18666932 9-staphylococcus

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18666932 9-staphylococcus

  1. 1. PRÁCTICA # 9 “STAPHYLOCOCCUS”OBJETIVOS: Determinar el tipo de microorganismo sembrado de diferentes fuentes a través de su crecimiento en diferentes medios de cultivo y comprobado a través de diversas pruebas bioquímicas. Describir las características microscópicas, culturales que permiten efectuar el aislamiento y la diferenciación entre Staphylococcus aureus y los estafilococos coagulasa negativa (ECN) Seleccionar los medios de cultivo adecuados para llevar a cabo la detección de los estafilococos Elegir, leer e interpretar las pruebas que permiten identificar a los estafilococosINTRODUCCIÓNSTAPHYLOCOCCUS.Los cocos gram positivos aerobios y anaerobios facultativos, según su forma de división y agrupación, se integran endos familias (Micrococcaceae y Deicrococcaceae) y otros géneros con personalidad propia como el géneroStreptococcus. La familia Micrococcaceae que tiene interés médico incluye aquellos que se agrupan de forma irregular oen tetradas, y está constituida por los géneros Staphylococcus, Micrococcus, Planococcus y Stomatococcus.Los cocos gram positivos aerobios y anaerobios facultativos de interés médico están en los géneros Staphylococcus yStreptococcus, que a su vez comprende el neumococo (S. pneumoniae).CONCEPTO Y CLASIFICACIÓN.ConceptoLos estafilococos son cocos gram positivos de 0.5-1 μm de diámetro, inmóviles, aerobios y anaerobios facultativos,caracterizados en que se agrupan de forma irregular en racimos, producen catalasa y descomponen los azúcares porfermentación. Son bacterias poco exigentes, que se cultivan fácilmente en medios comunes y presentan ciertaresistencia a los agentes externos, por cuyo motivo se pueden encontrar en la naturaleza, especialmente en el medioambiente que rodea al hombre, formando parte de la flora normal de la piel y mucosas e interviniendo en procesospatógenos diversos, sobre todo en infecciones supuradas e intoxicaciones alimentarias.ClasificaciónSe pueden distinguir las siguientes especies:1. S. aureus, prototipo de los estafilococos patógenos. Es el agente causal de la mayoría de las infecciones; se caracteriza por producir coagulasa o fermentar el manitol, elaborar diversas toxinas, en especial la toxina α, y sintetizar en su mayoría un pigmento amarillo dorado, no difusible, que colorea a las colonias.2. S. epidermidis y S. saprophyticus, prototipos de los estafilococos oportunistas. Son gérmenes comensales de la piel o libres en el medio ambiente, que en ocasiones pueden intervenir en procesos patógenos. Se caracterizan por no producir coagulasa ni toxina α, no fermentan el manitol y elaboran en su mayoría un pigmento blanco aporcelanado.La importancia de los estafilococos deriva de su aumento progresivo de resistencia a los antibióticos, sobre todo en elmedio hospitalario, que junto con su resistencia a los agentes externos les permite difundir y producir infecciones ybrotes epidémicos (infecciones hospitalarias), que plantean serios problemas epidemiológicos y terapéuticos.STAPHYLOCOCCUS AUREUSEstructura antigénica y clasificación en tiposLa estructura antigénica de S. aureus es compleja y mal conocida. En la pared celular se han demostrado cerca de 30antígenos, y los más importantes son:1. El polisacárido A, específico de especie, constituido por ácidos teicoicos, polímeros de fosfato de ribitol, que están unidos al peptidoglicano por enlaces covalentes. Son antigénicos e inducen la aparición de anticuerpos, y se ha demostrado un aumento de anticuerpos antirrubitol en los casos de endocarditis estafilocócica. En S. epidermidis, los ácidos teicoicos son polímeros de fosfato glicerol y en S. saprophyticus, polímeros de fosfato de ribitol. Los bacteriófagos se fijan en esta capa.
  2. 2. 2. La proteína A, específica de especie, se encuentra en la pared celular y puede liberarse en el medio. Presenta la propiedad de unirse a la extremidad Fc de las IgG normales y a la extremidad F(ab) 2 de las IgG específicas, así como de activar el complemento.3. Existen, además, en la pared celular un número indeterminado de proteínas responsables de la tipoespecificidad.4. También se han aislado cierto número de cepas mucoides capsuladas, especialmente en los animales, cuya composición e importancia no se conocen.La especies S. aureus se caracteriza por la presencia de ácidos teicoicos, polímeros de fosfato de ribitol y proteína A.Pero, además por sus antígenos tipoespecíficos se ha podido subdividir en tipos siguiendo dos criterios: a) En serotipos,mediante el empleo de sueros tipoespecíficos, y se ha clasificado en 18 serotipos. b) En fagotitos o lisotipos, por elestudios de la sensibilidad de la cepa frente a un grupo de fagos seleccionados. Se conocen más de 100 fagotipos quepor necesidades prácticas se han reunido en 4 grupos y un grupo no clasificado.Los serotipos 1, 2 y 3 se corresponden en líneas generales con los fagogrupos I, II y III. Es interesante señalar que enlos tres primeros fagogrupos se encuentran la mayoría de las cepas patógenas para el hombre: en el grupo II, cepasextrahospitalarias y productoras de toxinas exfoliativa y, en el grupo III, la mayoría de cepas multirresistentes a losantibióticos pertenecientes a determinados serotipos o fagotipos.Acción patógenaEs debida fundamentalmente a la acción de antígenos de superficie, toxinas y fermentos1STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUBESPECIE AUREUS.Staphylococcus aureus subespecie aureus es sin duda el patógeno humano más importante entre los estafilococos. Selo encuentra en el ambiente externo y en las narinas anteriores del 20 al 40% de los adultos. Otros sitios de colonizaciónson los pliegues cutáneos, el periné, las axilas y la vagina. Aunque este microorganismo suele formar parte de lamicroflora humana normal, puede producir infecciones oportunistas importantes en las condiciones apropiadas. Losfactores que pueden predisponer a un individuo a infecciones graves por S. aureus incluyen los siguientes: Defectos quimiotácticos de los leucocitos, sean congénitos o adquiridos. Defectos en la opsonización por anticuerpos. Defectos en la destrucción intracelular de las bacterias después de la fagocitosis. Lesiones cutáneas. Presencia de cuerpos extraños. Infecciones por otros agentes, particularmente virus. Enfermedades crónicas de base, como tumores malignos, alcoholismo, y cardiopatías. Administración profiláctica o terapéutica de agentes antimicrobianos.En estas circunstancias S. aureus puede producir una variedad de procesos infecciosos que van desde infeccionescutáneas relativamente benignas hasta enfermedades sistémicas potencialmente fatales. Las infecciones cutáneasincluyen la foliculitis simple (infección superficial que rodea los folículos pilosos) y el impétigo (infección superficial de lapiel observada frecuentemente en los niños). Así como furúnculos y carbuncos que afectan el tejido subcutáneo yproducen síntomas sistémicos como fiebre. S. aureus se aísla con frecuencia de heridas quirúrgicas infectadas, las quepueden funcionar como focos para el desarrollo de infecciones sistémicas. La bronconeumonía estafilocócica adquiridaen la comunidad se observa habitualmente en ancianos y se asocia con una neumonía viral como factor predisponiente.La neumonía nosocomial producida por S. aureus se observa en cuadros clínicos de enfermedad pulmonar obstructivacrónica, con intubación y aspiración. Las enfermedades malignas subyacentes se reconocen como factores de riesgoimportantes para el desarrollo de una bacteriemia por S. aureus. La bacteriemia también puede “sembrar” localizacionesdistantes del organismo y dar origen a una endocarditis, una osteomielitis, una pioartritis y la formación de abscesosmetastáticos, particularmente en la piel, los tejidos subcutáneos, los pulmones, el hígado, los riñones y el cerebro. Lameningitis estafilocócica aparece en pacientes con anormalidades del sistema nervioso central relacionadas contraumatismos, cirugía, tumores malignos e hidrocefalia y Staphylococcus aureus es la segunda causa más frecuente demeningitis asociada con derivaciones ventriculoperitoneales. También es uno de los muchos microorganismos asociadoscon peritonitis en pacientes sometidos a diálisis peritoneal ambulatoria continua. Las toxinas estafilocócicas también sonresponsables de la necrólisis epidémica tóxica (síndrome estafilocócico de la piel escaldada) y del síndrome de shocktóxico. También hay cepas de S. aureus que pueden producir intoxicaciones alimentarias debido a la elaboración deexotoxinas durante su desarrollo en alimentos contaminados.S. aureus posee varias propiedades que se supone que contribuyen a su capacidad de producir enfermedad. Sinembargo, estos factores de virulencia no se encuentran en todas las cepas de S. aureus y este microorganismo sigue 1 A. Fumarola, et al. Microbiología y parasitología medica. Segunda edición. Editorial Masson. 2
  3. 3. siendo fuente de sorpresas constantes a medida que se descubren propiedades patogénicas nuevas y diferentes. Estaspropiedades incluyen las siguientes.Formación de la cápsulaAlgunas cepas de S. aureus producen un exopolisacárido que puede evitar la fagocitosis del microorganismo por partede los leucocitos polimorfonucleares. Estos exopolisacáridos han sido observados por microscopia electrónica enderivaciones de marcapasos, catéteres peritoneales y guías intravenosas infectadas por S. aureus y han sidodemostrados inmunológicamente in Vitro. Este material puede facilitar la adherencia de los microorganismos a lascélulas del huésped y a los dispositivos protésicos. Los aislamientos clínicos de S. aureus se han clasificado en ochotipos de acuerdo con la inmunotipificación del polisacárido capsular y entre el 70 y el 80% de los aislamientos clínicosimportantes pertenecen a los serotipos capsulares 5 u 8. Estos dos tipos capsulares, particularmente el tipo 8, tambiénestán asociados con otros factores de virulencias de S. aureus, como por ejemplo, la producción de la toxina delsíndrome de shock tóxico. Además, una gran cantidad de cepas de S. aureus que son resistentes a la oxacilina, lapenicilina antiestafilocócica utilizada con mayor frecuencia, expresan el serotipo 5 de polisacárido capsular. Los tiposcapsulares 5 y 8 también se han encontrado en aislamientos animales de S. aureus.Proteína ALa pared celular de S. aureus contiene esta peculiar proteína que tiene la capacidad de unirse a la región Fc de lamolécula de inmunoglobulina G (IgG). La proteína A se encuentra unida al peptidoglucano de la pared celular y tambiénpuede ser segregada al medio durante el desarrollo. La proteína A funciona como un factor de virulencia al interferir enla opsonización y la ingestión de los microorganismos por parte de los leucocitos polimorfonucleares, activan alcomplemento y estimulan reacciones de hipersensibilidad de tipo inmediato y retardado. La proteína A es inmunogénicay en los individuos con infecciones graves producidas por S. aureus se encuentran anticuerpos dirigidos contra ella. Lapresencia de la proteína A en S. aureus constituye la base de las pruebas de coaglutinación que se utilizan muchoslaboratorios clínicos para la identificación de microorganismos y para la detección de antígenos bacterianos en líquidoscorporales.Constituyentes de la pared celularLa pared celular de S. aureus contiene peptidoglucano (polímeros de N-acetilglucosamina y de ácido N-acetilmurámicoligados en forma cruzadas), que son similares a los encontrados en otras bacterias gram positivas, y ácidos teicoicos,que son polímeros peculiares de ribitol (monosacáridos de cinco carbonos) con fosfatos. Los ácidos teicoicos participanen la adherencia específica de las bacterias gram positiva a las superficies mucosas. Además de conferir rigidez y laelasticidad a la pared celular de los estafilococos los peptidoglucanos y los ácidos teicoicos poseen varias propiedadesbiológicas que se supone que contribuyen a la virulencia. Estas propiedades incluyen la capacidad de activar el sistemadel complemento, de inhibir la quimiotaxis de las células inflamatorias y de estimular la producción de anticuerpos. Laspruebas sexológicas para la detección de anticuerpos contra estas moléculas han sido investigadas en lo que respecta asu posible valor diagnóstico o pronóstico; los resultados han sido desalentadores debido a la considerable superposiciónde títulos de anticuerpos entre individuos infectados y no infectados, el amplio espectro de infecciones y enfermedadesproducidas por S. aureus y la variabilidad dependiente del huésped de la respuesta inmune según la edad, otrasinfecciones y la inmunocompetencia general.EnzimasS. aureus produce varias enzimas que pueden contribuir a su virulencia. La producción de catalasa por parte de estosmicroorganismos pueden actuar para inactivar el peróxido de hidrógeno y los radicales libres tóxicos formados por elsistema mieloperoxidasa dentro de las células fagocíticas después de la ingestión de estos microorganismos. Tanto lacoagulasa libre como la unida pueden recubrir las células bacterianas con fibrina y tornarlas resistentes a laopsonización y la fagocitosis. Las fibrinolisinas pueden degradar coágulos de fibrina y permitir la diseminación de lainfección a los tejidos contiguos. En forma similar, la hialuronidasa hidroliza la matriz intercelular de mucopolisacáridosen los tejidos y, por lo tanto, pueden actuar diseminando los microorganismos a zonas adyacentes. Las cepas de S.aureus que provocan furunculosis crónica son productoras de potentes lipasas que pueden contribuir a la diseminaciónde los microorganismos en los tejidos cutáneos y subcutáneos. Se ha descrito una fosfolipasa C específica para elfosfatidilinositol asociada con cepas recuperadas de pacientes con síndrome de distrés respiratorio del adulto ycoagulación intravascular diseminada. Los tejidos afectados por esta enzima se vuelvan más susceptibles al daño y ladestrucción por componentes bioactivos del complemento y los productos de la activación del complemento. Losestudios inmunológicos y de especificidad de sustrato indican que S. aureus produce por lo menos tres tipos diferentesde beta-lactamasas. La producción estas enzimas puede ser inducible o constitutiva y hace que estos microorganismossean resistentes a la penicilina y a la ampicilina. Los genes que codifican estas enzimas habitualmente residen enplásmidos que también poseen genes para la resistencia a diversos antibióticos, como la eritromicina y la tetraciclina.Estos genes de resistencia pueden ser transferidos a otras bacterias por transformación y tranducción.Hemolisinas 3
  4. 4. Las hemolisinas de S. aureus poseen varias actividades biológicas. La alfa-hemolisina tiene efectos letales sobre unaamplia variedad de tipos celulares, entre ellos los leucocitos polimorfonucleares humanos, y lisa eritrocitos de variasespecies animales. La toxina es dermonecrótica por inoculación subcutánea y es letal para los animales cuando se leinyecta por vía intravenosa. También es una potente neurotoxina. Esta toxina es responsable del halo de eritrocitosbemolizados que se observa alrededor de las colonias de algunas cepas de S. aureus que se desarrollan en agarsangre de carnero. La beta-hemolisina es una esfingomielinasa que tiene actividad contra una variedad de células. Esuna hemolisina “caliente-fría” (es decir, sus propiedades hemolíticas son incrementadas por la exposición posterior delos eritrocitos a bajas temperaturas). La beta-hemolisina, junto con el factor CAMP producido por los estreptococos delgrupo B.ToxinasLa leucocidina es una exotoxina que ejerce un efecto tóxico directo sobre la membrana de los leucocitospolimorfonucleares humanos que provoca desgranulación del citoplasma, edema celular y lisis. La toxina tiene doscomponentes que interactúan en forma sinérgica para producir una granulocitopenia profunda. La forma de acción deesta toxina involucra la formación de poros que alteran la permeabilidad celular al potasio y otros cationes. Lasexfoliatinas o toxinas epidermolíticas son producidas por ciertas cepas de estafilococos y consisten en dos proteínas,denominadas ET-A y ET-B, de 24.000 Da de peso molecular relativo de cada una. Las dos moléculas son diferentesdesde el punto de vista bioquímico e inmunológico pero tienen actividades biológicas similares. La ET-A es una proteínatermoestable cuyo gen estructural es cromosómico, en tanto ET-B es termolábil y de origen plásmido. Estas proteínasposeen actividad proteolítica y disuelven la matriz mucopolisacárida de la epidermis, lo que da como resultado laseparación intraepitelial de las uniones celulares del estrado granuloso. Las cepas que producen una de estas toxinas oambas son responsables del ”síndrome estafilocócico de la piel escaldada”. En este cuadro clínico se observa laformación de bullas grandes áreas del cuerpo, con la posterior formación de escaras en las capas superficiales de lapiel. Esto da como resultado grandes áreas de piel denudada y en carne viva. La enfermedad se ve habitualmente enrecién nacidos y lactantes. Ambas toxinas son antigénicas y los anticuerpos dirigidos contra ellas son protectores. Lasenterotoxinas A a E son moléculas termoestables, responsables de la características clínicas de la intoxicaciónalimentaria estafilocócica. El mecanismo exacto de acción de estas enterotoxinas se desconoce pero aumentan elperistaltismo intestinal.ESTAFILOCOCOS COAGULASA-NEGATIVOSAntiguamente los estafilococos coagulasa-negativos por lo general se consideraban contaminantes de poca importanciaclínica. Sin embargo, en las últimas décadas estos microorganismos se han reconocido como agentes importantes deenfermedades humanas. Aunque se han descrito varias especies diferentes de estafilococos coagulasa negativos,relativamente pocos de ellos producen infecciones en los seres humanos. Sin embargo, como una mayor cantidad delaboratorios han intentado identificar estafilococos coagulasa- negativos se están reconociendo infecciones producidaspor otras especies cada vez con mayor frecuencia. Los tipos de infecciones asociadas con los estafilococos coagulasa-negativos incluyen las siguientes: Infecciones urinarias, nosocomiales y adquiridas en la comunidad. Infecciones producidas por dispositivos permanentes. Bacteriemia en huéspedes comprometidos. Endocarditis de válvulas cardíacas naturales y protésicas. Osteomielitis. Endoftalmitis posquirúrgica.ESPECIES DE STAPHYLOCOCCUS DE ORÍGEN HUMANO, ANIMAL Y AMBIENTALEstafilococos encontrados en el hombre y en primates no humanos Especie Comentarios. Integrante de la flora normal humana de la piel . Se encuentra también en primates no S. haemolyticus humanos. Esta especie, que representa aproximadamente el 1% de los estafilococos encontrados S. warneri normalmente en la piel humana, en la actualidad es una causa bien reconocida de bacteriemia relacionada con catéteres, de endocarditis de válvulas naturales. Esta especie se encuentra en la piel humana y ha sido aislada como causa de bacteriemia S. hominis en pacientes cancerosos. Encontrado en la piel y en la uretra de mujeres sanas. Ha sido identificado como causa de septicemia, osteomielitis y artritis séptica posterior a la reducción a cielo abierto de una S. simulans fractura de peroné. Posee una cápsula que inhibe la fagocitosis in Vitro y contribuye a la virulencia in vivo. 4
  5. 5. Se ha relacionado principalmente con endocarditis de válvulas naturales y protésicas, con S. lugdunensis celulitis de la piel y del tejido subcutáneo, con peritonitis, con prótesis de cadera infectadas y con abscesos mamarios. Integrante de la flora normal humano, se encuentra alrededor de las glándulas sebáceas del cuero cabelludo y de la frente. Recientemente la especie se ha dividido en dos S. capitis subespecies, S. capitis subespecie capitis y S. capitis subespecie urealyticus. Esta última subespecie es ureasa-positiva. Ha sido aislada a partir de varias infecciones humanas, entre ellas empiema cerebral, infecciones de heridas, bacteriemia como complicación de una osteítis vertebral, infección S. schleiferi de una prótesis de cadera. La especie ha sido dividida en dos subespecies; los aislamientos humanos se denominan S. schleiferi subespecie schleiferi y los aislamientos caninos reciben el nombre de S. schleiferi subespecie coagulans. Especie que se encuentra en muestras clínicas humanas y animales y en alimentos todavía S. pasteuri no han sido asociada con procesos infecciosos y es fenotípicamente similar a S. warneri. Esta especie se encuentra en el conducto auditivo externo de los seres humanos y rara vez S. auricularis ha sido implicada en infecciones Esta especie se ha subdividido en dos subespecies denominadas S. cohnii subespecie S. cohnii cohnii y S. cohnii subespecie urealytium. Ambos microorganismos pertenecen a la flora normal de la piel. Este microorganismo se encuentra tanto en seres humanos como en primates no humanos S. xylosus y ha sido implicado como causa de infecciones de las vías urinarias superior e inferior. S. Esta especie anaerobia, se encuentra en las mucosas humanas. saccharolyticus Originalmente aislado de cabras, recientemente se lo ha encontrado en la piel humana y en S. caprae nuestras clínicas humanas. Especie coagulasa-negativa resistente a la novobiocina, se encuentra en seres humanos y S. pulvereri en pollos.Estafilococos encontrados en otros animales. Especie Comentarios. S. intermedius Hallado como integrante de la flora de los perros, los hurones, los caballos y los gatos, pueden producir infecciones cutáneas, urinarias, óseas y del sistema nervioso central en varias especies animales S. hyicus Encontrado en cerdos, ganado vacuno y leche de vaca. S. choromogenes Produce infecciones cutáneas en el ganado vacuno. S. sciuri Se encuentra normalmente en roedores y otros mamíferos pequeños, fundamentalmente ardillas. S. gallinarum Esta especie se encuentra en aves de corral y no es patógena. S. lentus Forma parte de la flora normal de las ovejas y las cabras. S. equorum Una rara especie equina de importancia patógena indeterminada. S. delphini Especie coagulasa-positiva que produce lesiones cutáneas purulentas en delfines. S. felis Produce otitis, cistitis, abscesos, heridas y otras infecciones cutáneas en gatos. S. muscae Se encuentra como integrante de la flora transitoria de la superficie corporal de las moscas que viven en establos de vacas pero que no se ha encontrado en moscas que habitan en residencias humanas. S. piscifermentans Se encuentra en peces, en productos de pescados fermentados y en puré de soja. S. vitulus Se encuentra como parte de flora de los caballos, los ratones campestres y las ballenas piloto.Otras especies de estafilococos (en su mayoría de origen animal).2 Especie Comentarios Utilizado como cultivo iniciador en el procesamiento de productos cárneos como el salame S. carnosus y salchicha., Especie saprófita encontrada en la leche y otros productos lácteos y como parte de la flora S. caseolyticus del ganado vacuno y las ballenas. S. kloosii Encontrado en mamíferos, es de importancia clínica y ubicación taxonómica inciertas. Encontrado en mamíferos y aves, es de importancia clínica y ubicación taxonómica S. arlettae inciertas.INTOXICACIÓN ALIMENTARIA ESTAFILOCÓCINA. 2 Koneman, et al. Diagnóstco Microbiológico Texto y atlas a color. Quinta edición. Editorial Medica Panamericana. 5
  6. 6. La intoxicación alimentaria más común está causada por el coco Gram positivo Staphylococcus aureus. Este organismoproduce varia enterotoxinas que secreta al medio circulante o alimento; si se come el alimento que contiene la toxina, enel plazo de 1-6 horas se observan severas reacciones que incluyen náuseas, con vómitos y diarreas. Se han identificadoseis tipos de enterotoxinas de S. aureus: A, B, C1, C2, D y E. La enterotoxina A es la más frecuentemente está asociadaa los brotes de intoxicación alimentaria estafilocócica. El mecanismo de acción de la enterotoxina A es el de unsuperantígeno e implica la estimulación sistémica de un gran número de células T. La enterotoxina A de S. aureus es unpéptido pequeño, de peso molecular 30.000 Dalton, codificado por un gen cromosómico. La clonación y secuenciaciónde este gen, el gen entA, y de varios otros genes de enterotoxinas de S. aureus, muestra que esta familia de toxinasestán relacionadas genéticamente.Las clases de alimentos más comúnmente implicadas en las intoxicaciones alimentarias son los productos cocidos alhorno y rellenos de crema pastelera o de nata, las aves, la carne y los productos cárnicos, las salsas, las ensaladas conhuevo y carne, los flanes y los aliños con nata para ensaladas. Si estos alimentos se mantienen en el frigorífico despuésde ser preparados, permanecen relativamente seguros ya que S. aureus es incapaz de crecer a bajas temperaturas. Sinembargo, con frecuencia esta clase de alimentos no se refrigeran y frecuentemente se mantienen en cocinas calientes oal aire libre, durante meriendas campestres. Bajo estas condiciones Staphylococcus, que pueden haber llegado alalimento desde un manipulador de alimentos, durante su preparación, crece y produce enterotoxina. Muchos de losotros alimentos implicados en intoxicaciones alimentarias no se vuelven a cocinar de nuevo antes de comerlos, peroincluso si se cocinan, la toxina es relativamente termoestable y puede permanecer activa. La intoxicación alimentariaestafilocócina puede evitarse con cuidados métodos higiénicos o almacenando los alimentos a bajas temperaturas paraevitar el crecimiento microbiano, y eliminando todos los alimentos que hayan permanecido durante algunas horas atemperatura superior a 4 grados centígrados.3CURVA DEL CRECIMIENTO BACTERIANOLa curva del crecimiento bacteriano resulta de la representación gráfica de la determinación periódica del número decélulas viables por mililitro que existen en un líquido inoculado con células microbianas provenientes de un cultivo queha crecido previamente hasta la saturación.Dicha curva se divide en seis fases, mismas que se simbolizan con letras de la A a la F. A continuación se muestra uncuadro con las características principales de cada fase y se desarrollan las más importantes. Parte de la Curva Fase Tasa de Crecimiento A Rezago Cero B Aceleración Creciente C Exponencial Constante D De retraso Decreciente E Estacionaria máxima Cero F Declinación Negativa (muerte)A: Fase de Rezago.Este periodo consiste en la adaptación de las células microbianas a su nuevo ambiente. En esta fase, las célulasmicrobianas se encuentran empobrecidas en cuanto a metabolitos y enzimas, esto debido a las condicionesdesfavorables que representaba el cultivo previo. Por lo anterior, en este lapso de tiempo se forman las enzimas y losmetabolitos intermedios hasta alcanzar las concentraciones necesarias para reiniciar el crecimiento.Este periodo se puede prolongar en el caso de que el medio de cultivo previo y las condiciones actuales resulten tandiferentes que las células sean genéticamente incapaces de sobrevivir, por lo que sólo unas cuantas mutantes podránsubsistir, y obviamente se requerirá más tiempo para que éstas se multipliquen lo suficiente y sea notorio el aumento decélulas.C: Fase Exponencial.Como el nombre lo indica, en esta fase las células se encuentran en un estado de crecimiento sostenido.Se sintetiza nuevo material celular a una tasa constante, pero éste material es en sí catalítico y la masa aumenta demanera exponencial. Lo anterior continua hasta que uno o más nutrimentos se agoten, o hasta que se acumule talcantidad de metabolitos tóxicos que se inhiba el crecimiento. El nutrimento limitante para los organismos aerobios sueleser el oxígeno: cuando la concentración bacteriana es de aproximadamente 1 x 107/ml es necesario incrementar elingreso de oxígeno mediante agitación o burbujeo; pero cuando la concentración alcanza 4 o 5 x 109 bacterias por ml, latasa de difusión de oxígeno no puede satisfacer las demandas aun en un medio aireado, por lo que el crecimientodisminuye progresivamente. 3 Brock. Biología de los Microorganismos. Octava edición. Editorial Prentice Hall. 6
  7. 7. Durante el crecimiento exponencial, la tasa de crecimiento de las células (medida en gramos de biomasa producida porhora), cuando el crecimiento no es limitado por los nutrimentos, se puede obtener multiplicando la constante de la tasade crecimiento (k) por la concentración de biomasa. La constante de la tasa de crecimiento es la tasa a la cuál lascélulas producen más células, y el valor que esta toma se interpreta como los gramos de biomasa producidos por cadagramo de biomasa preexistente creados en una hora.El crecimiento se denomina exponencial porque la biomasa se incrementa exponencialmente con respecto al tiempo. Delo anterior se deriva que, si graficamos el logaritmo de la concentración de la biomasa (o celular) en función del tiempo,como ocurre en la curva del crecimiento, obtendremos una línea recta como representación de esta fase.Esta fase puede prolongarse indefinidamente si las células se transfieren repetidamente a un medio nuevo (fresco) decomposición idéntica al anterior, lo cual se logra de manera automática mediante dos aparatos: elquimiostato y el turbidostato.E: Fase Estacionaria Máxima.Como se explicó en la descripción de la fase anterior, ante el agotamiento de nutrimentos en el medio o la acumulaciónde metabolitos tóxicos el crecimiento cesa por completo después de un periodo de decrecimiento en la tasa decrecimiento, lo cual corresponde a la fase D o de retraso.No obstante, por lo general en esta fase se puede observar recambio celular, lo cual se debe a que, aunque existe unapérdida lenta de células por muerte, dicha pérdida se compensa exactamente por la formación de nuevas células através de crecimiento y divisón. Así, la cifra de células viables se mantiene constante, aunque en realidad en el conteoaumente poco a poco el número de células, si se cuentan también las muertas.Para comprender lo anterior debemos considerar que, para una célula microbiana, muerte significa la pérdidairreversible de la capacidad para reproducirse (crecer y dividirse), lo cuál se comprueba cuando una célula es incapazde producir una colonia en cualquier medio. De lo anterior se deriva que designar a una célula microbiana como muertano implica su destrucción física.La duración de esta fase depende de la naturaleza del microorganismo y de las condiciones del medio.F: Fase de Declinación.Esta fase, también conocida como fase de muerte, representa el decremento de células debido al aumento progresivode la tasa de mortalidad, misma que tarde o temprano alcanza un valor sostenido.Por lo general, una vez que la mayoría de las células ha muerto, la tasa de mortalidad disminuye bruscamente, por loque un número pequeño de sobrevivientes pueden persistir en cultivo por meses o años. Dicha persistencia puededeberse a que las células consiguen crecer gracias a los nutrimientos liberados por las células que mueren y se lisan,observándose recambio celular.4MEDIOS DE CULTIVOLos medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones físicasóptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio deMicrobiología por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud,confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.Clasificación de los medios de cultivoEn los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados enforma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquido al que se leañade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel.Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en:° Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.° Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química definida cualitativa y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación. (Para bacterias como: Echerichia coli y Leuconostoc citrovorum) 4 Brooks, et. al., Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg, 16a ed. 7
  8. 8. De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en:° Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar. Un medio de enriquecimiento se utiliza para aislar un tipo particular de microorganismo a partir de una población mixta de gran tamaño. Por ejemplo, las bacterias formadoras de endosporas pueden aislarse hirviendo una muestra de suelo y cultivando los supervivientes. Solamente las endosporas resistirán el tratamiento y podrán crecer. Las bacterias lijadoras de nitrógeno pueden seleccionarse cultivando el inóculo de suelo en un medio libre de nitrógeno, donde sólo ellas podrán crecer porque obtienen el nitrógeno de la atmósfera. Los ecólogos microbianos usan frecuentemente medios de enriquecimiento. Por ejemplo, para encontrar un microorganismo que degrade un determinado compuesto químico tóxico, se puede inocular la muestra de suelo en un medio en el cual la única fuente de carbono sea dicho compuesto. El microorganismo que prospere en él podrá ser utilizado en biorremediación.° Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. Un medio selectivo favorece el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros. Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja. Por ejemplo, se utiliza un medio selectivo, para aislar Salmonella typhi, agente causal de la fiebre tifoidea, a partir de heces donde existen cientos de microorganismos diferentes. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto químico, como la azida sódica, el telurito potásico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una grave intoxicación alimentaría. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de Clostridium. otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o una fuente de carbono poco común.° Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos. Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un determinado microorganismo. Por ejemplo, para identificar Streptococcus pyogenes, la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre es un agar que contiene hematíes. Las colonias de esta bacteria muestran a su alrededor una zona transparente debido a que producen hemólisis (muerte y lisis de los hematíes). Escherichia coli y las bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metabólicos ácidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias.° Medios selectivos-diferenciales: Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey es un ejemplo de medio selectivo-diferencial, utilizado para detectar cepas de Salmonella y Shigella, bacterias entéricas (del intestino) que causan disenterías. Cualquier muestra de heces enviada al laboratorio esta plagada de bacterias pertenecientes a muchas especies. El agente selectivo del MacConkey actúa como una especie de tamiz grosero que disminuye el campo de identificación. El cristal violeta y las sales del medio inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas (Salmonella y Shigella son Gram negativas). A partir de aquí, el componente diferencial del medio, en este caso la lactosa, comienza a ser importante. Salmonella y Shigella no fermentan la lactosa, pero la mayor parte de las enterobacterias sí lo hacen. Por tanto, las colonias de estas dos bacterias serán rojas, mientras que las restantes no lo serán.Por su composición los medios de cultivo se clasifican en:° Líquidos: conocidos como caldos, estos son especialmente útiles para hacer diluciones, para homogenizar mezclas de microorganismos, para enriquecer cultivos y para rehidratar cepas liofilizadas.° Sólidos: Para separar microorganismos y favorecer el desarrollo de las colonias aisladas en las que es posible observar las características típicas de un solo tipo de microorganismo.° Semisólidos: Son aquellos medios líquidos a los que se adiciona agar en concentraciones de 0.4 a 0.8%. Estos se emplean para determinar la movilidad de los microorganismos microaerofílicos.Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos o porsimple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente seprefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayorprobabilidad de obtener resultados reproducibles.Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:∼Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad. 8
  9. 9. ∼Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada. ∼Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada. ∼Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. ∼Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante. Almacenamiento de los medios de cultivo: Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que señale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25º), con poca humedad y protegidos de la luz solar di recta. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor; Los medios de cultivo deshidratados se deben descartar cuando se hidraten o decoloren. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre 2 y 8ºC, a menos que el medio requiera alguna condición diferente. Se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación. Cuando se usa tapón de algodón se debe colocar por encima una envoltura de papel (Craft).5 MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS: MAC CONKEY Medio empleado ampliamente para aislar e identificar selectivamente a enterobacterias como Salmonellas, Shigella y coliformes a partir de heces fecales, orinas, aguas negras y diversos alimentos.Formulación aproximada en gramos por litro: Peptona de gelatina........................................17.0 Mezcla de peptonas..........................................3.0 Lactosa............................................................10.0 Mezcla de sales biliares......................................1.5 Cloruro de sodio................................................5.0 Agar..................................................................13.5 Rojo neutro.......................................................0.03 Cristal violeta....................................................0.001 Preparación: Suspender 50 gramos del medio en un litro de agua destilada o desionizada de buena calidad. Remojar bien entre 10 a 15 minutos y calentar a ebullición agitando continuamente. Hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Enfriar a 45-50 ºC y vaciar en cajas de Petri unos 20 ml por placa. Dejar solidificar y luego invertir las cajas para evitar que se deposite un exceso de humedad en la superficie del medio. Usos: El espécimen puede sembrarse directamente en la placa por estría superficial, o bien inocularlo en medios líquidos d enriquecimiento, tales como caldo tetrationato, caldo selenito cistina o caldo GN. Incubar placas y caldos a 35ºC de 18 a 24 horas. Hacer resiembras de estas últimas en placas de Agar de Mac Conkey y volver a incubar. Se recomienda sembrar simultáneamente las muestras en otros medios mas selectivos tales como Eosina y Azul de metileno, Agar SS, Agar Tergitol 7, Agar XLD, Agar Entérico Hektoen, Agar Sulfito de Bismuto, Agar Verde Brillante, especial para Salmonellas. Los gérmenes Gram positivos son inhibidos por las sales biliares y el cristal violeta. Las enterobacterias fermentadoras de la lactosa bajan el pH del medio que es detectado por el indicador rojo neutro dando colonias rojas o rosadas. Las no fermentadoras de la lactosa dan colonias transparentes, incoloras o ambarinas. En el Agar MacConkey crecen también bacilos Gram negativos que no pertenecen a la familia Enterobacteriaceae, como Pseudomonas y Aeromonas. Asimismo, pueden desarrollarse en número reducido colonias puntiformes de Streptococcus fecalis de color rojo y de algunos estafilococos cuyas colonias son pequeñas, opacas de color rosa pálido. Por último, este medio puede usarse en la diferenciación de especies de Mycobacterium. CARACTERÍSTICAS DE LASA COLONIAS MICROORGANISM O 5 http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/metodesteril.pdf : “Método estéril y Medios de cultivo” por la Prof. Sofía Gutiérrez de Gamboa 9
  10. 10. Puntiformes, rosa pálido, opacas y Estafilococos escasas MEDIO BASAL O/F (DE HUGH Y LEIFSON) Para identificar bacilos NO fermentadores de importancia médica y sanitaria, principalmente El medio Hugh y Leifson se emplea extensamente, junto con otros medios de diferenciación, para identificar al numeroso grupo de bacilos Gram negativos NO fermentadores de carbohidratos, por medio de las reacciones de oxidación y/o de fermentación de los mismos. Estos bacilos predominantemente oportunistas que pueden provocar infecciones intrahospitalarias serias, por ejemplo las causadas por Pseudomonas. Sin duda alguna, una de las pruebas más importantes para el estudio de los bacilos NO fermentadores de carbohidratos, fue introducida en 1953 por Hugh y Leifson cuyo medio permite conocer si el germen en cuestión oxida, fermenta o no al hidrato de carbono agregado al mismo. Se encontró que el al contenido de peptonas (1%) en los medios usuales utilizados en el estudio de las fermentaciones, producían al ser degradadas, la suficiente cantidad de aminas alcalinas para neutralizar y enmascarar a la pequeña cantidad de ácidos formados por los microorganismo oxidativos. Bajando la concentración de peptona al 0.2% se podría determinar si el carbohidrato contenido en el medio era o no atacado por las bacterias en estudio. Los azucares que mas se emplean son la glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, manitol y xilosa.Formula aproximada en gramos por litro: Peptona de Caseína.................................2.0 Cloruro de sodio........................................5.0 Fosfato Dipotásico.....................................0.30 Agar............................................................2.5 Azul de Bromotimol.....................................0.03 Preparación: Suspender 9.8g del polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia hasta disolución del material. Esterilizar en autoclave a 15 libras durante 15 minutos. Agregar 10 ml de solución de glucosa al 10% esterilizada por filtración por cada 100 ml del medio fluido. Mezclar y distribuir asépticamente a razón de 5 ml por tubo. Si prefiere, puede agregarse directamente 1.0 g del carbohidrato a cada 100 ml del medio 1.0g del carbohidrato a cada 100 ml del medio y esterilizar en autoclave a 118ºC durante 10 minutos, a fin de evitar la degradación del azúcar. El medio tiene un color verde. Usos: Inocular 2 tubos recientemente preparados, por punción profunda con el germen en estudio. Si el medio ya tiene cierto tiempo de preparación, fundirlo en baño María para eliminar los gases disueltos. Agregarle a un de los tubos una vez inoculado, una cepa de 4 a 5 mm de petrolato, aceite de parafina o vaspar estériles. No es recomendable el uso de aceite mineral. Incubar ambos tubos a 35% durante 48 horas o mas. Se puede observar la producción de ácido por el cambio al color amarillo del medio, la formación de gas por la presencia de burbujas, y la movilidad o inmovilidad del microorganismo. Los cambios se aprecian mejor comparando los tubos inoculados con uno que no lo hayas sido, que funcionará como control. Para facilitar la identificación del grupo de bacilos Gram negativos NO fermentadores, utilizar también el Agar Diferencial de Sellers y el Medio del indol Nitrito. Resultados:Color amarillo en ambos tubos con o sin formación de gas: Carbohidrato fermentado. Degradación fermentativa.Cambio únicamente en el tubo que no contiene aceite: Oxidación de azúcar. Degradación oxidativa.Sin cambio en ninguno de los tubos: Microorganismos inertes. El carbohidrato no ha sido fermentado ni oxidado. AGAR SAL Y MANITOL Aislamiento de estafilococos 10
  11. 11. Es un medio selectivo muy empleado para aislar estafilococos patógenos de materiales clínicos diversos. También se utiliza en la industria alimenticia con los mismos fines, el aislamiento e identificación de Estafilococos que se encuentran en la leche y productos lácteos, carnes y derivados cárnicos incluyendo conservas de pescado.Formula aproximada en gramos por litro: Extracto de carne......................................1.0 Mezcla de peptonas...................................10.0 Cloruro de sodio........................................75.0 D-Manitol...................................................10.0 Agar............................................................15.0 Rojo de fenol...............................................0.025 Preparación: Suspender 111g. del medio deshidratado en un litro de agua destilada y remojar unos 15 minutos. Mezclar bien y calentar a ebullición durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Vaciar en cajas de petri. Usos: La degradación del manitol con producción de ácido cambia el color del medio, de rosado a amarillo. Debido a su alto contenido de cloruro de sodio, puede hacerse una siembra masiva del material en estudio. Generalmente se incuban las placas unas 36 hrs., apareciendo las colonias de estafilococos no patógenos de tamaño pequeño y rodeadas de una zona roja; en cambio, las colonias de estafilococos patógenos fermentadores del manitol, dan colonias más grandes y rodeadas de una zona roja; en cambio, las colonias de estafilococos no patógenos de tamaño pequeño y rodeadas de una zona roja; en cambio, las colonias de estafilococos patógenos fermentadores del manitol, dan colonias más grandes y rodeadas de una zona amarilla. Si agregamos a cada litro del medio, una yema de huevo en condiciones de esterilidad, los estafilococos, que además de fermentar el manitol producen lipasa, darán un precipitado amarillento de ácidos grasos alrededor de la colonia. Este fenómeno concuerda bastante bien con la propiedad de coagular el plasma que presentan los estafilococos patógenos coagulasa positivos. BASE DE AGAR SANGRE Aislamiento, cultivo y actividad hemolítica de gérmenes difíciles La base de Agar Sangre es adecuada para aislar y cultivar diversos microorganismos de difícil crecimiento. Al añadir sangre es adecuada para aislar bacilos tuberculosis. Preparación: Suspender 40 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar entre 5 y 10 minutos. Hervir durante un minuto. Los matraces pueden taparse y colocarse directamente en autoclave. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Después de esto enfriar a 4 –50ºC y añadir de 5 a 10% de sangre desfibrinada estéril, homogenizar y vaciar en cajas de petri estériles. No es recomendable emplear sangre humana. De preferencia utilice sangre de cordero o de conejo. También es posible inocular el fondo de una caja petri estéril con un pequeño inóculo, y vaciar posteriormente el medio fundido a unos 50ºC; la caja se hace girar suavemente para homogenizar la muestra. En algunos laboratorios se emplea el medio de cultivo preparado en tubos con tapón de rosca que se pueden inocular y posteriormente vaciar en cajas de petri estériles Usos: Para el aislamiento del Mycobacterium tuberculosis, la base de agar sangre con 0.1% de glicerol, 2.5% de sangre humana de banco de sangre y 100 unidades de penicilina por mililitro ha dado resultados comparables con los del medio de Lowenstein-Jensen. La base de agar Sangre también puede usarse para la preparación de antígenos. BASE DE CALDO ROJO FENOL Fermentación de carbohidratos; Medio usado para determinar las reacciones de fermentaciones.Formula aproximada en gramos por litro: Peptona de caseína.................................10g Cloruro de sodio........................................5g Rojo de fenol.............................................0.018g pH final 7.4+-0.2 Preparación: 11
  12. 12. Disolver 15 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada, agregar si se desea de 5 a 10 g de carbohidratos. Se puede agregar de 0.5 a 1.0 g de agar si el medio va a ser destinada al cultivo de organismos anaerobios. Si se desea investigar la formación de gases, emplear tubos Durham. Colocar los tubos en un recipiente adecuado y esterilizar de 116 a 118ºC durante 15 minutos. Usos: El base de caldo rojo de fenol puede usarse en los estudios de fermentación de muchas especies bacterianas. Los tubos de control sin carbohidratos deben inocularse e incubarse en paralelo con las pruebas de fermentación. Deben examinarse los cultivos frecuentemente ya que los diferentes carbohidratos pueden ser utilizados a velocidades variables. La aparición de color amarillo es indicio de fermentación. Para el cultivo de microorganismos anaerobios, el medio debe estar preparado recientemente o calentarse y enfriarse antes de su uso. AGAR MUELLER HINTON Pruebas de sensibilidad a antibióticos y cultivo de Neisseria En un medio muy rico en nutrientes que se recomienda para el aislamiento y desarrollo de gonococos y meningococos. También se emplea, sobre todo, en las pruebas de sensibilidad (antibiogramas)Formula aproximada en gramos por litro: Infusión de carne de res.......................................300.0 Peptona de caseína Ácida....................................17.5 Almidón.................................................................1.5 Agar.......................................................................17 pH final.................................................................. 7.4 +- 0.2 Preparación: Suspender 38 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Mezclar bien agitando frecuentemente. Hervir durante un minuto, y esterilizar a 121ºC por un tiempo no mayor de 15 minutos. Enfriar a 40-45ºC y vaciar en cajas de petri. Si se desea, pueden prepararse placas o tubos de agar “chocolote”, previa adicción de sangre de carnero o humana, preferiblemente la primera, calentando en baño María a 80ºC 10 minutos. No sobrecalentar el medio en ningún momento. Usos: Es un medio útil para el desarrollo de bacterias del genero Neisseria. Se recomienda incubar las cajas a 35ºC, en atmósfera de CO2. El medio deberá mantenerse húmedo en su superficie; esto puede lograrse si dentro de la jarra, envases de hojalata, frasco de vidrio de boca ancha, etc., se coloca una esponja o algodón húmedo y una vela encendida, cerrando luego herméticamente. Para realizar las pruebas de sensibilidad con sulfonamidas, las cajas deben examinarse después de 12 a 18 horas de incubación. Después de este tiempo se tendrán que revisar periódicamente las zonas de inhibición ya que el microorganismo puede desarrollar cuando la concentración del agente antimicrobiano comienza a disminuir. Se obtiene mejores resultados para aislar Neisserias patógenas preparando un agar chocolate con el Mueller Hinton adicionándole a cada 100 ml del medio terminado y fluido 1.0 ml de la suspensión VCN, mas 1.0 ml del polienriquecimiento. AGAR TCBS Para cultivar Vibirios selectivamente; Para el aislamiento selectivo de vibrios patógenos a partir de materiales clínicos, aguas y alimentos.Formula aproximada en gramos por litros: Extracto de levadura......................................5.0 Mezcla de peptonas......................................10.0 Citrato de sodio.............................................10.0 Tiosulfato de sodio........................................10.0 Bilis de buey..................................................5.0 Colato de sodio..............................................3.0 Sacarosa........................................................20.0 12
  13. 13. Cloruro de sodio............................................10.0Citrato de hierro.............................................. 1.0Azul de timol....................................................0.04Azul de bromotimol........................................0.04Agar................................................................14.0PreparaciónSuspender 86 g del polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia yhervir durante un minuto. Enfriar entre 45-50ºC y vaciar en cajas de petri. No esterilizar en autoclave.Usos:Se emplea ampliamente para aislar y cultivar diversas especies del género Vibrio que pueden provocar cólera, diarreascoliformes e intoxicaciones por alimentos contaminados. Las 2 últimas afecciones provocadas sobre todo, a partir dediversos pescados y mariscos que se ingieren crudos o semicudos y que pueden ser causadas por Vibrioparahemolyticus.El agar TCBS, es altamente inhibitorio para las Enterobacterias, incluyendo coliformes y proteus. Los Enterococos sontambién inhibidos en gran parte, de tal manera que se favorece grandemente la proliferación de los Vibrios, como elantes mencionado, el V. Cholerae y el V. Alginolyticus.El agar TCBS, es altamente inhibitorio para las enterobacterias, incluyendo coliformes y Proteus. Los enterococos sontambién inhibidos en gran parte, de tal manera que se favorece grandemente la proliferación de los vibrios, como elantes mencionado, el V. Cholerae y el V. Alginolyticus.El material sospechoso, se siembra masivamente por estría superficial y se incuba a 35ºC, de 18 a 24 horas.Casi todos los vibrios fermentan la sacarosa y dan colonias amarillentas por la producción de acido.Algunas cepas de Proteus fermentadores de la sacarosa pueden formar colonias amarillentas similares a las de losvibrios.6AGARSu composición es en base de polímero de galactosa y acido poligalacturónico; su fuente es algas marinas(Rodófitas), su enzima catabólica es agarasa. El agar nutritivo es usado como medio de cultivo para el crecimiento debacterias y hongos, pero no para virus (aunque los virus bacteriófagos crecen frecuentemente en bacterias cultivadas enagar).7MEDIO DE STUARTEstá descrito como un medio de transporte eficaz para la recuperación y viabilidad de microorganismos comoPneumococo, Strep.pyogenes , N. Gonnorrhoeae,Haemophilus sp. Y otros microorganismos lábiles. Se utiliza tambiénpara el transporte de muestras de secreciones oculares, óticas, heridas y abscesos. Los microorganismos permanecenviables de 6 días a 8 semanas. Se recomienda para la toma de muestras en sitios estériles.MEDIO DE CARY-BLAIRSe utiliza para el transporte de muestras fecales o raspados réctales para Coprocultivo. Se recomienda este medio, yaque permite el desarrollo de Salmonellas y Shigellas aún después de 49 días a 28ºC, Vibriones y campylobacterpermanecen viables hasta por 22 días a 28ºC.8PRUEBAS BIOQUÍMICASPrueba de Coagulasa:La coagulasa es una proteína de composición química desconocida y que resulta relativamente termoestable, ya queresiste temperaturas de hasta 60ºC durante 30 minutos; es muy sensible a la acción de enzimas proteoliicas y, comoposee una actividad similar a la de la protrombina (que la capacita para convertir el fibrinógeno en fibrina, aún cuando enel medio de reacción se encuentren ciertas sustancias anticoagulantes), permiten que el infectólogo lo detecte mediantereacciones simples. 6 Manual Bioxon, p.p 26, 28, 29, 33, 39, 41, 52 7 www.wikipedia.org 8 http://www.lablinsan.cl/productos/page8.html 13
  14. 14. En cuanto a su función in vivo, ésta consiste principalmente en interferir la fagocitosis, debido a que genera la producción de redes de fibrina alrededor de los microorganismos, impidiendo que el fagocito entre en contacto con ellos para englobarlos; sin embargo, al parecer también neutralizar la actividad antimicrobiana que el suero normal manifiesta contra los agentes infectantes. Tocante a su mecanismo de acción, existen evidencias de que la coagulasa puede inducir la activación de un mecanismo alterno de coagulación, habilitando a un componente del plasma, denominado factor reactivo de la coagulasa o FRC, para convertir el fibrinógeno en fibrina. De hecho, se sugiere que la coagulasa es una sustancia muy parecida a la protrombina que, al reaccionar con el FRC, forma un compuesto muy parecido a la trombina. Este paso es el decisivo por que, como es sabido, es la trombina la que activa al fibrinógeno para formar fibrina en el proceso normal de la coagulación. De acuerdo a lo anterior, la coagulasa origina la coagulación del plasma en dos pasos: inicialmente se verifica una reacción entre la enzima producida por el microorganismo y el FRC y posteriormente, las redes de fibrina son producidas por efecto del complejo formado en el paso anterior. Recordando el proceso que se efectúa en la última etapa de la coagulación sanguínea en el organismo, es posible relacionar el mecanismo asociado a la enzima estafilococcica Otro aspecto importante en la realización de la prueba, radica en la elección del plasma que se va a emplear; debe considerarse principalmente su origen, ya que se ha encontrado que algunas cepas presentan resultados positivos con el humano y el de conejo, pero negativos con el bovino. La reacción se considerará positiva si ocurre cualquier grado de coagulación visible dentro del tubo. Las bacterias coagulasa fuertemente positiva pueden producir el coagulo dentro de las primeras cuatro horas, razón por la que es recomendable leer el resultado en intervalos de 30 minutos, ya que S. aureus también produce fibrinolisinas, y la acción de éstas puede destruir el coágulo, provocando la obtención de resultados falsos negativos cuando se toman lapsos mayores. Otras cepas de S.aureus sólo son capaces de producir suficiente cantidad de coagulasa hasta que transcurren cerca de 18 h. Por tal motivo, es conveniente revisar nuevamente a las 24 h los cultivos que en los primeros tiempos se observen como coagulasa negativa. Es importante hacer notar que, a mayor virulencia de la cepa analizada, menor será el tiempo en que la prueba será positiva. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza más comúnmente para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otros Staphylococcus. Principio La coagulasa se halla presente en dos formas, “libre” y “fija”, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de técnicas de determinación diferentes: Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): la coagulasa fija está unida a la pared celular bacteriana. Los hilos de fibrina formados entre las células suspendidas en plasma (que contiene fibrinógeno) provocan su aglutinación, indicada por la presencia de agregados visibles en el portaobjetos. Coagulasa libre (prueba en tubo): la coagulasa libre es una enzima extracelular que se halla presente en los filtrados de cultivos. Cuando una suspensión de bacterias productoras de coagulasa se mezcla en partes iguales con plasma en un tubo de ensayo, se forma un coágulo visible como consecuencia de la utilización de los factores de coagulación del plasma de manera similar a cuando se añade trombina. Medios y reactivosPlasma coagulasa (Difco, o BBL)Cultivo de Staphylococcus de 24 horas en un agar nutriente o caldo nutriente. Procedimiento Prueba en portaobjetos Colocar una gota de agua destilada sobre un portaobjetos Emulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de obtener una suspensión cargada homogénea. Agregar una gota de plasma reconstituido junto a la gota de la suspensión del m.o. Mezclar bien con el asa. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la formación inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos. Prueba en tubo Colocar asépticamente 0,5 ml de plasma reconstituido en el fondo de un tubo estéril. Añadir 0,5 ml de cultivo de 24 horas (o suspensión en suero fisiológico de un cultivo en placa). 14
  15. 15. Mezclar por rotación el tubo, evitando remover o agitar el contenido. Colocar en baño de agua a 37°C y observar cada hora hasta 4 horas y luego a las 24 horas, la formación de un coágulo visible. Interpretación Prueba en portaobjetos: una reacción positiva se detecta usualmente en 15 a 20 segundos por la aparición de un precipitado granular. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinación en 2 a 3 minutos. Esta prueba es solo presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos o positivos tardíos deben verificarse mediante la prueba en tubos ya que algunas cepas de Staphylococcus aureus no producen coagulasa fija. Prueba en tubos: 1+: pequeños coágulos no organizados. 2+: pequeños coágulos organizados. 3+: gran coágulo organizado. 4+: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando se invierte el tubo.Se consideran positivos los grados 3+ y 4+ ControlesPositivo: S.aureusNegativo: S.epidermidis: Prueba de catalasa La catalasa es una enzima que descompone al peroxido de hidrógeno (H 2O2) en oxigeno y agua. Químicamente es una hemoproteina bastante similar a la hemoglobina lo están en estado reducido (Fe++). Exceptuando a los estreptococos y a gardnerella vaginalis, las bacterias aerobias y facultativas poseen esta enzima, no así la mayoría de las anaerobias que, con el objetivo de llevar a cabo la degradación del mismo sustrato, producen la peroxidasa. Dentro del laboratorio de Bacteriología, la prueba de la catalasa se utiliza generalmente para diferenciar al género Streptococcus (-) del Staphylococcus (+) y, con menor frecuencia, para hacerlo entre las especies de bacilos Gram positivos y entre las micobacterias. Para llevarla acabo es necesario disponer, por un lado, de una solución de peróxido de hidrógeno al 30 % y por otro, de un cultivo puro de 18-24 h del microorganismo por probar, contenido en una caja de Petri o bien en tubos de ensayo exentos de sangre, toda vez que los eritrocitos poseen esta actividad enzimática. El procedimiento más sencillo y rápido incluye el uso de un portaobjetos, en el cual se colocan, primeramente, una asada del microorganismo y posteriormente, se vierten sobre ésta una o dos gotas de la solución que está en contacto con las células, se empiecen a notar burbujas ocasionadas por el O2 que se desprende. 9 Prueba de oxidasa Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica. La prueba de la oxidasa se usa sobre todo paraIdentificar todas las especies de Neisseria (+)Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias. 9 Manual de practicas Bacteriología; Q.F.B. R. Garza Velasco; departamento de Biología; facultad de Química, UNAM. p.p 7-21 15
  16. 16. El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina(reactivo de Kovacs). Es menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo deGordon y McLeod), pero es más caro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que viragradualmente a púrpura-negruzco intenso.Realización de la prueba:1. Método en placa directa Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla. Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.1. Método indirecto sobre papel Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri. Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel. Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado. La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos. 10TINCIÓN DE GRAMLa tinción de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaños, morfologías celulares yreacción Gram (color). A nivel del laboratorio es útil como test para un rápido diagnóstico presuntivo de agentesinfecciosos, tanto en muestras como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad de lamuestra clínica. Las bacterias se tiñen gram positivas (+), gram negativas (–) o no se tiñen debido a sus diferencias enla composición de su pared y arquitectura celular. Las bacterias gram (+) tienen una gruesa capa de péptidoglucano y gran cantidad de ácidos teicóicos que no sonafectados por la decoloración con alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo yvisualizándose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su paredcelular está intacta o dañada (por tratamientos antibióticos, edad celular…).Las bacterias gram (–) tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una membrana externapor moléculas de lipopolisacáridos. Esta membrana externa es dañada por el alcohol y/o acetona de la decoloración,permitiendo que el primer colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contracolorante.Clásicamente los reactivos utilizados para la realización de la tinción de Gram han sido el cristal violeta como coloranteinicial, la solución de lugol para acomplejar a éste, el alcohol y/o acetona para la decoloración y la safranina o fucsinabásica como contracolorante.Existen una serie de puntos con respecto a un buen control de calidad de las tinciones de Gram, y que deben sertenidas en cuenta antes de su realización, a saber:· Diariamente se debe comprobar que no existen precipitados ni cristales en la solución de cristal violeta. Si los hay,filtrar antes de su uso.· La estabilidad de la solución de cristal violeta, alcohol y/o acetona, safranina o fucsina básica es de 1 año y la de lasolución de lugol de 6 meses, todas ellas conservadas en frascos cerrados (la evaporación puede alterar su efectividad)a temperatura ambiente.· Cada nuevo lote, aunque lo recomendable sería diariamente, preparar tinciones con cepas de colección de E.coli,S.aureus o S.epidermidis para comprobar los resultados esperados.· Ciertos procedimientos de laboratorio pueden dificultar la interpretación microscópica de la tinción, como son lapreparación de extensiones demasiado gruesas, uso de portas que no han sido prelavados o desengrasados,sobrecalentamiento en la fijación y excesivos lavados durante la tinción. Todos los anteriores son causas comunes depobres resultados en la tinción de Gram.· Debe tenerse en cuenta que no todos los microorganismos observados en una tinción pueden ser cultivados, y alcontrario, algunos no observados pero presentes consiguen ser recuperados en el cultivo.· Supervisión diaria de unas cuantas tinciones elegidas al azar por personal especializado, para confirmación decoincidencias y posibles discrepancias.Otras consideraciones importantes que deben ser revisadas e inspeccionadas por microscopía tras la realización de latinción son: 10 http://www.joseacortes.com/microbiologia/pruebasbioq/oxidasa.htm 16
  17. 17.  Como regla para evidenciar una buena decoloración, y teniendo en cuenta la fuente de la muestra, el fondo de la tinción deberá ser claro o ligeramente gram (-). Si hay leucocitos se observarán completamente gram (-), y si hay levaduras tipo Candida completamente gram (+). Para una buena interpretación de la tinción, el grosor de la extensión no debe permitir que aparezcan más de 2 células solapadas unas encima de otras. Examinar la tinción en busca de evidencias de inflamación (células polimorfonucleadas, células mononucleadas y/o hematíes). La presencia de células epiteliales, bacterias de la flora, restos alimenticios…, según el producto patológico que estemos observando, pueden indicar una mala obtención de éste. Inspeccionar distintas áreas de la tinción en busca de microorganismos. Prestar más atención en aquellas tinciones con signos de inflamación de pacientes inmunocompetentes, que en aquellas en donde no se observen éstos. Si no se detectan se indicará como “No se observan microorganismos”. Si se observan, se informará su número relativo, el tipo de microorganismo y su reacción gram. Se debe ser cuidadoso al informar si solo se observa 1 ó muy pocos (especialmente si no existen signos de inflamación), ya que los recipientes de recogida de muestras, los portas y algunos cultivos pueden contener bacterias no viables ni significativas pero contaminantes que nos aparecerán en la tinción. En cuanto a la reacción gram y características morfológicas de los microorganismos visualizados, estas son:Gram:  Positivo: de violeta fuerte a azul claro.  Negativo: rosa o rojo (en el caso de carbol-fucsina el rojo será intenso).  Variable: microorganismos parcialmente positivos y negativos. Puede ser debido a una mala extensión, fijación o tinción, presencia de células viejas, daño en la pared celular o por particularidades especiales de la pared celular de ciertos microorganismos.  Neutro: no toman ningún color, siendo generalmente el fondo alrededor de ellos de un ligero gram (-). Los microorganismos pueden ser intracelulares. Esta reacción gram ha sido vista en tinciones de muestras clínicas en donde están presentes elementos fúngicos o algunas especies de micobacterias.  Otras características: a examinar en el gram son si la tinción de los microorganismos es homogénea, bipolar, en cuentas o gotas, punteada, en barras o irregular. Formas:  Totales: cocos, cocoides, cocobacilares, bacilos, filamentosos (ramificados o no) y levaduriformes. Extremos: redondeados, afilados, romos, en forma de palo de tambor o inflado (por vacuolas, esporas, acúmulos de cualquier naturaleza…) y cóncavos.  Lados: paralelos, ovoides, cóncavos e irregulares.  Eje mayor: recto, curvado o en espiral.  Pleomorfismos: variación en la forma de un mismo conjunto de microorganismos. Ocurre en algunas especies de difteromorfos, Bacteroides spp., filamentosos ramificados (Actinomyces spp,…), por tratamientos antibióticos.Tamaños: teniendo en cuenta que el tamaño medio de un hematíe es de 7 mm y el de los gránulos citoplasmáticos de los leucocitos polimnorfonucleares son de 0,2-0,3 mm:  Totales: minúsculo (< 0,3 mm), pequeño (0,3-0,5 mm), medio y grande.  Longitud: corto (0,5-1 mm), medio, largo y filamentoso (10-30 mm).  Anchura: delgado, medio y grueso.  Pleomórficos: variación en el tamaño de un mismo conjunto de bacterias. Características agrupacionales: microorganismos aislados, en pares, en cadenas, tétradas, en grupo o arracimados, en empalizada, en letras chinas, empaquetados, en formas angulares tipo V o L .11 TOMA DE MUESTRA 11 http://www.a14.san.gva.es/labm/gram.htm 17
  18. 18. Consideraciones generales para la toma de muestra:1. Debemos saber QUE vamos a tomar como muestra (esputo, sangre, etc.)2. PORQUE vamos a tomar la muestra (con fines de diagnostico, investigación)3. COMO vamos a tomar la muestra (punción, raspado, etc.)4. DONDE vamos a tomar la muestra (piel, faringe, etc.)5. CUANDO vamos a tomar la muestra (ayuno, etc.)Características de una muestra: Ser obtenida del lugar donde asiente la patología. Generalmente tomada de los bordes de la lesión. Ser cualitativamente optima para su estudio. Alcanzar cuantitativamente un volumen razonable En la mayoría de los casos ser de emisión reciente. En algunos casos haber sido obtenida cuando el paciente esta atravesando determinadas instancias evolutivas de su patología. Obtenida siguiendo criterios anatómicos y funcionales. Perfectamente envasada, evitando recipientes que potencialmente puedan producir contaminaciones accidentales. Enviada inmediatamente al laboratorio para su estudio o si tiene que transcurrir algún tiempo será enviada en recipientes especiales o en medios de cultivo de transporte. Obtenida con material esterilizado y en condiciones de asepsia.Procedimiento para la toma de muestras:Instrucciones generales y específicas a seguir para lograr una buena toma de muestras. La toma de muestras debe realizarse antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos, ya que este interfiere en la observación directa del germen, así como en posterior aislamiento del mismo en los medios de cultivo. La toma de muestras debe realizarse en los lugares donde sea más probable es encontrar el microorganismo con la menor contaminación externa posible. Recoger la muestra en el estadio de la enfermedad más apropiado. Las muestras deben recoger es cantidades suficientes para permitir un examen completo; deben colocarse en recipientes estériles y remitirse lo más pronto posible el laboratorio. Es un requisito indispensable que el laboratorio recibe la suficiente o técnicas adecuas. El personal debe rechazar las muestras que no se han recogido de forma adecuada y los especialistas deben apoyar esta actitud. Recordando: La toma de muestras debe realizarse antes de iniciar el tratamiento antimicrobiano. Es muy importante seguir las normas necesarias para evitar la contaminación externa. La cantidad debe ser suficiente y es fundamental que se utilice un recipiente.Clasificación de la toma de muestras:Se clasifican en: 1. MUESTRAS SUPERFICIALES 2. MUESTRAS DE CAVIDADES 3. MUESTRAS ESPECIALES. 4. MUESTRAS ESPECÍFICAS1) MUESTRA SUPERFICIALES: Aquí consignamos a las muestras de la piel, pelo, uñas.℘ PIEL: Tenemos dos posibilidades de obtener la muestra, ya sea procediendo a alzar a los gérmenes con el asa bacteriología, por simple raspado ligero o con la ayuda de bisturí proceder a raspar algo energéticamente los bordes de la lesión, de manera no solo obtendremos los microorganismos sino también las capas superficiales de la piel, esto es provechoso en el caso de ciertas determinaciones.Finalmente puede ser que en determinados casos se pretenden nódulos los cuales están por debajo de la piel, siendomás palpable que visibles; en este caso procedemos también a raspar con el bisturí el lugar de la lesión llegando hastael nódulo de manera que una vez obtenida la pulpa, esta puede ser procesada y así llegar a observar al microbio.℘ PELO: También hay dos posibilidades, la primera cuando los gérmenes se hallan localizados en el folículo piloso, en este caso será suficiente proceder a raspar la región con el asa bacteríol6gíca previo de la zona con agua destilada, también se podrá arrancar el pelo a fin de aislar al germen a partir del folículo piloso. 18
  19. 19. La segunda posibilidad se vera cuando el tallo del pelo este atacado (micosis) en esta situación procederá acortar elpelo para su observación o posterior procesamiento en cultivo.℘ UÑAS: Se utilizan dos técnicas, de acuerdo al sitio atacado. La primera se utiliza cuando la lesión asienta en el lecho ungueal, en esta técnica desplazamos el asa bacteriológica, previo lavado de la región con agua destilada por el lecho ungueal con un solo trazo firme y seguro.Si la uña se halla atacada por microorganismos (hongos) entonces procedemos a cortar ayudados de un bisturí a fin decontinuar luego con el cultivo y el diagnostico a través de la microscopia.1) MUESTRA DE CAVIDADES: Consignamos las muestras de mucosas, conducto auditivo externo, esputo, orina, heces fecales.℘ MUCOSAS.- El instrumento que sirve de como denominador en la obtención de estas muestras es el hisopo, es decir un aplicada de madera que posee es uno de sus extremos un engrosamiento de algodón y que obviamente debe ser esterilizado. Si vamos describiendo las mucosas de arriba hacia abajo, encontramos lo siguiente:℘ MUCOSAS CONJUNTIVAL.- Usamos un hiposo estéril aunque algunas escuelas prefieren utilizar el asa bacteriológica, luego ubicamos la conjuntiva infectada o aquella que presente mayor exudado si la muestra a nivel del ángulo interno del ojo afectado. El hisopado debe ser cuidadoso y suave para rió producir mayor traumatismo.℘ MUCOSA NASAL.- De igual forma utilizamos un hisopo si la lesión es visible a simple vista procedemos entonces a obtener la muestra, si la lesión es mucho más interna. Entonces será necesario que un especialista la obtenga con instrumental que nosotros ya no poseemos. Hay otras oportunidades en que es preciso utilizar un cincel delgado y largo que podemos fabricar a partir de un sujetador de papel (clip) el cual es convertido en alambre rectilíneo y posteriormente aplastando uno de los extremos obtendremos un pequeño cincel, con el cual y una vez esterilizado procedemos a raspar lesiones sospechosas.℘ MUCOSA ORAL.- En esta cavidad es sencillo tomar cualquier nuestra pues tenemos gran visibilidad Allí podemos observar donde se localizan una lesión y posteriormente utilizando el hisopo llevar a cabo la toma de muestra. Por otra parte para fines de investigación podemos escoger cualquier segmento de la mucosa oral puesto, que esta posee una flora variada de microorganismos.℘ MUCOSA GENITAL FEMENINA.- Aun debemos considerar dos posibilidades más y son aquellas que se presentan en el caso de una mujer con himen intacto y otra que haya tenido contacto sexual. En la mujer con himen intacto tan solo debemos esperar que las secreciones se viabilicen al exterior para así ser obtenidas. En la mujer desflorada utilizaremos el especulo es decir dos valvas que una vez introducidas en el canal vaginal pueden ser separadas a voluntad, brindándonos de esta forma un campo de acción y observación ideales luego procederemos a hisopar las regiones escogidas, haciendo hincapié en las vecindades del orificio cervical externo, pues allí se acumularan las secreciones.3) MUESTRAS ESPECIALES.℘ ESPUTO.- El esputo es la colección de secreciones patológicas provenientes del árbol traqueo-bronquial. La muestra podemos obtenerla a través de diferentes técnicas, entre las cuales citaremos las más importantes:Forma natural de eliminación del esputo: Esta es la técnica más utilizada, se aplica a pacientes que pueden entender y aplicar las instrucciones que se les dé.Entregamos al paciente un recipiente especial para esta muestra y le indicamos que al despertara proceda a realizar un enjuague bucal con un antiséptico, luego debe proceder a expectorar directamente dentro de recipiente, llegando a acumular por lo menos tres esputos (flemas).Posteriormente se sierra herméticamente el envase y deberá ser enviado a laboratorio debidamente rotulado (nombre completo, edad y sexo) además de la numeración correspondiente y fecha.Lavado gástrico: Esta técnica se práctica en pacientes que no van ha poder realizar lo anterior, los niños (por que degluten el esputo), ancianos, enfermos mentales finalmente mujeres (por que también degluten el esputo.Lavado traqueal: Esta técnica consiste en instalar suero fisiológico tibia hacia el árbol traqueo- bronquial de manera que provoquemos el acceso de tos al despertar o excitar ese reflejo, en esa circunstancia debemos estar bien protegidos con barbijo, gorro, mandil y guantes.Forma postural: Este método también es útil en pacientes que no pueden eliminar en forma espontánea la muestra.Procedemos a colocar al paciente en decúbito ventral sobre una camilla (o cualquier superficial que cumpla la misma función) con una almohada debajo de ala región abdominal finalmente la cabeza queda colgado en una de los extremos la camilla al igual que los brazos lateralmente: de esta forma por simple acción de la gravedad la secreciones se viabilizaran al exterior, directamente al recipiente℘ RECOGIDA DE ORINA. - La toma de muestras se realizará en un frasco estéril que no deberá abrirse antes de la recogida. La recogida de orina puede realizarse de tres formas:Recogida de la porción media de la micción: Es aconsejable que la orina recogida sea de la primera hora de la mañana. El paciente debe lavarse meticulosamente los genitales externos con agua y jabón enjugándose finalmente con agua limpia. Iniciará la micción despreciándose la primera parte. A continuación, y sin detener la micción, debe 19
  20. 20. recogerse la segunda mitad de la misma en un frasco estéril de unos 20, 35 m1 evitando tocara el interior o borde de 1 frasco. Sondaje vesical o punción de sonda: El sondaje vesical debe utilizárselo menos posible ya que con lleva el riesgo de provocar una infección por introducir microorganismos del exterior. Se efectuara en condiciones de rigurosa asepsia y por personal cualificado. El enfermo portadores de sonda permanente debe recogerse la muestra a trabes de la sonda y nunca directamente de la bolsa. Punción suprapúvica: Esta técnica permite extraer la orina directamente de la vejiga mediante una jeringa con aguja asegurando una muestra libre de contaminaciones. Este método puede realizarse con muy poco riesgo en lactantes, niños y adultos con vejiga llena. Dado que la orina es un excelente medio de cultivo para la mayor parte de las bacterias, la muestra debe refrigerarse inmediatamente después de la extracción. A 40º C el recuadro de bacterias permanece constante durante 24 horas. ♦ Técnica de recolección en 24 horas: Se usa cuando la patología esta situada en los riñones. Consiste en recolectar durante 24 horas toda la orina eliminada de manera que aumentemos las posibilidades de coleccionar el agente etiológico. Características del recipiente para recolectar orina. a. La capacidad mínima es de 250 cc. b. Debe poseer boca ancha. c. Debe poseer sistema de rosca y tapa que asegure con este sistema. d. Debe ser estéril. e. Debe ser construido de material susceptible de esterilización. f. De preferencia será transparente a fin de observar ciertas características macroscópicas. g. Tiene que consignar el nombre, edad, sexo del paciente, además de la fecha y el correspondiente número de registro. ℘ HECES FECALES.- Tenemos dos posibilidades: heces diarreicas y heces sólidas. Heces diarreicas: En este caso obtenemos un volumen similar al de una cuchara sopera lo que más o menos viene a ser una cantidad de 10 cc. Estas muestras deben procesarse dentro de un margen de tiempo prudencial pues al acidificarse muchos gérmenes patógenos se lisan. Heces sólidas: Se toma un volumen similar al de una semilla de durazno. Características del recipiente para recolectar heces fecales. a. La capacidad mínima es de 30 ml b. Debe poseer sistema de rosca y tapa que asegure con este sistema, o en su defecto un tapón que asegure herméticamente. c. En lo posible debe ser estéril, aunque se puede utilizar un envase bien lavado. d. Podrá ser construido de material susceptible de esterilización, (polipropileno, policarbonato, vidrio) e. No debe ser fabricado de cartón pues deshidrata la muestra. En último caso se podrá utilizar recipientes de cartón parafinado. f. Tiene que consignar el nombre, edad, sexo del paciente, además de la fecha y el correspondiente número de registro. 4) MUESTRAS ESPECÍFICAS ℘ EXTRACCIÓN DE SANGRE PARA CULTIVOS: La técnica de extracción consta de una serie de pasos que deben rigurosamente, con objeto de reducir al máximo el riesgo de contaminación.Colocar una ligadura en el antebrazo.Escoger la vena tocando la piel antes de la desinfección.Limpiar la piel con alcohol (70%) sobre el sitio de la venopuntura en un área se unos 5 cm. frotando vigorosamente.Aplicar yodo-povi dona (2 %) desde el centro hacia afuera, hasta haber saturado todo el círculo. Se dejara que el yodo se seque, durante un minuto como mínimo, Este tiempo es fundamental y se debe cronometrar.Si después de desinfectada, el flebotomista debe tocar la piel, deberá desinfectarse los dedos que va a usar para la palpación o bien utilizar guantes estériles.Se insertara la aguja en la vena a y se realizara la extracción. Se cambiaran las agujas antes de inyectar la sangre en las botellas de cultivo.Después e retirar la aguja, la piel del paciente se desinfectara otra ves con alcohol al 70%, ya que muchos enfermos son sensibles al yodo. Una vez inoculadas, las botellas de hemocultivos deben remitirse inmediatamente al laboratorio para iniciar lo más pronto posible su procesamiento. 20
  21. 21. ∼No es aconsejable extraer sangre a través de una derivación 0 catéter, ya que estos dispositivos pueden estará colonizados por bacterias que no están presentes en la sangre el paciente por lo tanto, estos hemocultivos podrían dar resultados falsos positivos. ∼También se aconseja realizar la toma por debajo de las tubuladuras intravenosas ya que la sangre tomada por encima e ella estará diluida por el líquido transfundido. ∼Se recomienda 3 muestras en 24 h con un intervalo entre ellas superior a 1 h. ∼Sin embargo se acepta 2 o 3 extracciones separadas 30 min. Cada 24h, para cada hemocultivo, se extraerán lO ml de sangre y se inoculará a partes iguales en dos frascos (5ml en cada uno) uno para aislamiento de gérmenes aerobios y otro para anaerobios.℘ LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO: Esta muestra se obtiene a partir de una punción lumbar que se practica entre el 3er. Y 4to. Espacio intervertebral lumbar.Esta es una técnica práctica operatoria y se la debe realizar con todos los cuidados necesarios teniendo en cuenta las contraindicaciones.La cantidad necesaria es de 3 - 5ml. y siempre se debe realizar un estudio microscópico antes de entrar al estudio microbiológico. La presión más importante es de procesar el liquido cefalorraquídeo dentro de un margen de tiempo mínimo desde la toma de muestra, pues muchos gérmenes se lisan transcurrido cierto tiempo; dándonos de esta manera un resultado negativo.℘ MUESTRA CAPILAR: técnicas.Realizar la antisepsia del lugar elegido (lóbulo de la oreja, pulpejo del dedo anular, planta del pie en lactantes.Funcionar con rapidez y firmeza de tal manera que ingrese toda la punta de la lanceta.Descartar la primera gota.Recoger la sangre que fluye libremente llenando las tres cuartas partes del capilar.Presionar suavemente el lugar de punción con un algodón empapado en alcohol.La punción cutánea o capilar se emplea para: ∼ Frotis ∼Micro hematocrito ∼Grupo sanguíneo ∼Recuento de lóbulos blancos ∼Y otros.12ANTIBIÓTICOSustancia química producida por ciertos microorganismos, que mata o inhibe el crecimiento de otro. Inhibe elcrecimiento o matan a otros microorganismos .Los antibióticos constituyen una clase especial de agentesquimioterapeuticos , que se distinguen de los análogos de factores de crecimiento por que son productos naturales(productos de la actividad microbiana ) ,son sustancias producidas en los procesos microbianos a gran escala .ANTIBIOGRAMAEl medio de cultivo es sólido. Este sistema permite probar la eficacia de variosantibióticos al mismo tiempo.; Sobre la superficie de una placa de agar se realizala siembra de una suspensión bacteriana calibrada y a continuación se depositansobre ella discos de papel de filtro impregnados de antimicrobianos (discos paraantibiograma disponibles en el comercio). Tan pronto como el disco tomacontacto con la superficie húmeda del agar, el agua es absorbida por el papel defiltro y el antibiótico difunde hacia el medio circundante creando asíconcentraciones progresivamente decrecientes. Se observa como a medida quela distancia al disco aumenta hay una reducción logarítmica de la concentracióndel antibiótico. Así, al cabo de 18 horas de incubación, en aquella zona donde elantibiótico es capaz de impedir el crecimiento de la bacteria aparece un haloalrededor del disco: halo de inhibición.El tamaño de la zona de inhibición depende de ciertas propiedades fisicoquímicas del antibiótico que influyen invitrosobre la velocidad de difusión en agar y no están necesariamente relacionadas con la actividad terapéutica (in vivo) delantibiótico.; La valoración de los halos se hacen por patrones obtenidos de forma que se hallan correlacionadas la CIM yla carga antimicrobiana del disco con el diámetro del halo. Para ello es necesario determinar previamente en formaindividual la CIM y el halo de inhibición de un número amplio de cepas. Los resultados se representan en un sistema decoordenadas que nos permite establecer una correspondencia para un antibiótico determinado. De esta forma midiendoel diámetro del halo de inhibición de una cepa por el método del disco-placa, trasladamos este valor a la escala anterior 12 www.bvsops.org.uy/pdf/laboratorio.pdf 21

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