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Medios de-cultivo-y-pruebas-bioquimica-1225658128608610-9
 

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    Medios de-cultivo-y-pruebas-bioquimica-1225658128608610-9 Medios de-cultivo-y-pruebas-bioquimica-1225658128608610-9 Presentation Transcript

    • Medios de Cultivo yPruebas Bioquímicas
    • Medios deCultivo
    • INTRODUCCIÓNUno de los sistemas más importantes parala identificación de microorganismos esobservar su crecimiento en sustanciasalimenticias artificiales preparadas en ellaboratorio.El material alimenticio en el que crecen losmicroorganismos es el Medio de Cultivo yel crecimiento de los microorganismos esel Cultivo.
    • Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificialdebe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado dehumedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto deacidez o alcalinidad.
    • El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación demedios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del aguahirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepcionesno tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado poraquellas que crecen en él.
    • Medios de CultivoClasificación de los medios de cultivo basándose en sucomposición químicaA.- Medios sintéticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono,fuente de nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca), otroselementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucellaabortus) pero siempre a concentraciones conocidas.B.- Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevaningredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro,extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sinsaber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estosnutrientes.
    • C.- Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) conaditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinadosmicroorganismos (particularmente heterótrofos exigentes).Ejemplo: adicción de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.D.- Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimientoespecífico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es degran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una poblaciónmicrobiana mixta.Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos; adicionandocristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram. (+); utilizando maltosa comoúnica fuente de carbono sólo crecerán los que usen maltosa.
    • E.- Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar ladiscriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedadesdiferenciales de crecimiento en dichos medios.Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkeydiferencia lactosa (+) de lactosa (-).F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimientoóptimo ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerterápida de las células.Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producenácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosaen los medios de mantenimiento.
    • Agar-Agar
    • Agar NutritivoMedio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento demicroorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientosnutritivos.Su uso está descrito en muchos procedimientos para el análisis dealimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Pluripeptona 5.0 Suspender 31 g de polvo por litro de agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5 Extracto de carne 3.0 minutos. Calentar suavemente agitando y Cloruro de sodio 8.0 hervir 1 o 2 minutos hasta su disolución. Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15 Agar 15.0 minutos. pH final: 7.3 0.2
    • FundamentoEs un medio usado para el cultivo demicroorganismos poco exigentes en susrequerimientos nutricionales. No contieneinhibidores del desarrollo bacteriano.La pluripeptona es la fuente de carbono ynitrógeno para el desarrollo bacteriano.El agregado de cloruro de sodio permite elenriquecimiento con sangre de carnero u otrassustancias para facilitar el cultivo demicroorganismos exigentes.Características del medio: ámbar claroa medio ligeramente opalescente. Xanthomonas campestris
    • Base Agar Gelosa SangreMedio para propósitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerososmicroorganismos. Con la adición de sangre, el medio es útil tanto para elaislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobiosnutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, comopara la observación de reacciones de hemólisis.También, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base parapreparar el medio agar chocolate. Fórmula (en gramos por litro) Infusión de músculo de corazón 375.0 Peptona 10.0 Cloruro de sodio 5.0 Agar 15.0 pH final: 7.3 0.2
    • FundamentoLa infusión de músculo de corazón y lapeptona, otorgan al medio un alto valornutritivo, que permite el crecimiento deuna gran variedad de microorganismos,aún de aquellos nutricionalmenteexigentes.El cloruro de sodio mantiene el balanceosmótico.El agregado de sangre al medio decultivo, en concentración final de 5-10%, aporta nutrientes para el crecimientobacteriano, y permite detectar Características del mediohemólisis. Medio preparado: ámbar. Medio preparado con 5% de sangre de carnero: rojo cereza.
    • E.M.B. AgarEste medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gramnegativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite eldesarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona 10.0 Suspender 36 g del polvo en un litro Lactosa 5.0 de agua destilada. Reposar 5 minutos; Sacarosa 5.0 mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su Fosfato dipotásico 2.0 disolución. Esterilizar en autoclave a Agar 13.5 no más de 121 C durante 15 minutos. Eosina 0.4 Enfriar a 45 C y distribuir agitando suavemente. Azul de metileno 0.065 pH final: 7.2 0.2
    • FundamentoEste medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, paraobtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias yotras especies de bacilos Gram negativos.La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, yaquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina yazul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Grampositivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característicobrillo metálico.Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada orosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras.
    • Candida spp. como colonias rosadas y puntiformesEnterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes ytransparentes,La siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas enC. albicansMientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas puedendar colonias de color azul lavanda. esto puede ocurrir aunque lascepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ellose debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas.En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies deSalmonella y Shigella.
    • Resultados Microorganismos Tipo de Colonia Verdosas con brillo metálico y centro negro Escherichia coli azulado Klebsiella pneumoniae Mucosas, rosa púrpura, confluentes Proteus mirabilis Incoloras Enterococcus faecalis Incoloras, pequeñas, puntiformes Shigella flexneri Incoloras Salmonella typhimurium IncolorasCaracterísticas del medio
    • Mac Conkey AgarEste medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácildesarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacteriasque utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todaslas especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona 17.0 Pluripeptona 3.0 Lactosa 10.0 Suspender 50 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y Mezcla de sales biliares 1.5 mezclar hasta uniformar. Calentar Cloruro de sodio 5.0 suavemente y hervir 1 a 2 minutos hasta disolver. Esterilizar en autoclave Agar 13.5 a 121 C durante 15 minutos. Rojo neutro 0.03 Cristal violeta 0.001 pH final: 7.1 0.2
    • FundamentoEn el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para eldesarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezclade sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben eldesarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción enlas colonias, y la precipitación de las sales biliares.Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras. Resultados Microorganismos Colonias Escherichia coli Rojas con halo turbio Klebsiella pneumoniae Rosadas mucosas Salmonella typhimurium Incoloras, transparentes Shigella flexneri Incoloras, transparentes Proteus mirabilis Incoloras, transparentes Enterococcus faecalis Diminutas, incoloras, opacas
    • Características del medioMedio preparado: rojo púrpura
    • Estafilococo 110 AgarEs un medio selectivo para el aislamiento y diferenciación presuntiva deestafilococos, en base a la producciónde pigmentos, la fermentación demanitol y la hidrólisis de gelatina, a partir de alimentos y otras muestras. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Extracto de levadura 2.5 Tripteína 10.0 Suspender 149 g del medio en un Gelatina 30.0 litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a Lactosa 2.0 ebullición durante 1 o 2 minutos. D-Manitol 10.0 Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 C. Verter en placas y Cloruro de sodio 75.0 mezclar para dispersar el Fosfato dipotásico 5.0 precipitado. Agar 15.0 pH final: 7.0 0.2
    • FundamentoStaphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicaciónalimentaria, y para su aislamiento, pueden usarse distintos medios sólidosselectivos: Baird Parker Medio, Manitol Salado Agar, o Estafilococo Medio110.En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la tripteína aportan losnutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato dela enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbonofermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentración, parainhibir el desarrollo de la flora acompañante excepto Staphylococcus spp.,lográndose así un medio selectivo para el desarrollo de estos microorganismos.Las ventajas de este medio por sobre los otros mencionados anteriormente,es que permite, en la misma placa, obtener pruebas de identificaciónpresuntiva de especie como ser: desarrollo de pigmentos, fermentación demanitol e hidrólisis de la gelatina.
    • ResultadosObservar las características de las colonias y realizar las pruebas deidentificación de microorganismos.1-Fermentación de manitol: agregar unas gotas de púrpura debromocresol a las zonas donde se encuentran las colonias sospechosas yen una zona de la placa donde no hay desarrollo bacteriano. Comparar elcolor desarrollado entre estas dos zonas.Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona decrecimiento bacteriano. El medio sin desarrollo de microorganismospermanece sin cambio.Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimientobacteriano y la zona sin inocular.
    • 2-Hidrólisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solución saturada de sulfato de amonio y colocar en estufa, a 35-37 ºC, en aerobiosis durante 10 minutos. Positiva: halo transparente alrededor de las colonias. Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.Resultados Microorganismo Pigmento Fermentación de Hidrólisis de Prueba de la manitol la gelatina coagulasa S. aureus + + + + S. aureus + + + + S. epidermidis - - + - Características del medio Medio preparado: ámbar claro, opalescente con precipitado .
    • Sal y Manitol AgarMedio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento ydiferenciación de estafilococos.Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partirde muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materialesde importancia sanitaria.También, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halófilasde Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, MedioMarino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Extracto de carne 1.0 Pluripeptona 10.0 Suspender 111 g de polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y d-Manitol 10.0 mezclar calentando a ebullición Cloruro de sodio 75.0 durante 1 o 2 minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121 C Agar 15.0 durante 15 minutos. Rojo de fenol 0.025 pH final: 7.4 0.2
    • FundamentoSe trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio;las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de unazona roja o púrpura. Las colonias sospechosas, se repicarán en un medio sin excesode cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuentede carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbonofermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es elagente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo fenoles el indicador de pH.
    • Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal yfermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH delmedio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo.Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o nofermentar el manitol.Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizancomo colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color.Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como coloniasrojas, rodeadas de una zona del mismo color o púrpura.
    • Resultados Microorganismos Crecimiento Características de las colonias Staphylococcus aureus ATCC 25923 Excelente Amarilla Staphylococcus epidermidis ATCC Bueno Roja 14990 Escherichia coli ATCC 25922 Inhibido Inhibido Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Inhibido InhibidoCaracterísticas del medioMedio preparado: rojo
    • Salmonella Shigella AgarMedio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunasespecies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en loscuales se sospeche su presencia. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Pluripeptona 5.0 Extracto de carne 5.0 Suspender 60 g del polvo por litro de Lactosa 10.0 agua destilada. Reposar 5 minutos y Mezcla de sales biliares 8.5 mezclar hasta homogeneizar. Citrato de sodio 8.5 Calentar a ebullición durante 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN Tiosulfato de sodio 8.5 AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50 C y Citrato férrico 1.0 distribuir unos 20 ml por placa. Secar la superficie del medio unos Agar 13.5 minutos en la estufa. Verde brillante 0.00033 Rojo neutro 0.025 pH final: 7.0 0.2
    • FundamentoEs un medio de cultivo selectivo y diferencial.La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben eldesarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y eldesarrollo invasor del Proteus spp.Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácidosulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio.Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar,acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndosecolonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa,crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes.La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negrodebido a la formación de sulfuro de hierro.
    • Resultados Microorganismos Colonias Salmonella typhimurium Transparentes, centro negro Shigella flexneri Incoloras Shigella sonnei Incoloras Proteus mirabilis Transparentes, centro negro Escherichia coli Rosadas a rojas Klebsiella pneumoniae Rosadas cremosas y mucosas Incoloras, de muy escaso Enterococcus faecalis crecimientoCaracterísticas del medioMedio preparado: rojo naranja.
    • A. Klebsiella pneumoniae. Acid + Lac + B. Escherichia coli .Acid + Lac +C: Salmonella sp..H2S D: Proteus mirabilis H2S E: Pseudomona aeruginosa
    • Mueller Hinton AgarEste medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba desensibilidad a los antimicrobianos. Además es útil con el agregado de sangrepara el cultivo y aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Infusión de carne 300.0 Suspender 37 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar Peptona ácida de caseína 17.5 embeber de 10 a 15 minutos. Calentar Almidón 1.5 con agitación frecuente y hervir durante 1 minuto. Esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Enfriar a 45 -50 C y distribuir a cajas de Petri (o agregar los Agar 15.0 suplementos que se desee) hasta un nivel de 4 mm sobre una superficie horizontal (25-30 ml en placas de 9 cm de diámetro). pH final: 7.3 0.1
    • FundamentoEl Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), recomendó su uso en forma rutinaria para la realización del antibiograma en medio sólido, debido a una serie de factores :• presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad,• su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es bajo,• la mayoría de los patógenos crece satisfactoriamenteCuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, es útil para realizar las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en especies de estreptococos.
    • Resultados Consultar en la sección “prueba de sensibilidad a los antimicrobianos”, la metodología apropiada.Características del medioMedio preparado: ámbar. Chromobacterium violaceum Pseudomona aeruginosa Streptococcus pyogenes
    • Cerebro Corazón InfusiónMedio líquido adecuado para el enriquecimiento y cultivo de bacteriasaerobias y anaerobias, de microorganismos exigentes como estreptococos,neumococos y otros microorganismos de difícil desarrollo.Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 µg/ml de amicacina, se utilizaeste medio para el cultivo de hongos patógenos. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Infusión de cerebro de ternera 200.0 Suspender 37 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición Infusión corazón vacuno 250.0 hasta disolver completamente. Peptona 10.0 Esterilizar en autoclave a 121 C durante Cloruro de sodio 5.0 15 minutos. Los tubos que no se usen inmediatamente deberán calentarse en Glucosa 2.0 un baño hirviendo para la eliminación del oxígeno retenido. Enfriar Fosfato disódico 2.5 rápidamente sin agitar. pH final: 7.4 0.2
    • FundamentoEs un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollomicrobiano. La infusión de cerebro de ternera, la infusión de corazón vacuno yla peptona, son la fuente de carbono, nitrógeno, y vitaminas.La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantieneel balance osmótico y el fosfato disódico otorga capacidad buffer.Los nutrientes de este caldo son muy apropiados para los hemocultivos, yaque en esta infusión desarrollan todas las especies de estreptococos exceptolos tiol y piridoxal dependientes.Los estafilococos que crecen en esta infusión suelen dar mejores reaccionesen la prueba de la coagulasa.Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 µg/ml de amicacina, se inhibe laflora bacteriana cuando se utiliza este medio para el cultivo de hongospatógenos.
    • ResultadosExaminar los tubos para evaluar el crecimiento por turbiedad. Cuando seanecesario, subcultivar en medios sólidos apropiados y realizar la identificaciónbioquímica. Microorganismos Crecimiento Neisseria meningitidis Bueno a excelente Neisseria gonorrhoeae Bueno a excelente Streptococcus pyogenes Bueno a excelente Streptococcus pneumoniae Bueno a excelenteCaracterísticas del medioMedio preparado: ámbar claro, sin precipitado. 왼왼uninoculated tube : 왼왼Neisseria meningitidis : 왼왼왼 : Strepcococcus pyogenes
    • Tetrationato Caldo.Medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonellaspp. a partir de heces, orina, alimentos y otros materiales de importanciasanitaria. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona 5.0 Suspender 46 g del polvo en 1 litro de Sales biliares 1.0 agua destilada. Mezclar vigorosamente y Carbonato de calcio 10.0 llevar a ebullición. Enfriar a 45 C o menos. Agregar 20 ml de solución Tiosulfato de sodio 30.0 iodurada. Mezclar y distribuir 10 ml por pH final: 8.4 0.2 tubo, en tubos estériles. No debe calentarse luego de agregar la solución Solución iodo iodurada iodada. El medio base puede mantenerse Iodo 6.0 a 4 C , dura varios meses, pero una vez Ioduro de potasio 5.0 agregada la solución iodada debe usarse en el mismo día. Agua 20.0
    • FundamentoEl medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios parael desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbemetabolitos tóxicos.La selectividad está dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato(generado en el medio por el agregado de la solución iodo-iodurada) y salesbiliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzimatetrationato reductasa, como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de laflora acompañante.Para evitar la proliferación de especies de Proteus spp., se recomienda agregar40 mg/l de Novobiocina, antes de la solución iodada
    • Resultados Microorganismos Crecimiento Salmonella typhi Escaso Salmonella typhimurium Bueno-excelente Salmonella enteritidis Bueno-excelente Escherichia coli EscasoCaracterísticas del medio Medio preparado: suspensión blanco lechosa.
    • Stuart Medio de Transporte Medio destinado a la recolección, transporte y preservación de muestras clínicas aptas para exámenes bacteriológicos. Es útil para mantener la viabilidad de gonococos y de otros microorganismos de difícil desarrollo. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Tioglicolato de sodio 0.9 Suspender 14,1 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos. Glicerofosfato de sodio 10.0 Calentar a ebullición hasta disolución Cloruro de calcio 0.1 total. Distribuir en tubos con cierre a Azul de metileno 0.002 rosca (para evitar oxidación) llenándolos hasta 2/3 del tubo. Agar 3.0 Esterilizar 15 minutos a 121ºC. Dejar solidificar en posición vertical. pH final: 7.4 0.2
    • FundamentoMedio semisólido, no nutritivo.Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un ambiente reducido y es útilpara suprimir cambios oxidativos en el medio de transporte, y azul demetileno, que es el indicador de oxido reducción.De esta manera se favorece la viabilidad de los microorganismos durante suenvío al laboratorio. Cooper encontró que usando hisopos impregnados concarbón bacteriológico se recuperan en forma exitosa numerosos patógenosentéricos y respiratorios.
    • ResultadosLos tubos con medio de transportese subcultivan en medios sólidosapropiados según la muestra y elmicroorganismo que se quieraaislar. Luego de la incubación, debehaber escasa o nula reducción de laviabilidad de los microorganismos.Características del medioMedio preparado: ligeramenteopalescente con tonalidad azuldependiendo del grado deoxidación.
    • PruebasBioquímicas
    • INTRODUCCIÓNCon frecuencia, la identidad de una especie requiere que se conozca demanera detallada su actividad bioquímica, porque otras características noson suficientemente distintivas o diferenciales.
    • En el laboratorio disponemos de numerosas técnicas para lacaracterización bioquímica de una especie.Además de los productos finales de los procesos metabólicos, tambiénse necesita conocer con detalle como se producen estos cambios, comoocurren paso a paso las reacciones químicas, cuáles enzimasintervienen, cuales son los productos intermediarios además de que sedeben reconstruir las secuencias de las reacciones bioquímicas quetienen lugar dentro de la célula.En general el microorganismo se cultiva en medios que contienen unasustancia nutritiva específica o sustrato y después de la incubación delcultivo se examina para ver los cambios químicos que hayan ocurrido. Enterotube II
    • Kligler Hierro Agar Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiología de alimentos para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa y lactosa, y a la producción de ácido sulfhídrico. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona de carne 13.0 Cloruro de sodio 5.0 Suspender 54.8 g del polvo por litro de Lactosa 10.0 agua destilada. Mezclar bien y calentar Tripteina 10.0 con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución total. Llenar Glucosa 1.0 hasta la tercera parte de los tubos de Citrato de hierro y amonio 0.5 ensayo. Esterilizar a 121 C por 15 Tiosulfato de sodio 0.3 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo. Rojo de fenol 0.025 Agar 15.0 pH final: 7.3 0.2
    • Fundamento•En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteína, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.•La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables.•El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro.•El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agar es el agente solidificante. • Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido.•El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.
    • Resultados1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismosolamente fermenta la glucosa.2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismofermenta glucosa, y lactosa.3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es nofermentador de azúcares.4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que elmicroorganismo produce gas.5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácidosulfhídrico.
    • Características delmedioMedio preparado: rojo
    • TSI AgarMedio universalmente empleado para la diferenciación deenterobacterias, en base a la fermentación de glucosa,lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Extracto de carne 3.0 Pluripeptona 20.0 Cloruro de sodio 5.0 Suspender 62,5 g del polvo por litro Lactosa 10.0 de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitación frecuente, Sacarosa 10.0 hervir 1 o 2 minutos hasta disolución Glucosa 1.0 total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a Sulfato de hierro y amonio 0.2 121 C por 15 minutos. Enfriar en pico Tiosulfato de sodio 0.2 de flauta profundo. Rojo de fenol 0.025 Agar 13.0 pH final: 7.3 0.2
    • FundamentoEn el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona,aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbonofermentables.El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción deácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de ionesFe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producensulfuro de hierro, de color negro.El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantieneel balance osmótico.Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectanpor medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo enmedio ácido.El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el quereacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfurode hierro de color negro.
    • Características del medio Medio preparado: rojo
    • Resultados
    • Lisina Hierro AgarMedio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmenteSalmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina yen la producción de ácido sulfhídrico. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona de gelatina 5.0 Suspender 35 g del medio Extracto de levadura 3.0 deshidratado en un litro de agua Glucosa 1.0 destilada. Dejar embeber unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente, Lisina 10.0 agitando con frecuencia y hervir Citrato de hierro y amonio 0.5 durante un minuto hasta la disolución completa. Distribuir y esterilizar a Tiosulfato de sodio 0.04 121 C durante 15 minutos. Enfriar en Púrpura de bromocresol 0.02 pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la punción. Agar 15.0 pH final: 6.7 0.2
    • FundamentoEn el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan losnutrientes para el desarrollo bacteriano.La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustratoutilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa.El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de laproducción de ácido sulfhídrico.El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo apH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcalinizael medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta.La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que esnecesario que la glucosa sea previamente fermentada.
    • Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que sonfermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio decultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de colorvioleta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento delmedio debido a la formación de sulfuro de hierro.Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas deMorganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, elcual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizoen la superficie del medio.
    • Resultados1- Decarboxilación de la lisina: -Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. -Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.2-Desaminación de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp.3-Producción de ácido sulfhídrico: -Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en ellímite del pico y fondo)Características del medioMedio preparado: color violeta.
    • Color en el pico de flauta Ennegrecimiento Microorganismos Color en la base del tubo del medio Proteus mirabilis Rojo Amarillo NegativoSalmonella typhimurium Púrpura Púrpura Positivo Salmonella enteritidis Púrpura Púrpura Positivo Providencia spp. Rojo Amarillo Negativo Citrobacter freundii Púrpura Amarillo Positivo Morganella spp. Rojo Amarillo Negativo Edwarsiella spp. Púrpura Púrpura PositivoKlebsiella pneumoniae Púrpura Púrpura Negativo Escherichia coli Púrpura Púrpura Negativo
    • MIO MedioMedio usado para la identificación de Enterobacteriaceae en base a su movilidad,actividad de ornitina decarboxilasa y producción de indol. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Dextrosa 1.0 Extracto de levadura 3.0 Suspender 31 g del polvo en un Peptona 10.0 litro de agua destilada. Calentar Tripteína 10.0 a ebullición hasta completa Clorhidrato de L-ornitina 5.0 disolución. Distribuir en tubos y esterilizar 15 minutos a 121 C. Agar 2.0 Púrpura de bromocresol 0.02 pH final: 6.5 0.2
    • FundamentoMedio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia deextracto de levadura, peptona y tripteína.Además, la tripteína aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de laenzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol.La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustratopara la detección de la enzima ornitina decarboxilasa, el púrpura debromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color púrpuray en medio ácido es amarillo.Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo:movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol.
    • La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimientoque difunde mas allá de la línea de inoculación.La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio.Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo unacondición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresolvire al amarillo.La presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de laenzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente.Por decarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje delindicador hacia el color púrpura.El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos quecontienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego deagregar unas gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich, indica un resultadopositivo.
    • Resultados 1-Movilidad: -Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la línea de siembra. -Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra. 2-Ornitina decarboxilasa: -Resultado positivo: color púrpura. -Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio. 3-Prueba del indol: La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. -Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador. -Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro- amarillento.Características del medioMedio preparado: púrpura transparente a ligeramente opalescente.
    • SIM MedioEs un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indoly de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembrosde la familia Enterobacteriaceae. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Tripteína 20.0 Suspender 30 g del polvo por litro de agua Peptona 6.1 destilada. Mezclar hasta disolver; calentar agitando y hervir durante un minuto. Distribuir Sulfato de hierro y amonio 0.2 unos 4 ml en tubos de hemólisis y esterilizar Tiosulfato de sodio 0.2 en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Agar 3.5 Solidificar en posición vertical. pH final: 7.3 0.2
    • FundamentoEl triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, yparticularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacteriaspara formar indol.En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa.El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac s o deErlich, para originar un compuesto de color rojo.Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez queproducen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepasproductoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitadonegro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio semantenga a un pH mayor a 7.2.
    • ResultadosCepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende masallá de la línea de siembra.Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la líneade siembra.Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea desiembra o en todo el medio.Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar elreactivo de Kovac s o de Erlich.Cepas indol negativas: sin cambio de color.
    • Características del medio Medio preparado: ámbar.
    • UreaMedio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a laactividad ureásica. Es particularmente útil para diferenciar Proteus spp.de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Urea 20.0 Suspender 3, 87 g del medio Fosfato monopotásico 9.1 deshidratado por cada 100 ml de agua destilada. Disolver sin calentar Fosfato disódico 9.5 y esterilizar por filtración. Distribuir Extracto de levadura 0.1 en tubos pequeños estériles, entre 0,5 y 2 ml. Rojo fenol 0.01 pH final: 6.8 ± 0.2
    • FundamentoEste medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajocontenido de nutrientes y alta capacidad buffer.El extracto de levadura es la única fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas ycofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano.Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es elindicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrogenoproveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amoníaco y dióxido decarbono. Estos productos metabólicos alcalinizan el medio, haciendo virar elindicador rojo fenol del amarillo al rojo.Su uso, se recomienda para diferenciar Proteus spp. de otros géneros.
    • Características del medio Medio preparado: anaranjado.
    • Urea-1 Uninoculated Control,2 Proteus Vulgaris,3 E. coli
    • Simmons Citrato AgarMedio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a lacapacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Citrato de sodio 2.0 Cloruro de sodio 5.0 Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Fosfato dipotásico 1.0 Dejar reposar 5 minutos y mezclar Fosfato monoamónico 1.0 calentando a ebullición durante 1 o 2 Sulfato de magnesio 0.2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 Azul de bromotimol 0.08 minutos. Enfriar en posición inclinada. Agar 15.0 pH final: 6.9 0.2
    • FundamentoEn el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno yel citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes sonnecesarios para el desarrollo bacteriano.Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactorenzimático.El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es elindicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino.El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces deutilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como únicafuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.
    • El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citratoda progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.Resultados -Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. -Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color. Microorganismo Citrato permeasa Color del medio Klebsiella pneumoniae Positivo Azul S. typhimurium Positivo Azul E. coli Negativo Verde S. flexneri Negativo Verde
    • Características del medioMedio preparado: verde.
    • Gracias!