BIOLOGIA DE PLASMIDOS  JUAN CARLOS MUNEVAR N GENETICA MOLECULAR MICROBIANA                             1
PLASMIDOS• La primera demostración de INFORMACION TRANFERIBLE                    entre bacterias (1940)                   ...
PLASMIDOS• Los plásmidos son moléculas de ADN citoplásmico     descubiertas en Japón en los años 1955-60.   • Aisladas de ...
DEFINICION• Replicones extracromosomales presentes en bacteriasGram +/Gram -, así como en algunas levaduras y hongos• La m...
PLASMIDOS      EN LA NATURALEZA:        • Varían en estructura, tamaño.        • Modo de replicación.        • Número de c...
PLASMIDOS     • Los plásmidos median numerosas propiedades que       permiten una mejor adaptación de las bacterias.  ⇒ In...
•Pueden ser visualizados por microscopia electrónica o        por electrofóresis en gel de agarosa.   • Se pueden cortar p...
ESTRUCTURA• ADN circular de doble cadenade 2696 pb.• Fueron construidos porrecombinación de un fragmentode PBR 322 (2250 p...
•Si el polylinker es hidrolizado por una de las enzimasde restricción, puede recibir una secuencia de ADN ligada porrecomb...
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•La digestión por BamI permite recombinar el vector con unfragmento de digestión BamI del ADN a clonar.• La ligasa del bac...
PROPIEDADES BIOLOGICASRESISTENCIA        METABOLISMO Antibióticos       Aminoácidos Antisépticos       Carbohidratos Metal...
PROPIEDADES BIOLOGICASLos plásmidos poseen genes que especificanfunciones distintas:• Resistencia a antibióticos.• Resiste...
PROPIEDADES BIOLOGICAS• La adición de esas propiedades se deben a  una misma cepa.• La adquisición de una o varios caracte...
La transmisión de una célula a otra se efectúaa menudo por conjugación.   (codifican pilis sexuales)Se presenta también tr...
CLASIFICACION   Primeros sistemas de clasificación:1. Capacidad de plásmidos de transferir informacióngenética por conjuga...
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REPLICACION  Los mecanismos moleculares que regulan el númerode copias poseen la capacidad de corregir los cambios:       ...
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BACTERIAS GRAM (-)                       BACTERIAS GRAM (+)Replicación idéntica a la cromosomal- Inicio en un ori especifi...
MANTENIMIENTO     La replicación no es suficiente para que los  plásmidos constituyan una línea celular genéticamente  est...
PARTICION   El mecanismo de reparto involucra el reconocimiento depares de moléculas de plásmidos seguidos por un procesoa...
FUNCIONES ESPECIALIZADASLos plásmidos codifican funciones que dotan a las bacterias de atributos que las hacen relevantes ...
CONCLUSIONES Los plásmidos son elementos extracromosomalesencontrados en una gran variedad de bacterias. Los plásmidos p...
BIBLIOGRAFIA Madigan, Martinko and Parker. Brock Biologyof Microorganisms. 9ª edición. 1999. Tomalsky M, Actis L, Crosa ...
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  1. 1. BIOLOGIA DE PLASMIDOS JUAN CARLOS MUNEVAR N GENETICA MOLECULAR MICROBIANA 1
  2. 2. PLASMIDOS• La primera demostración de INFORMACION TRANFERIBLE entre bacterias (1940) Lederburg & Tatum • DNA extracromosomal asociado con transferencia de resistencia múltiple a antibióticos en las bacterias. (1960) Watanabe, Falkow y Rownd 2
  3. 3. PLASMIDOS• Los plásmidos son moléculas de ADN citoplásmico descubiertas en Japón en los años 1955-60. • Aisladas de enterobacterias multiresistentes (Shigellas SCTSu) responsables de diarreas. » Moléculas de ADN circular de doble cadena, citoplásmicos. » Poseen replicación autónoma » Poseen una talla variable (0.5 -500 Kb) 3
  4. 4. DEFINICION• Replicones extracromosomales presentes en bacteriasGram +/Gram -, así como en algunas levaduras y hongos• La mayoría son moléculas de ADN doble cadena,circulares.• Se han aislado plásmidos líneales, como intermediarios durante la replicación en ciertas Gram + » ESTA DEFINICION INCLUYE: - formas replicativas de colifagos filamentosos - estado profago de algunos fagos temperados (P1) 4
  5. 5. PLASMIDOS EN LA NATURALEZA: • Varían en estructura, tamaño. • Modo de replicación. • Número de copias por bacteria. • Capacidad de propagarse en diferentes bacterias • Transferencia entre especies bacterianas. • Características que poseen.Se han identificado plásmidos líneales en Gram+ y Gram- 5
  6. 6. PLASMIDOS • Los plásmidos median numerosas propiedades que permiten una mejor adaptación de las bacterias. ⇒ Indispensables para el metabolismo normal de la célula. P por plásmido, 2 ó 3 letras según las combinaciones y una cifra: • pSC 102; pIP 15; pUD 12» El modo de transmisión natural se efectúa normalmente de una célula a otra generalmente por conjugación. 6
  7. 7. •Pueden ser visualizados por microscopia electrónica o por electrofóresis en gel de agarosa. • Se pueden cortar por diversas endonucleasas, razón por la cual pueden ser caracterizados según su perfil de restricción. 7
  8. 8. ESTRUCTURA• ADN circular de doble cadenade 2696 pb.• Fueron construidos porrecombinación de un fragmentode PBR 322 (2250 pb) y uno deM13 doble cadena (446 pb)• El ADN PBR 322 contiene elgen ampr y el ADN de M13 tieneel promotor del gen Lac Z•Después del promotor del gen lac Z viene una región denominadasitio de clonación múltiple (polylinker).• Seguido de la secuencia de la parte NH2 del gen de βgalactosidasa 8
  9. 9. •Si el polylinker es hidrolizado por una de las enzimasde restricción, puede recibir una secuencia de ADN ligada porrecombinación• En este caso se interrumpe la expresión del péptidocomplementario de la β Galactosidasa, la bacteria no podrádigerir X- gal No tomarán el color azul característico • Solo permanecerán las colonias blancas resistentes a la ampicilina 9
  10. 10. •ADN circular, doble cadena de 4361 pb. •El nucleótido 1 se situa en medio del sitio de restricción EcoR I • Posee un origen de replicación (2535). • Un gen tetr (86 – 1276) y un gen (ampr 4153 – 3293)• El gen ampr codifica para una Beta-lactamasa (286 a.a.)• Posee numerosos sitios de restricción. Muchos de estos sitios sonúnicos permitiendo obtener ADN líneal: gen BamH I (375) 10
  11. 11. •La digestión por BamI permite recombinar el vector con unfragmento de digestión BamI del ADN a clonar.• La ligasa del bacteriofago T4 permite recircularisar el ADNdel plásmido.•Las células transfectadas con este plásmido recombinantereplicaran este plásmido durante su crecimiento• Sin embargo, esas células no expresaran mas el gen tetr, peropermanecen resistentes a la ampicilina.• Esto permite seleccionarlas y aislar el ADN del plásmido clonado 11
  12. 12. PROPIEDADES BIOLOGICASRESISTENCIA METABOLISMO Antibióticos Aminoácidos Antisépticos Carbohidratos Metales iónicos Hidrocarburos Irradiación Resistencia al huésped Otras Factores de adherencia Replicación Exotoxinas Movilización Factor invasivo Incompatibilidad Oncogénesis 12
  13. 13. PROPIEDADES BIOLOGICASLos plásmidos poseen genes que especificanfunciones distintas:• Resistencia a antibióticos.• Resistencia a metales pesados.• Sensibilidad a mutagénos.• Sensibilidad/resistencia a fagos• Producción de enzimas de restricción• Síntesis de aminoácidos raros.• Producción de toxinas.• Determinación de la virulencia• Catabolismo de moléculas orgánicas complejas.• Capacidad de formar relaciones simbióticas• Habilidad de transferir ADN entre distintas especies 13
  14. 14. PROPIEDADES BIOLOGICAS• La adición de esas propiedades se deben a una misma cepa.• La adquisición de una o varios caracteresmetabólicos: Producción de SH2 (E. Coli) Producción de lisin decarboxilasa (Proteus) Utilización de hidrocarburos (tolueno, xilol) PLASMIDOS SIN FUNCION CONOCIDA SE DENOMINAN CRIPTICOS 14
  15. 15. La transmisión de una célula a otra se efectúaa menudo por conjugación. (codifican pilis sexuales)Se presenta también transformación, perofrecuentemente sin especificidad del huésped.DIFUSION A OTRAS BACTERIAS. Difusión plasmidica en diversos grupos 15
  16. 16. CLASIFICACION Primeros sistemas de clasificación:1. Capacidad de plásmidos de transferir informacióngenética por conjugación.2. Funciones especializadas codificadas por plásmidos.3. Número de copias.4. Capacidad de sobrevivir en diferentes bacterias.5. Tipo de replicones* 16
  17. 17. CLASIFICACION• DEBIDO AL ELEVADO NUMERO DE COMBINACIONES DE CARACTERES Y AL RIESGO DE UNA “EPIDEMIA” ⇒ CLASIFICACION (1970) en grupos o clases de incompatibilidad (Inc) Pertenecen a un mismo grupo hay EXCLUSION Este clasificación dio origen al descubrimiento de genes móviles 17
  18. 18. CLASIFICACION INCOMPATIBILIDADFALLA DE 2 PLASMIDOS DE SER HEREDADOS DEFORMA ESTABLE EN LA MISMA LINEA CELULAR (sin presión selectiva) La incapacidad de coexistir es consecuencia del hecho decompartir elementos comunes de funciones heredadas La Inc nos da una idea de la estrecha relación entre los plásmidos. Se relacionaron como grupos de incompatibilidad 18
  19. 19. REPLICACION Para la conservación de plásmidos estables se necesitan funciones codificadas por el huésped y por los plásmidos. La capacidad del plásmido de regular el inicio de su replicación a partir de un origen específico (ori) El inicio de la replicación del plásmido es especifico dela molécula y de importancia para: 1. Proceso de propagación 2. Número de copias. 3. Incompatibilidad 19
  20. 20. REPLICACION Los mecanismos moleculares que regulan el númerode copias poseen la capacidad de corregir los cambios: 1. Del número de copias causados por la divisióncelular 2. Por la introducción de ADN plasmídico Los replicones plasmídicos contienen: • 1 o varios ori • 1 o más elementos reguladores Fragmento de ADN de +/- 3 Kb. • Gen que codifica una proteína o una molécula de ARN 20
  21. 21. Varios ori de plásmidos siguen el mecanismo molecular utilizado por oriC (E. Coli) Se necesita de una proteína codificada específica a ori de plásmidos, o un transcrito Esa proteína de replicación actúa en ori, sola o junto conDNaA (proteína de inicio de la replicación para el cromosoma) La replicación de algunos plásmidos requiere de enzimas celulares normales : DNA poli I, IHF, damMetilasas, Hsp. 21
  22. 22. BACTERIAS GRAM (-) BACTERIAS GRAM (+)Replicación idéntica a la cromosomal- Inicio en un ori especifico. Replicación por mecanismo de CIRCULO RODANTE (ØX174)- Replicación bidireccional completando el círculo. - Intermediario específico - Plásmidos de ADN monocatenario- Intermediario en theta. - Plásmido líneal se replican:- Enzimas del huésped responsables de la replicación del plásmido * Unión de la proteína a 5’ de cada cadena utilizada para iniciar la* Los genes del plásmido: síntesis de ADN. + Control temporal del inicio de la replicación El número de copias controlado por: El número de copias controlado por: 1. Genes del plásmido 1. Genes del plásmido + Reparto de copias de plásmidos 2. Interacciones huésped/plásmido 2. Interacciones huésped/plásmido 22
  23. 23. MANTENIMIENTO La replicación no es suficiente para que los plásmidos constituyan una línea celular genéticamente estable Conservar las funciones de los plásmidos desempeña un papel esencial para mantener ESTABLES los caracteres hereditarios. ••Sistemas que asesinan Sistemas que asesinan••Reparto equitativo de copias Reparto equitativo de copias bacterias sin plásmidos bacterias sin plásmidos•• Sistemas antiagregamiento Sistemas antiagregamiento ••Sistemas de recombinación Sistemas de recombinación especifica según el sitio. especifica según el sitio. 23
  24. 24. PARTICION El mecanismo de reparto involucra el reconocimiento depares de moléculas de plásmidos seguidos por un procesoactivo de separación de los miembros del par hacia los ladosopuestos de la membrana de la célula en división. PLASMIDOS F y P1 (Número de copias = 1)) • Rápida generación de líneas celulares sin plásmidos. • IMPORTANCIA DE LOS SISTEMAS DE PARTICION. Los sistemas de reparto están codificados por los plásmidos, aunque se necesitan las funciones celulares 24
  25. 25. FUNCIONES ESPECIALIZADASLos plásmidos codifican funciones que dotan a las bacterias de atributos que las hacen relevantes para la medicina, para elmedio ambiente, en el sector industrial, en el sector agrícola. Resistencia a antibióticos y metales pesados Factores de virulencia (seroresistencia,adhesividad) Metabolismo de compuestos orgánicos Fijación biológica de nitrógeno. Formación de tumores en plantas. Producción de compuestos tóxicos en larvas 25
  26. 26. CONCLUSIONES Los plásmidos son elementos extracromosomalesencontrados en una gran variedad de bacterias. Los plásmidos pueden codificar funciones esencialespara la célula hospedera que las dotan de atributos especiales. Para la conservación de plásmidos estables son necesariasfunciones codificadas por la célula huésped y los plásmidos Para mantener estables los caracteres hereditarios unafunción se relaciona con la partición equitativa de plásmidos Existen otros mecanismos para aumentar su estabilidad;sistemas de recombinación específicos según el sitio,sistemas antiagregamiento,sistemas que asesinan a las células hijas sin plásmidos. 26
  27. 27. BIBLIOGRAFIA Madigan, Martinko and Parker. Brock Biologyof Microorganisms. 9ª edición. 1999. Tomalsky M, Actis L, Crosa Jorge. Plasmids.Enciclopedia of Microbiology, 1992. Volumen 3, 431- 442. Feinbaum Rhonda. Vectors derived from plasmids. CurrentProtocols in molecular biology. Seccion II. Unidad 1.5. 1998. Alberts B, Bray, Lewis, Raff. Watson J. Molecular biology ofthe cell. 3a edición. 1999. Capítulo 6. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 27

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