CICLO CELULAR, REGULACION DEL CRECIMIENTO CELULAR, INTEGRACION DE CELULAS EN TEJIDOS, APOPTOSIS

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  • Los tejido fueron fijados en formol al 10% y recubiertos con parafina.
  • Los tejido fueron fijados en formol al 10% y recubiertos con parafina.
  • Los tejido fueron fijados en formol al 10% y recubiertos con parafina.
  • Los tejido fueron fijados en formol al 10% y recubiertos con parafina.

Transcript

  • 1. AMELOBLASTOMAwww.library.vcu.edu/.../46-ameloblastoma.jpg
  • 2.  Es el tumor mas frecuente del epitelio odontogenico Tiene un carácter benigno. Es invasor localmente. Tiende a recurrir
  • 3. CLASIFICACION HISTOLOGICA Folicular. Plexiforme De células acantosas De células granulares De células basales.
  • 4.  la proliferación celular tiene una progresión ordenada durante su ciclo Esta proliferación depende de una serie de complejos de proteínas formados por: › ciclinas › quinasas dependiente de ciclinas (cdk)
  • 5.  Las ciclinas D aumentan en respuesta a factores de crecimiento. Ciclina D1 forma complejo con la quinasa dependiente de ciclina 4 o 6 (cdk4 o cdk6). Este complejo D1-cdk4 o D1-cdk6 regula la transición del G1 a fase S.
  • 6. Crecimiento celular, síntesis de proteínas,preparación Separaciónpara mitosis de cromosomas hijos Interf ase Célula metabólicamen te activa. Está Síntesis, creciendo replicación de DNA
  • 7. Factores decrecimient oaumentan Cíclina D1 / D1 CDK4
  • 8.  Se unen a complejos ciclina-CDK y son: › 1. Inhibidores CDK4/6 que incluye la proteína p16. inhibe la progresión a la fase s. › 2. Inhibidores universales CDK, incluye proteína p21 y p27. detiene la fase G1.
  • 9. P21 y P27, detienen P16 esta fase inhibeCíclica D1 /CDK4
  • 10.  LA TOPOISOMERASA IIa (topo IIa) es una enzima nuclear reguladora del DNA. Se expresa en la fase S y la progresión G2- M.
  • 11.  El RNAm de la histona H3, alcanza su pico durante la fase S.
  • 12. Topo IIa P21 y P27, detienen P16 esta fase inhibeRNAm dehistona Cíclina D1 / H3 CDK4, regula
  • 13.  La expresión de una ciclina: D1 Inhibidores de quinasa dependiente de ciclina, CKi: proteínas p16, p21 y p27. Marcadores de fase de proliferación: topo IIa y RNA m de Histona h3.
  • 14.  31 especímenes de pacientes con ameloblastoma: › 18 foliculares › 13 plexiformes  9 acantomatosos  4 de células granulares  2 de células basales 8 Gérmenes dentales (en etapa inicial de mineralización de la corona.
  • 15. PREPARACION DEL TEJIDO Los especímenes fueron removidos quirúrgicamente en 31 pacientes con ameloblastoma. DX Histológicamente (OMS). Los tejido fueron fijados en formol al 10% y embebidos con parafina. Cortes de 3mm Inmunohistoquimicamente Hibridación in situ.
  • 16. Inmunohistoquimica Se desparafinaron. Sumergieron en Metanol con peróxido de hidrogeno al 0.3%. Recuperan antígeno 0.01M citrato buffer por 10 minen autoclave (121C 2 atm) Suero de conejo. Incubación con anticuerpos primarios.4C
  • 17.  Los anticuerpos confirmados por inmunoblotting. Sterptavidin-biotin-peroxidasa(Histofine SABPO )para ligar los anticuerpos primarios. Los productos de reacción fueron visualizados por inmersión en solución de diamino benzidina ) 0.03% con peróxido de hidrogeno por 2- 5 min.
  • 18.  Los núcleos fueron marcados con Methylgreen. Grupo control con tejidos de autopsias de epitelio escamoso estratificado normal.
  • 19. Hibridacion in situ Desparafinadas, rehidratadas y digeridas con pepsina al 0.4% N HCL 37C por 10 minutos. Incubadas con Histona H3 RNAm marcada con fluoresceína y con una hebra de DNA a 55C.( Dako). Lavadas con citrato salino de sodio. 55C por 30 Min.
  • 20. Hibridacion in situ Reaccionaron con un anticuerpo antifluoresceina por 45 Min. Los Núcleos fueron visualizados con metilgreen.
  • 21. J Oral Pathol Med 30: 309–15
  • 22. D1 p16 p21 p27Germenepitelio interno del Esporádico DispersoesmalteEpitelio externo del Esporádico DispersoesmalteEstrato intermedio Poco –nada PresenteRetículo estrellado Poco-nada PresenteLamina dental Poco-nada DispersoNúcleos cel.. epiteliales presente presente presente PresenteAmeloblastomaFolicular y Mucho en Mucho en células células polihedricas. columnares Algunas columna-Plexiforme y cuboidales res y cuboidales periféricas periféricasNúcleos cel. presente presente PresenteameloblastomaCel. queratinizadas Ausente presente Ausente IntensoBasales Positivo EsporádicoGlandulares ausente presente Ausente Ausente
  • 23. J Oral Pathol Med 30: 309–15
  • 24. Proteina p16 en ameloblastomaJ Oral Pathol Med 30: 309–15
  • 25. Proteina p21 Proteina p27J Oral Pathol Med 30: 309–15
  • 26. Topo II a (núcleos) RNAm de histona H3 (citoplasma)Germenepitelio interno del Algunas algunasesmalteEpitelio externo del PocoesmalteEstrato intermedio PocoRetículo estrellado PocoLamina dental PocoNúcleos cel. epiteliales presenteAmeloblastomaFolicular y Mucho en células columnares Algunas células cuboidales yPlexiforme y cuboidales periféricas columnares de la periferiaNúcleos cel. PresenteameloblastomaCel. queratinizadasBasalesGlandulares
  • 27. J Oral Pathol Med 30: 309–15 Kumamoto et al.
  • 28.  LA CICLINA D1 SE HA IDENTIFICADO COMO UN PROTOONCOGEN.(Motukura T) SU SOBREEXPRESION SE HA ENCONTRADO EN CANCERES HUMANOS.(Donnellan) CICLINA D1 FUE DETECTADA EN CELULAS EPITELIALES BASALES DEL GERMEN Y DEL AMELOBLASTOMA. ESTOS HALLAZGOS SUGIEREN QUE LA CICLINA D1 ESTÀ IMPLICADA EN LA PROLIFERACIÒN CELULAR.
  • 29.  LA PROTEINA p16 QUE ES UN INHIBIDOR DE QUINASA DEPENDIENTE DE CICLINA (CKI), ACTUA COMO SUPRESOR TUMORAL.(Quelle DE) EN ESTE ESTUDIO LA p16 FUE DETECTADA EN CELULAS EPITELIALES DEL GERMEN Y DEL AMELOBLASTOMA, LO QUE SUGIERE QUE EL EPITELIO ODONTOGENICO ES REGULADO AMPLIAMENTE POR LA PROTEINA p16 Y QUE EN TUMORES BENIGNOS NO HAY ALTERACIÒN DE ESTE GEN.
  • 30.  la proteína p21 es un supuesto inhibidor del ciclo celular en respuesta al daño del DNA.(el-deiry) la expresión de p21 fue diferente en las distintas etapas del desarrollo.(Bloch- zupan) la encontraron en etapas iníciales, lo que sugiere relación con la diferenciación celular del epitelio odontogenico.
  • 31.  La proteína p27, frena el crecimiento celular e induce apoptosis.(polyak, toyoshima,ohnishi) En este estudio células poliédricas centrales, columnares periféricas fueron positivas para p27 en germen dental y en ameloblastoma. Las células queratinizadas de ameloblastomas eran positivas para p27. (kumamoto) Sugiere que la proteína p27 es funcional en células no proliferativas o en reposo. (kumamoto)
  • 32.  La topoisomerasa IIa y la histona RNAm H3 fueron los marcadores de la fase del ciclo celular estudiados. (yabuki,maeyama,handa) También son marcadores de proliferación celular. En este estudio estos marcadores fueron localizados en células basales del germen y del ameloblastoma, indicando proliferación celular en el epitelio ondontogenico.
  • 33.  Estos hallazgos sugieren que : › La ciclina D1 está implicada en la proliferación celular. › Que en tumores benignos no hay alteración de la proteína p16. › La proteína p21 se relaciona con la diferenciación celular del epitelio odontogenico.
  • 34.  Estos hallazgos sugieren que : › Que la proteína p27 es funcional en células no proliferativas o en reposo. › Que marcadores del ciclo celular, la topoisomerasa IIa y la histona RNAm h3 estudiados, indican proliferación celular en el epitelio ondontogenico.
  • 35. JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 2000,David Pozo, MSc, PhD, Juan J. segura, MD, DDS, PhD, Alicia Jimenesz-Rubio, MD, DDS, PhD, Antonio Garcia-Peñada, MSc, I. Bettahi, MSc, Juan M. Guerrero, MD, PhD, and Juan R. Calvo, MD, PhD.
  • 36. “ Para identificar el mecanismo receptor involucrado en la señal de traducción delas células de la pulpa dental y observar laexpresión de las diferentes subunidades de la proteína G en la pulpa dental humana normal” JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 37. La estimulación de la superficie celular, inicia una serie de respuestas a la señalización Intracelular que son descritas como Cascada de transducción de señales mas o menos secuencial ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 2000, JOURNAL OF
  • 38. Las células de la pulpa dentalReceptores para múltiples ligandos unidos a distintos modelos de señalización intracelular. El receptor de la señalización unido proteína G y el tirosin Kinasa son 2 de los mecanismos de comunicación trasmembrana utilizado por numerosos agentes extracelularesTales como neuropéptidos, factores de crecimiento y aminas vasoactivas. JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 2000,
  • 39. Neuropeptidos factores de crecimiento Amina vasoactivas SUPERFICIE CELULAR RECEPTORA PROTEINA G Membrana pulpa Receptor de membrana celular Pulpa celular citoplasma Efector intracelular Segundo mensajero CELULA ESPECIFICA JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 2000
  • 40. Sustancia P: Proceso inflamatorio, ya que interactúa con diferentes poblaciones de células inflamatorias. Bradiquina Vasodilatador dependiente , aumenta la permeabilidad vascular y también está relaciona con el mecanismo del dolor. Neuroquina A Inflamación y el dolorPéptidos relacionados gen calcitonin Neuropéptido relacionado (CGRP): Inflamación, vascularizaciónPeptido intestinal vasoactivo (VIP): Propiedad vasodilatadoraAcido gama aminobutirico (GABA) Neurotransmisor de dolor. JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 2000,
  • 41. Todos los receptores asociados con proteínas G, tienen una estructura similar. Polipéptido que atraviesa 7 Veces la bicapa lipidica 4 segmentos extracelulares 4 segmentos citosolicos . El segmento carboxiloterminal, (C4) El bucle C3: interacción con proteína G. Figure 20-10 JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 2000
  • 42.  Las proteínas G constan de 3 subuniddes: alfa, beta y gamaDurante la señalización intracelular las subunidades B y gama permanecen juntasLa subunidad G alfa, es una proteína GTPasa interruptora que alterna entre un Biología Celular y molecular , Lodish, 5 edición, editorial panamericana, 2005 estado activo GTP y
  • 43. Figure 20-5a
  • 44. 4 subfamilias: (Gs, Gq, Gi, G ) 12 Gs y Gq: median los efectos estimuladores, como la secreción hormonal. Gi y G : media la inhibición de los procesos, 12 como secreción hormonal JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 45. Premolares removidos atraumaticamente Razones ortodonticas Premolares sin caries, restauraciones o enfermedad periodontal6 pacientes con edades entre 10 y 22 años JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 46. Cada diente fue examinado: Test frió de etil cloruro de esmalte Test guta percha caliente en esmalte Test de percusión Todos respondieron dentro de limites JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 47. Inmediatamente a las extracciones los dientes se almacenaron a 80 ° para la preparación de la proteina pulpar. JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 48. Para Ensayo Western Blot: Los dientes congelados fueron partidos longitudinalmente La pulpa se coloco en tubos para iniciar el procesamiento JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 49.  Descrita por Towbin et al. en 1979  La técnica del Western Blot (también llamado “inmunoblotting” debido a que se utilizan anticuerpos para detectar el antígeno específico de interés. La especificidad de la unión antígeno – anticuerpo permite la detección de una única proteína dentro de una mezcla JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 50. Western Blot Western BlotPasos:1) Separación de las macromoléculas mediante geles de electroforesis2) Transferencia a una segunda matriz generalmente una membrana de nitrocelulosa oPVDF.3) Bloquea la membrana para evitar la unión inespecífica a su superficie de los anticuerpos que se van a utilizar para la detección de la proteína de interés.4) Se une a dicha proteína transferida un anticuerpo especifico marcado con una enzima y, finalmente, se añade un sustrato apropiado para dicha enzima con lo que se produce un producto
  • 51. Los tejidos pulpares de 7 dientes Se recolectaron, agruparon y lavaron:Con 50 mm de tris – HCl (PH 7.5) a 4 °C, y colocados en el mismo contenedor con 0.2 mg/ml de bacitracin, 0.01 mg /ml de leupeptina, 0.1 mg/ml de inhibidor de tripsina, 0.1 mg/ml de N – α – tosil – L – liseneclorometil ketona y 1mm de fenilmetil sulfonifloruro ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200 JOURNAL OF
  • 52. Las suspensiones fueron centrifugados a 30.000 x g para 20 min a 4°C y fueron disueltos en 60 mM de contenedor HCL,que contenia glicerol al 10 %, SDS al 1% 1 mm de EDTA, 1mm ditiotreitol y lubrol al 0.05%. JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 53.  Las proteínas fueron medidas por el método de BradfordUtilizando suero de albúmina bovina como estándar JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 54.  Un procedimiento simple para la determinación de la concentración de la proteína en soluciones es el análisis de la proteína de Bradford que fue descrito primero por Bradford (Bradford y otros., 1976).  Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas.  El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja.
  • 55.  Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es sensible , simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.
  • 56.  Las proteínas de pulpa humana se disolvieron en un contenedor de muestra SDS y calentado por 3 minu a 94°C. Los geles acumulados y resueltos contenian acrilamida al 5% y al 12%. JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 57. Las muestras y las marcas de peso molecular preteñido fueron separados por SDS- PAGE y transferidos electroforeticamente desde los geles a las membranas nitrocelulares. JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 58.  SDS-PAGE es la electroforesis de proteínas más ampliamente usada. Su nombre significa la electroforesis en geles de poliacrilamida que se realiza en presencia de SDS (SDS-poliacrilamide gel electroforesis). Fue descrito por Laemmli (Lammeli (1970), Nature, 277, p. 680)
  • 59.  Se trata de un tipo de electroforesis desnaturalizante en la que las muestras sedesnaturalizan por calor en presencia de agentes desnaturalizantes (beta-mercaptoetanol, que destruye los puentes disulfuro, SDS quedesnaturaliza y recubre a la proteína), y se separan como cadenas polipeptídicas aisladas.
  • 60.  La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa . ( proteínas o ácidos nucleicos) Las proteínas se cargan con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente del peso molecular. Para la separación se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas, con una malla). Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla, por la que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán.
  • 61. Laminas de nitrocelulosa trasferida fueron cortadas en secciones, incubadas por 1h, en un cuarto con temperatura con 50mm de HCL (ph 8.0), 2mm de CaCl 2, 80 mm Na Cl, y leche seca no grasosa. JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 62. Las secciones fueron enjuagadas e incubadas en esta solución de bloqueoque contenía anticuerpos de proteína Gdiluidas en 1: 1,000 por 2h a un cuarto de temperatura . JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 63.  Las laminas fueron lavadas 3 veces dentro de 30 min en un contenedor WB. Las laminas lavadas fueron incubadas Hcl (ph: 7.5), 100mm de Nacl en un contenedor de TBST anticuerpos de peroxidasa de inmunoglobulina . Posteriormente las laminas fueron lavadas 2 veces dentro de 20 min en TBST. JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 64. El análisis de las proteínas de la pulpa dental humana, separados por SDS- PAGE y transferidos a una membrananitrocelulosa revelaron que los productos gen, G alfa q, Bc ,G alfa s, Gil- 2, y Gio-3 se expresaron en la Pulpa Humana. JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 65.  Demostraron que los productos G alfa q/ alfa 11, Beta c, G alfa s, Gil, G io-3,Se expresaron en la Pulpa Humana JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 66.  Este estudio mostró la expresión gen funcional de las subunidades delreceptor unido proteínas G en la pulpa dental humana. JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 67. G alfa s : juega un papel mayor en la señal de transducción del receptor unido a proteínas G.Gil -2 y Gio - 3 : mostró un peso molecular r G alfa q/ alfa elativo en la pulpa. (10) Calvo JR, Pozo D, Guerrero JM,G alfa q/ alfa 11: ambas mostraron un peso molecular relativo. (11) Mochizuki N, Urasawa K, Sanchez A, SDS - PAGE Insel P. JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 68.  No solo la identificación de alfa s, alfa i, alfa q, es crucial para la transducción de señales en la pulpa humana. La presencia de complejo B gama es importante porque incrementan la afinidad de las subunidades alfa para GDP. JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 69. Pulpa inflamada Examinación histológica Células inflamatorias (13) Okijit T, Kawashima N, Kosaka T, Matsumoto A, Kobayashi C, Suda H. *Neuropeptidos *PéptidosInteracción entre irritantes exógenos y *Comp de sist complementarioCélulas de la pulpa dental puede liberar *Aminas vasoactivas citocinas Mediadores químicos endógenos Dependen de las proteínas G Para mediar la comunicación entre RECEPTOR - EFECTOR (14) Torabinejead M. JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 70. Fibras del nervio peptidergico Secretan ligandosSustancia P , CGRP: han estado implicados en, regulacion de flujo de sangre, vasodilatación y respuesta inflamatoria.VIP, la sustancia P y CGRP: juegan un papel importante en el progreso de la inflamación. (15) Kim S.?????????????????(16) Segura JJ, Guerrero JM, Pozo D, Calvo JR, JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 71.  La señal receptora unida a la proteína G es el mecanismo de comunicación de los neuropéptidos con la membrana. La pulpa humana contiene la maquinaria necesaria para responder a Neuropéptidos liberados por las fibras del nervio peptidergico (17) Calland JW, Harris EH, Carnes DL JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
  • 72. 1. JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 2000.2. Biología Celular y molecular , Lodish, 5 edición, editorial panamericana, 2005.3. Introduccion a al Biologia Celular, Bruce Alberts, 2 edicion, editorial panamericana, 2006.4. La celula, Geoffrey M. Cooper, 20075. J Oral Pathol Med 2001: 30: 309-15, Hiruyuki Kumamoto, Kenji Kimi, Kiyoshi Ooya, Departemnet of Oral Patology, Tohoku University School of Dentistry, Sendal, Japan.6. http://es.wikipedia.org/wiki/Bradiquinina7. http://encolombia.com/foc-C.htm
  • 73. MATRIZ EXTRACELULAR“Red organizada de materiales extracelulares que está mas allá de la vecindad de la membrana plasmática” “Asociación amorfa de: PROTEINAS Y POLISACÁRIDOS” Gerald Karp- Cell and Molecular Biology
  • 74. Compleja e interactiva asociación demacromoléculas y pequeñas moléculas, en constante equilibrio dinámico, con capacidad para regular la expresión de genes de las células contenidas en ella Mariotti A, Periodontology 2000; 1993
  • 75. MATRIX EXTRACELULAR ?COMPOSICION Colágenos MOLECULAS M O Proteínas R F DE ADHESION No FACTORES O colágenas DE G CRECIMIENTO E Proteoglicanos N O MOLECULAS S DE ADHESION
  • 76. MATRIZ EXTRACELULAR (Componentes) FIBRILAR COLÁGENO (glicoproteína) NO FIBRILAR SYNDECAN HEPARAN SULFATO BETAGLICANOS PROTEOGLICANOS KERATAN SULFATO BYGLICAN(Proteína + polisacáridos) DERMATAN SULFATO TENASCINA OTRAS FIBRONECTINA PROTEINAS LAMININA TROMBOSPONDINA ENTACTINA
  • 77. COLAGENO GLY – X – Y – GLY – X – Y - GLY PROLINA GLICINA HIDROXIPROLINA
  • 78. SINTESIS DE COLAGENO
  • 79.  La síntesis del colágeno se inicia en el citoplasma formándose cadenas aisladas que son llevadas al retículo endoplásmico donde los residuos de lisina y de prolina son hidroxilados, mediante sendas enzimas que requieren Fe+3 y vitamina C como cofactores () . La hidroxilación de la prolina hace termoestable a la proteína, mientras que la hidroxilacion de la lisina permitirá el entrecruzamiento de varias triples hélices. En este punto, las glicosil- transferasas del retículo endoplásmico glicosilan algunos restos de hidroxilisina. La triple hélice es ensamblada entonces quedando los extremos como polipéptidos libres, que pueden plegarse para formar las estructuras globulares. Las triples helices son transportadas al aparato de Golgi donde son modificadas por sulfatación, fosforilándose algunas serinas. El procolágeno resultante terminado es excretado de la célula a través de vesículas secretoras La conversión del procolágeno en colágeno tiene lugar extracelularmente. Los telopéptidos terminales son hidrolizados por proteasas específicas y las triples hélices se ensamblan en fibrillas, momento en el que pueden participar otras proteínas del tejido conjuntivo como la laminina. Algunos de los restos de hidroxilisina son convertidos a aldehidos reactivos por la lisil-oxidasa, aldehidos que reaccionan con otros restos de lisina o hidroxilisina para formar
  • 80. CARACTERISTICAS ESPECIALES DE LA MOLECULA DE COLAGENO Es una triple hélice continua o interrumpida por proteínas no colágenas La secuencia es Gly-X-Y. Glicina es esencial para conformar la hélice Únicos con hidroxiprolina e hidroxilisina. (Y)Contienen muchos enlaces cruzados intermoleculares. Gran estabilidad
  • 81.  Familia de glicoproteínas fibrosas. Fuerza tensil. Proteína individual en humano (25%) Se produce en fibroblastos , algunas células del tejido conectivo , músculo liso y epiteliales.
  • 82. TIPO DISTRIBUCIÓN I Piel, hueso, tendón, córnea, vasos sanguíneos (↑ rigidez). II Cartílago, discos intervertebrales (↑ elasticidad). III Piel fetal, vasos sanguíneos IV Membrana basal (NO FIBRILAR) V Placenta, piel IX, XII Y XIV Interrupción de la triple hélice (Cartílago).
  • 83. MEDIADORES QUE AFECTAN SINTESIS DE COLAGENOF. DE CRE CITOCINAS HORMONAS OTROSCIMIENTO PDGF ↑ IL-1α ↓ PGE2 ↓ Glucocorticoides ↓ TGF-β↑ IL-1β ↓ FGF ↑ IFN-γ ↓ IGF ↑ TNF-α↓
  • 84. MATRIZ EXTRACELULAR (Componentes) PROTEOGLICANOS ó GLICOSAMINOGLICANOS (GAGs) Contribuyen a la adhesividad celular, mediante su interacción con la superficie celular Gerald Karp- Cell and Molecular Biology
  • 85. MATRIZ EXTRACELULAR (Componentes) SINDECAN Transmite señales a proteínas transmembranales, como lasintegrinas, que a su vez interactúan con el citoesqueleto, el cual facilita la interacción de los filamentos de actina GAG (Heparan sulfato): media la unión con la fibronectina y el colágeno Gerald Karp- Cell and Molecular Biology
  • 86. Nidogen Laminina TenascinaFibronectina Vitronectina PROTEINASOsteonectina NO Osteocalcina COLAGENAS Sialoproteína Trombospondina ósea Elastina
  • 87. MATRIZ EXTRACELULAR (Otras Proteínas) Glicoproteína de adhesión celular, se encuentra formada por un dímero de unidades idénticas, enlazadas entre sí FIBRONECTINA por puentes disulfuros.Fijación de células a todas las matricesque contienen colágeno fibroso Gerald Karp- Cell and Molecular Biology
  • 88. LAMININA 3(A) 3(B1) 3(B2)Se localiza en la membrana basal y tiene un papelfundamental en el desarrollo embrionario, durante el procesode implantación.
  • 89. MATRIZ EXTRACELULAR (Otras Proteínas) • Red laminar de componentes de la matriz extracelular. • Da sostén al epitelio.  Deja pasar ciertas moléculas.  Adhesión celular. MEMBRANA BASAL  Influye sobre la(Laminina – Colágeno diferenciación celular y tipo IV) la reparación de los tejidos. Gerald Karp- Cell and Molecular Biology
  • 90. OSTEOPONTINA C Formación y Thrreabsorción ósea N D G R HA Ser-PO4 N-linked olisaccharide
  • 91. OSTEOCALCINA N C Asp-Glu- β- sheet Sheet β-turn HA Gla-helix
  • 92. SIALOPROTEINA OSEA Ser-PO4 Su expresión C induce laN Thr-PO4 emergencia de osteoblastos D Tyr-SO4 G Esencial en la R mineralización de tejidos y formación ósea HA O-linked oligosaccharide Predomina el ácido glutámico
  • 93. ADHESIÓN DE CÉLULAS A SUBSTRATOS NO CELULARES Las integrinas son un conjunto de glicoproteínas formadas por la asociación de dos subunidades, α y β. Presentan peso molecular que varía de 90 a 220 Kd. Son mediadoras de las interacciones célula célula y célula-matriz; muchas de estasINTEGRINAS acciones son mediadas por la secuencia RGD
  • 94. MATRIZ EXTRACELULAR La MEC es más que un material pasivo, protector e inerte. Juega un papel clave en múltiples actividades celulares. PROTECCIÓN MECÁNICA SELECTIVIDAD MIGRACIÓN CELULARFUNCIONES PROLIFERACIÓN CELULAR DIFERENCIACIÓN CELULAR SEÑALIZACIÓN CELULAR DISPOSICIÓN TRIDIMENSIONAL DE TEJIDOS Y ÓRGANOS
  • 95. MEC CELULA CITOESQUELETO MATRIZ NUCLEAR MEC RECEPTORES DE MEMBRANA Señales CITOPLASMA Citoesqueleto NUCLEO Afectan GENES Expresión ESPECIFICOSBisell, M., Hall H., Perry G: How does the extracellular matrix direct gene Expression ? J. Theor Biol 1982;99:31-68
  • 96. HOMEOSTASIS DEL TEJIDO CONECTIVO SÍNTESIS DE DEGRADACIÓNPROLIFERACIÓN PROTEÍNAS DE DE PROTEINAS CELULAR LA MEC DE LA MEC FAGOCITOSIS MMPs TIMPs FACTORES DE CRECIMIENTO Y CITOCINAS FIBROGÉNICAS CÉLULAS DEL FIBROBLASTOS SISTEMA INMUNE
  • 97. “APOPTOSIS”
  • 98. “Apoptosis vs Necrosis”
  • 99. Características de las células apoptóticas Reducción del volumen celular Compactación de las organelas Condensación de la cromatina Fragmentación del ADN Exposición de fosfatidil-serinas en el lado externo de la membrana plasmática Formación de “cuerpos apoptóticos”
  • 100. Vías principales de apoptosis en mamíferos Hengartner et al, Nature, 2000, 407: 770
  • 101. Caspasa scysteine-dependent aspartate-specific proteases
  • 102. Tabla de caspasas
  • 103. Activación por receptores de muerte ApoReview: Introduction to Apoptosis. Andreas Gewies (2003)
  • 104. Eventos mitocondriales
  • 105. ApoReview: Introduction to Apoptosis. Andreas Gewies (2003)
  • 106. Miembros de la familia de Bcl-2 Los niveles relativos de los miembros anti/pro- apoptóticos determinan el destino celular. Los miembros antiapoptóticos se localizan enmembranas. Los proapoptóticos principalmenteen citoplasma y se translocan a la mitocondria ante un estímulo de muerte. Regulan la liberación desde la mitocondria de proteínas que inducen la apoptosis.
  • 107. ApoReview: Introduction to Apoptosis. Andreas Gewies (2003)
  • 108. Posibles mecanismos de acción de los miembros de la familia de Bcl-2
  • 109. Quiste radicular apical(ARC), es la lesión quísticamás frecuente en losmaxilares (Shear 1985).Son un desordeninflamatorio periapicalprovocado por pulpadental necrótica einfectada (Torabinejad 1983,Shear 1985, Meghji 1996).
  • 110. En tales circunstancias,las toxinas bacterianas(LPS – lipo-polisacaridos) ymediadoresinflamatorios (IL-1 yPEG2), continuamentese relacionan con lareabsorción del huesoalveolar y su sustituciónpor tejido degranulación(granuloma apical. Gervasio et
  • 111. Como los restos epitelialesde Malassez son comunes enesta área, otros mediadorescomo IL-6 y EGF, liberadosdentro de los tejidosperiapicales, inducen laproliferación de estas célulasepiteliales.Esto es el evento centralhistogenético, para eldesarrollo de ARC(Nickolaychuk 2002).Cuando se forma la cavidadcentral → QUISTE
  • 112. El alargamiento de lalesión ocurre por unacontinua reabsorciónósea y la presencia defactores decrecimiento desde eltejido conectivoinflamado o entradade liquido desde ellumen por presiónosmótica (Torabinejad 1983y Nickolaychuk 2002).
  • 113. Aspectos morfológicos del epitelio han sidoconsiderados como reflejo funcional de laactividad de ARC (Cury et al 1998).Lesiones con una capa regular y fina de epitelioescamocelular estratificado atrófico con infiltradoinflamatorio en el tejido conectivo, sonconsideradas quistes quiescent (detenidos).Epitelio escamoso estratificado de célulasepiteliales hiperplásicas de grosor irregular perocreciente, a menudo en arcadas de proliferación,y con infiltración severa de células inflamatorias enla cápsula, se ha considerado como característicade lesiones activas (Cury et al 1998 y Moreira et al 2000).
  • 114. Muerte celular puede ser iniciada por señalizacióncelularDos mecanismos de muerte celular son conocidos:necrosis y apoptosis (Searle et al 1982 y Loro et al 2003).Necrosis: destrucción masiva del tejido celular,ocasionada por señales ambientales quesobrepasan la respuesta celular adaptativa.Apoptosis: mecanismo de muerte celularprogramada genéticamente que participa en elcontrol homeostático de la población celular(Blagosklonny 2003, Satchell y col. 2003).La supervivencia de la célula en los tejidosdepende de la llegada continua de señalespositivas (fuente de oxígeno).
  • 115. La carencia de tales estímulos activa víasapoptóticas para disminuir a la población celular(Chu y cols. 2002, Blagosklonny 2003, Loro y cols. 2003,Renton y cols. 2003).Apoptosis ocurre en células individuales ogrupos pequeños de células y son iniciados porseñales específicas (hipoxia y aumento de laactividad proliferativa) que activan las víasintracelulares que conducen a cambiosmitocondriales, citoesqueléticos y nucleares.La célula apoptótica se fragmenta y losmacrófagos u otras células vecinas la fagocitan,sin la liberación de mediadores inflamatorios(Blagosklonny 2003, Loro y cols. 2003).
  • 116. Investigar la frecuencia de muerte celular por apoptosis, en el epitelio de los quistes radiculares y comparar su frecuencia en lesiones presentando estados funcionales distintos.
  • 117. Muestra: 20 quistes radiculares apicales.Todos los quistes mostraron una líneaepitelial completa en los cortes histológicosevaluados.Se clasificaron de acuerdo al estadofuncional del epitelio en hiperplásicos oatróficos (Cury et al 1998).La evaluación morfológica de apoptosis serealizó en cortes histológicos de 5µmcoloreados con el método convencionalH&E (hematoxilina – eosina).
  • 118. Dos investigadores fueron calibrados para evaluarla alteraciones características de las célulasSe evaluaron los siguientes parámetros: * Contracción nuclear* Hipercromasia de la cromatina * Separación de células vecinas30 secuencias de microscopia de campo de altopoder fueron evaluadas, con un aumento de1000x. Para establecer el recuento de célulasapoptoticas y no apoptoticas.El análisis estadístico se realizó por la técnica Jack-knife y bootstrap que modelan muestras repetidasy permiten establecer el ES y los IC (Goldsworthy y otros. 1995, Loro y otros. 2003
  • 119. La coloración inmunohistoquímica deel Ag Bcl-2 fue realizado con el Acmonoclonal “124” (Dako, Carpintería, CA,EEUU). Diluido en 1: 75 en 5 mmol/L deBuffer Tris-HCl con albúmina bovina al 1%.Se hicieron cortes de tejido fino de 3 µmrevestidas con silano y rehidratada conetanol, sometidos a la recuperación del Agpor vapor EDTA Buffer, pH 8.2.Luego incubado con el Ac primario por 18horas a 4°C.
  • 120. Células apoptóticas (AI) y Bcl-2 teñidasinmunohistoquímicamente (Bcl-2I) fuerondeterminadas como la razón entreapoptóticas o células positivas bcl-2 yel número total de células.Comparación del promedio entregrupos de epitelio hiperplásico y atróficose realizó usando t-test.La posible correlación entre AI y Bcl-2Ise evaluó con el test de Spearman. La significancia estadística se evaluó al5%.
  • 121. Células apoptóticas y Acs se observaronen el epitelio de todos los quistes
  • 122. El promedio de Al fue 0.134 (SD 0.188).Apoptosis fue más frecuente en epitelioatrófico (AI χ: 0.170 SD 0.247) que enepitelio hiperplásico (χ: 0.098 SD 0.103) .De igual manera bcl-2I fue encontradaen epitelio atrófico (χ: 0.06 SD 0.03) queen epitelio hiperplásico (χ: 0.04 SD 0.01).Estas diferencias no fueronestadísticamente significativas.
  • 123. La detección inmunohistoquímica delAg bcl-2 fue observado como una levecoloración café citoplasmática decélulas individuales.El promedio de bcl-2I fue 0.073 (SD0.027).Una correlación positiva y significantefue encontrada entre Al y bcl-2I(R = 0.71, p < 0.05)
  • 124. El trabajo demostró la muerte celularapoptótica en el epitelio de ARC.Este proceso se observó en todas laslesiones observadas.Se demostró apoptosis en leucocitos deltejido conectivo obtenido de laslesiones. Ningún estudio se habíarealizado en ARC (Takahashi y cols 1999).
  • 125. En la literatura endodóntica, lacavitación adentro de granulomasepitelizados ocurre cuando las célulasinternas de los islotes epitelialesproliferativos llegan a ser distantes deltejido conectivo de soporte (Summers &Papadimitriou 1975, Torabinejad 1983).La isquemia resultante disminuye losniveles del ATP en la célula, rompiendolas bombas electrolíticas y permitiendoel influjo citoplasmático de Ca2+.
  • 126. Esto activa las enzimas que causan loscambios celulares morfológicos,característicos de necrosis y lasubsecuente formación de la cavidadquística (Searle et al. 1982, Blagosklonny 2003, Renton etal. 2003).Lo anterior a pesar de que la isquemialeve es necesaria para poder inducir laapoptosis más que la necrosis (Chu y cols.2002, Blagosklonny 2003) Una disminución precipitada deoxigeno no ocurre en la lesióninflamatoria periapical.
  • 127. Aún cuando los resultados no pueden explicar laformación de la cavidad en ARC, y no descartanla muerte por necrosis de la célula, sugieren laparticipación de la apoptosis en el desarrollo deésta lesión.Las células de proliferación no neoplásicasresponden a la hipoxia y a las restriccionesalimenticias activando los genes capaces deinducir la detención del ciclo celular y la apoptosis(Chu y cols. 2002, Renton y cols. 2003).Anteriormente se realizó un intento para demostrarque el epitelio atrófico tiene mas eventosapoptoticos que el epitelio hiperplasico, esteultimo se considera una lesión menos activa (Curyet al. 1998, Moreira et al. 2000).
  • 128. Los resultados demuestran esta situaciónsugiriendo un papel de la apoptosis enel control de las poblaciones celularesen quistes radicular.La regulación de la apoptosis por lasproteínas bcl-2 es dependiente deniveles relativos de moléculas inhibitoriase inductivas (Adams y Cory 1998).La correlación positiva e inesperadaentre el AI y bcl-2I puede ser el resultadode los caminos reguladores que actúanen las células epiteliales.
  • 129. Apoptosis se encontró siempre presente en el epitelio del ARC. Aunque fue más frecuente en lesiones con epitelio atrófico (detenido) , sin diferencias significativas entre los grupos analizados.