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  • 1. PCR Marcela Cárdenas Tueme 1500792
  • 2. Amplifica pequeñas cantidades dePCR ADN entre cientos de miles y millones de veces
  • 3. Determinación de paternidad Ciencia forense: Estudios de identificación expresión de restos genética biológicos. PCR SecuenciaciónDiagnóstico de directa deenfermedades secuencias amplificadas Seguimiento de la efectividad Detección de de tratamiento mutaciones de enfermedades
  • 4. Metodología básicaExtracción de ácidos nucleicos: • Procesamiento de la muestra Preparación de la “MASTER” de PCR: • Extracción de ácidos nucleicos • Primers • Precipitación de los ácidos nucleicos • Polimerasa • dNTPs • Buffer de amplificación Comprobación de la extracción DNA diana Amplificación por medio de PCR Detección e interpretación: • Desnaturalización • Análisis electroforético • Alineamiento • Análisis secundario de restricción o • Elongación hibridación
  • 5. dNTP • Concentraciones entre 20 y 200µM (sustratos para polimerizar al nuevo resultan en un balance óptimo entre DNA) rendimiento, especificidad yC • fidelidad. Los cuatro dNTP deben ser usados en concentraciones equivalentes.o Primers • Tamaño ideal: 18-30 nucleótidos de R longitud.m • • Extremo 3’: Debe ser una G o una C Tm: 50-65% °C e • Contenido GC: 40-60%p d • Autocomplementariedad: Debe de ser evitada, para evitar los dímeros a de primer.o e • 100% de apareamiento con el molde. c Polimerasa • Un rango de concentración paran polimerasa es entre 1 y 2.5 unidades por 100 µL de reacción. c Concentración Magnesio • El alineamiento de los primers, lae l temperatura de disociación de las i cadenas, tanto del templado como del producto de PCR, la especificidadn a del producto, la formación de ó dímeros de primer y la actividad yt • fidelidad de la enzima. La Taq polimerasa requiere magnesio n libre en la unión con el templado, lose • primers y los dNTPs. Los PCR deben contener 0.5 a 2.5 mM de magnesio sobre el total de las Buffer para PCR concentración de dNTP. • Buffer recomendado para PCR es de 10-50 mM de Tris-HCl • 50 mM de KCl, tween 20 o laureth 12
  • 6. PCR • Desnaturalización del DNADesnaturalización • 95°C por 30 segundos • 97°C por 15 segundos • Hibridación de los primers. • La temperatura de Alineamiento alineamiento óptima es 5°C por debajo de la Tm de los primers. •La polimerasa inserta los nucleótidos complementarios. •El tiempo de extensión depende de la longitud y la [] de la secuencia blanco. Extensión •Tiempo de extensión de 1 minuto es suficiente para productos de hasta 2 kb de longitud.
  • 7. Número de Ciclos• Los tres pasos anteriores constituyen un ciclo.• Repetir el ciclo varias veces permite obtener un experimento de amplificación. Millones de copias del fragmento de interés.• Demasiados ciclos incrementan la cantidad y complejidad de productos no específicos; sin embargo pocos ciclos dan como resultado un bajo rendimiento del producto.
  • 8. Número de Cantidad de ciclos DNA 0 1 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128Relación entre cantidad de DNA 8 9 256 512 y el número de ciclos 10 1024 11 2048 12 4096 13 8192 14 16384 15 32768 16 65536 17 131072 18 262144 19 524288 20 1048576
  • 9. PCR anidada• Es un tipo de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación.• Se utilizan cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada.• Cuando se tiene el primer amplicón, se unen los cebadores y se amplifica de nuevo, dentro del amplicón inicial.• Ventaja  brinda alta sensibilidad y especificidad. Así, evitamos posibles hibridaciones inespecíficas de los cebadores.• Desventaja  no nos permite cuantificar la muestra.
  • 10. PCR in situ• Consiste en una reacción de PCR en células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación.• En la técnica de PCR in situ se realiza una primera amplificación de DNA blanco y luego detección mediante hibridación in situ con sondas de DNA/RNA.• De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma.
  • 11. PCR múltiple• PCR en la cual se amplifica simultáneamente más de una secuencia.• Se combinan dos o más pares de cebadores en un mismo tubo, para amplificar simultáneamente varios segmentos de DNA.• Ventajas  información sobre varios locus en una sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de bases de datos.
  • 12. Q-PCR• Es utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de DNA.• Utiliza los mismos reactivos que un PCR normal, se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo.• Se usa un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generación de uno o más productos específicos.• Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no específicos y en las técnicas basadas en sondas específicas.
  • 13. Q-PCR, técnicas de fluorocromos• En las técnicas basadas en fluorocromos el DNA, se une al fluorocromo (SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real.• Ventaja  Utiliza cebadores normales para su realización. Es mucho más económica que la que usa sondas específicas.
  • 14. Q-PCR, técnicas de sondas • Utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador forward y el reverse. • Si la sonda está intacta, presenta una transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET). Sin embargo si la sonda está dañada no. • Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.