Manual de prácticas
de química analítica II
José Ramón Verde Calvo • Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado
Alberto Reyes Dorant...
Ramón Verde Calvo es egresado
de la Facultad de Química de la
UNAM, en donde obtuvo su título
de químico farmacéutico biól...
DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como l...
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Manual de prácticas de
química analítica II
DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohi...
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA
Dr. José Luis Gázquez Mateos
Rector General
Lic. Edmundo Jacobo Molina
SecretarioGenera...
Manual de prácticas de
química analítica II
José Ramón Verde Calvo
Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado
Alberto Reyes Dorantes...
Cuidado de la edición y corrección deestilo:
Ma. Guadalupe Olvera Arellano
Primera impresión: 1999
© UNIVERSIDAD AUTÓNOMA ...
índice
Presentación 9
Capítulo 1. CROMATOGRAFÍA DE GASES 11
Práctica1.Análisis cualitativo de cromatografía
de gases (dos ...
II. TURBIDIMETRÍA 95
Práctica7. Cuantificaciónturbidimétrica de sulfates 97
Bibliografía 101
Capítulo 4-MÉTODOS ELECTROQUÍ...
Presentación
Elpresente manual tiene como meta apoyar de lamaneramás amplia el curso
teórico-práctico de Química Analítica...
DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como l...
Capítulo 1
CROMATOGRAFÍA DE GASES
DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la re...
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Introducción
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Cromatografía de gases
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Componentes importantes de un cromatógrafo de gases
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Cromatografía de gases
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Cromatografía de gases
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Tabla 1.3 Conductividadtérmica.
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Cromatografía de gases
Número de platos teóricos en una columna (n)
Un plato teórico es el lugar donde se lleva a cabo el ...
Manual de prácticas de química analítica II
Cálculo del área de un pico con forma de triángulo
Las curvas o picos en un cr...
Cromatografía de gases
Cálculo de la resolución
Mide la separación entre componentes. La figura 1.4 indica lamanera de med...
Manual de prácticas de química analítica II
Análisis cuantitativo
Existen diversos métodos para el cálculo de concentracio...
Cromatografía de gases
Estándar interno
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Manual de prácticas de química analítica II
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Cromatografía de gases
Operación del cromatógrafo
Gow-Mac modelo 69-350
Descripción
Todos los controles de operación del m...
Manual de prácticas de química analítica II
1. Puerto de inyección para lacolumna "A"
2. Control de ajuste delflujodela co...
Cromatografía de gases
Flujo del gas del
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Marcas de
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PERA
Burbuja
Figura 1....
Manual de prácticas de química analítica II
atenuación del cromatógrafo en laposición 1.Coloque el atenuador en
la posició...
Cromatografía de gases
Metodología para las prácticas de química analítica II
1. Losalumnosdebencubrirtotalmente lasnuevep...
DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como l...
Práctica 1
Análisis cualitativo de cromatografía de gases
(dos columnas)
Introducción
Objetivo
Conocer yutilizar la cromat...
Manual de prácticas de química analítica Ií
Materiales y reactivos
• Cromatógrafo de gases
• Medidor deflujo deburbuja
• C...
Análisis cualitativo de cromatografía de gases
2. Las condiciones del cromatógrafo deben ser las siguientes:
Temperatura d...
Manual de prácticas de química analítica II
Cuestionario
i.
2.
3.
Calcule el número de platos teóricos "n" y AEPT para cad...
Práctica 2
Factor de respuesta en cromatografía de gases
Introducción
El uso de estándares internos es necesario en el aná...
Manual de prácticas de química analítica II
Cronómetro
Jeringa para cromatografía de gases de 50mi
2 tubos de ensayo de 10...
Factor de respuesta en cromatografía de gases
Tratamiento de datos experimentales
Cuestionario
Midaytabule todos lostiempo...
Manual de prácticas de química analítica II
Bibliografía
Baugh, P. J. (editor). 1993. Gas Chromatography A Praetical Appro...
Bibliografía
Rowan, R. Jr. 1961."Prediction of Retention Temperatures in Programmed
Temperature Gas Chromatography. A Desc...
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Capítulo 2
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
DE ALTA RESOLUCIÓN
DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México...
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Introducción
La cromatografía de líquidos de alta resolución en los pasados diez años ha
incrementado suimportancia en muc...
Manual de prácticas de química analítica II
medida enla fase estacionaria yque gracias alas altas presiones con lasquese
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Cromatografía líquida de alta resolución
Tabla 2.1 Lista dedisolventes.
Disolvente
Ácido acético
Acetona
Acetonitrilo
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Manual de prácticas de química analítica II
Cromatografía de intercambio iónico
Consiste en cambiar iones de la fase estac...
Cromatografía líquida de alta resolución
Tabla 2.2 Columnaspara HPLC de intercambioiónico.
Columna
Syn Chropac SAX
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Manual de prácticas de química analítica
Moléculas grandes
son excluidas
Moléculas
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penetran el gel
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Cromatografía líquida de alta resolución
Operación del cromatógrafo de
alta resolución (HPLC)
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Manual de prácticas de química analítica II
Figura 2.3 Control del sistema de bombas del HPLC
Figura 2.4 Sistema de bombas...
Cromatografía líquida de alta resolución
Operacióndel sistema de bombas (figuras 2.3 y 2.4):
Se enciende el aparato con el...
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Figura 2.5 Control del sistema de detección de solutos eluidos.
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Figura 2.6...
Cromatografía líquida de alta resolución
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Cromatografía líquida de alta resolución
Figura 2.7 Integrador
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Cromatografía líquida de alta resolución
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Práctica 3
Cuantificación de una muestra problema de
anisaldehído (método del patrón interno)
Introducción
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Cuantificación de una muestra problema de anisaldehído
Procedimiento
1. Las condiciones de funcionamiento del cromatógrafo...
Manual de prácticas de química analítica II
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[SOLUTO S]
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Cuantifícación de una muestra problema de anisaldehído
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Práctica 4
Separación y cuantificación de una muestra de
antocianinas (método del patrón externo)
Introducción
La cromatog...
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Separación y cuantifícación de una muestra de antocianinas
Procedimiento
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Manual de prácticas de química analítica II
5. Para elaborar la curva patrón con el clorhidrato de malvidin 3-
monoglucósi...
Separación y cuantificación de una muestra de antocianinas
3. ¿Se puede confiar en un cromatograma que fue obtenido durant...
Manual de prácticas de química analítica II
Bibliografía
Brewer, S. 1987.Solución deproblemas de química analítica.Ed. Lim...
Capítulo 3
ESPECTROFOTOMETRIA
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I. VISIBLE ULTRAVIOLETA
Introducción
Los usos analíticos de la espectrofotometría en lazona del visible ultravioleta
son m...
Manual de prácticas de química analítica II
En donde b es el recorrido del haz de luz en la celda, c es la concentración
(...
Espectrofotometría
esta escala hasta 80% de 7, pero entonces se aumenta el error fotométrico
(valores de absorbancia para ...
Manual de prácticas de química analítica II
Celda cilindrica para
flujo constante
Celda normal
con tapa
Microcelda típica ...
Espectro fotometría
200 250 300 350 400 nm
1. Spectrosil
2. Sílice fundido
3. Cuarzo fundido
4. Vitreosil grado IR
5. Vidr...
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7. Control de longitud de onda
2. Control de ajuste de 0% de
transmitancia o d...
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7. Control de longitud de onda
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transmitancia o d...
Manual de practicas instrumentales y analiticas
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  1. 1. Manual de prácticas de química analítica II José Ramón Verde Calvo • Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado Alberto Reyes Dorantes•Frida Malpica Sánchez Casa abierta al tiempo UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  2. 2. Ramón Verde Calvo es egresado de la Facultad de Química de la UNAM, en donde obtuvo su título de químico farmacéutico biólogo, tecnólogo en alimentos. Poste- riormente realizó sus estudios de maestría en la Facultad de Ciencias de la UNAM. Actualmente trabaja en la UAM-Iztapalapa en el grupo de Enología y Ali- mentos Fermentados, en donde lleva a cabo investiga- ciones sobre el cambio en el color del vino tinto du- rante el añejamiento. María de Lourdes Escamilla Hur- tado realizó sus estudios de licen- ciatura en la Facultad de Química de la UNAM, obteniendo el título de química farmacéutica bióloga, orientación en Tecnología de Ali- mentos. Posteriormente obtuvo su grado de maestría en la Universi- dad de Hiroshima, Japón, en el área de Tecnología de Fermentaciones. Posteriormente se ha desarrollado profesionalmente como profesora-investigadora en la Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapa- lapa, desde 1982, dirigiendo proyectos sobre fermen- taciones lácticas en alimentos indígenas tradicionales, producción de aromas por fermentación y enología, de los cuales surgieron diversas publicaciones nacionales e internacionales. También ha ejercido la docencia, tanto en la UAM-Iztapalapa como en la Facultad de Química de la UNAM, formando recursos humanos en los cam- pos de microbiología y biotecnología alimentaria. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  3. 3. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  4. 4. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  5. 5. Manual de prácticas de química analítica II DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  6. 6. UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA Dr. José Luis Gázquez Mateos Rector General Lic. Edmundo Jacobo Molina SecretarioGeneral UNIDAD IZTAPALAPA Dr. Luis Miery Terán Casanueva Rector Dr. Eduardo Carrillo Hoyo Secretario Dr. José LuisArredondo Figueroa Director de la División de Ciencias Biológicasy de la Salud Dr. Gerardo Saucedo Jefe del Departamento de Biotecnología Ma. del Rosario Hoyos Alea Jefa de la Sección de Producción Editorial Casa abierta altiempo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  7. 7. Manual de prácticas de química analítica II José Ramón Verde Calvo Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado Alberto Reyes Dorantes Frida Malpica Sánchez guc i DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  8. 8. Cuidado de la edición y corrección deestilo: Ma. Guadalupe Olvera Arellano Primera impresión: 1999 © UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA Av.MichoacányLa Purísima Iztapalapa, 09340,México,D.F. ISBN: 970-654-363-5 Impreso y hecho en México / Printed inMéxico DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  9. 9. índice Presentación 9 Capítulo 1. CROMATOGRAFÍA DE GASES 11 Práctica1.Análisis cualitativo de cromatografía de gases (dos columnas) 33 Práctica 2. Factor de respuesta en cromatografía de gases 37 Bibliografía 40 Capítulo 2. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN 43 Práctica3. Cuantificación deunamuestra problema de anisaldehído (método delpatrón interno) 63 Práctica4.Separación ycuantificación deunamuestra de antocianinas (método del patrón externo) 69 Bibliografía 74 Capítulo 3.ESPECTROFOTOMETRÍA 75 I. VISIBLE ULTRAVIOLETA 77 Práctica 5. Desarrollo de un método espectrofotométrico 85 Práctica 6. Determinación por espectrofotometría de la concentración decobalto yníquel enunamezcla 91 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  10. 10. II. TURBIDIMETRÍA 95 Práctica7. Cuantificaciónturbidimétrica de sulfates 97 Bibliografía 101 Capítulo 4-MÉTODOS ELECTROQUÍMICOS 103 Práctica8.Determinación potenciométnca de constantes deionización 113 Práctica9,Titulación potenciométnca del ferrocianuro conceno 117 Bibliografía 125 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  11. 11. Presentación Elpresente manual tiene como meta apoyar de lamaneramás amplia el curso teórico-práctico de Química Analítica II,materia que se imparte en el sexto trimestre delascarreras deingeniería en alimentos e ingenieríabioquímica in- dustrial. El material está elaborado pensando en el sistema trimestral de la Universidad Autónoma Metropolitana, hecho que no restringe que cual- quier curso de química analítica impartido en otra escuela puedautilizar este material. En elmanual se abordan temascomo:cromatografía de gasesy de líquidos de alta resolución, espectrofotometría y potenciometría. Cada capítulo está estructurado conuna introducción (los fundamentos teóricos necesarios para comprender lostemas incluidos en lapartepráctica),ypresenta la descripción de los aparatos autilizar, así como la forma correcta de operarlos. El texto secompone denueveprácticas,estructuradas con objetivos, intro- ducción,materialyreactivos,normasyreglasdeseguridad,técnicas,tratamiento dedatos experimentales, cuestionario ybibliografía. Estaúltima sepresentaal finaldecadacapítulo eincluyetextosdeautoresreconocidos,asícomorevistas con artículos actualizados de apoyo a los experimentos. Para la obtención de mejores resultados, se recomienda relacionar am- pliamente losconceptosteóricos con las actividades experimentales. Los autores DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  12. 12. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  13. 13. Capítulo 1 CROMATOGRAFÍA DE GASES DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  14. 14. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  15. 15. Introducción Este capítulotienecomo objetivo mostrar alalumno losfundamentos prácticos de lacromatografía de gases:cómo funciona un cromatógrafo condetector de conductividad térmica y cómo se obtiene e interpreta el cromatograma, in- cluyendo una explicación sobre los cálculos para cuantificar muestras apartir de compuestos puros. La cromatografía de gases es la técnica más utilizada entre los métodos instrumentales de separación, ya que identifica demanera sencillayrápida el número de componentes de una mezcla. El único requisito para su imple- mentación es que las sustancias a separar sean estables a la temperatura ne- cesaria para mantenerlas en estado gaseoso (Ewing, 1979). Clasificación de la cromatografía Por sus características analíticas lacromatografía puede ser: a) Cromatografíacualitativa, que consiste solamente en la separación de los componentes deuna mezcla. b) Cromatografía cuantitativa o analítica, que permite identificar y cuantificar cada uno de los componentes de la mezcla. De acuerdo con la naturaleza de la fase estacionaria, la cromatografía de gases se divide endos: a) Cromatografía gas sólido (CGS), también conocida como croma- tografía de adsorción, en donde la fase estacionaria cuenta con un material sólido como el sílice granular, laalúmina oelcarbón. El soluto seadsorbe en la superficie de laspartículas sólidas.Las separaciones se llevan a cabo sobre adsorbentes, debido a que se crea un equilibrio entre el adsorbente y lasmoléculas de lafase móvil. Silas moléculas de un componente están estrechamente ligadas al adsorbente, la sustancia DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  16. 16. Manual de prácticas de química analítica II no correrá por la columna ya que es retenida fuertemente por ésta. Si las moléculas tienen unabaja atracción por el adsorbente,tenderán a moverse con rapidezjunto con la fase móvil (figura 1.1). Soluto absorbido en la superficie de la fase estacionaria Figura 1.1 Cromatografía de adsorción. Latabla siguientemuestra algunos ejemplos decolumnas capilares comer- ciales,utilizadas en cromatografía gas sólido,mencionando su aplicación y la temperatura máxima de trabajo. Tabla 1.1 Columnascapilares comerciales. Columna HPSoM Poraplot Q Poraplot U Temperatura Máxima 200 °C 250 °C 190°C Aplicación Hidrocarburos, gas natural Alcoholes volátiles en agua,gases Compuestos volátiles polares, aldehidos HP Hewlett Packard Columnas capilares, soporte; A12O3 14 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  17. 17. Cromatografía de gases b) Cromatografía gas líquido (CGL) o cromatografía de reparto, en donde la fase estacionaria esuna capa delgada deun líquido no volátil, colocada sobre un soporte sólido (figura 1.2). Lafase estacionaria forma unapelícula delgada en la superficie deun soporte sólido. El soluto se equilibra entre este líquido estacionario y una fase móvil gaseosa. La cromatografía de reparto o de partición presentagrandesventajas, comparada conlacromatografía deadsorción: es mucho más reproducible y,gracias a que el coeficiente de partición sehace constante enunmargenmásampliodeconcentraciones,permite que las bandas sean más definidas ymucho más simétricas. Soluto disuelto en la fase líquida que recubre la superficie del soporte sólido Figura 1.2 Cromatografía de reparto. El soporte sólido ideal no debe tener efecto en el proceso cromatográfico, sólo debe servir como matriz mecánica para la fase líquida.Elsoportemáscomúneslatierradediatomeas,tambiénconocida como kieselguhr, material muy poroso que contiene muchos grupos oxidrilo libresen su superficie. 15 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  18. 18. Manual de prácticas de química analítica II Componentes importantes de un cromatógrafo de gases Uno delospuntos más importantes aconsiderar en lacromatografía degases, es el grado de separación quepuede lograrse entre diferentes componentes en una columna dada. Sonvarios los factores quepueden influir en la separación deseada: dimensiones de la columna, temperatura, velocidad deflujodel gas acarreador, volumen de la muestra ycaída depresión en la columna. Existen dos diferentes tipos de columnas: las empacadas y las capilares. En lasprimeras el soporte seencuentra empacado entubos deacero inoxidable o vidrio, que comúnmente tienen un diámetro de 3 a 6mm y de uno a cinco metrosdelongitud.Lascolumnas conmayordiámetro sonutilizadasen trabajos de preparación para obtener una mayor cantidad de compuestos separados. En las columnas capilares la longitud esmucho mayor, pudiendo llegar hasta 100metros conun diámetro de 0.1 a 0.3 mm. Estasúltimas secaracterizan por tener un mayor número de platos teóricos, lo que implica mejor resolución, menor tiempo de análisis y una mayor sensibilidad, aunque la cantidad de muestra por correr debe ser menor (Harris, 1992). Se pueden emplear muy diversos soportes sólidos y fases líquidas esta- cionarias.Laeleccióndepende básicamente delanaturaleza delos compuestos que sedesean separar (tabla 1.2). Laliteratura informa acercade grancantidad de soportes sólidos quehanresultado satisfactorios, ydeunnúmero aunmayor de líquidos para la fase estacionaria. El líquido estacionario debeproducir un reparto diferencial de los diversos componentes de la mezcla de ensayo,y poseer suficiente poder de disolución sobre los componentes en estado vapor. Por supuesto, el líquido estacionario no hade ser volátil alastemperaturas de trabajo, pues de otra manera se evaporaría abandonando la columna. Si se tiene interés por profundizar en estetema, sepueden consultar lostrabajos de Bens (1961), donde describe algunas propiedades y características de los soportes ordinarios.Rohrschneider (1971)reportóunaclasificación delas fases líquidas en función de supolaridad, ypropuso una escala de 0 a 100en laque el escualeno estomado como ceroy el oxidipropionitrilo como cien. La temperatura necesaria para efectuar la separación de una mezcla está determinadapordosfactores: el gradodeseparación queseconsidere suficiente y el tiempo razonable para el análisis. En general, cuanto más baja es latem- peraturamayoreslaseparacióndeloscomponentes,ymayortambién eltiempo 16 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  19. 19. Cromatografía de gases deretención deestos últimos enlacolumna. Rowan (1961),aligual queDesty (1965) y muchos otros autores (Meloan, 1973), analizan el efecto de la temperatura en lacromatografía degases. Lavelocidad deflujodelgasportadorvaríaconcadaanálisisypuedecambiar para diferentes tipos de compuestos por analizar. Tal velocidad influye en la cuantificación de la altura equivalente de un plato teórico (AEPT). Para las columnas empacadas de 0.63 cm de diámetro, se recomiendan flujos de 40 a 100ml/min, que deberán regularse conunaprecisión mayor de 1ml/min. Los gases portadores que se utilizan con más frecuencia son: nitrógeno, helio, argón y dióxido de carbono. Su elección se basa, al menos enparte, en el factor económico, pero un criterio más importante es el tipo de detector empleado. Para un detector de conductividad térmica, los gases adecuados son:nitrógeno,hidrógeno,argónyhelio.Elhidrógeno presenta altosvaloresde conductividad térmica, factor muy importante en ladetección decompuestos, pero debido a su explosividad no es recomendable para la docencia. El helio también tiene un alto valor de conductividad térmica, pero es un recurso no renovable yde costo elevado.Encambio,elnitrógeno seutiliza ampliamente por ser barato e inocuo, a pesar de no tener un valor alto de conductividad térmica. 17 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  20. 20. Manual de prácticas de química analítica II Tabla 1.2 Fases estacionarias líquidas de uso común en cromatografía de gases. Nombre Comercial Escualeno Apienzon L SE-30 OV-1 UCW-982 DC-200 OV-101 SP-2100 SE-52 0 SE-54 Dexsii 300 OV-17 OV-25 OV-210 Carbowax20M Carbowax20M TPA Carbowax1500 SilariOC Descripción Escualeno Apienzon L 100% goma de silicona 100% goma de silicona goma del 99% metil, 1%vinil 100% de metil silicona líquida 100% de metil silicona líquida 100% de metil silicona líquida fenilo al 5% Metil carbonato de silicona Metil fenil silicona al 50% Metil fenil silicona al 75% 3,3,3-trifluoropropilo al50% polietilen glicol polietilen glicol modificado con ácido tereftálico polietilen glicol Cianopropil silicona al 100% Polaridad* I I I I II II II II II II II III III IV IV IV IV Temperatura Iíquido/°C 20/100 50/300 50/300 50/300 0/300 0/250 0/350 0/350 50/300 50/450 0/375 0/350 0/275 60/225 60/250 40/200 0/250 * I a IV de menor a mayor polaridad. 18 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  21. 21. Cromatografía de gases La muestra líquida se introduce en el cromatógrafo inyectándola con una jeringa através de un septo de goma, la temperatura vaporiza la muestra yel gasacarreadorlollevaalolargodelacolumna.Lascolumnasanalíticasrequieren de 0.1 a 10 jal de muestra líquida, mientras que las columnas para trabajo preparativo llegan autilizar de 20 a 1000jil. Lasmuestras gaseosas requieren dejeringasconcierrehermético oválvulasdemuestreo degases.Parael trabajo analítico seutilizanvolúmenesde0.5a 10midegas,yparaelanálisispreparativo los volúmenespueden aumentar hastaun litro (Harris, 1992). Detector de conductividad térmica. La capacidad de enfriamiento de un gas está basada en la facilidad quetiene para transferir el calor que absorbe, cualidad representadapor suvalor deconductividad térmica.Entre másgrande sea el valor, la capacidad paratransmitir el calor serámejor. Por lotanto, si se suministra unacantidad constante deenergíaeléctricaalfilamentodel detector, sutemperatura estaráenfunción delaconductividad térmicadelgasacarreador. Conun gaspuro,latemperatura delfilamentoesconstante,pero al presentarse cambios en la composición del gas, la temperatura varía y se modifica la resistencia eléctrica. Por lo tanto, los filamentos deben ser resistentes a los cambios detemperaturayalacorrosión química.Para sufabricación seemplea generalmente platino,tungstenoyníquel. Losfactores que afectan la sensibilidad delosfilamentosson: sugeometría, lacorriente quepasa através de losmismos, suresistencia yelvalor de lacon- ductividad térmica del gas.Latabla 1.3 muestra la conductividad térmica de los gasesyde algunos compuestos utilizados en cromatografía. 19 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  22. 22. Manual de prácticas de química analítica II Tabla 1.3 Conductividadtérmica. sustancia Nitrógeno Helio Argón co2 Hidrógeno Oxígeno CO Metano Propano n-Butano Étanol Acetona Cloroformo ct* 5.81 34.80 3.98 13.52 41.60 5.89 5.63 7.21 3.58 3.22 3.50 2.37 1.58 * unidades de la conductividad térmica cal cnrr2 seg^2 /°C crrr1 Cálculos en cromatografía Con los datos de un cromatograma es posible realizar una serie de cálculos sencillos para conocer parámetros como laeficiencia de la columna, además, siaplicamostécnicas deestándares sepuedeconocertambién la concentración demuestrasproblema.Acontinuación sedesarrollan loscálculosmáscomunes yútiles en cromatografía. 20 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  23. 23. Cromatografía de gases Número de platos teóricos en una columna (n) Un plato teórico es el lugar donde se lleva a cabo el equilibrio de distribución de la muestra entre la fase móvil y la fase estacionaria. A mayor número de platosteóricos, la separación en lacolumna es mejor. w= 16 n - número de platos teóricos t^ = tiempo quetranscurre desde la inyección hasta el centro del pico del componente Aw=ancho del pico del componente tj^yAwseexpresan en lasmismas unidades (tiempo,volumen, distancia, etc.) Altura equivalente de un plato teórico (AEPT) Un plato teórico puede considerarse la longitud de columna necesaria para establecer unequilibrio dedistribución entrelafase estacionaria del solutoyla fasemóvil. AEPT = ^ AEPT = altura equivalente deunplato teórico L= longitud de lacolumna n = número deplatos teóricos 21 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  24. 24. Manual de prácticas de química analítica II Cálculo del área de un pico con forma de triángulo Las curvas o picos en un cromatograma generalmente presentan una forma gaussiana.Unmétodosencilloparacalculareláreabajo lacurvaes transformarla en un triángulo, extrapolando latangente en los puntos de inflexión hacia la línea dereferencia, como lo indicalafigura1.3. Respuesta del. detector t = 0 inyección tr o vr Punto de inflexión (parte más j inclinada de la / curva) / tiempo o volumen Figura 1.3 Cromatograma ideal Fórmula para calcular el área deuntriángulo: A b*h A A = área h = altura b = longitud de la base 22 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  25. 25. Cromatografía de gases Cálculo de la resolución Mide la separación entre componentes. La figura 1.4 indica lamanera de medir los parámetros: ECUACIÓN DE RESOLUCIÓN Figura 1.4 Resolución entre dos picos cromatográficos. V -VV 2 V R 1/2 (Wx + W2) Vx = distancia desde la aplicación hasta el centro del pico 1 V2 = distancia desde la aplicación hasta el centro del pico 2 FPj y fP2 = ancho de los picos 1 y 2 23 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  26. 26. Manual de prácticas de química analítica II Análisis cuantitativo Existen diversos métodos para el cálculo de concentraciones en un sistema cromatográfico. Loshaysencillos,peropococonfiables,puesnoutilizanninguna sustancia de referencia, y los hay más elaborados con un mayor grado de confiabilidad. Estosmétodos son: 1. Normalización 2. Calibración absoluta 3. Estándar interno 4. Estándar externo Normalización o porcentaje por áreas Con base en el cromatograma de una mezcla separada, esposible determinar la concentración de cada uno de sus componentes por el área bajo la curva. Primero hay que medir las áreas individuales de cada pico, sumarlas y, con base en el total, sacar el porcentaje de cada componente. Este porcentaje es proporcional alaconcentración delcomponenteenlamezcla, siempreycuando laconductividad térmica de loscomponentes sea lamisma, omuyparecida,y que larespuesta del detector de conductividad térmica también sea igual para todos los componentes. Como esto no esposible en la mayoría de los casos, serequiere utilizar otros métodos másexactos. Calibración absoluta Consiste en inyectar en la columna una cantidad conocida de sustancia pura paramedir el áreadelpicoresultante.Enseguida, bajo lasmismas condiciones decorrimiento cromatográfico, semideeláreadelpicoqueresultedelasustancia en lamezcla desconocida. Finalmente, estableciendo una proporción, se puede encontrar la con- centración de la sustancia desconocida. 24 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  27. 27. Cromatografía de gases Estándar interno Estemétodo sepuedeutilizar dedosformas,paracalcularunfactor derespuesta o elaborandounacurvaestándarparaencontrar laconcentración deunamuestra problema. El estándar o patrón interno es aquella sustancia que se inyecta junto con lao lasmuestrasproblema enuncromatógrafo. Lascondiciones que esta sustancia debe cumplir son (León, 1982): • No debe formar parte de la muestra que se desea analizar. • Tener similitud conlos componentes delproblema. • Proporcionar por sísolayjuntoconlamuestraproblema,picosbienresueltos y de buena forma. • Eluir enuntiempo cercano al de los componentes del problema. • No debe reaccionar con los componentes de la muestra. a) FactorderespuestaElmétodo sebasa encalcular elfactor derespuesta para cada sustancia analizada, yaque losdetectores noresponden dela misma manera atodos los solutos.Latécnica no esmuy complicaday consiste enmedir el áreabajo lospicos de cada compuesto, enrelación con el área de lospicos deun patrón interno. El factor derespuesta está definido porlarelación: [P] Ap [S] = concentración del soluto (cualquier unidad de masa/volumen) [P] = concentración del patrón (cualquier unidad de masa/volumen) As = Área del soluto Ap = Área del patrón Este factor de respuesta se puede utilizar tanto con el método de normalización como conel delpatróninterno. b) Estándar interno con elaboración de curva estándar.En este caso también se requiere de la adición de un compuesto de concentración conocida. Se utilizan mezclas conocidas del patrón (P) y del soluto o analito (S)paraconstruir unacurvapatrón,como en lafigura1.5. Siuna 25 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  28. 28. Manual de prácticas de química analítica II cantidad conocida de patrón seagrega auna muestra problema, lacurva de calibración puede utilizarse para hallar laconcentración delsoluto. Cuando seuseunestándar interno esrecomendable quela curva de calibración seelabore cuando menos con tres puntos. Las unidades de concentración pueden ser moles/litro, g/1,mg/1,porcentuales, etc. hs ~hp [S] = concentración del soluto hs = altura del soluto [P]= concentración del patrón hp = altura del patrón Figura 1.5 Curva para estándares internos. Estándar externo Esta técnica es menos complicada que el estándar interno, pero requiere de mayor cuidado durante las separaciones cromatográficas. Las curvas de calibración con patrones puros son elaboradas con base en varias concen- traciones.Esimportante cuidarquelosvolúmenes deinyección seanlosmismos que para los compuestos de interés. Seconstruye una gráfica de área o altura, en función de la concentración, la cual puede estar en cualquier unidad de masa/volumen, ya sea molaridad, %p/v,otambién puede utilizarse el %p/p. La concentración del compuesto desconocido se interpola en el gráfico, con base en el dato de área o altura del pico correspondiente (figura 1.6). Área o altura Concentración Figura 1.6 Curva para estándares externos. 26 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  29. 29. Cromatografía de gases Operación del cromatógrafo Gow-Mac modelo 69-350 Descripción Todos los controles de operación del modelo 69-350 están localizados en la parte frontal del aparato (figura 1.7). 11 Figura 1.7 Cromatógrafo de gases Gow-Mac. 27 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  30. 30. Manual de prácticas de química analítica II 1. Puerto de inyección para lacolumna "A" 2. Control de ajuste delflujodela columna "A" 3. Control detemperatura del puerto de inyección 4. Control detemperatura del detector 5. Control detemperatura de la columna 6. Sistemaanalógico demedición 7. Selector de medición 8. Control de encendido del cromatógrafo 9. Control de cambio de polaridad 10. Control de encendido del detector 11. Control de ajuste del cero 12. Control de atenuación 13. Control de lacorriente del detector 14. Control de ajuste deflujodela columna"B" 15. Puerto de inyecciónpara lacolumna"B" 16. Tapa delhorno del cromatógrafo Uso del cromatógrafo 1. Verifique quetodosloscontroles esténapagadosysigalasinstrucciones, en función de los parámetros a utilizar en cada una de las prácticas de cromatografía degases. 2. Abra lallavedeltanque quecontiene el gasacarreadoryverifique quela presión se encuentre entre 500 y 2 300 lb/in2 , en caso de ser menor a 500 lb/in2 , repórtelo al profesor. 3. La presión de entrada del gas al cromatógrafo debe ser de 30 lb/in2 . Mida la velocidad del flujo de salida de las columnas utilizando un flujómetro deburbuja que tenga una disolución dejabón al 3%. 28 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  31. 31. Cromatografía de gases Flujo del gas del cromatógrafo u Marcas de calibración _ Disolución jabonosa PERA Burbuja Figura 1.8 Medidordeflujo. Lametodologíaes la siguiente:conecte lamanguera delflujómetroala salidadelacolumnadondesequiereajustar elflujo.Presioneligeramente elbulbollenodedisoluciónjabonosa,paraformar lasburbujas queserán arrastradas por el gas. Mida el tiempo en segundos, desde la marca cero hasta la diez del aparato y calcule el flujo utilizando la siguiente ecuación: Flujo = 600 tseg Conbaseenelresultadoyutilizando elcontrolcorrespondiente (columna "A"o "B") ajuste elflujorequerido. 4. Ajuste loscontroles detemperatura ydeinyección (tanto dela columna como del detector). Fije la corriente de esteúltimo. 5. Verifique que el registrador tengapapel ytinta para un buen funciona- miento,enciéndaloy seleccione lavelocidad decorrimiento. Para subuen funcionamiento el cromatógrafo requiere aproximada- mentede2horasparaqueseestabilice lalíneabase.Durante estetiempo sepuede preparar la muestra, limpiar lajeringa y ajustar elcero. 6. Ajuste del cero: el atenuador del cromatógrafo debe marcar infinito (número 12 de la figura 1.7). Con el control de cero del graficador, coloque la plumilla donde desee la línea base. Ponga el control de la 29 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  32. 32. Manual de prácticas de química analítica II atenuación del cromatógrafo en laposición 1.Coloque el atenuador en la posición 256 yel cero con el control del cromatógrafo. 7. Inyección de lamuestra. Se debetener cuidado al introducir lajeringa, si ésta es de una capacidad de 5o 10 |il,tanto el émbolo como la aguja sonmuy delgadas y sedoblan fácilmente. Debe colocarse lajeringa en posición perpendicular conrespecto alcromatógrafo eintroducirla enel puerto de inyección de la columna. Efectuar la inyección con fuerza, para asegurar que lamuestra entre en la columna. Con el fin de evitar contaminaciones, se debe enjuagar la jeringa cuando menos cincoveces con el disolvente adecuado.Debe limpiarse inmediatamente después deusarla,paraprevenir quelamuestra seseque yqueden residuos en lajeringa oel émbolo. 8. Si lospicos delamuestra se salen deescala, incremente laatenuacióny corra nuevamente su sistema. 9. Unavezterminado eltrabajo cromatografía) disminuyalas temperaturas de lacolumna, inyector ydetector,yapague lacorriente de esteúltimo. Cuidequeelflujodelgascontinúehastaquelatemperaturadelacolumna descienda hasta 50 °C o menos. Cierre él paso del gas acarreador y limpie lajeringa. Precauciones en el manejo del detector de conductividad térmica a) Para evitar que se queme elfilamentodel detector, verifique que el gas acarreador fluya a través del cromatógrafo, antes de encender el detector. b) Apagar la corriente delfilamento,antes de abrir el sistema,para evitar que éste se oxide. c) Lavelocidad deflujodel gas portador debe permanecer constante. 30 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  33. 33. Cromatografía de gases Metodología para las prácticas de química analítica II 1. Losalumnosdebencubrirtotalmente lasnueveprácticasdeestemanual. 2. Cada alumno debe elaborar una bitácora, en la cual, además de anotar todas lasobservaciones delaprácticaencuestión,realizará lassiguientes actividades: • Dibujar un diagrama de bloques de la práctica que seva a realizar. • Anotar laspropiedadesfísicas,químicasytóxicas de cadauno delos reactivos mencionados en el protocolo de lapráctica (investigados previamente enlabiblioteca). • Realizar loscálculosnecesariosparalapreparacióndelasdisoluciones mencionadas enlapráctica,tomando comobase 100midedisolución. Prevención de accidentes en el trabajo con sustancias químicas* 1. Al manipular sustancias corrosivas será obligatorio el uso de equipo personal de protección. 2. La transferencia de líquidos, especialmente los corrosivos otóxicos, debe hacerse con ayuda de pipeta y propipeta. Queda estrictamente prohibido usar las pipetas succionando con laboca. 3. Al poner en contacto sustancias que reaccionan violentamente o al calentar líquidos entubos de ensayo ofrascos, la cara deberá apartarse para que no sea alcanzada por posibles proyecciones. Se deben usar anteojos protectores o careta de plástico. 4. Nunca vierta agua sobre ácido sulfúrico concentrado. 5. Todas las operaciones con sustancias volátiles deberán hacerse en la campana de extracción. 6. Queda estrictamente prohibido probar cualquier sustancia química. 7. Lassustancias susceptiblesdegenerarperóxidos (THF,éter,etc.)deberán serverificadas periódicamente. * Las normas de seguridad indicadas en esta parte fueron extraídas del Instructivo sobre elfuncionamiento internoy operativopara regular el uso de losservicios einstalaciones de los laboratorios de docencia de la UAM, aprobado por el Consejo Académico en su sesión 133. 31 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  34. 34. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  35. 35. Práctica 1 Análisis cualitativo de cromatografía de gases (dos columnas) Introducción Objetivo Conocer yutilizar la cromatografía de gases eshoy en díaun aspecto primor- dial, tanto en la industria como en el campo científico. La elaboración de productos alimenticios ofarmacéuticos necesita deunbuencontrol decalidad, ymuchas delastécnicasutilizadasparaestorequieren delaprecisión delanálisis cromatográfico. Uno de los primeros problemas en cromatografía es la selección de la fase estacionaria otipo de columna a utilizar. Existe una gran variedad de fases líquidas disponibles paralacromatografía dereparto gas-líquido.Pararesolver este problema es necesario considerar que un soporte polar retendrá más fuertemente un soluto polary que,por lotanto,las sustanciasmenos polares saldrán con mayor rapidez de la columna, presentando tiempos de retención más cortos. En estapráctica secorrobora tal criterio,ya que son separados compuestos de diferente polaridad corriéndolos enuna columna polar como la Carbowax 20M.Posteriormente seefectúa lamismaseparación,peroutilizandolacolumna DC-200 no polar. El alumno aprenderá autilizar el cromatógrafo de gases Gow-Mac, modelo 69-350, para el análisis cualitativo de mezclas y observará la diferencia de separar unamismamuestra en dos columnas de diferente polaridad. 33 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  36. 36. Manual de prácticas de química analítica Ií Materiales y reactivos • Cromatógrafo de gases • Medidor deflujo deburbuja • Cronómetro • Jeringa para cromatografía de gases de 50mi • 5tubos de ensayo de 10x 150 mm con tapón de baquelita • 5vasos deprecipitados de 50 mi 5 pipetas volumétricas de 1mi Propipeta • n-pentano Tetrahidrofurano • 2-butanona • n-propanol En laparte teórica de este capítulo se encuentran las instrucciones deope- ración del cromatógrafo Gow-Mac, modelo 69-350 (p.27). Normas de seguridad Maneje los disolventes con cuidado en un lugar ventilado, utilice propipetas para hacer la mezcla. Asegúrese de que no haya mecheros prendidos y coloque letreros para indicar que está trabajando con disolventes. Cuando trabaje con el cromatógrafo, asegúrese de que se encuentre presente elprofesor del laboratorio,quien leayudaráybrindará asesoría sobre el buen manejo del equipo. Procedimiento 1. Mezcleunmililitrodecadaunodelossiguientesdisolventes:n-heptano, tetrahidrofurano, 2-butanona yn-propanol. Guarde lamezcla enunre- cipiente cerrado. 34 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  37. 37. Análisis cualitativo de cromatografía de gases 2. Las condiciones del cromatógrafo deben ser las siguientes: Temperatura de la columna Flujo del gas Corriente del detector 130°C 80 ml/min. 200 mA (si el gas es helio) 100 mA (si el gas es nitrógeno) 3. Tome en cuenta que el equipo requiere al menos de tres horas de ca- lentamientoprevio,conelfindeestabilizar latemperaturadelacolumna, el flujo del gas acarreador y la corriente del detector, y para que todo esto serefleje en una línea base estable. 4. Verifique el flujo del gas en las dos columnas, utilice un medidor de burbuja como se indica en la figura 1.8. 5. Trabaje primero con la columna de Carbowax. Fije el atenuador en 4y ponga a funcionar el graficador auna velocidad de 2.5 cm/min. 6. Conunajeringa de 50 fil, mida 3 ú den-heptano yadicione otros 10 |Lil de aire.Inyéctelos en la columnayenjuague lajeringa. 7. Marque el punto de inyección en la carta, así como la información relacionada con lamuestra inyectada. 8. El primer pico que debe eluir es elpico de aire, seguido por el pico del n-heptano. 9. Repita los pasos 5 y 6 con los otros tres componentes y, por último, inyecte lamezcla de losdisolventes. 10. Bajolasmismascondiciones detrabajo,repitatodoelproceso utilizando lacolumnaDC-200.Cambie lapolaridad del sistemaparaquelospicos salgan enelmismo sentido que conlacolumna polar. Tratamiento de datos experimentales • Midaytabule todos lostiempos yvolúmenes deretención detodas las corridas. • Con la ayuda de los tiempos de retención de las sustancias puras, identifique los componentes de lamezcla en los cromatogramas de las doscolumnas. 35 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  38. 38. Manual de prácticas de química analítica II Cuestionario i. 2. 3. Calcule el número de platos teóricos "n" y AEPT para cada columna, utilizando losdatos deln-heptano. Calcule elporcentaje de cada componente de lasmezclas,utilizando el método de normalización (por áreas). ¿En qué se basa la cromatografía de gases? ¿Cómo puede medirse laeficiencia deuna columna? ¿Qué seentiendeporcromatografía líquido-líquido ycromatografía gas- líquido? ¿Quéventajas tienelaprogramación detemperatura enla cromatografía de gases? ¿Se puede hacer esta programación en un cromatógrafo de gases con detector de conductividad térmica? Justifique su respuesta. Explique cuáles sonlasventajas ydesventajas delascolumnas capilares y las columnas empacadas. Conbaseenlossiguientesdatos,obtenidosconelempleodeunacolumna deftalatode dodecilo, realice los ejercicios que se piden. Compuesto Acetona Butanona 3-pentanona Acetilcetona Vr(ml) 21.5 58.0 145.0 400.0 a) Calcular elnúmero deplatosteóricos"n"yAEPTparacadacompuesto. b) Calcular el porcentaje de cada componente, utilizando el método de normalización. 36 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  39. 39. Práctica 2 Factor de respuesta en cromatografía de gases Introducción El uso de estándares internos es necesario en el análisis cuantitativo. La sensibilidad delosdetectoresdeconductividad térmicadifiere deuncompuesto a otro, ya que depende de la conductividad térmica del analito. A menor conductividad térmica, mayor es la respuesta para una cantidad dada de compuesto. Por lo tanto, debe medirse unfactor de respuesta empírico para cada sustancia que se somete aun análisis cuantitativo. El factor de respuesta F está definido por larelación: [P] ApJ Objetivo El alumno efectuará el análisis de cromatografía de gases para conocer el factor de respuesta con el n-heptano, empleando como estándar interno al n-pentano. Materiales y reactivos • Cromatógrafo de gases • Medidor deflujo deburbuja 37 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  40. 40. Manual de prácticas de química analítica II Cronómetro Jeringa para cromatografía de gases de 50mi 2 tubos de ensayo de 10x 150 mm con tapón de baquelita 2 vasos de precipitados de 50 mi 2 pipetas volumétricas de 1mi Propipeta n-pentano n-butano Normas de seguridad Procedimiento Los compuestos atrabajar sonmuyvolátiles yflamables,trabaje enun área ventilada ylejos de fuentes de calor. Tome en cuenta las reglas de seguridad de lapráctica 1. 1. Prepareentubodeensayounadisoluciónestándar,mezclandounmililitro de n-heptano con otro de n-pentano. 2. Ajuste lascondiciones del cromatógrafo conbaseenlossiguientesdatos: Columna Gas acarreador Flujo del gas Temperatura Atenuación Corriente del detector Velocidad de la carta DC-200 Helio 60 ml/min. 90 °C 4 200 mA 2.5 cm/min. 3. Verifique que la líneabase seencuentre estable. 4. Inyecte 3 (il de la disolución estándar, repitapor triplicado. 5. Solicite al profesor la muestra problema e inyecte 3 ú9 repita por triplicado. 38 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  41. 41. Factor de respuesta en cromatografía de gases Tratamiento de datos experimentales Cuestionario Midaytabule todos lostiempos yvolúmenes deretención detodas las corridas. Conbaseenlasáreasyconcentraciones deladisoluciónpatrón, calcular el factor derespuesta para el n-heptano, utilizando el n-pentano como estándar interno. Calcularlaconcentracióndeln-heptanoenlamuestraproblema,utilizando el factor derespuesta y las áreas del segundo grupo de cromatogramas. 1. Explicar qué se entiende por factor de respuesta. 2. Esta técnica para el cálculo del factor ¿se puede utilizar con otros detectores como eldeionizacióndeflamaoeldecapturade electrones? 3. ¿Cómo seseleccionan lastemperaturas para el inyector, lacolumnayel detector? 4. Problema: Para la cuantificación de una muestra comercial del antimicrobianometilparabeno,seutilizólatécnicadelfactor derespuesta usando elpropilparabeno como estándar interno. Secorrieron lasmues- tras enun cromatógrafo con detector de ionización deflama,columna capilar BP5 conpelícula de 0.5 |Lim,temperatura inicial de 160°Cyun gradiente de 15 °C/min. La temperatura final fue de 280 °C. Para el cálculo delfactor seutilizaron 0.98mmoldemetilparabenoy0.75mmol depropilparabeno. Seobtuvieron lassiguientes alturasrespectivas: 180 y 165mm. Una segunda corrida cromatográfica es utilizada para cuantificar la muestra comercial. Se mezcla el problema con 1.2 mmol de propil parabeno.Lasalturasresultantes fueron 150mmparaelmetily 160mm para el propil parabeno. Calcular la concentración del metil parabeno en lamuestra comercial. 39 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  42. 42. Manual de prácticas de química analítica II Bibliografía Baugh, P. J. (editor). 1993. Gas Chromatography A Praetical Approach. IRL Press, Gran Bretaña. Bens, E. 1961."Adsorption Characteristics of Some Gas-Liquid Chromato- graphic Supports."Anal Chem.,33:178, California. Brewer, S. 1987.Solución deproblemas de química analítica. Ed. Limusa, México. Ewing, G. W. 1979.Métodos instrumentalesde análisis químicos. Ed. Me GrawHill,México. Giddins, J. C. y R. A. Keller (eds.). 1965.Advances in Chromatography. Vol. 1:199, USA. Giddins, J. C. y R. A. Keller (eds.). 1971.Advances in Chromatography. Vol. 4:333, USA. Harris, D. C. 1992. Análisis químico cuantitativo. Grupo Editorial Iberoamérica, México. Meloan, C. F. y R. M. Kiser. 1973.Problemasy experimentos en análisis instrumental.Ed. Reverte, México. Miller, J. M. y R. L. Harmon. 1978. Elementary Theory ofGas Croma- tography. Gow-Mac Instrument Co.,USA. Operator} s Manual Gas Chromatograph,Model 69-350.1989. Gow Mac Instrument Co.,USA. Pecsok, R. L. 1981.Métodos modernos de análisis químico. Ed. Limusa, México. 40 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  43. 43. Bibliografía Rowan, R. Jr. 1961."Prediction of Retention Temperatures in Programmed Temperature Gas Chromatography. A Descriptive Equation and Com- putacional Method."Anal. Chem.,33:510-515,Nueva Jersey. Storch de García y Asensio, J. M. 1975.Fundamentos de lacromatografía degases. Alhambra, España. 41 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  44. 44. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  45. 45. Capítulo 2 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  46. 46. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  47. 47. Introducción La cromatografía de líquidos de alta resolución en los pasados diez años ha incrementado suimportancia en muchas delas áreas del análisis,tanto anivel investigación como anivel industrial. Muchasde lastécnicas decontrol deca- lidad de fármacos, alimentos,aditivos ycontaminantes yase están efectuando conHPLC. Hace más de 80años que seconoce la cromatografía delíquidos,pero sólo a partir de 1967 los avances tecnológicos permitieron desarrollar un proceso cromatográfico para trabajar con altas presiones. Este proceso de ninguna manera sustituye a lacromatografía de gases, sólo esun complemento parael análisis decomponentes quenotoleranunafase móvil gaseosa otemperaturas muyelevadas.Dehecho,presentalassiguientesventajasfrenteala cromatografía degases: • Tieneunadifusión mínimaenlafasemóvil,debidoalarapidezdelanálisis. • No tiene efectos negativos por calor, ya que generalmente serealiza a temperatura ambiente o ayudado por un calentador de columnas a temperaturas menores de 100°C. • La muestra no se destruye, por lo que se puede recuperar para un uso posterior. La cromatografía de líquidos es una técnica de separación que utiliza una fase móvil líquida, es ideal para la separación de macromoléculas de interés biológico y de compuestos iónicos,ya queno depende de lavolatilidad oes- tabilidad térmica delos componentes. Sepuede utilizarpara separarproteínas, aminoácidos, lípidos,ácidos nucleicos. Otras aplicaciones industriales sonel análisis de pesticidas, aceites, polímeros, antioxidantes, análisis de agua, contaminantes, sabores,colorantes, etc.La cromatografía de líquidos sebasa en la solubilidad de los compuestos:hayqueescoger el disolvente o lamezcla dedisolventesapropiadosparallevar alamuestraatravésdel sistema,también hay que tomar en cuenta que los compuestos se adsorben en menor o mayor DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  48. 48. Manual de prácticas de química analítica II medida enla fase estacionaria yque gracias alas altas presiones con lasquese mueve lafase móvil,sepuedeobtenerunarápidaseparacióndeloscomponentes deunamezcla. Lacromatografía delíquidos sepuedeclasificar encuatrotipos,dependiendo de suuso: Cromatografía de líquido-sólido En este caso, la separación depende de la afinidad de lamuestra hacia la fase sólida olíquida. Silamuestra esmuy afín alafase estacionaria (compuestapor partículas sólidas pequeñas) el tiempo de retención será mayor. El solvente utilizado se conoce como eluyente ytambién influye demanera importante en laseparación: silamuestraesmásafín alafase líquida,lostiemposderetención serán más cortos. La tabla 2.1 muestra una lista de disolventes según su capacidad para eluir solutos. La selección de la fase móvil influye directamente en la separación de las muestras. Los solventes pueden ser denaturaleza orgánica o acuosa. Existen muchas características que debe tener una buena fase móvil, entre las más importantes se encuentran: no alterar la columna ni su naturaleza, disolver la muestra, serdebaja viscosidady,unavezterminadalaseparación,debepermitir la recuperación del soluto demanera simple (Watty, 1989). En la cromatografía líquido-sólido existen dos subdivisiones que están en función de suconformación: lafase normalylafase inversa. Para l^fase normalserequiere de una fase estacionaria polar, por lotanto, la fase móvil debe ser no polar. Los empaques que sepueden utilizar en fase normal son diol, sílicayamino,entreotros. En difase inversa se necesita un empaque no polar y una fase móvil po- lar. Los empaques más comunes para la fase reversa son: ODS (C18),octyl, dimetil,etc. Otra variación de este tipo de cromatografía se conoce comofase ligada (bondedphase), que consiste en enlazar con el soporte de sílica compuestos que aumenten su carácter no polar (C2,C6,C8, Clg). En función del tamaño de lacadena dehidrocarburos que sehayaunido, lostiempos deretención delos solutos que eluyan en estas columnas,tenderán a aumentar, pues seretendrán más fuertemente. 46 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  49. 49. Cromatografía líquida de alta resolución Tabla 2.1 Lista dedisolventes. Disolvente Ácido acético Acetona Acetonitrilo Benceno N-butanol Tetracloruro de carbono Cloroformo Ciclohexano 1,2-dicloroetano Cloruro de metileno Dimetil sulfóxido Dioxano Acetato de etilo Etanol Dietiléter Heptano Hexano Metanol Pentano N-propanol Iso-propanol Tetrahidrofurano Tolueno Tricloroetileno Agua Xileno índice de polaridad 0.62 5.10 5.80 2.70 3.90 1.60 4.10 0.20 3.50 3.10 7.20 4.80 4.40 6.20 2.80 0.00 0.00 5.10 0.00 4.00 3.90 4.00 2.40 1.00 9.00 2.50 Longitud de onda de corte nm 230 330 190 280 215 263 245 200 225 235 268 215 260 210 220 200 200 205 200 210 210 215 285 273 200 290 Solubilidad en agua % p/p 100 100 100 0.18 7.81 0.08 0.815 0.01 0.81 1.6 100 100 8.7 100 6.89 0.0003 0.001 100 0.004 100 100 100 0.051 0.11 100 0.018 47 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  50. 50. Manual de prácticas de química analítica II Cromatografía de intercambio iónico Consiste en cambiar iones de la fase estacionaria por iones que se encuen- tran disueltos en la fase móvil. Aniones como el sulfito -SO3~ o cationes [N-(CH3*)3 + ] se unen covalentemente con la fase estacionaria: los iones de soluto, de carga opuesta a los de la fase estacionaria, son atraídos por fuerzas electrostáticas (la fase móvil es un líquido, figura 2.1). Se puede efectuar cromatografía de intercambio iónico no solamente enHPLC,sinotambién en capafina,en columna yen papel impregnado deresina. En estemétodo lase- paración depende de las variables: fuerza iónica, capacidad de carga de la columna ydel pH durante elproceso de separación. Elprocedimiento deriva de lacromatografía delíquido-sólido,yseutilizaenlaseparación deaminoáci- dos, en análisis de trazas, en la separación de metales por formación de complejos, etc. Lasresinasutilizadas enlascolumnaspuedenestaronopolimerizadas.Enel mercado existenresinas intercambiadoras catiónicas,tipo ácido fuerte odébil, e intercambiadores amónicos tipo base fuerte o débil. También hay geles de intercambio iónico,queseutilizanpara separar moléculaspequeñas conpesos moleculares menores a 500. La tabla 2.2 muestra ejemplos de columnas de intercambio iónicocomerciales,mencionando eltipodeionesquepuederetener, el pH detrabajo y lapresión máxima a la quepueden serutilizadas. Aniones móviles mantenidos cerca de los cationes unidos covalentemente a la fase estacionaria Figura 2.1 Cromatografía de intercambio iónico (resina de intercambio aniónico, sólo los aniones pueden ser atraídos hacia ella). 48 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  51. 51. Cromatografía líquida de alta resolución Tabla 2.2 Columnaspara HPLC de intercambioiónico. Columna Syn Chropac SAX Fuertemente aniónica Syn Chropac WAX Débilmente aniónica Syn Chropac SCX Fuertemente catiónica TSKcatiónica Soporte Sílica Sílica Sílica Resina pH 2 a 8 2 a 8 2 a 8 2a12 Presión máx. 5 000 psi 5 000 psi 5 000 psi 200 psi Cromatografía de exclusión molecular Conestemétodo lasmoléculas se separanpor sutamañoyconformación: siel peso molecular les permite adentrarse en la red del gel y/o si la molécula es globular, laretención serámayor, comparada conunamolécula depeso supe- rior al de la capacidad del gel o con una molécula de conformación irregular (figura 2.2).Lasaplicaciones deestatécnica sonamplias,yaquepermite separar muestras conpesos moleculares entre 700y más de 150millones, particular- mente aquellas de interés bioquímico. También es muy utilizada para la separación depolímeros (tabla2.3).Los soportes utilizados pueden serdegel de sílice unido a compuestos que aumentan su carácter hidrofílico, como las columnas Biosep-SEC-S;opueden serpolímeros como losdelaseriePolysep- GFC-P (poliestireno,polihidroximetacrilato, estireno-divinilbenceno, etc.).En el mercado de lacromatografía deexclusión molecular existeun grannúmero de columnas quepermiten seleccionar el intervalo de fraccionamiento que se requiera (Phenomenex, 1994). 49 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  52. 52. Manual de prácticas de química analítica Moléculas grandes son excluidas Moléculas pequeñas penetran el gel Figura 2.2 Cromatografía de exclusión molecular. Tabla 2.3 Columnas comercialespara la exclusión molecular. Columna Styagel HR 0.5 Styagel HT 4 Styagel HMW7 Rango PM 0 a 1 000 5 000 a 600 000 500 000 a 1x108 Aplicaciones Aditivos, fenoles, epóxidos, urea PM intermedio PM alto Cromatografía de afinidad Sebasa enla interacción específica que existe entre un soluto deunamezclay un sitio activo presente en el gel de la fase estacionaria de la columna. Las interacciones están relacionadas más con lascaracterísticas estructurales que con la carga, tamaño, solubilidad u otras propiedades que se aprovechan en otrostipos decromatografía. Ejemplos deaplicaciones sonlarelación sustrato enzima y larelación antígeno anticuerpo (DayyUnderwood, 1989). Una mayor fuente de información sobre los métodos cromatográficos se puede encontrar en los excelentes libros: Harris, 1992;Pecsok, 1981. 50 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  53. 53. Cromatografía líquida de alta resolución Operación del cromatógrafo de alta resolución (HPLC) El HPLC constadecuatropartes:el sistemadebombas encargado demantener constante elflujodelafase móvil;elsistemadeinyecciónquepermiteintroducir lamuestraatrabajar;lacolumnaquetienelafunción deseparar loscomponentes de la muestra y el sistema de detección de los solutos eluidos, el cual manda una señal al sistema deregistro. Sistema de bombas Este sistema es un componente importante del cromatógrafo de líquidos, el cual requiere de una bomba de alta presión, comúnmente de un máximo de 6 000psi.Lapresión esnecesariapara mover laspartículas del soluto entre la fase estacionaria de la columna. Una bomba para cromatografía de líquidos debe tenerunflujocontinuo y libre depulsaciones. Existen dostipos de sistemas deelución:uno donde eldisolvente no cambia de composición durante el proceso de aislamiento, conocido como elución ¡socrática, y otro que requiere de un gradiente para mejorar la separación de los componentes enuna mezcla (elución porgradiente). Lasbombasconpistonessincronizados sonlasmásempleadasenlossistemas deHPLC.Un pistón siemprebombea disolvente,mientras el otro se llena.Es- te arregloproporciona unflujorelativamente libre depulsos opulsaciones. Pueden evitarsemuchosproblemas conlasbombas sisecuidanlossolventes utilizados:nodebentenerunpHmuybajo ni formar precipitados con facilidad. Encolumnasconvencionales de 5mm dediámetro internoyconflujosentre 1y2ml/min, pueden resultar presiones de400bar,dependiendo de la longitud de la columna, eltamaño departícula yel disolvente. El sistema de bombas debe de mantenerse en óptimas condiciones si se quieretener reproducibilidad en las corridas cromatográficas. 51 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  54. 54. Manual de prácticas de química analítica II Figura 2.3 Control del sistema de bombas del HPLC Figura 2.4 Sistema de bombas del HPLC 52 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  55. 55. Cromatografía líquida de alta resolución Operacióndel sistema de bombas (figuras 2.3 y 2.4): Se enciende el aparato con el botón rojo de laparte inferior derecha (número 8 de lafigura2.4).Laparte frontal consta de (figura 2.3): 1. Pantalla digital para conocer lapresión del sistema, lacual está dadaen librasporpulgada cuadrada (psi).Elnúmero que aparece en lapantalla debe multiplicarse por 10,a fin de obtener lapresión verdadera. 2. Botones quefijan la presión mínima y máxima de trabajo durante el proceso de separación. Se recomienda establecer la presión baja en ceropsiy lamáxima en 3 500psi.Elvalor máximo depende deltipo de columna autilizarydelaviscosidad del disolvente omezcla deellos.Si durante el proceso de separación la presión del sistema rebasa estos valores, el sistema debombas seapaga automáticamente. 3. Standby. Permite que el motor se apague y el sistema eléctrico siga funcionando. 4. Reset.Botónquereenciende lasbombasyrestablece elflujoylapresión del sistema. 5. Led. Foco rojo que indica el apagado de las bombas y que el flujo del sistema tiende acero. 6. Control deflujo.Consta detres diales rotatorios individuales ypermite preseleccionar elflujodel sistemaenml/min.Elflujodebe incrementarse poco a poco (de décima de mi en décima de mi). Una lectura de 070 indicaunflujode0.70 ml/min. 7. Válvula depurga. Permite lapurgahidráulica del sistema. 8. Botón de encendido o apagado. Sistema de detección de solutos eluidos Existendiferentes tiposdedetectoresutilizados enlacromatografía delíquidos, loshay defluorescencia,índice derefracción, conductividad eléctrica, deUV- visible, arreglo de diodos,etc. El tipo UV-visible es el más ampliamente distribuido como detector en HPLC,lamayoríadeloscompuestostienen cuandomenos alguna absorbancia en las regiones del UV o el visible. El fundamento cuantitativo de estas 53 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  56. 56. Manual de prácticas de química analítica II Figura 2.5 Control del sistema de detección de solutos eluidos. 6 7 Figura 2.6 Detector UV-visible. 54 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  57. 57. Cromatografía líquida de alta resolución determinaciones se encuentra en la ley de Lamber y Beer, lacual relaciona la absorbancia del soluto con su concentración (c, en moles/1)y la longitud del paso del haz de luz (b):A = 8be. Los detectores delosequipos actualestienenunamayorflexibilidadquelos espectros comunes,yaquepuedenreportar valoresmenores de0.001 unidades de absorbancia. Operación del sistema de detección Se enciende el aparato con el botón rojo de laparte inferior derecha. Laparte frontal (figuras 2.5 y2.6) constade: 1. Pantalla. Permite leer hasta diezmilésimas deunidades de absorbancia. 2. Botón depolaridad. Sirvepara cambiar la señal de salida del sistemade registro. 3. Botón de corte (short switch). Conecta o desconecta las terminales positiva ynegativanulificando la señal del integrador oregistrador. Este efecto eslomismoquesisemandaraunaseñaldecerovoltsalregistrador, permitiendo ajustar el cero independientemente del ajuste hecho enel registrador o integrador. 4. Mark. Este botón permite producir una marca en la carta y se utiliza generalmente para indicar el momento de lainyección de lamuestra. 5. Auto cero.Estebotónpermite definir lalíneabaseytieneunintervalode ± 0.7 UA (unidades deabsorbancia).Cuando lalámparaparpadea indica que la señal de salida de la línea base excede el intervalo detrabajo del auto cero. 6. Pantalla indicadora de la longitud deonda seleccionada. 7. Control de selección de longitud deonda. Ajusta la longitud de ondade trabajo entre 190y 700 nm con incrementos de 0.2 nm. 8. Intervalo de unidades de absorbancia (AUFS,Absorbance Units Full Scale). Cuenta con doce posiciones diferentes que seleccionan la sensibilidad de lasunidades de absorbancia. 9. Botón de control. Consta de seisposiciones que sepueden seleccionar yobservar en lapantalla: 55 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  58. 58. Manual de prácticas de química analítica II SE {Sample Energy).La pantalla reporta la energía UV de la celda de lamuestra problema. RE (Reference Energy). Reporta la energía UV de la celda de referencia. AU (Absorbance Units).Se observan la unidades de absorbancia presentes enlamuestra problema. Zero, cantidad en unidades de absorbancia que el aparato toma como cero. • DLV(Deuterium Lamp Voltage). Reporta el voltaje de la lámpara de deuterio. DLC{Deuterium LampCurrent). Reporta lacorriente del filamento de lalámpara enmiliamperios, una lectura de 300 es idealy de285 a 315 es aceptable. 10. Tiempoderespuesta. Soncincoposicionesqueseleccionanlos diferentes tiempos de respuesta: • 0.05 sea, respuesta rápida que provoca picos angostos y mucho ruido en la líneabase. • 0.10 sea, respuesta rápida con ruido ligeramente menor que la anterior. • 0.50 sea, másrápidaquelarespuestanormalyconruido ligeramente mayor de lonormal. • 1.00 sea, respuesta normal con picos angostos y una cantidad pequeña deruido. • 5.00 sea, respuesta lentaparauna supresión máxima delruido. Operación del integrador SP4400 Es un equipo que permite interpretar la señal mostrando no sólo el croma- tograma, sino también un reporte completo con lostiempos deretención, las áreasy susporcentajes. Siserequiere,tambiénproporciona información sobre las condiciones bajo las cuales se corrió el sistema y cuenta con programas para hacer cálculos con patrones externos e internos (figura 2.7). 56 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  59. 59. Cromatografía líquida de alta resolución Figura 2.7 Integrador Figura 2.8 Vistaparcial del teclado delintegrador. 57 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  60. 60. Manual de prácticas de química analítica II Dentro de las ventajas que tiene utilizar un integrador, se encuentran los métodos numéricos que permiten realizar diferentes tipos de cálculos, como lossiguientes: a) Método numérico cero:MN =0. Es un método de porciento de área usado cuando los resultados de concentración no son necesarios. Este método noutiliza factores derespuesta del detector y deestamanerano requiere de calibración. Una vez que el diálogo de rutina termina, se selecciona el método en el reporte, el cual incluye todos los picos del cromatograma identificados por orden de elución. Los nombres de los componentes no son generalmenteutilizados. b) Método numéricouno:MN =1.Es el más utilizado en cromatografía de gases,enparticular cuandotodos los componentes de lamuestra son conocidos. Es muy similar al método cero, con excepción de que las áreas (o altura) de los picos son corregidos por factores de respuesta, calculados previamente en una corrida con sustancias patrón de con- centración conocida. c) Método numéricodos:MN = 2. Requiere la utilización de estándares internosparacuantificar demaneraexactaloscomponentesdeunamezcla. Es deuso común en análisis de compuestos farmacéuticos, aditivosali- mentarios,etc.Laconcentración delestándarinternodebe serligeramente mayor,pero nopasar deunfactor de 10,conrespecto alos componentes de interés enuna mezcla. Descripción del teclado (figura 2.8) Backspace: borra datos previos moviendo el cursor hacia atrás. LCDstatus:Presenta un cuadro enpantalla donde indica el canal(C/z), archivo (FI número de inyecciones en ese archivo (Biri), la velocidad de la carta (Cs),atenuación (Atteri), tiempo de corrimiento (Runtime), nivel (Level)y capacidad de memoria. Inj/endA: Tecla que se debe oprimir en el momento de efectuar la inyección enlacolumna"A". Shiftinj/endA:Detiene eldesarrollo del cromatograma sindar elreporte delmismo. 58 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  61. 61. Cromatografía líquida de alta resolución Aítem Se usa para verificar la atenuación en cualquier momento del proceso cromatográfico. Cuando se presiona, aparecen en la pantalla losvalores numéricos válidos para cambiarla. Entre paréntesis aparece elvalor que seestáutilizando. Chartspeed: Seutilizaparaverificar lavelocidad delacartaencualquier momento del proceso cromatográfico. Cuando se presiona, aparecen en la pantalla los valores numéricos válidos para cambiarla. Entre paréntesis aparece el valor que se está utilizando. Se recomienda usar velocidad 2 para cromatogramas con pocos picos y 2 o 4 para cromatogramasricosenpicos. PTeval: No debe utilizarsedurante la corrida.Normalmente se ob- serva suvalor antes deinyectar nuevamente lamuestra, yaqueunvalor menor a250indicaqueyanohayresiduos de solutodel análisis anterior pasando por el detector. Metodología para el manejo del HPLC 1. Preparación del disolvente y la muestra a analizar. Ambos deben ser filtrados enmembranas de 0.4 |um,paraevitar quelasimpurezas entren y contaminen lacolumna. El disolvente debe ser gradoHPLC. 2. Revisar que el sistema de entrada y salida de los disolventes estén sumergidos en susrespectivos recipientes. 3. Encender el sistema de bombas (número 8de lafigura2.4). 4. Ajustar el flujo oprimiendo los botones respectivos (número 6 de la figura2.3) del sistema debombas. 5. Seleccione lalongitud deondaconbaseenelsistemaaseparar,moviendo el dial correspondiente (número 7 de la figura 2.6). Al igual que el cromatógrafo degases,elHPLCrequieredeuntiempo (20a 30minutos) para que se estabilicen las condiciones de trabajo. 6. Encender elintegrador y ajustar lavelocidad de lacartay la atenuación, presionando primero latecla Chartspeeddel teclado del integrador y posteriormente la tecla Atten (figura 2.8). Se puede elegir entre una serie de valores que van desde 0.5 hasta 4 096 en incrementos geométricos para la atenuación. Si en una primera corrida los picos 59 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  62. 62. Manual de prácticas de química analítica II rebasan la escala del integrador, se puede aumentar la atenuación al valor próximo, demanera que lospicos reduzcan a lamitad sutamaño (siemprey cuando seutilicen lasmismas condiciones de separación). 7. Verifique el valor del PT evaluation: debe ser como máximo de250. 8. Inyecte lamuestra conunajeringa de 50 jalcon aguja sin punta, mida la cantidad establecida en el manual deprácticas de lamuestra acorrer e introduzca lajeringa en la válvula de inyección. El mecanismo de inyección de la muestra (figura 2.9) es de dos posiciones: carga y descarga. Presione el émbolo para que la muestra pase a latubería de acceso (loop).Mueva la palanca a laposición de descarga para que la muestra sea llevada a la columna, el líquido contenido en el loopserá desplazado hacialacolumna. Elmovimiento debe serrápidoparaevitar una caída brusca de presión que desconecte el sistema de bombas. Posteriormente oprima latecla inj/endA del integrador. Terminado eltiempodecorrimiento vuelvaapresionar latecla inj/end A, el integrador le dará un reporte completo de su sistema separado. 60 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  63. 63. Cromatografía líquida de alta resolución Hacia la columna Flujo Alojamiento de muestras Flujo Jeringuilla I Exceso de inyección CARGAR Unión INYECTAR Figura 2.9 Válvula de inyección para cromatógrafo de líquidos de alta resolución. 61 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  64. 64. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  65. 65. Práctica 3 Cuantificación de una muestra problema de anisaldehído (método del patrón interno) Introducción Elfuncionamiento deuncomatógrafo dealtaresoluciónempiezaconelsistema de bombas de alta presión, el cual impulsa el disolvente a través de todo el sistema.Lamuestra esinyectadapormedio deunamicrojeringa,elvolumenes de unos cuantos microlitros para que laresolución de lospicos seabuena yla separación sea más rápida. Una vez en la columna, se realiza la interacción soporte-soluto-disolvente, lo cual permite la separación de los componentes de la muestra. El detector está compuesto por una microcelda en forma de "Z", atravésdelacualfluyeladisolución; esexcelenteparaqueloscompuestos no se mezclen y el flujo searápido. Por último, en el integrador, la absorban- cia es convertida en señal eléctrica y así esreproducida como cromatograma. En la cromatografía de líquidos departición existen dos grupos de trabajo, el más frecuente se conoce como cromatografía de fase inversa, en ella la fase estacionaria tiene un carácter nopolar y se eluye conun disolvente polar. El segundo grupo es la cromatografía defase normal que utiliza un soporte polaryun disolvente no polar. El sistema de elución puede ser isocrático opor gradienteyeldetector máscomúneseluv-visible, aunquetambién esutilizado el deíndice de refracción. Lacuantificación deunamuestraproblemapormediodeunestándarinterno se puede efectuar con la elaboración de una curva estándar, la cual debe ser hechamínimo contrespuntos.Enel laboratorio sedebetener especial cuidado 63 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  66. 66. Manual de prácticas de química analítica II sobre las condiciones de separación, en cuanto avolumen inyectado,flujoy composición delafase móvil.Lacurvasedesarrollará enfunción delarelación de alturas oáreas delospicosdel compuesto entrelasdelestándar (vercapítulo 1: Cálculos en cromatografía). En las abscisas se coloca la relación de la concentración del soluto entre la concentración de la sustancia patrón. La concentración de lamuestra problema se interpola de la curva patrón. Objetivo El alumno aprenderá autilizar el cromatógrafo de líquidos de alta resolución para cuantificar unamuestra problema de anisaldehído, utilizando el método del patrón interno. Materiales y reactivos Cromatógrafo de líquidos de alta resolución Columna Spherisorb ODS C]810 mm Filtros deteflón de 0.4 mm Jeringa de 50 mi, con aguja para HPLC 5 frascos viales de 5mi con tapa 2 pipetas volumétricas de 1mi Anisaldehído Acetonitrilo Tolueno Muestraproblema con anisaldehído Normas de seguridad Alpreparar lamezclaacetonitriloaguayacetonitrilotoluenodebehacerlo en la campana de extracción. Revise su bitácora para recordar que el acetonitrilo es venenoso yfla- mable,quedebeevitarrespirar susvaporesyquepuedecausar irritación enlapiel. 64 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  67. 67. Cuantificación de una muestra problema de anisaldehído Procedimiento 1. Las condiciones de funcionamiento del cromatógrafo deben ser las si- guientes: 2. 3. 4. 5. 6. Columna Spherisorb Dimensiones Presión máxima Fase móvil Flujo 10ODS10jim 250 x 4.6 mm 3 500 psi acetonitrilo/agua (50:50) 0.8 ml/min Prendayacondicioneelcromatógrafo dejando queelsistemaseestabilice. Prepare las siguientes mezclas de anisaldehído ytolueno: Compuesto Anisaldehído Tolueno Corrida 1 0.07 M 0.05 M Corrida 2 0.05 M 0.05 M Corrida 3 0.03 M 0.05 M Filtre por membranas de 0.4 jom: a) Lamezcla de acetonitrilo agua,b) cada una de las mezclas patrón y c) lamuestra problema. Solicite alprofesor lamuestraproblemaquecontiene 0.05 Mdetolueno como estándar interno,mida 2 |il einyéctelos. Repitaportriplicado la determinación. Tratamiento de datos experimentales Con las concentraciones y las alturas de los picos del patrón externo, elabore una curva patrón como laque se muestra en lafigura2.10. 65 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  68. 68. Manual de prácticas de química analítica II ALTURA S ALTURA P [SOLUTO S] [SOLUTO P] Figura 2.10 Curva patrón. La concentración de la muestra problema se calcula a partir de sustituir el valor de la altura del anisaldehído (altura S) en la mezcla problema en la relación: ALTURAS ALTURA P La altura "P"es la altura del tolueno, el valor de esta relación se interpola en la curva patrón y el valor de la gráfica es sustituido en la siguiente relación, para obtener laconcentración del soluto de lamuestra problema: SOLUTO S SOLUTO P Cuestionario 1. Mencione tres diferencias, en cuanto a suaplicación, entre la cromatografía degasesyelHPLC. 2. Describa los cuidados experimentales que se deben tener para: a) los disolventes a utilizar como fase móvil, b) la muestra problema a separar o cuantificar. 66 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  69. 69. Cuantifícación de una muestra problema de anisaldehído Indique usted qué fase estacionaria, quéfase móvil yquédetector serían losindicadosparaefectuar unabuenaseparacióndelassiguientesmezclas: a) de carbohidratos, b) de aminoácidos y c) de proteínas. Para conocer elcontenido de anfetamina enunpreparado farmacéutico comercial,seutilizacomoestándarinternolametanfetamina yse efectúan tres corridas cromatográficas. Con base en estos datos construya una curva patrón y calcule la concentración de una muestra problema de anfetamina quedio una altura de 123mm. Corrida Fármaco Anfetamina Metanfetamina 1 Conc. 0.6 0.6 Altura 30 38 2 Conc. 1.2 0.6 Altura 60 38 3 Conc. 1.8 0.6 Altura 98 38 Conc.= concentración en mM. 67 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  70. 70. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  71. 71. Práctica 4 Separación y cuantificación de una muestra de antocianinas (método del patrón externo) Introducción La cromatografía de líquidos de altaresolución ha tenido un gran auge en los últimos 20años,sehautilizado comotécnicaparaseparar,identificar ypreparar sustancias en muchas áreas. Actualmente estos equipos se combinan con el banco dememoria de una computadora, lo que ofrece unamayor facilidad en laidentificación decompuestos. Una aplicación actualizada esla separación eidentificación deantocianinas, tanto en uvas como en vinos tintos. A pesar de tener el vino tantos años de historia, aún no se conoce qué ocurre con sus compuestos durante el añejamiento. El color es uno de los atributos más importantes del vino y es determinante en la evaluación sensorial. En las uvas tintas está dado por el contenido de antocianinas y en las uvas blancas por los flavonoles. Existen en las uvas tintas 14 antocianinas, de las cuales cinco se encuentran en ma- yorproporción:malvidina, petunidina, cianidina,peonidinay delfidina (Reyes etal., 1992). Lasantocianinas sonpigmentos decolorrojo, azulyvioleta. En condiciones acidas, el color rojo predomina; en presencia del ion bisulfito (HSO~3 ) reaccionan y se decoloran, esta reacción es reversible. El color de los vinos tintos sedebeprincipalmente alasantocianinas libres(estoscompuestostienden a polimerizarse casi de manera inmediata desde que son estrujadas), y a pigmentos polímeros formados durante eltiempo deafiejamiento delvino,por condensación de antocianinas con otros compuestos flavonoides y proba- 69 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  72. 72. Manual de prácticas de química analítica II blemente aldehidos. El color de losvinostintos depende del pH, el contenido de SO2? de los pigmentos poliméricos y lostaninos. El uso de equipos como elHPLC permite la separación de las antocianinas envinos tintos y éstas aparecen como picos discretos. Objetivo El alumno utilizará el cromatógrafo delíquidos de altaresolución para separar ycuantificar unamuestradeantocianinas,utilizandoelmétododelpatrónextemo. Materiales y reactivos Cromatógrafo de líquidos de alta resolución Columna Spherisorb ODS Clg 10mm Filtros deteflón de 0.4 mm PapelfiltroWhatmanNo. 1 Jeringa de 50 mi, con aguja para HPLC 4 tubos de ensayo con tapa de rosca Mortero conpistilo Pipeta graduada de 10mi Clorhidrato de malvidinamonoglucósido Ácido fórmico Acetonitrilo Metanol HC1(concentrado) Normas de seguridad Cuidequealpreparar lasmezclasacetonitrilo aguayacetonitrilo tolueno se haga en la campana de extracción. 70 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  73. 73. Separación y cuantifícación de una muestra de antocianinas Procedimiento Recuerde queelacetonitrilo esvenenoso,flamableyquecausairritación en lapiel. Se debe evitar respirar susvapores. Maneje con cuidado el ácido fórmico yevite el contacto con lapiel,ya que es corrosivo. 1. Extracto apartir del hollejo de lauva: lavar yquitar elhollejoa 10uvas tintas,colocando ésteenunmortero limpio.Adicionar 10midemetanol ypresionar suavemente con elpistilo contra elhollejo para obtener una disolución muy colorida. El extracto esprefiltrado conpapel Whatman No. 1,antes defiltrarconmembranas Millipore de 0.45 |Ltm.El extracto se guarda enuntubo de ensayo limpioy con tapón derosca. Seprotege de la luzy debe utilizarse a la brevedad. 2. Lascondiciones de funcionamiento del cromatógrafo deben ser: Columna Spherisorb 10ODS 10 |jm Dimensiones 250x4.6mm Presión máxima 3 500psi Fasemóvil. Seutilizaun gradiente deelución condos disolventes: Disolvente A, ácido fórmico al40% DisolventeB,acetonitrilo Gradiente inicial:25%solventeA 6 minutos después incremente el disolvente Ba 23 %. 8 minutos después incremente el disolvente B a 50%. 5 minutos después incremente el disolvente Ba 95 %. Flujo 0.7ml/min NOTA:verifique quetanto lasmuestras como los disolventes de la fase móvil sefiltrenenmembranas Millipore de 0.45 |jm. 3. Prenda yacondicione el cromatógrafo, permitiendo que se estabilice el flujo ylacolumna. 4. Se inyectan 2 (il del extracto colorido. Repítalo por triplicado. 71 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  74. 74. Manual de prácticas de química analítica II 5. Para elaborar la curva patrón con el clorhidrato de malvidin 3- monoglucósido, sepreparan cuatro diferentes concentraciones 25,50, 100y 150mg/1en metanol con 1ml/1de HC1 concentrado. Se inyectan en la columna por separado, losvolúmenes de inyección deben ser de 214,1.Ajuste la atenuación para que los picos no rebasen la escala del integrador. Tratamiento de datos experimentales Cuestionario Con las concentraciones y las alturas de los picos del patrón externo, elabore unacurvapatrón como ladelafigura1.6. Calcule el coeficiente de correlación. Conlaalturadelospicosdelextractodeuvaenelcromatogramainterpole los datos en la curva patrón. Con el valor verdadero (datoproporcionado por elprofesor) calcule la precisión y exactitud ydiscuta susresultados. 1. ¿Qué influencia pueden tener los siguientes cambios sobre el croma- tograma obtenido en esta práctica? a) Utilizar una columna C-8 en lugar deunaC-18. b) Disminuir elflujodelafasemóvil. c) Hacerunaelución isocrática (enlugardeunapor gradiente) encondi- cionesdedisminución delflujodelafase móvil. 2. ¿Qué puede suceder si,por descuido,no sefiltrael extracto de materia colorante y seinyecta en el cromatógrafo? 72 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  75. 75. Separación y cuantificación de una muestra de antocianinas 3. ¿Se puede confiar en un cromatograma que fue obtenido durante una corrida que presentó fuertes variaciones en la presión de las bombas? ¿Qué puede ocasionar este comportamiento? 4. ¿Qué otros sistemas de detección son de uso frecuente en los croma- tógrafos dealta resolución? 5. Mencione brevemente tres aplicaciones directas de la cromatografía líquida de altaresolución, mencionando además tipo de columna, fase móvil que sepodría utilizar yel detector adecuado. 73 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  76. 76. Manual de prácticas de química analítica II Bibliografía Brewer, S. 1987.Solución deproblemas de química analítica.Ed. Limusa, México. Dallas, C. y O. Laureano. 1994. "Effects of pH, Sulphur Dioxide, Alcohol Content, Temperature and Storage Time on Colour Composition of a YoungPortugueseRedTable Wine". J.Scl Food Agrie. 65:477-485. Ewing, G. W. 1979.Métodos instrumentalesde análisis químicos. Ed. Me GrawHill,México. Harris, D. C. 1992. Análisis químico cuantitativo. Grupo Editorial Iberoamérica, México. León, R. 1982.Libro básicopara cromatografíade líquidos. LDC/Milton Roy,USA. Meites, L. (editor). 1963.HandbookofChemistry. Me Graw Hill, USA. Operator'sManual. 1993. SpeetroMonitor 3200 Variable Wavelength De- tector. Thermo Separation Products,USA. Operator'sManual. 1993.ConstaMetric 3200 Fluid Metering Pump.Thermo Separation Products,USA. Pecsok, R. L.y L.D. Shields. 1987.Métodosmodernosde análisisquímico. Ed.Limusa,México. Reyes-Dorantes, A., M. L. Escamilla-Hurtado y J. R. Verde-Calvo. 1992. Enología VolI. Elaboración devinosde mesa.Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa, México. Watty, M. 1989. Químicaanalítica.Ed. Alhambra Mexicana, México. 74 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  77. 77. Capítulo 3 ESPECTROFOTOMETRIA DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  78. 78. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  79. 79. I. VISIBLE ULTRAVIOLETA Introducción Los usos analíticos de la espectrofotometría en lazona del visible ultravioleta son muchos y muy variados. El objeto de este capítulo es hacer mención de algunas de estas aplicaciones, y que el alumno ponga en práctica los co- nocimientos adquiridos en lateoría sobre la ley deLambert yBeer. Cuando un compuesto o ion capaz de absorber luz es colocado en una cel- da en un espectrofotómetro, cierta cantidad de luz monocromática será absorbida por dicho compuesto yelresto saldrá de laceldapara ir aincidir so- bre el fototubo que la detectará. Este comportamiento es aprovechado para conocer la concentración de los compuestos. La transmitancia, T,deuna disolución se define como la fracción de la in- tensidad odelafuerza delaluzincidente,Po,quesetransmite verdaderamente a través de la disolución. En donde P es la intensidad de la luz que sale de la muestra. T = — o T = 100 Po Po) La absorbancia,A, de una disolución es la luz que absorbe, no la que se transmite,y sedefine como: A = - logT = log — La ley de Beer (también conocida como la ley de Bouguer-Beer o deLam- bert y Beer) establece que: a una longitud de onda dada, la absorbencia es proporcional a la concentración de la especie absorbente en una disolución, como loindica la siguiente ecuación. A = zbc DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  80. 80. Manual de prácticas de química analítica II En donde b es el recorrido del haz de luz en la celda, c es la concentración (moles/1) y la constante de proporcionalidad es la absortividad molar, e. Su valor numérico depende de las unidades que se usen para expresar by c. Sib está dada encmy cenmolespor litro, sele denomina coeficiente de extinción molar o absortividad molar yrecibe el símbolo de e. Sila concentración seda en g/1,solamente sellama coeficiente deextinción oabsortividad ysu símbolo es"a" (paraobtenermayorinformación sobreestaleysepuedenleerlostrabajos de Hughes, 1952,Liebhafsky, 1953,yLykos, 1992). Desviaciones de la ley de Beer Una gran cantidad de compuestos absorbentes siguen bastante bien la leyde Beer en soluciones diluidas,pero enalgunas sustancias lasabsorbancias varían enforma nolinealrespecto delaconcentración. Estecomportamiento seconoce como "desviación de la ley de Beer". Paratrabajar estos sistemas se requiere una curva de calibración, trazada con valores de muestras de concentración conocida, de este modo se puede conocer el intervalo de concentraciones en el cual larelación es lineal. Sedebe tomar en cuenta que las desviaciones con respecto aestaleypuedentenercausasdiversas:pormuestrasmuyconcentradas omuydiluidas,porvariación delequilibrio químico delasustanciaqueabsorbe yporlimitacionesdelinstrumentoutilizado. Para tener el mínimo de problemas con las desviaciones, se recomienda trabajar en el intervalo de concentraciones de 10'2 M a 10'6 M. Si seutilizauna técnica poco reconocida, hay que cuidar el equilibrio químico poniendo espe- cial atención en la fuerza iónica y en el pH del sistema, ya que hay muchos compuestos cromóforos oquelatos quepresentanequilibriosparciales,enestos casos hay que agregar un exceso de ligando para desplazar el equilibrio hasta la formación del complejo conmayor número de coordinación. También existenproblemas causadospor losequipos,como lasradiaciones reflejadas dentro del aparato que llegan aldetector, loscambios de sensibilidad del detector ylasfluctuacionesen lacorriente eléctrica queprovocan cambios enlaintensidaddelaradiaciónyporendemodificaciones enlalecturaregistrada. Un dato muy importantees que las mediciones espectrofotométricas sólo sonconfiables convalores intermedios deabsorbancia, aproximadamente entre 0.187 y 0.824; o en % de T,entre 15 y 65; si se requiere, se puede ampliar 78 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  81. 81. Espectrofotometría esta escala hasta 80% de 7, pero entonces se aumenta el error fotométrico (valores de absorbancia para un espectro de un solo haz,utilizando la gráfica de Ringbom. Servicios Centrales deInstrumentación, 1983). Celdas La celda es un depósito transparente especialmente diseñado para contener la disolución deprueba oel disolvente dereferencia (blanco) durante losestudios espectrofotométricos. Existen celdas ocubetas de diversostamaños y formas apropiadas para losdiferentes tipos deespectros comerciales (figura 3.1).Las celdas más comunes para medir espectros en laregión del visible-ultravioleta están fabricadas con cuarzo ytienen un paso de luz de 1.0 cm. Las celdas de vidrio óptico son apropiadas sólopara mediciones en laregión del visible,ya que absorben laradiación ultravioleta. Generalmente las celdas son cuadradas con dos lados esmerilados,pero las hay cilindricas enforma detubo deensayo para serutilizadas enel Spectronic 20. También existen las celdas de flujo que permiten la circulación continua deuna disolución através de lacubeta. Sonútiles paramedir laabsorbancia de disoluciones quefluyendeuna columna cromatográfica. También existen las celdastérmicas conrecirculación de agua oalgún líquido quefluyeenuna ca- misa para mantener el contenido de la celda a latemperatura deseada. Lascaracterísticas detransmisión delasceldas envarias longitudes deonda sonfunción delosmaterialesdefabricación. Porejemplo,elvidriopyrextransmite en el intervalo de los 320 a los 2 500 nm. La figura 3.2 muestra las zonas de absorción de losmateriales más comúnmente empleados en la fabricación de celdas. Sepuedenutilizar vidrios oplásticos especiales enlaregióndelvisible. 79 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  82. 82. Manual de prácticas de química analítica II Celda cilindrica para flujo constante Celda normal con tapa Microcelda típica con tapa Celda cuadrada para flujo constante s Figura 3.1 Diferentes tipos de celdas para espectrofotometria. 80 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  83. 83. Espectro fotometría 200 250 300 350 400 nm 1. Spectrosil 2. Sílice fundido 3. Cuarzo fundido 4. Vitreosil grado IR 5. Vidrio óptico especial 6. Vidrio Figura 3.2 Espectro de transmisión para materiales utilizados en la fabricación de celdas. Resulta conveniente contar con una marca en el lado donde incida la luz, de manera que la celda pueda siempre ser orientada en la misma posición para permitir la reproducibilidad de los resultados. 81 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  84. 84. Manual de prácticas de química analítica II 7. Control de longitud de onda 2. Control de ajuste de 0% de transmitancia o de absorbancia 1 3. Control de cero y de encendido 4. Portaceldas Figura 3.3 Espectrofotómetro Spectronic 20. Operación del espectrofotómetro Spectronic 20 Descripción El Spectronic 20 (figura 3.3) se enciende girando el control del cero, de la perilla izquierda, enel sentido de lasmanecillas delreloj. Elaparato secalienta 82 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  85. 85. Manual de prácticas de química analítica II 7. Control de longitud de onda 2. Control de ajuste de 0% de transmitancia o de absorbancia 1 3. Control de cero y de encendido 4. Portaceldas Figura 3.3 Espectrofotómetro Spectronic 20. Operación del espectrofotómetro Spectronic 20 Descripción El Spectronic 20 (figura 3.3) se enciende girando el control del cero, de la perilla izquierda, enel sentido de lasmanecillas delreloj. Elaparato secalienta 82 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com

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