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Cultivo de células stem de cordón umbilical humano

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  • 1. OBTENCION Y CARACTERIZACIONOBTENCION Y CARACTERIZACIONDE CELULAS MESENQUIMATOSAS DE CELULAS MESENQUIMATOSASDEL CORDON UMBILICAL HUMANO DEL CORDON UMBILICAL HUMANO Juan C. Munévar; J. Castellanos; M. Martínez; H Hurtado; G. Lafaurie.
  • 2. Introducción MESENQUIMA Neoplasias Ingeniería Síndromes Tisular TraumaCélulas Madre Violencia
  • 3. CORDON UMBILICAL Circulación feto placentaria Epitelio Amniótico Arterias Adventicia Vena Gelatina de Wharton Estructuralmente el C.U.H. esta formado por Matriz extracelular mucoide (M.E.C.), células mesenquimatosas, células semejantes a fibroblastos, células musculares, endotelio. Takechi y col, 1993
  • 4. • Presencia de células con morfología similar al fibroblasto que expresan colágeno tipo V y VII en la gelatina de Wharton. Nanaev y Col 1997, Rayynanen y Col 1993• Cultivo in vitro de células semejantes a los fibroblastos aisladas de la gelatina de Wharton. Pelletier y col, 1986, McElreavey y col, 1991 • Revestimiento biológico en quemados; acelera la cicatrización, favorece el control de infecciones. Banerjee, 1987
  • 5. Mesenquima. Mesenquima.• Células mesodérmicas multipotenciales indiferenciadas• MORFOLOGIA ESTRELLADA• EMBEBIDAS EN UNA Sustancia Fundamental Amorfa • CAPACIDAD DE PRODUCIR EN EL ADULTO TEJIDO DE REPARACION DIFERENCIADO NO SECRETAN UNA M.E.C. ESPECIFICA •• NO SECRETAN UNA M.E.C. ESPECIFICA Bruder S y col. J Cell Biochem. 64: 278- 94 (1997)
  • 6. Materiales y Métodos Consentimiento informado Cultivo Primario Primer Subcultivo    Segundo Subcultivo
  • 7. Inmunocitoquímica FGFR3 Permeabilización Anti FGFR3 Ig G anticonejo Coloración Revelado
  • 8. Inmunocitoquímica BrdU BrdU HCL Bórax Permeabilizar Anti BrdU AcMo 2ª      Coloración Revelado
  • 9. Resultados Resultados   Gelatina de Wharton Inmunohistoquímica. H.E. 100 x anti FGFR 3. 400 x
  • 10. CULTIVO PRIMARIO PRIMER SUBCULTIVO    SEGUNDO SUBCULTIVO
  • 11. Expresión de FGFR 3 Expresión de FGFR 3 en cultivos de C.U.H. en cultivos de C.U.H. Control   Núcleo celular Núcleo/Citoplasma
  • 12. Incorporación BrdUIncorporación BrdU   Control
  • 13. Cinética celular COMPARACIÓN ENTRE CULTIVOS EN EL MARCAJE CON BrdUNEGATIVOS SEGUNDO SUBCULTIVO% PRIMER SUBCULTIVO%POSITIVOS    CULTIVO PRIMARIO% 0 20 40 60 80 100
  • 14. Inmunocaracterización COMPARACIÓN ENTRE CULTIVOS EN EL MARCAJE DEL FGFR3 80 60 40   20 0   NUCLEO CITOPLASMAPRIMARIO % PRIMER SUBCULTIVO % SEGUNDO SUBCULTIVO %
  • 15. Discusión• Alta expresión del FGFR3, en el conjuntonúcleo / citoplasma (73,9 %). La distribuciónde la expresión en el núcleo fueaproximadamente cuatro veces mayor. En elcitoplasma la expresión fue demasiado baja.   • Cuando se compararon los tres cultivos(primario, primer y segundo pasajes) seencontró una tendencia similar.
  • 16. Discusión• La tasa de síntesis de ADN fue bastante baja(19,07%) en los cultivos primarios, estoconcuerda con la baja capacidad deproliferación que caracteriza a las célulasmesenquimatosas indiferenciadas. Pelletier y col, 1986.   en• Se podría decir que  general las células delcultivo primario aisladas del cordón umbilicalhumano no poseen una alta tasa replicación.
  • 17. Discusión♦ Aumento de la proliferación celular en el primer pasaje de cultivo celular (45%)♦ Inmunomarcaje con FGFR-3. - 2 tipos de marcaje predominantes - Nuclear y núcleo/citoplasma.♦ Según la literatura   las células FGFR-3 + son   precursoras (¿precondrocitos?) Robinson D, Zvi Nevo, Clin Orthop. 1999
  • 18. Conclusiones• Distribución del FGFR3 (Núcleo/Citoplasma)• Baja tasa de replicación• Las células aisladas del C.U.H. se puedenconsiderar precursoras conjuntivas.• Las células mantienen el estado de diferenciacióndurante los subcultivos.• ¿Existirían diferentes estadios de diferenciación o   actividad celular in -vitro?• Estudios adicionales para reafirmar esta posiciónutilizando por ejemplo factores solubles queestimulen la diferenciación.