How fat stem cells could or not form muscle cells (French)

  • 1,891 views
Uploaded on

This is a resume of my previous work on human adult stem cells (obtained from fat). Slides are in French.

This is a resume of my previous work on human adult stem cells (obtained from fat). Slides are in French.

  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Be the first to like this
No Downloads

Views

Total Views
1,891
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
2

Actions

Shares
Downloads
31
Comments
1
Likes
0

Embeds 0

No embeds

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
    No notes for slide
  • Wnxwnh,jkwhkw;ncn:;:,w

Transcript

  • 1. Les cellules souches mésenchymateuses du tissu adipeux humain : Etude de leur potentiel myogénique Ari Massoudi UMR 6543 CNRS « Stem cells and differentiation » Centre de Biochimie Université de Nice-Sophia Antipolis Faculte des Sciences
  • 2.
      • Renouvellement tissulaire
      • - Tissus à renouvellement rapide
      • Renouvellement de l’épiderme
      • Renouvellement de l’épithélium intestinal
      • Renouvellement des cellules du sang
      • … .
      • Dégénérescence
      • - Traumatique
      • (brulure, blessure…)
      • - Pathologique
      • (Alzheimer, défaut génétique,
      • cirrhose…)
    Des cellules non-spécialisées assurent le maintien de l’homéostasie tissulaire : « cellules souches et progéniteurs » Un homme adulte ≈ 10 trillions (10.10 18 ) de cellules spécialisées
    • 20- 40 millions de cellules
    • disparaissent / seconde !
  • 3. Totipotentes stade 8 blastomères (3 jours) Nouveau-né œuf fécondé (jour 1) embryon pré-implantatoire Pluripotentes cellules souches embryonnaires (ES) (≈400 types cellulaires) trophoblaste Bouton embryonnaire (ICM) Embryon/Fœtus cellules foetales Multipotentes
    • Cellules souches
    • du cordon ombilical
    • Cellules souches adultes
    • NSC
    • MSC
    • SC
    • ESC
    • SPG …
    Multipotentes, Oligopotentes, Unipotentes
    • Totipotentes => organisme entier
    • Pluripotentes => l’ensemble des types cellulaires
    • Multi / oligopotentes => capacités plus restreintes
    • Unipotentes => un seul type cellulaire
    cellules souches/progéniteurs (Adulte ≈ 400 types cellulaires) cellules souches germinales embryonnaires (EG) Pluripotentes
  • 4. progéniteur précurseur cellule différenciée cellule souche Hiérarchie ontogénique Potentiel régénératif Les cellules souches sont des cellules « rares » Fréquence : 1 / 500 à 10 8 Identité tissulaire
  • 5. « Définition minimum mais insuffisante » : « Cellule indifférenciée  » ayant la « potentialité  » de se transformer en au moins un type cellulaire Cellule souche
  • 6.
    • Cellule souche
    • « Définition minimum mais insuffisante » :
    • « Cellule indifférenciée  » ayant la « potentialité  » de se transformer en au moins un type cellulaire
    • Traits importants s’ajoutant à la définition minimum :
    • Auto-renouvellement :
    • maintien du potentiel « souche » au fil des générations cellulaires
    • Multipotence :
    • la potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire
    • Clonogénicité :
    • les différents traits phénotypiques exprimés sont intrinsèque à une cellule
  • 7. progéniteur précurseur cellule différenciée cellule souche Auto-renouvellement Maintien du pool de cellules souches au fil des générations
  • 8.
    • Cellule souche
    • « Définition minimum mais insuffisante » :
    • « Cellule indifférenciée  » ayant la « potentialité  » de se transformer en au moins un type cellulaire
    • Traits importants s’ajoutant à la définition minimum :
    • Auto-renouvellement :
    • maintien du potentiel « souche » au fil des générations cellulaires
    • Multipotence :
    • la potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire
    • Clonogénicité :
    • les différents traits phénotypiques exprimés sont intrinsèque à une cellule
  • 9. progéniteur précurseur cellule différenciée cellule souche Mulipotence La potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire
  • 10. Multipotence par plasticité progéniteurs unipotents cellule souche indéterminée Programme type cellulaire B Plasticité : capacité d’acquérir de novo différents « programmes » de différenciations Le programme peut se matérialiser par l’expression de facteurs de transcription qui entrainent l’expression de gènes spécifiques d’un type cellulaire Programme type cellulaire A
  • 11. Multipotence par trans-différenciation Song et al. Faseb J. 2004 de la Fuente et al. Exp Cell Res. 2004 Real et al. Dev Biol. 2006
  • 12. Multipotence par fusion Ying et al. Nature. 2002 Terada et al. Nature. 2002 Spees et al. PNAS. 2003 Garbade et al. EJCS. 2005 Ishikawa et al.FASEB J.2006
  • 13.
    • Cellule souche
    • « Définition minimum mais insuffisante » :
    • « Cellule indifférenciée  » ayant la « potentialité  » de se transformer en au moins un type cellulaire
    • Traits importants s’ajoutant à la définition minimum :
    • Auto-renouvellement :
    • maintien du potentiel « souche » au fil des générations cellulaires
    • Multipotence :
    • la potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire
    • Clonogénicité :
    • les différents traits phénotypiques exprimés sont intrinsèque à une cellule
  • 14. Cellules souches mésenchymateuses (MSC)
    • Définition de l’ International Society for Cellular Therapy (ISCT) :
    • Toute population cellulaire obtenue à partir d’un tissu/organe ayant in vitro les caractéristiques minimums suivantes :
    • Adhérence au plastique (par opposition aux cellules hématopoïétiques)
    • Multipotence mésenchymateuse Adipo-Ostéo-Chondrocytaire
    • Combinatoire d’expression des marqueurs de surface :
    • CD45, CD34 , CD19, CD14, CD11b, HLA-II… Négatives
    • CD105, CD90, CD73… Positives
    • Clonogénicité
  • 15. culture in vitro expansion cellules adhérentes adipocytes cellules stroma-vasculaire Tissu adipeux humain nouveaux-nés ou enfants human Multipotent Adipose-Derived Stem cells (hMADS cells) Culture secondaire Zaragosi et al. Stem Cells. 2006 Rodriguez et al. J Exp Med. 2005
    • Auto-renouvellement
    • Activité télomérase
    • Caryotype normal
    • Non-tumorigénique in vivo - souris nude -
    • Multipotence
    cellules hMADS => propriétés fondamentales de cellules souches :
  • 16. Multipotence mésenchymateuse des cellules hMADS cellules hMADS adipocytes ostéocytes chondrocytes induction adipogénique induction osteogénique induction chrodrogénique cellules hMADS = MSC du tissu adipeux
    • CD34 négative
    • adhérence au plastique
  • 17. Multipotence mésenchymateuse par «  plasticité  » ALP Ostéonectine Ostéocalcine Ostéopontine Col I  1 … CBFA-1 Osterix SMADs VD 3 R FosB Adipocytes CD36 GAPDH LPL aFABP Leptine Adiponectine Adipsine … Pref-1 C/EBP  C/EBP  PPAR  PPAR  C/EBP  Induction adipogénique Induction ostéogénique progéniteur précurseur Ostéocytes Alizarin red ORO hMADS cells
  • 18. Contribution myogénique cellules hMADS in vivo cellules hMADS injection intra-musculaire Résultats antérieurs du laboratoire : Protéine dystrophine humaine Noyaux hMADS / myofibre Rodriguez et al. J Exp Med . 2005. plusieurs mois après souris mdx Souris mdx = modèle de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) Mutation ponctuelle dans le gène dystrophine => nécrose musculaire
  • 19. Myogenèse La myogenèse est sous le contrôle de facteurs de transcription « clés » : Myogenic Regulatory Factors (MRF) : Pax7, MyoD, myf-5, myogénine, MRF4
  • 20. nls-LacZ cellules hMADS myoblastes lignée C2C12 souris + noyau humain  -gal + myotube hybride homme - souris
    • Résultats similaires obtenus avec :
    • Myoblastes primaires souris wt ou mdx
    • Myoblastes humains de patients sains
    • Myoblastes humains de patient DMD
    Contribution myogénique cellules hMADS in vitro
  • 21. Expression de messagers musculaires humains en co-culture hMADS / C2C12 D 0 D 1 D 2 D 4 hMADS cells / C2C12 co-cultures h = human specific primers m = mouse specific primers h sarcospan h dystrophin h muscle creatine kinase h enolase 3 h desmin h actin m hprt muscle markers human muscle cells mouse C2C12 RT-PCR
  • 22. noyaux hMADS  sarcoglycane humain ( confocal analysis ) Expression de la protéine  -sarcoglycane en co-culture hMADS / C2C12  sarcoglycane humain
  • 23. Expression de la dystrophine en co-culture Myotubes hybrides hMADS/DMD expriment la dystrophine Myotubes issus de myoblastes de patient DMD Co-culture celllules hMADS / myoblastes DMD dystrophine
  • 24. 3) Par quel mécanisme les cellules hMADS contribuent-elles à la myogenèse ?
    • Contribution des cellules hMADS
    • à la formation de myotubes hybrides
    • 2) Expression de gènes musculaires
    • codés par le génome hMADS dans les myotubes hybrides
    in vitro
  • 25. Hypothèse : Les cellules hMADS possèdent une « plasticité myogénique » intrinsèque ? Stratégie : « Allumer » le programme myogénique en testant différentes conditions inductives connues pour promouvoir la myogenèse Mecanisme de la contribution myogénique ?
  • 26.
    • 46 conditions de culture testées en présence ou en l’absence de sérum
    • milieux conditionnés provenant de myoblastes
    • membrane natives provenant de myoblastes
    • différents type de matrice extracellulaire
    Aucune des conditions testées n’a permit d’induire un programme myogénique Conditions de culture testées pour promouvoir la myogenèse des cellules hMADS
  • 27. Hypothèse : Seuls les myoblastes induisent le programme myogénique dans les cellules hMADS ? Stratégie : Evaluer l’expression des MRF par les cellules hMADS en co-cultures Pax7 ? MyoD ? Myogenin ? cellules hMADS Myoblastes Induction « complexe » Mecanisme de la contribution myogénique ? Pax7 + MyoD + Myogenin + « myo »-hMADS
  • 28. myoblastes Myogenin + Expression de la myogénine en co-culture GFP-hMADS / myoblastes C2C12 GFP-hMADS cells Myogenin - Aucun MRF exprimé par les cellules hMADS en co-culture Expression des MRF en co-culture GFP-hMADS cells : Pax7 - Myoblasts : Pax7+ GFP-hMADS cells : MyoD - Myoblasts : MyoD+ Résultats similaires : co-cultures hMADS/ myoblastes humains
  • 29. Expression de la myogenin en co-culture GFP noyau hMADS Hoescht smooth noyau souris merge myoG Noyaux issus des cellules hMADS dans les myotubes hybrides contiennent la myogénine codée par le génome de souris noyau hMADS noyau souris hum myogenin hum actin mouse hprt co-culture hMADS/C2C12 myotubes RT-PCR human muscle cells mouse C2C12
  • 30. Mécanisme de la contribution myogénique ? cellules hMADS Myoblastes induction «  complexe  » Engagement «  partiel  » indépendante des MRF ? Hypothèse : Pax7 - MyoD - Myogenin - Desmine + Nestine + « myo-like »-hMADS Desmine ? Nestine ?
  • 31. myoblastes myotubes (j4) myoblastes humains GFP-hMADS + myoblastes C2C12 souris Nestine «  humaine  » différenciation Expression de Nestine humaine En co-cultures, seuls les myotubes hybrides expriment la Nestine humaine Co-culture
  • 32. Expression de Nestine humaine Co-culture cellules hMADS / myoblastes C2C12 souris Myotube hybride Myotubes humain * * * *
  • 33. Conclusion 2 nd hypothèse Engagement partiel 1 st hypothèse Plasticité myogénique Modèle : Conversion myogénique post-fusion Expression gènes musculaires :  sarcoglycane + dystrophine + nestine + sarcospane + desmin + enolase3 + muscle creatine kinase + myocytes cellules hMADS Fusion cellulaire myotube MRFs ( myogenin, herculin, MEFs ) Conversion myogénique des cellules hMADS
  • 34. Perspectives Expression gènes musculaires :  sarcoglycan + dystrophin + nestin + sarcospan + desmin + enolase3 + muscle creatin kinase + myotube MRFs ( myogenin, herculin, MEFs ) Rôle des MRFs dans la reprogrammation Facteurs impliqués dans la fusion hétérologue reprogrammation approche globale Myogenin-expressing myoblasts hMADS cells cellular fusion
  • 35. This work has been supported by Association Française contre les Myopathies