Valeria Tiranti, Convegno Mitocon 2013

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Le nuove frontiere della diagnosi genetica ed il sequenziamento esomico: il punto sulla situazione italiana e sui centri di riferimento.
Valeria Tiranti, Istituto Neurologico Besta, Milano

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Valeria Tiranti, Convegno Mitocon 2013

  1. 1. Le nuove frontiere della diagnosigenetica ed il sequenziamentoesonico: il punto sulla situazioneitaliana e sui centri di riferimentoValeria Tiranti3° Convegno Nazionale sulle Malattie MitocondrialiTivoli1-2 giugno 2013
  2. 2. Le malattie mitocondriali sono difetti multisistemicicausati da alterazioni della OXPHOS
  3. 3. Analisi biochimica della catenarespiratoria, PDH, ciclo di KrebsPCR quantitativaper delezione odeplezione delmtDNARicerca di mutazionifrequenti del mtDNASequenza dellinteromtDNAAnalisi HRM e sequenzadi geni nucleariEXOME SEQUENCINGDiagnostica avanzata =Diagnostica integratabiopsia muscolareValutazione clinica, MRI
  4. 4. 1918 – Edmund Cowdry descrive i mitocondri come corpi granulari presenti nel citoplasma1981 – Anderson e colleghi pubblicano su Nature la sequenza e organizzazione genomica del mtDNA1988 – Holt, Harding e Morgan-Hughes pubblicano su Nature la prima alterazione strutturale delmtDNA associata a miopatia1988 – Zeviani e colleghi pubblicano su Neurology la presenza di delezioni del mtDNA nella sindrome KSS1988 – Wallace e colleghi pubblicano su Science la prima mutazione puntiforme del mtDNA associataad atrofia ottica di Leber1988/2000 – Le patologie mitocondriali diventano una entità clinica rilevante1990/2000 – Vengono identificate mutazioni in tutti i 37 geni codificati dal mtDNA. Perdiagnostica viene analizzato un pannello di circa 12 mutazioni note che causano malattie2002 – mtDNA viene sequenziato interamente per diagnostica2010 – I geni nucleari diventano 1002009/2010 – Next Generation Sequencing-EXOMELe tappe fondamentali per la medicina mitocondriale1995 – Bourgeron e colleghi identificano la prima mutazione in un gene nucleare SDH2007 – Identificate mutazioni in 80 geni nucleari che codificano perproteine mitocondriali2006 – Pubblicato il primo catalogo di proteine che formano ilProteoma Mitocondriale (MAESTRO)2000 – Analisi di linkage in famiglie, mappaggio per omozigosi e analisi per genecandidato consentono di identificare nuovi geni nucleari2008 – Aggiornato il catalogo di proteine che formano il ProteomaMitocondriale (MitoCarta)2013 – Identificate mutazioni in 43 geni responsabili dimalattie mitocondriali19101920198019902000201020202000/2003 – Completato il sequenziamento del Genoma Umano
  5. 5. Analisi di linkage e mappaggioper omozigosiIdentificazione geni candidatiIdentificazione di geni-malattia: il vecchio metodoFamiglie con malattiemitocondriali autosomicherecessiveScreening mutazionale
  6. 6. La ricerca di geni malattia: il nuovo approccioEXOME SEQUENCINGFiltraggio e selezione dei genicandidati+ validazione patogenicitàdelle mutazioniPazienti singoli e piccole famiglie
  7. 7. EXOME SEQUENCINGStrategia per sequenziare selettivamente le regioni codificanti del genoma:ESOMA L’esoma rappresenta l’insiemedi tutte le sequenze esonichedel genoma umano L’esoma costituisce circa 1%del genoma (30 MB) edovrebbe contenere circal’85% delle mutazioniassociate a patologia Consente di identificare levariazioni di sequenza a caricodi potenziali geni-malattia
  8. 8. Il DNA genomico vieneframmentatoDNA genomicoIntroni EsoniVengono attaccati deglioligo specifici per gliesoni e sequenziamentosuccessivoEluizione,sequenziamentoanalisi bioinformaticaExome sequencing: come funziona
  9. 9. Michael J. Bamshad,Nature Reviews Genetics 12, 745-755, 2011DNA genomicocostruzione diuna libreria diframmentiframmentiibridazionesonde esone-specifichebiotinilatearancioneprecipitazione+lavaggiocattura del DNAsequenziamento DNAmappaggio, allineamento,identificazione dellevariantiExome sequencing: come funziona
  10. 10. Filtraggio varianti identificatePannelli di riferimento1000 Genomes ProjectConservazione e patogenicità delcambio aaGeni codificanti per proteinemitocondrialiValidazione patogenicità dellevariantiL’exome sequencing di un singolo campione di DNA produce circa 25000 variantiCome fare per identificare la specifica mutazione responsabile della patologia??EXOME SEQUENCING
  11. 11. Caratterizzare le varianti sulla base dell’impattopredetto sulla funzione del gene
  12. 12. Ghezzi et al, AJHG, 2012
  13. 13. VantaggiApplicazioni su casi singoli osu piccole famiglieMantiene una buonacopertura delle sequenze diinteresseCosti più contenuti rispettoall’analisi dell’intero genomaTecnica di screening moltoefficiente che consente diidentificare geniresponsabili di malattiaLimitiRileva solo le varianti presenti nellaregione codificante dei geniNon rileva le varianti strutturali e noncodificanti associate a patologia (99%del genoma non è analizzato)Delezioni/duplicazioni di interi esoni nonvengono identificateL’analisi statistica di un’ampia mole didati può essere difficoltosaCi sono criticità legate alla presenza difalsi positivi e falsi negativiEXOME SEQUENCING
  14. 14. EXOME SEQUENCINGn. pubblicazioniEXOME SEQUENCING & MITOn. pubblicazioni2008 2009 2010 2011 2012 2013 2010 2011 2012 2013
  15. 15.  Il fenotipo clinico o la storia familiare indicano fortementeuna causa genetica, ma il fenotipo non corrisponde ad unamalattia in cui esiste già un gene responsabile Un paziente affetto da una malattia genetica estremamenteeterogenea che richiede l’analisi simultanea di più geni Un paziente con una probabile malattia genetica è già statoanalizzato per tutti i geni noti ma non si è giunti ad unadiagnosiAmerican College of Medical Genetics(http://www.acmg.net/StaticContent/PPG Clinical_Application_of_Genomic_Sequencing.pdf), March 2012Quando effettuare exome sequencing ?
  16. 16. L’esperienza della UO Neurogenetica MolecolareIRCCS C. Besta 2011-2013 Esomi analizzati 21 Casi risolti 15 Casi non risolti 671%casi risolti29%casi nonrisolti1. Inserzioni/delezioni non vengono identificate2. L’analisi statistica dei dati può essere stata troppo stringente3. La copertura dell’esoma non è completa e alcune regioni restano non analizzateQuali pazienti?-pazienti con difetto biochimico-analisi del mtDNA negativa-analisi di numerosi geni noti negativa
  17. 17. 4 pazienti diagnosticati3 pazienti diagnosticatiEXOME SEQUENCING12 pazienti diagnosticati4 pazienti diagnosticati
  18. 18. Studio su una grossa famiglia americana (già descritta nel 1985); l’exome seq hapermesso di identificare il gene malattia, AIFM1Analisi su sorelle italiane; l’exome seq ha permesso di identificare il genemalattia, SUCLA2
  19. 19. Quale approccio seguire nella diagnostica???Mito-esoma+mtDNA Esoma completoMcCormick E, Neurotherapeutics, 2013
  20. 20. Lieber et al, Neurology 2013L’esperienza americana-australiana di targetresequencing con Mito-exome (1598 geni) + mtDNA
  21. 21. 1) Targeted exome sequencing è una alternativa rapida e relativamente menocostosa rispetto al sequenziamento tradizionale del mtDNA e di numerosi singoligeni nucleari.Considerazioni generali2) Esistono dei fenotipi clinici sovrapposti tra malattie mitocondriali e altremalattie genetiche. Se i costi dovessero scendere è ipotizzabile applicare exomesequencing e poi filtrare i dati concentrandosi su un numero più ristretto di geni.Questo avrebbe il vantaggio di poter effettuare una seconda analisi di dati “giàdisponibili” nel caso il primo screening fosse negativo.3) Ove possibile sarebbe auspicabile sequenziare anche i genitori per determinare lafase degli aplotipi, identificare mutazioni de-novo e filtrare per le varianticandidate.4) E’ necessario definire delle linee guida per l’interpretazione dei dati di NGS nellemalattie mitocondriali. L’interpretazione può essere aiutata dalla disponibilità didatabase di soggetti controllo e malati. Problematiche legate alla privacy5) E’ estremamente importante che i dati di NGS siano interpretati nel contesto delquadro clinico, biochimico del paziente e quindi in centri specializzati nella diagnosie terapia delle malattie mitocondriali.Come procedereMalattia geneticaeterogeneaExomesequencingSangersequencingTutti gliesoni!!!!!gene 1gene 2gene 3gene 4gene 5gene 6gene n.€€+” €€+risultato€€+”€€+”€€+”€€+”€€+”€€+”€€+”€€€€+Nessun risultato+TEMPO
  22. 22. Piattaforme NGS disponibili in Italia-Strutture Ospedaliere diGenetica Medica-Istituti Ricovero e Cura aCarattere Scientifico (IRCCS)-Parchi Tecnologici-Piccole-Medie ImpreseRoche 454LifeTechIon e Proton TorrentIllumina HiSeq
  23. 23. Le collaborazioni della UO NeurogeneticaMolecolare-IRCCS C. Besta
  24. 24. UO Neurogenetica Molecolare(D.ssa Garavaglia)MBU-Mitochondrial Biology UnitCambridge (Dr. Zeviani)MiSeq- IlluminaIl futuro…… prossimo
  25. 25. Next Generation Sequencing: le nostre collaborazioni

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