OBTENCION Y CARACTERIZACIONOBTENCION Y CARACTERIZACIONDE CELULAS MESENQUIMATOSAS DE CELULAS MESENQUIMATOSASDEL CORDON UMBI...
Introducción                                MESENQUIMA                  Neoplasias                   Ingeniería  Síndromes...
CORDON UMBILICAL          Circulación feto placentaria                                    Epitelio Amniótico              ...
• Presencia de células con morfología similar al  fibroblasto que expresan colágeno tipo V y VII en  la gelatina de Wharto...
Mesenquima.             Mesenquima.• Células mesodérmicas multipotenciales indiferenciadas• MORFOLOGIA ESTRELLADA• EMBEBID...
Materiales y Métodos Consentimiento informado       Cultivo Primario      Primer Subcultivo                  Segundo Subcu...
Inmunocitoquímica FGFR3           Permeabilización          Anti FGFR3     Ig G anticonejo  Coloración           Revelado
Inmunocitoquímica BrdU        BrdU            HCL             Bórax       Permeabilizar   Anti BrdU AcMo 2ª               ...
Resultados            Resultados                    Gelatina de Wharton    Inmunohistoquímica.     H.E. 100 x         anti...
CULTIVO PRIMARIO      PRIMER SUBCULTIVO                          SEGUNDO SUBCULTIVO
Expresión de FGFR 3 Expresión de FGFR 3     en cultivos de C.U.H.     en cultivos de C.U.H.                          Contr...
Incorporación BrdUIncorporación BrdU            Control
Cinética celular    COMPARACIÓN ENTRE CULTIVOS EN EL MARCAJE                   CON BrdUNEGATIVOS                          ...
Inmunocaracterización        COMPARACIÓN ENTRE CULTIVOS EN EL              MARCAJE DEL FGFR3 80 60 40                     ...
Discusión• Alta expresión del FGFR3, en el conjuntonúcleo / citoplasma (73,9 %). La distribuciónde la expresión en el núcl...
Discusión• La tasa de síntesis de ADN fue bastante baja(19,07%) en los cultivos primarios, estoconcuerda con la baja capac...
Discusión♦ Aumento de la proliferación celular en el primer pasaje de cultivo celular (45%)♦ Inmunomarcaje con FGFR-3.    ...
Conclusiones• Distribución del FGFR3 (Núcleo/Citoplasma)• Baja tasa de replicación• Las células aisladas del C.U.H. se pue...
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Cultivo de células stem de cordón umbilical humano

  1. 1. OBTENCION Y CARACTERIZACIONOBTENCION Y CARACTERIZACIONDE CELULAS MESENQUIMATOSAS DE CELULAS MESENQUIMATOSASDEL CORDON UMBILICAL HUMANO DEL CORDON UMBILICAL HUMANO Juan C. Munévar; J. Castellanos; M. Martínez; H Hurtado; G. Lafaurie.
  2. 2. Introducción MESENQUIMA Neoplasias Ingeniería Síndromes Tisular TraumaCélulas Madre Violencia
  3. 3. CORDON UMBILICAL Circulación feto placentaria Epitelio Amniótico Arterias Adventicia Vena Gelatina de Wharton Estructuralmente el C.U.H. esta formado por Matriz extracelular mucoide (M.E.C.), células mesenquimatosas, células semejantes a fibroblastos, células musculares, endotelio. Takechi y col, 1993
  4. 4. • Presencia de células con morfología similar al fibroblasto que expresan colágeno tipo V y VII en la gelatina de Wharton. Nanaev y Col 1997, Rayynanen y Col 1993• Cultivo in vitro de células semejantes a los fibroblastos aisladas de la gelatina de Wharton. Pelletier y col, 1986, McElreavey y col, 1991 • Revestimiento biológico en quemados; acelera la cicatrización, favorece el control de infecciones. Banerjee, 1987
  5. 5. Mesenquima. Mesenquima.• Células mesodérmicas multipotenciales indiferenciadas• MORFOLOGIA ESTRELLADA• EMBEBIDAS EN UNA Sustancia Fundamental Amorfa • CAPACIDAD DE PRODUCIR EN EL ADULTO TEJIDO DE REPARACION DIFERENCIADO NO SECRETAN UNA M.E.C. ESPECIFICA •• NO SECRETAN UNA M.E.C. ESPECIFICA Bruder S y col. J Cell Biochem. 64: 278- 94 (1997)
  6. 6. Materiales y Métodos Consentimiento informado Cultivo Primario Primer Subcultivo    Segundo Subcultivo
  7. 7. Inmunocitoquímica FGFR3 Permeabilización Anti FGFR3 Ig G anticonejo Coloración Revelado
  8. 8. Inmunocitoquímica BrdU BrdU HCL Bórax Permeabilizar Anti BrdU AcMo 2ª      Coloración Revelado
  9. 9. Resultados Resultados   Gelatina de Wharton Inmunohistoquímica. H.E. 100 x anti FGFR 3. 400 x
  10. 10. CULTIVO PRIMARIO PRIMER SUBCULTIVO    SEGUNDO SUBCULTIVO
  11. 11. Expresión de FGFR 3 Expresión de FGFR 3 en cultivos de C.U.H. en cultivos de C.U.H. Control   Núcleo celular Núcleo/Citoplasma
  12. 12. Incorporación BrdUIncorporación BrdU   Control
  13. 13. Cinética celular COMPARACIÓN ENTRE CULTIVOS EN EL MARCAJE CON BrdUNEGATIVOS SEGUNDO SUBCULTIVO% PRIMER SUBCULTIVO%POSITIVOS    CULTIVO PRIMARIO% 0 20 40 60 80 100
  14. 14. Inmunocaracterización COMPARACIÓN ENTRE CULTIVOS EN EL MARCAJE DEL FGFR3 80 60 40   20 0   NUCLEO CITOPLASMAPRIMARIO % PRIMER SUBCULTIVO % SEGUNDO SUBCULTIVO %
  15. 15. Discusión• Alta expresión del FGFR3, en el conjuntonúcleo / citoplasma (73,9 %). La distribuciónde la expresión en el núcleo fueaproximadamente cuatro veces mayor. En elcitoplasma la expresión fue demasiado baja.   • Cuando se compararon los tres cultivos(primario, primer y segundo pasajes) seencontró una tendencia similar.
  16. 16. Discusión• La tasa de síntesis de ADN fue bastante baja(19,07%) en los cultivos primarios, estoconcuerda con la baja capacidad deproliferación que caracteriza a las célulasmesenquimatosas indiferenciadas. Pelletier y col, 1986.   en• Se podría decir que  general las células delcultivo primario aisladas del cordón umbilicalhumano no poseen una alta tasa replicación.
  17. 17. Discusión♦ Aumento de la proliferación celular en el primer pasaje de cultivo celular (45%)♦ Inmunomarcaje con FGFR-3. - 2 tipos de marcaje predominantes - Nuclear y núcleo/citoplasma.♦ Según la literatura   las células FGFR-3 + son   precursoras (¿precondrocitos?) Robinson D, Zvi Nevo, Clin Orthop. 1999
  18. 18. Conclusiones• Distribución del FGFR3 (Núcleo/Citoplasma)• Baja tasa de replicación• Las células aisladas del C.U.H. se puedenconsiderar precursoras conjuntivas.• Las células mantienen el estado de diferenciacióndurante los subcultivos.• ¿Existirían diferentes estadios de diferenciación o   actividad celular in -vitro?• Estudios adicionales para reafirmar esta posiciónutilizando por ejemplo factores solubles queestimulen la diferenciación.

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