práctica, se puede encontrar variación aún mayor especialmente entreresultados obtenidos por diferentes microbiólogos.12.2 CADA CAJA CONTIENE MENOS DE 15 COLONIAS CARACTERÍSTICAS (véase el numeral 11.2)Consúltese la Tabla A.1. Para obtener los límites de confianza, se multiplican los límitessuperior e inferior dados por 1/d, en donde d es el factor de dilución.13. INFORME DEL ENSAYOEl informe de ensayo debe especificar:- toda la información necesaria para la completa identificación de la muestra;- el método de muestreo utilizado, si se conoce;- el método de ensayo utilizado, con referencia a esta parte de la norma;- todos los detalles operativos no especificados en esta parte de la norma, o considerado como opcional, cualquier incidente detallado que pueda haber influenciado los resultados del ensayo;- el resultado obtenido. 10
  17. 17. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización) ANEXO A (Normativo)LÍMITES DE CONFIANZA PARA LA ESTIMACIÓN DE NÚMEROS PEQUEÑOS DE COLONIASEn la Tabla A.1 se dan los límites de confianza al nivel del 95 % para la estimación de númerospequeños, cuando el número de colonias en las cajas seleccionadas es menor de 15. Tabla A.1 Límites de confianza al nivel del 95 % Número de coliformes Inferior Superior 1 <1 2 2 <1 4 3 <1 5 4 1 6 5 2 9 6 2 10 7 2 12 8 3 13 9 4 14 10 4 16 11 5 18 12 6 19 13 7 20 14 7 21 15 8 23 11
  18. 18. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización) ANEXO B (Informativo) BIBLIOGRAFÍA[1] The Scientific Association Dedicated to Analytical Excellence, Official Methods of Analysis of AOAC International. Method 996.02. Colifrms and E. coli in food, plate count technique. Chapter 17. 18th Edition, 2005.[2] INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology. General Guidance for the Enumeration of Coliforms. Colony Count Technique. Geneva: ISO, 12 pp. (ISO 4832:2006).[3] GTC 125, Guía de referencias de métodos horizontales de análisis microbiológicos para bebidas, alimentos y alimentos para animales. Tabla No. 8. 2006.[4] Fluorocult® LMX Broth modified acc_ to MANAFI and OSSMER.htm. 2006-11-12.[5] http://www.epa.gov/nerlcwww/online.htm. 2006-11-12.[6] http://www.bergeys.org/. 2006-11-12.[7] William B. Whitman. Bergeys Manual Trust. Department of Microbiology. 527 Biological Sciences Building. University of Georgia. Athens, GA 30602-2605. USA. 12

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