Este documento evalúa si la exposición a 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) induce estrés de retículo endoplásmico en células PC12 y cultivos primarios de corteza cerebral de rata. Los resultados muestran que TCDD altera la morfología del retículo endoplásmico y aumenta la expresión de proteínas de estrés como GRP78 y CHOP. Además, TCDD activa la vía PERK-eIF2α de la respuesta de unfolded

1. Neurotoxicology 44: 149-159
Curso de Microscopía Electrónica
Departamento de Tecnología Médica
Facultad de Medicina
Universidad de Chile 2014
The PERK-eIF2α signaling pathway
is involved in TCDD-induced ER
stress in PC12 cells
Zhiqing Duan, Jianya Zhao,Xikang Fan, Cuiying Tang, Lingwei Liang,
Xiaoke Nie, Jiao Liu, Qiyun Wu, Guangfei Xu
Nantong University, Republic of China
2014
Autores: Camila Leyton Santander- Ignacio Maureira Caviedes
Profesor Tutor: TM. Verónica Bahamondes L.

2. 2, 3, 7, 8 tetraclorodibenzo-p-dioxina
Subproducto no intencional de la
combustión incompleta o
incineración en industria química
Efectos agudos
Efectos crónicos no
cancerígenos
Efectos crónicos
cancerígenos
Efectos en
reproducción
Introducción

3. Introducción
TCDD Condición de estrés Neurotoxicidad
Figura 1. Micrografía obtenida por MET
que muestra retículo endoplásmico
rugoso
Condiciones fisiológicas
1. Plegamiento de proteínas
nacientes
• GRP78
• PDI
2. Glicosilación
3. Homeostasis de Calcio
Cambios ambientales o estresor
químico conduce a mal plegamiento
proteico, acumulación y activación
UPR

4. Introducción
Figura 2. Condición de estrés
de retículo. Activación de UPR

5. Objetivos
Objetivo General
Evaluar si los efectos de distintas concentraciones de
TCDD en línea celular PC12 y cultivo primario de
corteza de rata inducen un estrés de retículo que
conlleva a la activación de UPR

6. Objetivos
Objetivos Específicos
1- Examinar los efectos de distintas concentraciones de
TCDD sobre CHOP y GRP78, así como de proteínas que
participan en la vía ER-UPR (IRE1, ATF-6 y PERK) en línea
celular PC12 mediante las técnicas Western Blot,
Inmunofluorescencia, microscopía electrónica de
transmisión y transfección de siRNA.
2- Evaluar los efectos de distintas concentraciones de
TCDD en cultivo primario de corteza de rata mediante
microscopía electrónica de transmisión.

7. Cultivos
celulares
Línea de
Células PC12
Tratamiento a
distintas
concentraciones
de TCDD y
Solubrimal
Cultivo primario
de células de la
corteza cerebral
de ratón
Materiales y Métodos

8. Materiales y Métodos
• Semi cuantificación de proteínas involucradas en vías de
estrés de retículo y apoptosis.
• Anticuerpos utilizados contra : GRP78, p-PERK, PERK, p-
IRE1, IRE1, cleaved ATF-6, ATF-6, caspasa-3 activa, CHOP,
p-eIF2α o eIF2α.
W
est
er
n
Bl
ot
• Localización de proteínas involucradas en vías de estrés
de retículo e inducción de apoptosis.
• Anticuerpos primarios utilizados: GRP78, CHOP y eIF2α.
• Anticuerpo secundario conjugado a FITC.
Inmunofluore
scencia
Western Blot
Inmunofluorescencia

9. Materiales y Métodos
Microscopía electrónica de transmisión
Observación de corte fino de los
cultivos para análisis de
cambios de volumen del
retículo endoplásmico en
correlación con el estrés de
retículo y apoptosis.

10. Microscopía electrónica de transmisión
Células PC12 y
neuronas primarias
tratadas con TCDD (1,
10, 50,200 nM) por 24
hrs.
Lavado en PBS
Fijación en
glutaraldehído 4%
p/v
Post fijación en
Tetróxido de
Osmio (OsO4) 1%
p/v
Deshidratación en
concentraciones de
etanol
ascendentes.
Inclusión de la
muestra en resina
epoxy (Epon 812)
Cortes ultrafinos
MET
*Cada experimento
tiene al menos 3
repeticiones.
Materiales y Métodos

11. Resultados MET
Tratamiento con TCDD altera la ultraestructura del retículo
endoplásmico en células PC12 y cultivo primario de neuronas de rata
Fig. 3. Alteraciones ultraestructurales del RE en células PC12 tratadas con TCDD (Control: A; 10 nM: C; 50
nM: D; 200 nM: E) por 24 horas observadas por microscopía electrónica de transmisión en células PC12.
Células PC12

12. Resultados MET
Fig. 4. Alteraciones ultraestructurales del RE en cultivo 1° con TCDD (Control: G; H: 1nM, I:10 nM: J:
50 nM: K: 200 nM: E) por 24 horas observadas por microscopía electrónica de transmisión en cultivo 1°

13. Resultados Western Blot
TCDD provoca una respuesta de estrés en el retículo endoplásmico
en las células PC12.
Fig 5. Western blot de las células PC12 las cuales fueron lisadas y se utilizaron anticuerpo contra CHOP y GPR78 para observar la variación en el tiempo de
la concentración de estos marcadores al tratar las células con TCDD. (A). Western blot con TCDD a una concentración 1,10 y 100nM.(B). Densitometría
relativa de GRP78. (C) Densitometría relativa de CHOP.

14. Aumento en GRP78 y CHOP en células PC12 respecto a controles
por altas concentraciones de TCDD
Fig. 6. Inmunofluorescencia que muestra
la expresión de CHOP (verde) en células
con TCDD (200 nM) y controles
Resultados IF
Altas concentraciones
de TCDD (200 nM)
inducen una condición
de estrés de retículo

15. Resultados Western Blot
TCDD estimula la UPR y activa la vía PERK-eIF2α en células PC12
Fig. 7. Activación de PERK y eIF2α inducido por TCDD en células PC12.
(A) IZQ. Western blot que muestra el efecto de TCDD (200nM) en la
activación de la vía UPR a diferentes tiempos de exposición. DER.
Grafico donde se aprecia la densidad relativa de las bandas del
western blot anterior. (B) Expresión relativa de p-eIF2α y eIF2α.

16. Resultados IF
Aumento de la vía p-eIF2α producto de altas concentraciones de
TCDD. Activación de UPR por condición de estrés
Figura 8. Inmunofluorescencia de p-eIF2α (verde) en células controles y tratadas con TCDD por 3 horas. Núcleo marcados
con DAPI.

17. Resultados Western Blot
Resultados
Salubrinal protege a la célula PC12 de la muerte celular neuronal
inducida por TCDD
Fig. 9. Efecto del salubrinalen muerte celular de células PC12 inducidas por
TCDD. (A)Western blot de células PC12 tratadas con 30uM de salubrimal.
(C)Análisis por western blot de la expresión de CHOP, GRP78 y caspasa 3.

18. Discusión
Alteración de la morfología del RE
Dilatación de los lúmenes a
altas concentraciones de TCDD
MET
1. Acumulación de proteínas
mal plegadas
Se produce estrés de retículo
1. Se corrobora acumulación de
proteínas mal plegadas (GRP78)
2. Activación de eIF2α
Western Blot
Inmunofluorescencia

19. Conclusiones
Conclusiones
La utilización de las distintas técnicas en este trabajo nos permite cumplir con el
objetivo general, el cual era examinar si concentraciones de TCDD producían una
condición de estrés de retículo que conlleva a la activación de proteínas de la vía
UPR.
El aumento del lumen del retículo endoplásmico es posible observarlo mediante
microscopía electrónica de trasmisión, pero esta herramienta debe estar
acompañada de técnicas de biología molecular (Western Blot), acompañada de
inmunofluorescencia, que nos permiten entender cómo TCDD induce la vía UPR
(PERK-eIF2α)a través de la semi cuantificación de las moléculas que están
involucradas en esta vía
Cabe destacar que para este trabajo la sola utilización de técnicas de biología
molecular no permitía cumplir el objetivo, ya que no hubiese sido posible
observar cambios ultra estructurales de los lúmenes del retículo endoplásmico

20. BBiibblliiooggrraaffííaa