Criopreservación de células STEM de pulpa
dental humana (DPSCs)
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REGENERATIVA
Interés en las células Stem debido a
su enorme potencial terapéutico in vi...
Existe un interés científico generado por las aplicaciones terapéuticas
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• Auto renovación in vitro / in vivo
• Adherentes in vitro
• Potencial de diferenciación in vivo
• Reserva celular in vivo...
Gronthos S. J Dent Res. 2002; 81 (8): 531-5 y Iohara K J Dent Res. 2004; 83(8):590-5.
Caracterización
del fenotipo
Expresi...
INTRODUCCIÓN
Optimizar la seguridad y el control de calidad de los métodos empleados
in vitro con las células Stem para ap...
Evaluar la viabilidad y fenotipo de células
Stem de pulpa dental humana sometidas a 2
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Pacientes
18- 31 años
48 dientes
sanos
Premolares y
molares
erupcionados
Sistémicamente sanos
Cultivo
Células
CD105+
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Sección del diente
a nivel UAC
Procedimientos realizados
en la Clínica el Bosque
Luego de la exodoncia se
sumergió el dien...
DMEM suplementado SFB 10%
1. TRANSPORTE DE LA MUESTRA 2. DISGREGACION DE LA PULPA DENTAL
Mecánica Enzimática
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media
MILTENYI
Biotec
5. Expansión in vitro CD105+
Incubación 37°C,
Atmósfera húmeda
5% de CO2, 70%
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Protocolos de criopreservación
Método de Papaccio y col/2006
Método de Kamath, A.
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PROTOCOLO DE DESCONGELACIÓN
Retiro de criovial DPSCs que
se encontraba a
-196ºC en tanques de
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CITOMETRÍA DE FLUJO
EVALUACIÓN DE LA PRESERVACIÓN DEL FENOTIPO Y VIABILIDAD POST CRIOPRESERVACIÓN
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DATOS DESCRIPTIVOS DE OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
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Microscopia De Contraste De Fase
Expansión in vitro
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DISCUSIÓN
METODOLOGÍA
Disgregación mecánica /
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DISCUSIÓN
La Disgregación enzimática posiblemente afecte los resultados, Woods et
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DISCUSIÓN
CULTIVO CELULAR
En nuestro estudio DPSCs presentaron morfología
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Nuestroestudio
•CITOMETRIA DE FLUJO
• Viabilidad exclusión 7-AAD
• Fenotipo D105+/CD73+/CD34-
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• 2 métodos de
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Las células Stem mesenquimales aisladas de pulpa dental, pueden ser
criopreservadas manteniendo la viabilidad celular y su...
Emplear marcadores específicos (STRO-1, CD 146,, CD105,
CD73, CD90, CD34, CD45) que caractericen el fenotipo de las
DPSCs ...
Evaluar a largos tiempos de criopreservación ( ≥1año)
con mayores criterios de evaluación.
Evaluar el potencial de regener...
¡GRACIAS UIBO!
Agradecimientos
Dra. Andrea Villegas
Dr. Carlos Terán
Dr. Jorge Gruber
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Criopreservacion Stem cells pulpa dental humana

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  • Desde tiempos inmemorables el hombre ha tenido una fascinacion por entender la capacidad del cuerpo para reparar o reemplazar las celulas o tejidos del organimos. Una de las principales lineas de investigacion en regeneracion e ingenieria tisular son las celulasstem debido a su gran potencial terapeutico.
  • De hecho existen reportes en la literatura cientifica donde se demuestra el potencial de diferenciacioninvitro e invivo y su uso en ingenieria tisular para la sintesis de organos de reemplazo como dientes y condilos a partir de celulasstemmesenquimales adultas. Estas celulas tienen aplicación clinica en pacientes que presenten lesiones irreversibles de organos y tejidos morfologicos y/o funcionales como consecuencia de sindromes, enfermedades cronicas, tumores, o accidentes.
  • Debemos saber que las celulasstem pueden proveenir del embrionespecificamente de la masa celular interna a las 4 semanas de desarrollo. Estas celulas no las utilizamos ya q generan conflicto etico y legal. Centramos nuestra investigacion en el uso de celulasstem adultas las cuales son celulas troncales, multipotenciales que se encuentran en los tejidos de los seres humanos en etapa posnatal. Encontramos en el cuerpo humano celulasstemmesenquimales las cuales pueden dar lugar a tejido y organos derivados del mesodermo, las cuales son de nuestra interes por ser el diente, la pulpa y el periodonto de origen mesodermico. Las propiedades biologicas de las celulasstemmesequimales son consideradas como los criterios para la aplicación en medicina regenerativa, según la sociedad internacional de terapia celular.
  • Criopreservacion Stem cells pulpa dental humana

    1. 1. Criopreservación de células STEM de pulpa dental humana (DPSCs) GRUPO UNIDAD DE INVESTIGACIÓN BÁSICA ORAL U.I.B.O. Munévar Niño JC, Jiménez T, Tamayo MC, Dorta D, Gómez A, Rodríguez L, Velandia C, Forero J. FACULTAD DE ODONTOLOGÍA XVII Congreso Institucional de Investigaciones. Bogotá, Octubre 27 2010 REGENERACIÓN TISULAR Gutiérrez Collazos N,
    2. 2. REGENERACION TISULAR & ODONTOLOGIA REGENERATIVA Interés en las células Stem debido a su enorme potencial terapéutico in vivo
    3. 3. Existe un interés científico generado por las aplicaciones terapéuticas de células Stem mesenquimales adultas en el ser humano debido a: Lesiones irreversibles de órganos y tejidos Los productos de Ingeniería Tisular se basan en biomateriales novedosos que integran células Stem capaces de auto-renovarse o bien de diferenciarse en tipos celulares específicos. (neuronas, osteoblastos, condrocitos, queratinocitos) Thirumala S, Goebel W. S, Woods E. Clinical grade adult stem cell banking. Organogenesis. 5: 3. 143 – 54. 2009 Síndromes Enfermedades crónicas Neoplasias Trauma INJERTOS DE HUESO HUMANO DISEÑADOS ANATOMICAMENTE POR INGENIERIA
    4. 4. • Auto renovación in vitro / in vivo • Adherentes in vitro • Potencial de diferenciación in vivo • Reserva celular in vivo FRIEDENSTEIN A.J y col/1974 Friedenstein AJ, Deriglasova UF, Kulagina NN, Panasuk AF, Rudakowa SF, Luria EA, Ruadkow IA: Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol 1974, 2:83-92 Células Stem Adultas Mesenquimales  Medula ósea  Tejido adiposo  Sangre periférica  Sangre de Cordón Umbilical  Gelatina de Wharton  Placenta  Periostio  Ligamento periodontal  DPSCs  SHEDs  SCAPs  iPS Propiedades
    5. 5. Gronthos S. J Dent Res. 2002; 81 (8): 531-5 y Iohara K J Dent Res. 2004; 83(8):590-5. Caracterización del fenotipo Expresión de marcadores CD105+, CD73+, CD34-, CD45- SHED SCAPs PDLSCs iPS Desarrollar óptimos métodos de cultivo , expansión y criopreservacion DPSCs Gronthos S, Brahim J, Li W, Fisher LW, Cherman N, Booyde A, et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res. 2002; 81 (8): 531-5 Iohara K. Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2. J Dent Res. 2004; 83(8):590-5.
    6. 6. INTRODUCCIÓN Optimizar la seguridad y el control de calidad de los métodos empleados in vitro con las células Stem para aplicaciones terapéuticas in vivo. Brandon Perry, Dan Zhou, Xiaohua Wu. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derivded mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering: Part C. Volume 14, Number 2, 2008. CRIOPRESERVACION La criopreservación es el proceso de congelamiento de las células con el fin de reducir su actividad metabólica y mantenerlas a temperaturas reducidas durante tiempos prolongados, preservando al mismo tiempo su VIABILIDAD, FENOTIPO Y POTENCIAL DE DIFERENCIACIÓN.
    7. 7. Evaluar la viabilidad y fenotipo de células Stem de pulpa dental humana sometidas a 2 métodos de criopreservación en 3 tiempos diferentes.
    8. 8. Pacientes 18- 31 años 48 dientes sanos Premolares y molares erupcionados Sistémicamente sanos Cultivo Células CD105+ Consentimiento informado Comité Institucional de Ética en Investigación Estudio Experimental in vitro
    9. 9. Sección del diente a nivel UAC Procedimientos realizados en la Clínica el Bosque Luego de la exodoncia se sumergió el diente en NaOCl 5% y solución salina
    10. 10. DMEM suplementado SFB 10% 1. TRANSPORTE DE LA MUESTRA 2. DISGREGACION DE LA PULPA DENTAL Mecánica Enzimática Cámara de Neubauer 3. VIABILIDAD CELULAR Células CD105+ MILTENYI MiniMACS 4. SEPARACIÓN MAGNETICA
    11. 11. NH Stem cell media MILTENYI Biotec 5. Expansión in vitro CD105+ Incubación 37°C, Atmósfera húmeda 5% de CO2, 70% confluencia celular Papaccio et al/2006 Kamath Fischer Scientific 6. CRIOPRESERVACION P≤0.05 Test T Student U Mann Whitney 7. ANALISIS ESTADISTICO Control - fibroblastos Control + C.U.H.
    12. 12. Protocolos de criopreservación Método de Papaccio y col/2006 Método de Kamath, A. (SC Protocol Sheet: 00007 Thermo Fisher Scientific. Cellular engineering technologies, Inc.) Desprenden las DPSCs de la monocapa con EDTA 0.02% en PBS Retiro de monocapa se lava con PBS 10ml/75cm2 Conteo celular en hemocitometro Se agrega 5 ml de solución de Tripsina 0,5% (SH30042.01) Thermo Scientific HyClone Se deposita la suspensión celular en solución de criopreservacion DMSO 10% en SFB Incubación enzimática a 37ºC por 5 minutos Se deposita la suspensión celular en un criovial 4ºC durante 2hrs, luego a -70ºC por 16 hrs, Se agrega 5ml NH CFU-F y se centrifuga a 200rpm por 10 minutos Finalmente -196ºC en nitrógeno líquido hasta el proceso de descongelación Conteo celular en hemocitometro Se deposita la suspensión celular en solución de criopreservación DMSO 10%, SFB 70% y 20% NH CFU-F en nitrógeno líquido -196oC
    13. 13. PROTOCOLO DE DESCONGELACIÓN Retiro de criovial DPSCs que se encontraba a -196ºC en tanques de nitrógeno liquido Se deposito el criovial al baño maría bajo agitación moderada Bajo la cabina de flujo laminar se abrió cada criovial para transferir el contenido en tubos Falcon de 15 ml Se agregó 10 ml de solución de descongelamiento precalentada a la suspensión celular obtenida. La solución de descongelamiento consiste en 80% de Suero Fetal Bovino y 20% de NH Expansion Medium. Se centrifugó a 200 g durante 10 minutos la suspensión celular obtenida. Se retiró el sobrenadante para resuspender el pellet en 5 ml de medio de cultivo NH Expansion Medium y así realizar la incubación de los anticuerpos para evaluar viabilidad y fenotipo de las DPSCs mediante citometría de flujo.
    14. 14. CITOMETRÍA DE FLUJO EVALUACIÓN DE LA PRESERVACIÓN DEL FENOTIPO Y VIABILIDAD POST CRIOPRESERVACIÓN (FACS CANTO II Becton & Dickinson) Evaluación de la viabilidad mediante exclusión de 7-AAD (7 Amino-actinomicina D) Fenotipo CD105+/CD73+/CD34-/CD45- de la suspensión de células DPSCs sometidas a 2 procesos distintos de criopreservación en 3 tiempos diferentes. Marcaje fue leído en citómetro de flujo en U.I.B.O. reportando cada dato como porcentaje para cada marcador en cada condición.
    15. 15. DATOS DESCRIPTIVOS DE OBTENCIÓN DE LA MUESTRA VARIABLES PROMEDIO*/ FRECUENCIA DS* / %** Edad del paciente* n= 20 21 años +5.39 años* Tiempo de obtención de la muestra* 78` + 47.02`* Tiempo de procesamiento de la muestra* 197` + 41.91`* Tipo de diente Premolares 13 27%** 3ºs molares erupcionados 30 62,5%** 3ºs molares incluidos 5 10,4%** Total de dientes 48 100% *DS / **%
    16. 16. Microscopia De Contraste De Fase Expansión in vitro Morfología in vitro de células Stem de pulpa dental. 40x Unidades Formadora de Colonias (DPSCs). 10x Morfología in vitro de fibroblastos de la pulpa dental humana. 10 x MSC de Cordón Umbilical in vitro. 10x
    17. 17. Citometría de flujo Viabilidad De Células Stem De Pulpa Dental Humana postcriopreservación Evaluación Viabilidad De Células Stem De Pulpa Dental Humana postcriopreservación
    18. 18. Inmunofenotipificación 0.0% 10.0% 20.0% 30.0% 40.0% 50.0% 60.0% 70.0% 80.0% 90.0% 100.0% PORCENTAJEEXPRESIÓN MARCADORES CELULAS STEM MESENQUIMALES PULPA DENTAL FENOTIPO POST CRIOPRESERVACIÓN PAPACCIO 24 HORAS 7 DIAS 1 MES Porcentaje De Expresión De Marcadores de DPSCs Mediante Citometría De Flujo 0.0% 10.0% 20.0% 30.0% 40.0% 50.0% 60.0% 70.0% 80.0% 90.0% 100.0% PORCENTAJEEXPRESIÓN MARCADORES CELULAS STEM MESENQUIMALES PULPA DENTAL FENOTIPO POST CRIOPRESERVACIÓN KAMATH 24 HORAS 7 DIAS 1 MES 94.9% 97.3% 99.9% 98.1% Fenotipo De Células Stem De Pulpa Dental Humana Por Citometría De Flujo p≤0.05 p≤0.05
    19. 19. Zhang W, Walboomers XF, Shi S, Fan M, Jansen JA. Multilineage differentiation potential of stem cells derived from human dental pulp after cryopreservation. Tissue Eng. 2006 Oct; 12(10):2813-23. Estudios recientes describen métodos de caracterización, aislamiento y cultivo celular de DPSCs, pero no analizan factores relevantes sobre la efectividad de la criopreservación, como los presentados en este estudio Gronthos et al/2000. PNAS Miura et al/2003. PNAS. Papaccio et al/2006. J Cell Physiol. Iohara et al/ 2006. Stem Cells. Perry et al/2008. Tissue Eng Methods. Woods et al/ 2009. Cryobiology
    20. 20. Woods EJ, Perry BC, Hockema J, Larson L, Zhou D, Goebe W, et al. Optimized cryopreservation method for human dental pulp-derived stem cells and their tissues. Elseiver. Cryobiology. 2009; 59(2): 150-157. Woods y col/2009 Cryobiology Nuestro estudio 1 semana, 1 mes, 6 meses 1 día, 1 semana, 1 mes TIEMPO DE CRIOPRESERVACIÓN Estudio original e interesante para la biología de las DPSCs, es la primera vez que se comparan dos métodos de criopreservación reportados en la literatura científica mundial: El método de Papaccio y el método de Kamath. DISCUSIÓN
    21. 21. DISCUSIÓN METODOLOGÍA Disgregación mecánica / enzimática, procedimiento previo a la criopreservación semejante al empleado por Perry et al/2008. Seo et al/2005, criopreservación realizada directamente sin antes disgregar el tejido. Seo BM., Miura M, Sonoyama W, Coppe C, Stanyon R, Shi S, et al. Recovery of Stem Cells from Cryopreserved Periodontal Ligament. J Dent Res. 2005; 84(10): 907-912.
    22. 22. DISCUSIÓN La Disgregación enzimática posiblemente afecte los resultados, Woods et al/2009, quienes reportan en su estudio que es probable que el tejido pulpar digerido comprometa la integridad de la superficie de las membranas celulares. La disociación enzimática produce stress en las membranas y potencialmente pueden predisponer a crio lesiones leves. Papaccio G, Graziano A, d'Aquino R, Graziano MF, Pirozzi G, Menditti D, De Rosa A, Carinci F, Laino G. J Cell Physiol. Long-term cryopreserva-tion of dental pulp stem cells (SBP-DPSCs) and their differentiated osteoblasts: a cell source for tissue repair. 2006 Aug; 208(2):319-25.
    23. 23. DISCUSIÓN CULTIVO CELULAR En nuestro estudio DPSCs presentaron morfología estrellada, diámetro mayor al de los fibroblastos, núcleo esférico definido y no se observaron refringentes. Polisetty et al/2008, las células cultivadas tienen la capacidad para la formación de CFU que puede aumentar o disminuir con los números de pasajes. En algunos pozos se observó la formación de Unidades Formadoras de Colonias (CFU-F) Polisetty N, Fatima A, Madhira SL, Sangwan VS, Vemuganti GK. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Mol Vis. 2008; 14: 431-442.
    24. 24. Nuestroestudio •CITOMETRIA DE FLUJO • Viabilidad exclusión 7-AAD • Fenotipo D105+/CD73+/CD34- /CD45- • 2 métodos de criopreservación en 3 tiempos. Temmermanetal/2010 • Evalúa la viabilidad de fibroblastos de pulpa dental humana de acuerdo al porcentaje de confluencia alcanzado en el primer pasaje. • No evalúan el fenotipo celular con sus respectivos marcadores. Viabilidad y Fenotipo La criopreservación podría modificar la configuración espacial de la proteína de membrana celular comprometiendo su detección por citometría de flujo o bien quizás afecta su estadio de diferenciación celular. Temmerman L, Beele H, Dermaut LR, Van Maele G, De Pauw GA. Influence of cryopreservation on the pulpal tissue of immature third molars in vitro. Cell Tissue Bank. 2010 Aug;11(3):281-9.
    25. 25. Las células Stem mesenquimales aisladas de pulpa dental, pueden ser criopreservadas manteniendo la viabilidad celular y sus propiedades biológicas, lo que genera posibilidades para la creación de un banco de células Stem de pulpa dental (DPSC). Los resultados demuestran que según el método de congelación empleado se modifica la expresión de los marcadores que caracterizan el fenotipo de las DPSCs.
    26. 26. Emplear marcadores específicos (STRO-1, CD 146,, CD105, CD73, CD90, CD34, CD45) que caractericen el fenotipo de las DPSCs establecidos por las sociedades científicas de células Stem para un próximo estudio. Usar reactivos humanos libres de proteína animal para cultivar, expandir y criopreservar células Stem mesenquimales de pulpa dental para futuras aplicaciones terapéuticas en la práctica clínica odontológica.
    27. 27. Evaluar a largos tiempos de criopreservación ( ≥1año) con mayores criterios de evaluación. Evaluar el potencial de regeneración in vivo (animales) después de la criopreservación de DPSCs
    28. 28. ¡GRACIAS UIBO! Agradecimientos Dra. Andrea Villegas Dr. Carlos Terán Dr. Jorge Gruber Residentes II año Endodoncia

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