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  • 1. Le nuove acquisizioni della diagnosi biochimica e genetica: quanto manca per caratterizzare i pazienti mitocondriali? Valeria Tiranti2° Convegno Nazionale sulle Malattie Mitocondriali Firenze 26-27 maggio 2012
  • 2. Le malattie mitocondriali sono difetti multisistemici causati da alterazioni della OXPHOS
  • 3. Diagnostica avanzata =Diagnostica integrata Valutazione clinica, MRI Analisi biochimica della catena respiratoria, PDH, ciclo di KrebsPCR quantitativaper delezione o Ricerca di mutazionideplezione del frequenti del mtDNAmtDNA biopsia muscolare Analisi HRM e sequenza Sequenza dellintero di geni nucleari mtDNA EXOME SEQUENCING
  • 4. Cells Permeabilization by DigitoninFibroblasts >106 cells Digitonin Cytosol Cytosol Cytosol Cholesterol CytosolLDH activityCS activity Cytosolic fraction Mitochondrial fraction Cells homogenate Mitochondrial Enriched Fraction •store at -80°C until use •just before assay 3 rounds freeze/thaw
  • 5. Respiratory Chain Complexes Complex I Complex II Complex III Complex IV Complex V + + + + H H H HIntermembrane space Cyt c CoQ +Matrix H Succinate Fumarate 1/2 O2 H2O NADH NAD+ ADP + Pi ATP
  • 6. LimitiI dosaggi spettrofotometrici misurano l’attività biochimicadei singoli complessi respiratoriIl materiale biologico è a volte insufficienteSensibilità del metodo non elevataSpecificità tissutale: attenuazione o scomparsa del difettobiochimico presente nel muscolo o nel fegato, nei fibroblastiin coltura dello stesso pazienteCosa fare con le determinazioni molecolari successive????
  • 7. SEAHORSE XF96 Misurazioni in tempo reale su cellule adese e vitali in piastre da 96 pozzetti di: consumo ossigeno (OCR) acidificazione del terreno (ECAR)
  • 8. Consumo O2 (OCR) e acidificazione terreno (ECAR)
  • 9. Obiettivi specificiDefinire i protocolli sperimentali in fibroblasti condifetti OXPHOS geneticamente determinatiVerificare se l’ossigrafia su microscala potesse svelare lapresenza di difetti in fibroblasti con normale attivitàbiochimica spettrofotometrica, ma derivati da soggetti condifetto biochimico presente nel muscoloRidurre il numero di cellule necessarie per la definizionebiochimica e l’inquadramento diagnostito del paziente.
  • 10. 19 linee di fibroblasti geneticamente determinati 6 pazienti con difetto Complesso I : Difetto biochimico muscolo 5/6 Difetto biochimico fibroblasti 3/6 3 pazienti con difetto Complesso III : Difetto biochimico muscolo 2/3 Difetto biochimico fibroblasti 1/3 6 pazienti con difetto Complesso IV : Difetto biochimico muscolo 4/6 Difetto biochimico fibroblasti 5/6 4 pazienti con difetto Complesso V : Difetto biochimico muscolo 2/4 Difetto biochimico fibroblasti 2/4
  • 11. Profilo OCR dopo aggiunta oligomicina e FCCP OCR (pMolesO2/min) 9 control Oligo FCCP P2 4 P1 5 Time (min) OCR (pMolesO2/min/cells) 0,012 0,01 0,008 * 0,006 0,004 ** 0,002 0 control P1 P2
  • 12. Parametri di disfunzione mitocondriale1) Maximum respiration rate (MRR) viene calcolata come respirazione massima dopo aggiunta di FCCP (OCR-F)2) Respiratory control ratio (RCR) viene calcolato come il rapporto tra OCR-F/OCR-O3) Il metabolismo glicolitico rispetto a quello ossidativo viene calcolato come rapporto tra OCR/ECAR, in condizioni basali4) Spare respiratory capacity viene misurata come differenza tra OCR-F and OCR in condizioni basali
  • 13. MRR in difetti di Complesso I 160 140 120 100 * %CI Activity% MRR 80 * ** 60 ** 40 ** ** 20 0 C P1ND3 P2ND3 P3ND5 P4NDUFV1 P5NDUFA10 P6NDUFS1 mtDNA mutations Nuclear DNA mutationsP1-P3-P4 avevano attività spettrofotometriche normali
  • 14. MRR in difetti di Complesso III 160 160 140 140 %CIII Activity 120 120 100 * 100 % MRR ** ** 80 80 60 60 40 40 20 20 0 0 C P7 P8 P9 BCS1 mutationsP8-P9 avevano attività spettrofotometriche normali
  • 15. MRR in difetti di Complesso IV 160 160 140 140 %CIV Activity 120 120 % MRR 100 100 * ** 80 ** ** 80 60 ** 60 40 40 20 20 ** 0 0 C P10 P11 P12 P13 P14 P15 SURF1 COX15 SCO2 COX6B1P14 aveva attività spettrofotometriche normale
  • 16. MRR in difetti di Complesso V da mutazioni in mtATP6 160 160 140 140 %CV Activity 120 120 % MRR 100 * 100 80 * 80 60 * 60 40 ** 40 20 20 0 0 C P16 P17 P18 P19 (8993T>G) (8993T>C) (TMEM70) (TMEM70) P16 e P17 avevano attività spettrofotometriche normali
  • 17. 2,0 controls controls 3,5 CI CI CIII CIII 1,5 CIV CIV 3,0 estimated marginal means CVestimated marginal means CV 1,0 2,5 0,5 2,0 0 1,5 -0,5 1,0 0,5 -1,0 SRC MRR RCR OCR-B OCR-O OCR-F 4 controls Normal Enzyme Defective Activities Enzyme Activities 3 95%Conf.Int. 2 1 0
  • 18. SeaHorse XF96 Vantaggi LimitiAumento sensibilità Molti reagenti e substrati nonRidotto numero di cellule entrano nelle cellule se nonRapidità e semplicità permeabilizzate: non si puòMisurazioni in condizioni stabilire quale complesso fisiologiche respiratorio è difettivoLe cellule rimangono vitali I risultati non sono di semplice dopo le misure interpretazione
  • 19. Un nuovo agente permeabilizzante in difetti di Complesso I Glutamate (10mM)/Malate (5mM) ADP Rotenone (2µM) (4mM) Ct Pt1 Pt2
  • 20. Un nuovo agente permeabilizzante in difetti di Complesso I Succinate (10mM) ADP Antimycin (2µM) (4mM) Ct Pt1 Pt2
  • 21. Identificazione di geni-malattia: il vecchio metodo Famiglie con malattie mitocondriali autosomiche recessive Analisi di linkage e mappaggio per omozigosi Identificazione geni candidati Screening mutazionale
  • 22. La ricerca di geni malattia: il nuovo approccioPazienti singoli e piccole famiglieEXOME SEQUENCINGFiltraggio e selezione dei genicandidati+ validazione patogenicitàdelle mutazioni
  • 23. EXOME SEQUENCINGStrategia per sequenziare selettivamente le regioni codificanti del genoma: ESOMA  L’esoma rappresenta l’insieme di tutte le sequenze esoniche del genoma umano  L’esoma costituisce circa 1% del genoma (30 MB) e dovrebbe contenere circa l’85% delle mutazioni associate a patologia  Consente di identificare le variazioni di sequenza a carico di potenziali geni-malattia
  • 24. Exome sequencing: come funziona Il DNA genomico viene frammentato Vengono attaccati dei linker per il sequenziamento successivo E’ necessario sequenziare specifici frammenti di DNA costruendo una library arricchita per le regioni di interesse
  • 25. EXOME SEQUENCINGL’exome sequencing di un singolo campione di DNA produce circa 25000 variantiCome fare per identificare la specifica mutazione responsabile della patologia?? Filtraggio varianti identificate Pannelli di riferimento Conservazione e patogenicità del 1000 Genomes Project cambio aa Geni codificanti per proteine mitocondriali Validazione patogenicità delle varianti
  • 26. EXOME SEQUENCING Vantaggi LimitiApplicazioni su casi singoli o Rileva solo le varianti presenti nellasu piccole famiglie regione codificante dei geniMantiene una buona Non rileva le varianti strutturali e noncopertura delle sequenze di codificanti associate a patologia (99%interesse del genoma non è analizzato)Costi più contenuti rispetto Delezioni/duplicazioni di interi esoni nonall’analisi dell’intero genoma vengono identificateTecnica di screening molto L’analisi statistica di un’ampia mole diefficiente che consente di dati può essere difficoltosaidentificare geniresponsabili di malattia Ci sono criticità legate alla presenza di falsi positivi e falsi negativi
  • 27. EXOME SEQUENCING EXOME SEQUENCING & MITO n. pubblicazioni n. pubblicazioni2008 2009 2010 2011 2012 2010 2011 2012 4 pazienti diagnosticati
  • 28. EXOME SEQUENCING: 8 pazienti analizzati 5 casi risolti 1 in corso di validazione 2 negativi 11 pazienti diagnosticati 3 pazienti diagnosticati 2 pazienti diagnosticati
  • 29. Ricerca medica=Ricerca per il paziente Inquadramento Dal paziente clinico e biochimico bioinformatica Identificazione di nuovi geni-malattiamodelli in vitro & in vivo EXOME SEQUENCING KO Al bancone ? WT Funzione proteina