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Valeria Tiranti, Isabella Moroni - Convegno Mitocon 2014
 

Valeria Tiranti, Isabella Moroni - Convegno Mitocon 2014

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IV Convegno Nazionale Mitocon Onlus, Tivoli Terme 23-25 maggio 2014- Tiranti, Moroni, Istituto Neurologico Besta, Milano

IV Convegno Nazionale Mitocon Onlus, Tivoli Terme 23-25 maggio 2014- Tiranti, Moroni, Istituto Neurologico Besta, Milano

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    Valeria Tiranti, Isabella Moroni - Convegno Mitocon 2014 Valeria Tiranti, Isabella Moroni - Convegno Mitocon 2014 Presentation Transcript

    • La consulenza genetica nelle malattie mitocondriali ValeriaTiranti-Isabella Moroni 4° Convegno Nazionale Mitocon, 22-25 maggio 2014 TivoliTerme
    • Nelle malattie mitocondriali la corretta funzionalità della catena respiratoria (RC) e del sistema della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) è compromessa. Ampio spettro di presentazioni cliniche: qualsiasi sintomo, qualsiasi organo o tessuto, qualsiasi età. Le malattie mitocondriali sono considerate il disordine metabolico più frequente. Prevalenza stimata ca. 1:5000-8500 nati. Gli organi più colpiti sono quelli che hanno maggior fabbisogno energetico (cervello, muscoli, cuore).
    • COMPLEX IVCOMPLEX III COMPLEX II COMPLEX I ATP SYNTHASE DNA mitocondriale 7 subunità 2 subunità1 subunità 3 subunità + 72 subunità codificate da nDNA. Più di un migliaio di geni nucleari sono coinvolti nella corretta funzionalità del sistema OXPHOS.
    • Le malattie mitocondriali possono essere sporadiche, trasmesse per via matrilineare o come carattere autosomico (recessiva, dominante o X-linked). Malattia Mitocondriale Mutazioni mtDNA Mutazioni geni nucleari Sporadica macrodelezioni Mendeliana con alterazioni del mtDNA Mendeliana con difetti biochimici senza alterazioni del mtDNA Deplezione del mtDNA Delezioni multiple del mtDNA Difetto singolo complesso Difetti multipli Difetti di comunicazione tra genomi Matrilineare mutazioni puntiformi
    • In ogni cellula sono presenti migliaia di molecole di mtDNA. Quando una mutazione colpisce il mtDNA nella stessa cellula coesistono due popolazioni di mtDNA in percentuale variabile (eteroplasmia). La mutazione causa la malattia quando la percentuale di molecole mutate supera la soglia critica (diversa per mutazione, età e tessuto). Mutazioni del mtDNA (matrilineare) Eteroplasmia Mutazione 30% nessun fenotipo Mutazione 70% malattia Omoplasmia Mamma con mutazione Papà senza mutazione Figli con mutazione Mamma senza mutazione Papà con mutazione Figli senza mutazione
    • Zygote of a heteroplasmic mother carrying 20% mutant mtDNA Mother with mild or no symptoms Her primary oogonia Small number of mother’s mitochondria, selected randomly, goes into each early egg cell Her mature oocytes 80% mutant 50% mutant 20% mutant Contribution from mother + + + = = = Sperm cells (no mtDNA contribution) Contribution from father Possible outcome Child with severe disease? Child with no disease? Child with mild disease?
    • heteroplasmic mother her oogonia mitochondrial bottleneck her offspring healthy mitochondrial proliferation STOP! Single deletions are usually NOT transmitted Heteroplasmic single deletion eg, KSS/PEO
    • homoplasmic mother her offspring (usually) healthy (usually) sick Mutation is necessary but not sufficient to produce the disease phenotype Homoplasmic point mutation eg, LHON mitochondrial bottleneck mitochondrial proliferation her oogonia
    • Mutazioni in geni nucleari: ereditarietà Autosomica recessiva Portatore sano Portatrice sana Affetta Sano Portatrice sana Portatore sano Autosomica dominante Affetto Sana Affetta Affetto Sana Sano Sano XY Portatrice sana XX Affetto XY Sana XX Portatrice sana XX Sano XY Legata al cromosoma X
    • Criticità nella diagnosi prenatale (DP) delle malattie mitocondriali La DP è complicata nel caso di mutazioni eteroplasmiche: -la % di mutazione dovrebbe essere la stessa nei tessuti extra-embrionali e nel feto -la % di mutazione non dovrebbe cambiare nel tempo -correlazione tra % mutazione e severità di fenotipo difficile Mutazioni mtDNA Mutazioni geni nucleari Se il gene è noto la DP su villi coriali (9-12 settimane) o amniociti (14-16 settimane) è affidabile Il tipo di ereditarietà consente di stabilire il rischio di ricorrenza DP è affidabile per mutazione NARP 8993T>G :<20% soggetto sano =60% soggetto probabilmente affetto >80% soggetto affetto E per mutazioni de novo
    • Adattato da Nesbitt et al, EJHG, 2014 L’esperienza inglese dal 2007 ad oggi: 17 mtDNA e 45 geni nucleari
    • Come prevenire la trasmissione di una malattia legata a mutazioni del mtDNA  Donazione di ovociti da soggetto sano e fertilizzazione in vitro da parte di spermatozoi del partner: il bimbo sarà geneticamente simile al padre ma non alla madre  DP può essere un’opzione in: -mutazioni de novo: madre sana e senza mutazione in diversi tessuti analizzati -mutazioni con chiara correlazione genotipo/fenotipo (es. NARP 8993)  Diagnosi genetica pre-impianto  Trasferimento del genoma nucleare
    • La diagnosi Genetica pre-impianto  Alternativa alla DP: gli ovociti sono fertilizzati in vitro, vengono effettuate delle biopsie di cellule quando l’embrione è formato da 8 cellule, gli embrioni sani sono trasferiti nell’utero materno.  Analisi è facilitata dalla presenza di un alto numero di copie del mtDNA  Criticità: quanto la % di mutazione dei blastomeri riflette quella dell’intero embrione  E’ stata effettuata per diverse mutazioni: 3243A>G, 8993T>G, 8344A>G. Embrione 1 Embrione 2 Embrione 3 Embrione 4 Embrione 5 Embrione 1 Embrione 3 adattato da Smeets H, Reproductive BioMedicine 2013
    • Trasferimento nucleare nelle patologie del mtDNA metafase II trasferimento fuso mitotico fusione e fertilizzazione fertilizzazione trasferimento pronuclei fusione adattato da Smeets H, Reproductive BioMedicine 2013 Trasferimento fuso mitotico Trasferimento pronuclei
    • Conclusioni  DP può essere un’opzione in: -mutazioni de novo e mutazioni ricorrenti che rispettano criteri precisi  La diagnosi pre-impianto è l’opzione preferita per ridurre il rischio per molte portatrici di mutazioni eteroplasmiche. Il limite è la capacità di produrre ovociti con basse % di mutazione; può essere un problema per mutazioni in alta %  Sia DP che la diagnosi pre-impianto sono tecniche accettate nella pratica clinica  Il trasferimento del genoma nucleare è una tecnica ancora sperimentale e sarà necessario dimostrarne la sicurezza anche nell’uomo.  Lo screening prenatale non invasivo mediante sequenziamento di mtDNA fetale presente nel sangue materno è tecnicamente possibile grazie al sequenziamento massivo ma i risultati possono essere di difficile interpretazione.
    • Fecondazione assistita: la legge 40 dal 2004 a oggi, cosa cambia? Limitazioni all’analisi dell’embrione: non previsto dalla legge ma inserito nelle Linee guida del ministero della Salute del 2004.A seguito della sentenza 398 delTar del 21/1/2008 è stata eliminata la limitazione alla sola analisi osservazionale. Divieto di produzione di più di tre embrioni previsto dall’articolo 14, comma 2: è stato eliminato dalla sentenza della Corte Costituzionale 151/2009. Obbligo di contemporaneo impianto di tutti gli embrioni prodotti previsto dall’articolo 14, comma 2: è stato eliminato dalla sentenza della Corte Costituzionale 151/2009 Limitazione della deroga al divieto di crioconservazione degli embrioni per i soli casi di «grave e documentata causa di forza maggiore relativo allo stato di salute della donna non prevedibile al momento della fecondazione» previsto dall’art. 14 comma 3: è stato modificato dalla sentenza della Corte costituzionale 151/2009 che ha chiarito esplicitamente che «il trasferimento degli embrioni, da realizzare non appena possibile, deve essere effettuato senza pregiudizio della salute della donna». Divieto di diagnosi pre-impianto per le sole coppie infertili portatrici di malattie genetiche: è da considerare non sussistente sia in relazione all’annullamento delle Linee guida ministeriali che introducevano la sola possibilità di analisi osservazionale dell’embrione (sentenza del Tar Lazio 398/2008) sia in virtù della giurisprudenza consolidata (13 tra sentenze e ordinanze dei Tribunali italiani) con un’interpretazione conforme alla Costituzione degli art. 13 e 14 della legge 40 e in relazione alla legge 194/78. Divieto di accesso alle coppie fertili ma portatrici di patologie genetiche, previsto dall’art. 5, che consente l’accesso alla PMA solo per i soggetti con problemi di infertilità e sterilità : questione il cui divieto è stato ritenuto illegittimo da 4 sentenze di tribunali italiani (Salerno e Roma) nonché dalla pronuncia definitiva di condanna della Corte europea per i diritti dell’uomo del 29 agosto 2012 emessa nei confronti dell’Italia. La decisione europea è stata eseguita nel 2013 dopo autorizzazione del tribunale di Roma. La Consulta ha ritenuto questa norma incostituzionale 9 aprile 2014. Divieto di fecondazione eterologa e cioè di donazione dei gameti previsto dall’art. 4 comma 3: eliminato dalla Consulta.
    • LA COMUNICAZIONE DELLA DIAGNOSI Dare la diagnosi di malattia mitocondriale alla famiglia di un bambino affetto implica non solo comunicare tutto ciò che riguarda la sintomatologia, le possibilità di evoluzione, il trattamento e la prognosi, ma parlare del significato di una malattia genetica Si apre uno scenario spesso vissuto come un viaggio nuovo e difficile, che richiede un particolare e delicato rapporto di fiducia ed alleanza tra il medico e la famiglia che deve essere accompagnata anche lungo questo percorso……
    • La caratterizzazione del difetto genetico specifico è indispensabile per definire • il rischio di ricorrenza • l’identificazione di altri familiari affetti OBIETTIVO SPESSO MOLTO DIFFICILE NONOSTANTE LA DISPONIBILITA’ DELLE NUOVE TECNICHE DIAGNOSTICHE
    • Se il difetto genetico è noto Se il difetto genetico non è definito I test genetici coinvolgono non soltanto il paziente, ma anche tutta la famiglia di origine e la sua discendenza. Un corretto approccio a queste tematiche richiede la collaborazione integrata di competenze professionali diverse, che vanno dallo specialista neurologo, al genetista molecolare, al genetista medico. Problematiche diverse Consulenza genetica
    • Patologia a difetto genetico non definito - incertezza della prognosi - timore di non potere adottare trattamenti adeguati e specifici - necessità di sottoporre il bambino a ripetuti esami diagnostici - impossibilità di planning per rischio di ricorrenza
    • Rischio di ricorrenza Estrema variabilità: da 0 % per casi de novo, 25 % nei casi AR, a 100 % se trasmissione matrilineare più frequenti nell’infanzia patologie AR da mutazioni in geni nucleari Fondamentale raccolta anamnesi familiare e ricostruzione albero genealogico per orientare il rischio di ricorrenza Casi a difetto non definito  %
    • Sospetto OPA1  AD Consanguineità e LS  probabile AR Maschi affetti, femmine sane/lievi  probabile X-linked Possibile trasmissione matrilineare
    • Patologia a difetto noto 1. rischio di ricorrenza definibile 2. possibilità di prospettare diagnosi prenatale 3. possibilità di estendere analisi a familiari a rischio con possibile espressione fenotipica differente Ma…… notevoli differenze se difetto in gene nucleare (nDNA) o mitocondriale (mtDNA)
    • il rischio di ricorrenza segue le leggi di Mendel, e varia in modo prevedibile Trasmissione Autosomica Dominante 50 % Trasmissione Autosomica Recessiva 25 % Mutazioni in geni nucleari (nDNA) X-linked 25%
    • Sono frequentemente associate ad una notevole variabilità della sintomatologia all'interno della stessa famiglia Accanto a soggetti affetti da sintomi gravi, vi sono spesso parenti materni che hanno percentuali basse o molto basse di mutazione, e manifestano solo sintomi minori o sono completamente asintomatici, ma la prognosi non è sempre definibile. La diagnosi prenatale è complicata dalla distribuzione variabile della mutazione nei diversi tessuti. Mutazioni nel DNA mitocondriale (mtDNA)
    • IN PRATICA……. • I maschi portatori di mutazioni del mtDNA non trasmettono la malattia ai figli. • Le donne con PEO o con sindrome di Kearns-Sayre in cui venga documentata una delezione del DNA mitocondriale, non trasmettono la malattia ai figli, tranne che in casi assolutamente eccezionali. • Nelle famiglie in cui venga documentata una mutazione puntiforme del DNA mitocondriale, tutte le donne in linea materna devono essere considerate a rischio di avere un figlio affetto  il rischio varia da 0 a 100%.
    • MELAS e MERRF  la diagnosi prenatale per queste mutazioni è complessa perché: - la mutazione su amniociti o villi coriali non corrisponde a quella degli altri tessuti fetali - il grado di mutazione riscontrato sui tessuti prenatali può modificarsi in utero o dopo la nascita a causa della segregazione mitotica NARP/MILS  diagnosi prenatale possibile per < 30 % di mutazione T8993G o T8993C nel campione; diversi tessuti hanno stessa % mutazione LHON  mutazione prevalentemente omoplasmica: le madri trasmettono sempre la mutazione, ma il fenotipo non è prevedibile  diagnosi prenatale non è informativa
    • Diagnosi prenatale • Quando il difetto è noto ed è noto lo stato di portatore dei genitori; consiste nell’analisi genetica su campione di villi coriali o amniociti entro le prime settimane di gravidanza Esecuzione in Centri specializzati per prelievo e preparazione del campione ed invio ai Laboratori diagnostici specialistici La diagnosi prenatale basata sulla sola valutazione biochimica della catena respiratoria può dare risultati falsi negativi perché alcuni difetti possono non essere espressi nei CVS/amniociti o avere elevata attività residua in CSV/amniociti E’ affidabile solo nel caso di mutazioni del DNA nucleare e mutazione NARP
    • Laboratorio Neurogenetica Molecolare INNCB 2009-2013  31 esami Numero casi Età materna aa media (range) Villi coriali/amniociti Tempo di refertazione gg media (range) RISULTATO negativo RISULTATO positivo RISULTATO portatore Mitocondriali 6 35 (31-41) 6/0 3,1 (1-4) 2 4 no Nucleari 25 32 (21-42) 23/2 4,64 (1-22) 5 7 13
    • Diagnosi pre-impianto • Consente la selezione di embrioni non-affetti per l’impianto in utero • Prevede trattamenti di stimolazione ormonale per la donna al fine di produrre un numero elevato di ovociti, che devono poi essere aspirati ed uniti ai gameti per la fecondazione in vitro; l’embrione viene quindi introdotto in utero • nelle mutazioni del mtDNA ha comunque significativi limiti dovuti all’elevato carico mutazionale in un’alta % di ovociti • la Legislazione italiana ancora attualmente non consente diagnosi genetica pre-impianto per le coppie fertili
    • Estensione ai familiari asintomatici Nel caso in cui in un soggetto affetto venga individuata la mutazione causativa, sia del mtDNA che del DNA nucleare, lo screening può essere esteso ai familiari attraverso una semplice analisi del DNA Inoltre: nelle mutazioni di mtDNA la % di mutazione non sempre è correlata a gravità dei sintomi, ed è quindi difficile prevedere l’evoluzione clinica Da considerare: - per molte malattie non sono al momento disponibili efficaci strategie terapeutiche o preventive - tuttavia alcune possono essere trattate meglio se diagnosticate in stadi clinici precoci o pre-clinici - Possibili implicazioni psicologiche, familiari e sociali  un test genetico presintomatico con risultato positivo può implicare discriminazione sociale e lavorativa, esclusione da assicurazioni vita e malattia etc …
    • Conclusioni Il ruolo del medico che effettua consulenza genetica è di offrire in modo chiaro e completo tutte le conoscenze disponibili che permettano alla famiglia di fare scelte consapevoli
    • UO Neuropsichiatria Infantile Isabella Moroni Anna Ardissone Silvia Genitrini Claudia Gandioli UO Neurogenetica Molecolare Valeria Tiranti Barbara Garavaglia Eleonora Lamantea Federica Invernizzi Daniele Ghezzi Costanza Lamperti Graziella Uziel Massimo Zeviani GRAZIE