Guia laboratorio biologia 2012 1 - copia

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Guia laboratorio biologia 2012 1 - copia

  1. 1. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL GUÍA DE LABORATORIO BIOLOGÍA GENERAL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA
  2. 2. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL NORMAS DE BIOSEGURIDAD DEL LABORATORIONORMAS DENTRO DEL LABORATORIOSiga las siguientes recomendaciones que son generales a tener en cuenta en unlaboratorio 1. GENERALES Mantenga las luces apagadas si no hay necesidad de su utilización. Los grifos de agua se deben manejar con cuidado a fin de no romperlos y cerciorarse que no se está perdiendo agua inútilmente. Las llaves de gas que abastecen los mecheros deben estar cerradas, en caso de fugas informar al Monitor o al profesor directamente. Si hay fuerte olor a gas cohíbase de encender fuego hasta tanto no desaparezca el olor a gas. Terminada la práctica cierre correctamente las llaves de paso. Estar puntual a la hora de entrar al laboratorio, recuerde ese adagio que dice “Uno llega tarde porque se sabe que lo esperan, si sabe que no lo esperan uno no llega tarde”. Se da un margen máximo de 5 minutos para su llegada Está prohibido comer, beber o fumar dentro del laboratorio, esto genera indisposición general y no ayuda al desarrollo armónico de las prácticas No se permite juegos ni indisciplina dentro del laboratorio, éste es un sitio donde el respeto y la academia nos debe ayudar a formar integralmente. No pierda tiempo, trabaje rápido y con cuidado, sea diligente dentro del proceso de las distintas prácticas. Evite el deambular por el espacio físico del laboratorio sin motivo aparente, céntrese en su trabajo con el grupo de compañeros el cual le correspondió. De esta manera el trabajo rinde y se hace más armónico. Finalizada la práctica la mesa de trabajo debe quedar en buen estado y aseada. Entregue el material de laboratorio asignado en perfecto estado y de manera limpia. En caso que por accidente se haya fraccionado algunos de los materiales dados, debe hablar con el profesor de la materia o en su defecto con el monitor. Es claro que debe reponer el material que averió.
  3. 3. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL 2. MATERIAL DEL LABORATORIO Dentro del laboratorio siempre utilizar bata de manga larga, blanca, preferiblemente de algodón. Cuide los lentes del microscopio para que no se manchen con colorantes. Una vez dentro el laboratorio lave y seque correctamente el material que previamente le han entregado procurando no ocasionar fracturas del mismo. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos. Jamás pipetee ácidos o Bases fuertes, sustancias toxicas o volátiles Nunca arroje materiales sólidos (papeles, fósforos, vidrios, etc) en los sumideros o vertederos, utilice los implementos adecuados para ello. Evite instalaciones o montajes inestables de aparatos durante las distintas prácticas. No pipetear nunca con la boca. Se debe utilizar la bomba manual, una jeringuilla o artilugio que se disponga en el Centro. Las pipetas se cogerán de forma que sea el dedo índice el que tape su extremo superior para regular la caída de líquido. Al enrasar un líquido con una determinada división de escala graduada debe evitarse el error de paralaje levantando el recipiente graduado a la altura de los ojos para que la visual al enrase sea horizontal. Cuando se calientan a la llama tubos de ensayo que contienen líquidos debe evitarse la ebullición violenta por el peligro que existe de producir salpicaduras. El tubo de ensayo se acercará a la llama inclinada y procurando que ésta actúe sobre la mitad superior del contenido y, cuando se observe que se inicia la ebullición rápida, se retirará, acercándolo nuevamente a los pocos segundos y retirándolo otra vez al producirse una nueva ebullición, realizando así un calentamiento intermitente. En cualquier caso, se evitará dirigir la boca del tubo hacia la cara o hacia otra persona. Cualquier material de vidrio no debe enfriarse bruscamente justo después de haberlos calentado con el fin de evitar roturas. Los cubreobjetos y portaobjetos deben cogerse por los bordes para evitar que se engrasen.
  4. 4. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL
  5. 5. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL 3. EVITAR ACCIDENTES Sofoque cualquier principio de incendio con un trapo mojado Evite inhalar vapores de manera directa de cualquier material. Si es absolutamente necesario porque la practica así lo requiere, opere arrastrando los vapores con la mano hacia la nariz Lea con atención las etiquetas que están adosadas a los envases de las sustancias químicas, evite accidentes por consumo de sustancias químicas del laboratorio. Cerciórese antes de coger cualquier material de vidrio, hierro y porcelana, que estos se encuentran a la temperatura ambiente para evitar posibles quemaduras En caso de quemaduras con sustancias químicas o materiales expuestos a altas temperaturas, vaya directamente con el docente a fin de utilizar algún paliativo para la quemadura. Evite por si solo hacer combinaciones de sustancias. Hable con el docente si es procedente hacer algo al margen de lo manifestado en la guía de laboratorio. Evite cortarse con vidrio cumpliendo las siguientes instrucciones: a. Nunca trate de insertar tubos de vidrio, termómetros, embudos o cualquier otro objeto de vidrio en tapones de caucho, o cualquier otro objeto sin humedecer el tapón y el objeto de vidrio. b. Proteja sus manos con una toalla c. Para reducir el palanqueo que se ejerce sobre el vidrio, mantenga una mano en el tapón y con la otra tome el material de vidrio muy cerca del extremo que se va a insertar, haga presión y el objeto de vidrio se ira introduciendo lentamente. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se hará al baño María, nunca directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama. Cuando se manejan productos corrosivos (ácidos, álcalis, etc.) deberá hacerse con cuidado para evitar que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se verterán bruscamente en los tubos de ensayo, sino que se dejarán resbalar suavemente por su pared. Cuando se quiera diluir un ácido, nunca se debe echar agua sobre ellos; siempre al contrario: ácido sobre agua.
  6. 6. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL Cuando se vierta un producto líquido, el frasco que lo contiene se inclinará de forma que la etiqueta quede en la parte superior para evitar que si escurre líquido se deteriore dicha etiqueta y no se pueda identificar el contenido del frasco. RECOMENDACIONES PARA EL ÉXITO DE LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO Antes de realizar una práctica, debe leerse detenidamente para adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y técnica. Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan. Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material . Llevar el material solicitado en las distintas prácticas Trabajar con diligencia y de manera armónica de tal forma que no se malgaste el tiempo y pueda terminar la practica en el tiempo estipulado Conformar grupos de trabajo de acuerdo a las indicaciones del Docente o Monitor y presento los informes de laboratorio con el grupo de trabajo con quien realizo la practica PREGUNTAS PREGUNTAS PRELABORATORIO COMPLEMENTARIAS (Se entregan ocho días después de hacer este laboratorio) 1. Defina: Residuo solido Residuo peligroso Residuo combustible De acuerdo con la clasificación Residuo corrosivo de residuos diseñe una tabla Residuo reactivo que incluya: clase de residuo Residuo explosivo (NO PELIGROSOS, Inflamabilidad reciclables, vidrio); contenido básico (toda case de vidrio no Residuo patógeno contaminado), color (blanco) y Residuo volátil etiqueta. Residuo cortopunzante Biodegradable Biosanitario Metales pesados Recalcitrante
  7. 7. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL PRESENTACIÓN GENERAL DEL INFORME DE LABORATORIO El desarrollo práctico de la asignatura Biología General se realiza a través de cuatro laboratorios. Todas las prácticas requieren del manejo del microscopio para observar diferentes tipos de sistemas biológicos unicelulares, pluricelulares, bacterianas, protista, hongo, animales y vegetales. Las guías de biología inician con un conocimiento sobre microscopía, resaltando la importancia del microscopio como instrumento fundamental para la observación y estudio de la diversidad celular y otros campos importantes de la Biología microscópica; continúa con el estudio de la célula como entidad estructural y funcional de todos los sistemas vivos, destacando la variabilidad que se presenta en cuanto a forma, tamaño y tipos celulares. Las actividades de laboratorio están diseñadas con el objetivo de llevar a la práctica los conceptos fundamentales que se imparten en teoría y de esta manera involucrarse experimentalmente con la ciencia. En los instructivos de cada práctica encontrará una introducción, objetivos, procedimiento y cuestionario, los cuales deben ser resueltos antes de ingresar al laboratorio ya que contienen aspectos indispensables para comprender la práctica. Todas las prácticas indican qué material, equipo o reactivo se utilizará y el procedimiento a seguir, para llevar a cabo los experimentos.Forma de presentar el laboratorio: El estudiante deberá presentar en un cuaderno de laboratorio cada una de las prácticas desarrolladas (no se reciben laboratorios en computador). El laboratorio se presenta en tipo artículo científico: Título, resumen, abstract, introducción, metodología (materiales y métodos), resultados (gráficas, figuras, gráficos), discusión de resultados, conclusiones y bibliografía. Las personas que no asistan a las prácticas no podrán entregar informe de laboratorio.
  8. 8. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO PRÁCTICA No 1INTRODUCCIÓNEl microscopio óptico es el instrumento principal en el laboratorio de biología, ya que estenos ayuda a observar cosas que no podemos ver a simple vista.Existen tres tipos de microscopios en el laboratorio de biología1. - Microscopio estereoscópico: este nos sirve para observar muestras vegetales ymuestras animales, y consta de 2 objetivo, uno de 2 “x” y otro de 4 “x”, por lo tanto suaumento será de 20 y 40 veces.2. - Microscopio de luz polarizada: este se utiliza para observar metales, tiene 5 objetivosy un solo ocular.3. - Microscopio óptico: este es el que se utiliza de manera más común en las prácticasde laboratorio de biología, este microscopio consta de tres sistemas.a)Sistema mecánico: son todas las partes que sirven de soporte al microscopio: el brazo,el pie o soporte, el carro o la platinab) Sistema de iluminación: las fuentes de luz, el condensador y el espejoCLASES DE MICROSCOPIOS:Existen dos tipos de microscopios: simples y compuestos� Microscopios simples : Consta de un solo sistema de lente� Microscopios compuestos:Constan de dos (2) sistemas de lentes: el objetivo y el ocular.El microscopio compuesto es un instrumento que aumenta considerablemente la imagende los objetivos que en él se observan. Entre las variedades de éste microscopioencontramos el electrónico y el fotónico u óptico. Este último tipo de microscopio estáformado por una parte mecánica y una parte óptica.
  9. 9. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALParte Mecánica:a. Pie o Base: Generalmente en forma de herradura o rectangular, es el apoyo de lasdemás piezas del microscopio. El pie debe ser sólido y pesado para asegurar suestabilidad.b. Columna o Brazo: Este elemento relaciona el tubo del microscopio con el pie; sostienela platina y el condensador y de ella se agarrará el microscopio cuando se trasladadurante los trabajos. En algunos c. Tubo del Ocular: Está colocado en la parte superiordel microscopio, donde están acoplados los oculares, que pueden tener movimientovertical, con ayuda de una cremallera sobre la columna. En algunos microscopios el tubodel ocular es inclinado y se mantiene fijo, en este caso se mueve la platina.d. Revólver o Disco Giratorio: Está debajo del tubo ocular donde están acoplados losobjetivos, presenta movimiento giratorio para facilitar el cambio de un objetivo a otro.e. Platina: Es una placa que puede ser cuadrada, circular o rectangular, con un orificiocentral que permite el paso de la luz a través de ella. Su función es sostener las placascon los preparados biológicos que se van observarf. Carro: es un dispositivo ubicado sobre la platina, cuya función es sujetar y mover laplaca que se va a estudiar. Posee dos tornillos que permiten movimientos horizontales(hacia adelante, hacia atrás, hacia la derecha y hacia la izquierda) del portaobjeto.Cuando la platina carece del anterior dispositivo, lleva dos soportes para fijar las placasllamadas ganchos o uñas.g. Mecanismos de Movimiento: Está integrado por el tornillo macrométrico y elmicrométrico� Tornillo Macrométrico: Acerca o aleja rápidamente el objetivo del preparado aobservar; su función es lograr un enfoque más o menos claro o aproximado del objeto.� Tornillo Micrométrico: Acerca o aleja el objetivo del preparado, pero lentamente, casiimperceptiblemente, permite desplazamientos muy finos de la platina o del tubo delocular. Durante la observación y enfoque este tornillo debe estarse moviendopermanentemente; su función es darle nitidez al enfoque.Parte óptica:Esta integrada por los objetivos, oculares y el aparato de iluminación (espejo, diafragma,condensador y filtros). Estos elementos son los que permiten la iluminación, ampliación yla visión aumentada del objetivo.a. Objetivo: Es la pieza más importante del microscopio. Ellos se acoplan medianteroscas estándar al revólver y pueden ser cambiados de posición con sólo rotarlos.Reciben el nombre de objetivos porque son los lentes que están más cerca del objeto. Lamayoría de los microscopios tienen tres o cuatro objetivos. Las lentes de los objetivosson de aumentos diversos, los más usados son:Objetivos de pequeños aumentos 3.5x; 4x, 5x, 6x, 8x y 10x; objetivos de grandes
  10. 10. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALaumentos 40x, 45x, 50x y objetivos de inmersión 90x, 95x y 100x.Las lentes de inmersión se emplean con aceite de inmersión para conectar la lente frontal(lente inferior del objetivo) al porta-objeto. Entre el objetivo y el objeto se produce unapérdida de luz por reflexión que se corrige adicionando al preparado unas gotas de aceitede cedro (aceite de inmersión) cuyo índice de refracción 1.515, es próximo al cristal. Esteaceite también reduce o suprime por completo la refracción de los rayos de luzprovenientes de la fuente luminosa. b. Ocular: Están colocados en la parte superior deltubo ocular. Está formado por dos sistemas de lentes dispuestos de un cilindro. Sufinalidad es aumentar la imagen dada por el objetivo y eventualmente corregir algunosdefectos de la misma. Reciben dicho nombre porque son las lentes que se encuentranmás cerca del ojo. Hay oculares de 3.5x; 5x; 6,3x; 10x; 12.5x; 15x; 20x y 25x.El aumento de la imagen de un objeto observado a través de un microscopio, se calculamultiplicando el número de aumento del objetivo con el cual se está trabajando por elnúmero de aumento del ocular que se está utilizando.c. Aparato de iluminación: Está conformado por la fuente de luz, el diafragma, elcondensador y los filtros.d. Fuente de luz: Puede ser natural o artificial, cuando es natural (solar) o procede de unfoco luminoso situado fuera del microscopio, un espejo recoge la luz del medio y la reflejaa través del objeto y del sistema de lentes. La luz artificial la constituye generalmente unbombillo ubicado en el microscopio y conectado a un circuito eléctrico de bajo voltaje.e. Diafragma: Está ubicado entre la fuente de luz y el condensador, inmediatamentedebajo de la platina, su función es regular la intensidad de luz que atraviesa el objeto. Eldiafragma tiene una palanquita que al moverla hacia delante o hacia atrás agranda oachica el orificio central, dejando pasar mayor o menor cantidad de luz respectivamente.f. Condensador: Es un elemento cónico que posee un sistema de dos lentesconvergentes que recogen o concretan los rayos luminosos para enviarlos al objetivo porel agujero de la platina.Existe un tornillo manual que permite guardar la altura del condensador. Esta graduaciónes importante cuando se trabaja con objetivos de gran aumento (40x, 100x), ya que en lamedida que se trabaja con éstos objetivos el condensador debe subirse. Lo contrariosucede cuando se trabaja con objetivos de menor aumento (4x, 10x).g. Filtros: Entre la fuente de luz y el condensador de algunos microscopios existe unportafiltros en el cual se puede colocar filtros a voluntad del observador. Los filtros sonelementos de cuarzo o de vidrio, pueden ser de color azul, amarillo o verde. Ellosinterceptan el haz de rayos luminosos antes de entrar al condensador, esto se hace conel objeto de seleccionar un tipo de luz determinada para una experiencia dada.
  11. 11. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALLENTES:Las lentes son el componente más importante del microscopio; se fabrican de vidrio uotros materiales transparentes.Pueden ser convexas o cóncavas en ambas superficies, planas en una cara o tenercualquier combinación de éstas dos formas en su superficie.Las lentes son de dos tipos: positivas y negativas.� Lentes Positivas: Hacen converger los rayos de luz, es decir, los concentra para formaruna imagen real.� Lentes Negativas: Hacen divergir los rayos de luz, sin formar ninguna imagen real.PREPARACIONES MICROSCÓPICAS:Debemos tener en cuenta que a través del microscopio solamente se pueden observarobjetos que dejan pasar rayos de luz, por esta razón el preparado debe ser lo másdelgado y transparente posible, pues un preparado grueso solo nos permite observar unamancha negra. Los detalles solo se observan si la preparación es lo suficientementedelgada para que sea transparente con la luz que recibe. Para realizar preparacionesmicroscópicas los porta y cubre-objetos deben limpiarse antes de usarse. Un buenmétodo es guardarlos en alcohol y antes de utilizarlos secarlos con un paño limpio y librede grasa. Los cubre-objetos deben limpiarse con mucho cuidado porque son frágiles.Las preparaciones microscópicas pueden ser acuosas o en seco.Las preparaciones acuosas son las más simples y fáciles usadas para examinarcualquier objeto fluido, como agua de estanque o sangre. Se deposita una gotita dellíquido que se desea observar en el centro del porta-objeto, se coloca el cubreobjetosobre el porta, forme con las dos láminas un ángulo de 45 grados y luego deje caersuavemente la laminilla cubre-objeto sobre el preparado, evitando la formación deburbujas.El líquido no debe rebosar los bordes del cubre-objeto, en caso de que suceda sequecuidadosamente el líquido sobrante usando papel absorbente o papel toalla. Lapreparación queda así lista para la observación. Estas preparaciones son de cortaduración porque se secan rápidamente; para hacerlas más duraderas debe cerrarseherméticamente los bordes del cubre objeto; la duración de ésta preparación no esindefinida. Los bordes se pueden cerrar con vaselina o esmalte.COLORANTES :Los colorantes son sales compuestas por un ácido y una base. Se clasifican en ácidos,básicos y neutros, según la parte de los mismos que imparta el color. En los colorantesácidos el grupo cromóforo, el que imparte el color, es el componente ácido, elcomponente básico es incoloro. Lo contrario sucede con los colorantes básicos. Los
  12. 12. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALcolorantes neutros tienen coloreado el componente ácido y el básico.La mayoría de los colorantes son sintéticos, aunque se emplean todavía algunosnaturales. La hematoxilina y el carmín son los colorantes naturales más importantes parala tinción de tejidos. El carmín es producido por la conchinilla (Coccus cacti). Lahematoxilina se extrae de la madera de un árbol de México, el palo Campeche.Otro colorante es la orceína que se extrae de líquenes. Existen tres técnicas de tinción deuso general: la coloración seca o de tejidos muertos, la coloración vital o de tejidos vivosy la histoquímica, en la cual se utilizan las reacciones de los colores para hacer visible loselementos estructurales de las células y de los tejidos. Partes de un microscopio ópticoRESUMEN PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICOSISTEMA ÓPTICOOCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
  13. 13. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALSISTEMA MECÁNICOSOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular.REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar losobjetivos.TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico queconsigue el enfoque correcto. I. MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.4. Para realizar el enfoque: a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al
  14. 14. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.6. Empleo del objetivo de inmersión: a. Bajar totalmente la platina. b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite. c. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40. d. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. e. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión. f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. h. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3. i. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio. II. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES 1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumentoen posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina nosobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. 2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlocubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usarde forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo
  15. 15. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALdel polvo. 3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlasmuy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica. 4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando elmicroscopio. 5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite quequeda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menosrecomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido ycon suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlocon una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo delimpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes ysu sujeción. 6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico,micrométrico, platina, revólver y condensador). 7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre lamirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiarnunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se estáobservando a través del ocular. 8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobreella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un pañohumedecido en xilol. 9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar lasesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión generalde los mismos.EL DIBUJO EN BIOLOGIA, debe tener las siguientes características: Objetividad y claridad. Deben representarse los objetos tal como son y con nitidez. Exactitud. Proporcionalidad entre el objeto y su representación gráfica en toda su estructura. Trazos nítidos y firmes. Con ausencia de sombras y colores. Nombres. Todas las estructuras que aparecen deberán llevar su nombre por fuera del dibujo en forma ordenadaRECORDEMOS: Usar eficientemente el microscopio y los elementos y equipos a su disposición. Estudiar e interpretar críticamente el material biológico para el estudio microscópico. Registrar las imágenes microscópicas para ilustrar y discutir los resultados
  16. 16. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL obtenidos. El examen microscópico proporciona información fundamental en investigación. Mucha de esta información sólo puede ser obtenida a través de esta herramienta, por lo tanto, se debe poner el máximo interés en la adquisición de una información lo más amplia y profunda posible sobre la estructura microscópica y los métodos de trabajo utilizados para su observación y estudio.Objetivos Identificar cada una de las partes que conforman el microscopio óptico y conocer los cuidados que se deben tener para su manejo. Manejar los mecanismos de enfoque del microscopio Comprender la importancia del microscopio como herramienta fundamental en biología celularMateriales (descripción de equipos, reactivos, materiales de vidrio, plástico y acero,especificar los materiales que deben llevar los estudiantes)Microscopio¼ hoja de papel periódicoPortaobjetosCubreobjetosTijerasPapel seda bancoGoteroXilolFibras de lana o algodón de diferentes coloresGranos de polenMetodología – Procedimiento 1. Cortar un pedazo de papel periódico de 1 cm2 de área y colocarlo sobre un cubre limpio y seco 2. Adicionar con el gotero un poco de agua sobre el papel hasta humedecer y poner el cubre objeto sobre el evitando que se formen burbujas. 3. Observar la muestra en el microscopio para ello se debe colocar la muestra e la platina asegurándola con las pinzas. 4. Realizar las observaciones con los objetivos de 10x, 40x, 100x
  17. 17. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL 5. Ajustar las observaciones con los tornillos macrométrico y micromético. 6. Realizar los esquemas de cada una de las observaciones. 7. Realizar el mismo procedimiento con fibras de lana o algodón de diferentes colores y con Granos de polen. 8. Después de utilizar el microscopio limpiar suavemente el microscopio y las lentes con xilol y papel seda 9. Cubrir y guardar debidamente el microscopioCuestionario ¿Cómo se puede definir un microscopio? ¿Cuáles son las diferencias entre un microscopio simple y uno compuesto? ¿Cuáles son las diferencias al observar la muestra con diferentes tipos de lentes de aumento? ¿Que dificultades tendrías si al iniciar un trabajo lo hicieras con la lente de mayor aumento? Cuando utilizas el objetivo de inmersión ¿por que es necesario utilizar un aceite con este nombre? Por que el objetivo necesita un índice? Cuáles son los poderes del microscopia. Cuál es el índice de refracción del agua y del aceite. Cuáles pueden ser las causas de las rupturas de los micropreparados ¿Qué importancia tiene el microscopio en la biología celular? Investiga si es lo mismo amplificación y resolución ¿y de que factores depende cada una de ellas?
  18. 18. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL CÉLULAS VEGETALES Y CÉLULAS ANIMALES PRÁCTICA No 2 INTRODUCCIÓNLas células son la porción más pequeña de materia viva capaz de realizar todas lasfunciones de los seres vivos, es decir, reproducirse, respirar, crecer, producir energía,etc. Existen dos tipos de células con respecto a su origen, células animales y célulasvegetales:En ambos casos presentan un alto grado de organización con numerosas estructurasinternas delimitadas por membranas. La membrana nuclear establece una barrera entreel material genético y el citoplasma. Las mitocondrias, de interior sinuoso, convierten losnutrientes en energía que utiliza la planta.Tanto la célula vegetal como la animal poseen membrana celular, pero la célula vegetalcuenta, además, con una pared celular de celulosa, que le da rigidez. La célula vegetalcontiene cloroplastos: organelos capaces de sintetizar azúcares a partir de dióxido decarbono, agua y luz solar (fotosínteis) lo cual los hace autótrofos (producen su propioalimento) y la célula animal no los posee por lo tanto no puede realizar el proceso defotosíntesis. Pared celular: la célula vegetal presenta esta pared que está formada porcelulosa rígida, en cambio la célula animal no la posee, sólo tiene la membranacitoplasmática que la separa del medio. Una vacuola única llena de líquido que ocupacasi todo el interior de la célula vegetal, en cambio, la célula animal, tiene varias vacuolasy son más pequeñas.Las células vegetales pueden reproducirse mediante un proceso que da por resultadocélulas iguales a las progenitoras, este tipo de reproducción se llama reproducciónasexual. Las células animales pueden realizar un tipo de reproducción llamadoreproducción sexual, en el cual, los descendientes presentan características de losprogenitores pero no son idénticos a él.CÉLULAS VEGETALESMATERIALES: Una cebolla cabezona. Viruta de madera Semillas de durazno y cereza. Un tomate, Una arracacha, yuca, papa y banano. Una hoja de lirio, elodea Láminas porta y cubres. Cuchilla o bisturí. Papel absorbente. Aguja de disección. Pincel.
  19. 19. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALPROCEDIMIENTO.MONTAJE HUMEDO DE EPIDERMIS DE CEBOLLA (Allium cepa)En un porta objetos coloque dos muestras de epidermis de cebolla. Uno con agua y otrocon lugol. Observe la forma de la célula y su disposición en el tejido. Identifique Paredcelular, membrana celular, citoplasma, vacuola, núcleo, nucleolos. Cuántos núcleos ynucleolos presenta la célula. Diferencie entre las dos preparaciones. Cuáles son lasventajas de utilizar colorantes. Qué organelos celulares se colorean con lugol.MONTAJE HUMEDO DE EPIDERMIS DE LIRIO- ElodeaColoque un segmento de hoja de lirio en el porta objetos, coloree con azul de metileno.Observe al microscopio y diga: cuántos tipos de células observa y qué forma tienen,identifique y esquematice en las células epidérmicas las siguientes estructuras: paredcelular, membrana celular, citoplasma, vacuolas y núcleo. Identifique un estoma, señaleel ostiolo y diga su función. De cada una de las estructuras anteriores diga su función.MONTAJE HUMEDO DE EPIDERMIS DE TOMATE (Lycopersicum esculentumMillar)Raspe la epidermis de tomate sobre la lámina porta objetos, lavando con agua hasta quela epidermis esté translucida. Agregue tionina y observe: La forma de las células, sucoloración, pared celular, la lámina media y los plasmodesmos que fraccionan oseccionan la pared celular. Diga qué son y cuál es su función.OBSERVACIÓN DE CLOROPLASTOS.Tome una hoja de elodea (Egeria densa) y ubique el ápice foliar. Pase a 40X y diga cómose llaman los organelos de color verde que se observan, dónde se localizan y cuál es sufunción. Describa el tipo de movimiento de los organelos y cómo se llama este tipo demovimiento?. Dibuje lo observado.OBSERVACIÓN DE AMILOPLASTOS.Tome un trozo de papa (Solanum tuberosum L) y con el bisturí o cuchilla haga unraspado y deposítelo sobre el portaobjetos; agregue una gota de lugol, cubra y lleve almicroscopio. Observe la forma de los amiloplastos. Repita la misma operación conbanano (Musa sapientum L.).OBSERVACIÓN DE CROMOPLASTOS.Tome una muestra de pulpa roja (mesocarpo) de tomate, extienda sobre la lámina portaobjetos, agregue una gota de agua y lleve al microscopio. Observe las células grandes ytransparentes con una pared delgada, dentro se encuentran unas granulaciones de colorrojo que pueden agruparse alrededor del núcleo o estar dispersos en el citoplasma.
  20. 20. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALCÉLULAS ANIMALES METODOLOGÍA Muestra de sangre: Con la lanceta estéril realizar una punción en un pulgar. Depositar una gota de sangre en la parte central de un portaobjetos. Colocar un portaobjetos como indica el dibujo y deslizarlo sobre toda la superficie del porta de manera que se pueda obtener una fina película de sangre. El porta absorbe la gota y la arrastra, pero sin pasar nunca por encima de ella para no dañar los gota de sangre hematíes. Colocar el frotis de sangre sobre la cubeta de tinción y añadir unas gotas de alcohol absoluto y dejar que el alcohol se evapore para fijar la preparación. Cubrir con unas gotas de hematoxilina y dejar actuar durante 15 minutos. Evitar la desecación del colorante agregando más líquido. Lavar la preparación y añadir unas gotas de eosina dejándola actuar 1 minuto. Volver a lavar hasta que no queden restos de colorante. Dejar secar aireando el porta. Observar al microscopio. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA Al microscopio se verán con un dominio predominante los glóbulos rojos, hematíes o eritrocitos teñidos de color rojo por la eosina. No tienen núcleo y son más delgados por el centro que por los bordes.
  21. 21. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL Los glóbulos blancos o leucocitos se identifican fácilmente por la presencia de núcleo, teñido de morado por la hematoxilina. Hay varias clases de leucocitos: Linfocitos: de tamaño aproximado al de los glóbulos rojos, tienen un solo núcleo que ocupa casi todo el glóbulo. Monolitos: son los leucocitos mayores, poco frecuentes normalmente, núcleo grande, redondo, son los más móviles y su función principal es la fagocitosis. Polimorfonucleares: núcleo fragmentado o arrosariado. Pueden ser eosinófilos, con abundantes granulaciones teñidas de rojo por la eosina, neutrófilos y basófilos. Las plaquetas no son visibles ya que precisan una técnica especial de tinción. Muestra de protozoarios: -Agregar una gota de muestra de agua estancada (con gotero) en el portaobjeto, poner el cubreobjeto con la precaución de que no se formen burbujas, observar en los objetivos de 10x y 40x.Actividad ComplementariaEn el siguiente cuadro marca las estructuras que pudiste observarMuestras/ Células Vegetales Células Animalesorganelos Cebolla Tomate Elodea Sangre Protozoarios 10 X 40X 10 X 40X 10 X 40X 10 X 40X 10 X 40XNúcleoMembranacelularParedcelularCitoplasmaVacuolasOtrosPOST LABORATORIO 1. Indique las principales diferencias entre células vegetales y células animales (realice un cuadro comparativo). 2. Porque los organelos celulares son de diferente formas y color 3. Describa los organelos celulares que diferencias los dos tipos de células de estudio. 4. Revise diferentes tipos de técnicas que se utilizan para estudia células vegetales y animales.
  22. 22. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS PRÁCTICA 3INTRODUCCIÓNLos hongos constituyen un grupo muy numeroso de organismos (se han descritoaproximadamente 500.000, pero se estima que pueden existir entre 1 y 1,5 millones deespecies) que presentan una amplia distribución en la naturaleza, contribuyendo a ladescomposición de la materia orgánica (Figura 1) y participando en los ciclos biológicos.Un pequeño número son patógenos de animales y plantas.Figura 1. Estructura de Hongos estructuras para la degradación de materia orgánica.Inicialmente, los hongos fueron clasificados dentro del Reino Plantae ya que fueronconsiderados organismos inmóviles presentando estructuras que se asientan firmementeen el sustrato sobre el que crecían. Sin embargo, cuando se ha aplicado la biologíamolecular en los estudios taxonómicos se ha observado que los hongos están máspróximos al Reino Animalia que al Plantae. En el sistema de clasificación de los seresvivos en cinco reinos, los hongos se encuentran clasificados en el Reino Fungi, que sedivide en cuatro Phyla denominados Ascomycota (el más extenso que comprende el 50%de los hongos conocidos y aproximadamente el 80% de los hongos patógenos,Basidiomycota, Zygomycota, y Chytridiomycota, encontrándose en los tres primeros loshongos patógenos humanos. Los hongos en los que no se conoce su reproducciónsexual, constituyen un grupo heterogéneo denominado Deuteromicetos, hongosimperfectos o mitospóricos, que representa el segundo grupo más numeroso y quetambién incluye patógenos humanos.Los hongos son organismos eucariotas típicos (Figura 2) y poseen un núcleo quecontiene varios cromosomas (siete en Candida albicans, ocho en Aspergillus nidulans ydieciséis en Saccharomyces cerevisiae) delimitado por una membrana nuclear, connucléolo rico en ARN y orgánulos citoplásmicos, como mitocondrias, vacuolas, retículoendoplásmico, aparato de Golgi y ribosomas 80 S. El citoplasma se encuentra limitadopor la membrana citoplásmica, que es una doble capa de lípidos que contiene proteínas yesteroles y que controla la permeabilidad celular y participa en la síntesis de la paredcelular. La estructura de las células de los hongos es muy diferente de la de las bacteriasque son organismos procariotas. Aunque comparten muchas estructuras, las células delos hongos se diferencian de las de las plantas en la composición de la pared celular y enque carecen de cloroplastos y clorofila, y de las humanas en que tienen pared celular yen la presencia de ergosterol en la membrana citoplásmica. Por el exterior de lamembrana citoplásmica, presentan una pared celular que está compuestafundamentalmente por polisacáridos y por diversas proteínas. Los polisacáridos másimportantes son la quitina (polímero de n-acetil glucosamina), el manano (polímero demanosa) y el glucano (polímero de glucosa).Los hongos presentan básicamente dos tipos de morfologías: una multicelulardenominada filamentosa y otra unicelular denominada levaduriforme. Los hongosfilamentosos (miceliares o mohos), representan el crecimiento más típico de los hongos
  23. 23. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALmicroscópicos. En medios de cultivo sólidos y también sobre cualquier superficie en laque se desarrollen, por ejemplo frutas u otros alimentos, producen colonias algodonosaso pulverulentas que son muy características. Al microscopio óptico, los hongosfilamentosos presentan unas estructuras tubulares, formadas por múltiples células, quese denominan hifas.Los hongos obtienen los nutrientes por absorción y tienen un metabolismoquimioheterótrofo, ya que obtienen la energía y el carbono de compuestos orgánicossintetizados por otros organismos. Este hecho condiciona su modo de vida, ya que en lanaturaleza se encuentran asociados a la materia orgánica en descomposición,participando en los ciclos naturales de reciclado del carbono y otros elementos naturaleso Bial - Arístegui 3 4 Rev Iberoam Micol 2002 como patógenos oportunistas de losanimales y plantas. Los hongos pueden degradar una gran cantidad de componentes,para lo que disponen de potentes exoenzimas que en algunos casos pueden servirlescomo factores de virulencia en el hospedador.En el laboratorio, los hongos crecen fácilmente en la mayoría de los medios de cultivo,necesitando una fuente de carbono orgánica e iones amonio o nitrato como fuentes denitrógeno. Esta facilidad para crecer en cualquier medio de cultivo y la presencia deconidios en el aire hace que sean contaminantes habituales en el laboratorio. Los hongosfilamentosos son aerobios y los levaduriformes anaerobios facultativos. Susrequerimientos de temperatura y de pH son poco exigentes y la mayoría crecen en unrango de pH de 2 a 9 y a temperaturas entre 10 y 40 °C.La mayoría de los hongos presentan reproducción sexual y asexual. El estado sexual sedenomina teleomorfo o meiospórico y el asexual anamorfo o mitospórico. Esrelativamente común que un mismo hongo tenga dos nombres, el del estado anamorfo yel del estado teleomorfo, ya que suelen haberse descubierto y nombrado de formaindependiente. En un grupo importante de hongos solamente se conoce la reproducciónasexual, bien porque no se conocen las condiciones adecuadas para que se desarrolle laforma sexual o porque ésta se ha perdido a lo largo de la evolución. Aunque lareproducción asexual puede lograrse por fragmentación de las hifas, ya que cadafragmento puede producir una nueva colonia, normalmente los hongos se reproducen,tanto sexual como asexualmente, por medio de esporas. Los hongos producen millonesde esporas, cada una con la capacidad para desarrollar una nueva colonia. Las esporassexuales se producen tras la fusión de los núcleos de dos hifas sexualmente compatibleso de dos levaduras y posterior meiosis. La morfología de las esporas sexuales es muyvariada y tiene gran interés para la identificación fúngica, ya que presentan diferenciascaracterísticas. OBJETIVOS 1. Conocer procesos de preparación en fresco y en cinta adhesiva de distintas especies de hongos 2. Observar la morfología de los hongos y distinguir las diferentes estructuras que presenta. 3. Diferenciar los diferentes tipos de hongos según su origen y materia
  24. 24. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL orgánica que pueden degradar Una semana antes de realizar el laboratorio se deberán cultivar hongos, los cuales serán observados en el laboratorio. En diferentes frascos de vidrio de plástico o vidrio de boca ancha, colocar los siguientes materiales: a) un trozo de pan de marca o de panadería, b), un trozo de tomate, papaya u otros alimentos en descomposición. Dejar la caja a la intemperie un día en un lugar sombreado y después taparla. Colocar los frascos de preferencia en un lugar fresco por cinco días y llevarla posteriormente al laboratorio. Materiales Microscopio Agujas de disección Solución salina al 1% Gotero Pinza de punta roma Lugol Cajas de Petri Azul de metileno Portaobjetos Cubreobjetos Cuchilla-bisturí Muestras de hongos Cinta transparente Champiñón Procedimiento en el laboratorio -Abrir los frascos y separa los diferentes productos colocándolos en una caja de Petri. -Empleando el estereoscópico, observa cada uno de los productos y describe la apariencia que tienen los mohos o pelusas que se observan sobre ellos, así como las manchas que aprecies sobre los mismos. -En el cuadro que se presenta en la sección de resultados deberás indicar que olor despiden los diferentes productos: si es azucarado, picante como vinagre, rancio, fétido, etc. Estas observaciones son subjetivas. Igualmente deberás indicar el color de los mohos, manchas o pelusas, si se ve como polvo o como gelatina.
  25. 25. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL -Una vez descritos los productos observados con el estereoscópico, realizar una serie de preparaciones temporales y observar con el microscopio compuesto la estructura microscópica que presentan, añadir una gota de colorante y describir la estructura que logra identificar. Elaborar los esquemas representativos de las observaciones y anéxala a este reporte. En caso de no observar hifas, conidióforos o esporangióforos señala las características de forma y color que presentan conidiósporas y esporangiósporas. -Respecto al champiñón, realizar con un bisturí un corte lo más fino posible tanto en la cabeza del hongo como de su talo o estípite, colocarlo en el porta objeto, añadir una gota de azul de metileno, describir a través de un esquema las estructuras que observa. -Técnica cinta adhesiva: colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiado gruesa. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 2cm. Tocar con el lado adhesivo de la cinta la superficie de la fruta o el pan enmohecidos o el borde de una colonia de hongo de un cultivo. En la zona central de una colonia puede haber una excesiva concentración de esporas. Pegar la cinta adhesiva sobre la gota del portaobjetos. Eliminar el colorante sobrante con un papel de filtro. Una vez concluidas las observaciones trata de agrupar a los hongos observados de acuerdo a las características comunes. Completar en el siguiente cuadro y guía. Sustrato o Olor que Apariencia de Estructuras alimento despide las colonias observadas Cuestionario 1. ¿En qué consisten las diferencias que presentan los hongos encontrados o desarrollados en los distintos materiales? 2. ¿Qué origen tienen olores que despiden los diferentes alimentos? Señalar si éstos pueden indicar cuál sustancia o compuesto degradan los hongos 3. Tras realizar las observaciones con el microscopio compuesto, qué
  26. 26. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL estructuras se pueden identificar en los organismos observados. 4. Con base en las características observadas en los diferentes organismos, ¿Cómo se clasifican los organismos observados? 5. Realizar un esquema con las divisiones del reino hongo o fungi. PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO PRÁCTICA No 4 INTRODUCCIÓNPara realizar el estudio microbiológico, ya sea humana o animal, vegetal, industrial o delmedio ambiente, se debe someter a una serie de procesos estandarizados de laboratorio,que permitan reconocer los microorganismos. Las coloraciones permiten diferenciarformas, agrupaciones, características tintoriales y estructuras de los diferentesmicroorganismos en las muestras.COLORACIONESLos colorantes biológicos tienen varias aplicaciones en microbiología, se usan paraclasificar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas, también para observar lasdiferentes estructuras microbianas como pared, capsula, espora, flagelo, núcleo ygránulos, tienen utilidad para la observación de levaduras y estructuras, en medios decultivo se emplean como indicadores o inhibidores selectivos.La morfología bacteriana se puede observar claramente por medio de coloración de lascélulas. En las técnicas de coloración, las bacterias están muertas por el hecho de fijarcon calor la muestra a la lámina y por el mismo proceso de coloración.Al aplicar un colorante a la preparación microbiana, las bacterias se tiñen haciéndolasresaltar con claridad, debido a la composición química tan diferente con respecto almedio que las rodea, además permite estudiar las características morfológicas y emplearmayores amplificaciones microscópicas.Al poner en contacto una célula bacteriana con un colorante, ocurre un intercambio deiones entre el colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la célula. Losiones tenidos del colorante reemplazan a los iones de los componentes celulares, porejemplo, el catión azul de metileno, reemplaza el catión de sodio, dándoles el color.Según la estructura que el colorante tiñe en la bacteria, las coloraciones se hanclasificado en:
  27. 27. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL-Coloraciones simples: En las que se emplea un solo colorante para el proceso, porejemplo: azul de metileno, cristal violeta, fucsina básica y safranina.-Coloraciones compuestas y diferenciales: En estas se usa más de un colorante, ycon la misma coloración las células se tiñen de manera diferente.Ejemplo: Tinción de Gram, Ziehl Neelsen.-Coloraciones especiales: permiten la observación de estructuras especiales de labacteria como esporas, glicocálix, cápsulas, flagelos, etc. Ejemplo: Wayson (esporo),Leifson (flagelo), rojo congo (coloración ácida) (glicocalix, cápsula), Van Stoltemberg(gránulos metacromáticos).-Coloración de Gram:La coloración de Gram fue descrita en 1884, por el citólogo Christian Gram, para teñirbacterias presentes en los tejidos. Actualmente continúa siendo la más empleada enmicrobiología, esta clasificada como una coloración compuesta y diferencial, debido aque en el proceso se utilizan dos colorantes: el cristal violeta y la fuscina básica, ydependiendo del colorante que toma la pared bacteriana y dos grandes categoríasdenominadas: Gram positivas (se tiñen de cristal violeta) y las Gram negativas (toman elcolor de la fuscina básica).Esta diferenciación es fundamental para establecer específicamente el tratamiento conantibióticos. La reacción tintorial que presentan las bacterias al ser coloreadas con Gramdemuestra una composición química y estructural de la paredes, pues se evidenciatambién el comportamiento bacteriano específico frente a agentes físicos y químicos.Reacción de las células frente a los componentes de la coloración de Gram. COMPONENTES GRAM POSITIVAS (más GRAM NEGATIVAS concentración de (menos concentración de peptidoglicano) peptidoglicano, doble capa lipídica) Cristal violeta (colorante Bacteria de color violeta. Bacterias de color violeta básico) Lugol (fijador) Se forma complejo CV-I Se forma complejo CV-I. Bacteria de color violeta Bacterias de color violeta Alcohol acetona Deshidratación de paredes Extracción de lípidos de la (decolorante) celulares, retracción de pared, mayor porosidad, poros, disminución de la liberación del complejo permeabilidad. colorante-fijador (CV-I). Presencia del complejo Bacteria incolora CV-I. Bacteria de color violeta. Fucsina básica Bacteria de color violeta Bacteria de color rosadoLa pared celular es responsable de lo que le sucede al colorante utilizado en la tinción deGram (1884). Las propiedad de teñirse o no de violeta oscuro (Gram positivas o Gram
  28. 28. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALnegativas) por esta coloración es un criterio de clasificación importante correlacionablecon otras propiedades bacterianas. Unos pocos organismos son Gram variables.Tanto las Gram positivas como las Gram negativas captan la misma cantidad de cristalvioleta e yodo. El complejo CV-I sin embargo es atrapado dentro de la célula Grampositiva por la deshidratación y la reducción del tamaño de los poros de la paredresultante del proceso de lavado con solvente. En contraste en las Gram negativas la fina(y probablemente discontinua) capa de peptidoglicano no impide la extracción por elsolvente del complejo.Avala lo antedicho el hecho que, si después de su tinción se tratan con lisosomabacterias Gram positivas, se ve que los protoplastos siguen teñidos, pero pierden elcolorante si se los trata con alcohol. Esto indica que el colorante es fijado a nivel delprotoplasto, y que la pared celular de las bacterias Gram positivas es la que impide laextracción del colorante. Corroborando esta suposición se observa que cuando B.subtilis emerge de su espora su pared celular está inmadura y se comporta como Gramnegativas. Cuando la pared celular adquiere su estructura final pasa a ser Gram positiva.La pared bacteriana está compuesta por elementos comunes para la mayoría deespecies como son peptidoglucano, ácido diaminopimélico, y componentes especialesque están presentes solo en algunas especies como ácido teicoico – teicurónico en Grampositivas, lipopolisacaridos en Gram negativas, ácido micólico – arabinogalactano enmycobacterias, formas meso – levo de ácido diaminopimélico o carencia de ellas comosucede en Actinomices, Streptomyces y Nocardias, ausencia de peptidoglucano enMicoplasma y Ureaplasma.Dichos componentes son aprovechados por la coloración de Gram que clasifica lasbacterias en 4 grandes grupos: Cocos Gram positivos, Cocos Gram negativos, BacilosGram positivos, Bacilos Gram negativos. Sin embargo algunos géneros bacterianos nopueden ser incluidos dentro de la clasificación por la coloración de Gram porque notoman el colorante por su baja afinidad (Ricketsias), ausencia de pared (micoplasmas),diferente composición química de la pared (mycobacteias, Nocardias, Actinomices),carcterísticas especiales o no visibles al microscopio óptico común por su reducidotamaño (Espiroquetas, Mycobacterias entre otras), formas diferentes a las clásicas(Haemophilus, fusoespirilos). Como coloraciones alternas para estos microorganismosesta Ziehl Neelsen, Giemsa, Wright, fluorocromos e incluso microsocopía electrónica.-Coloración de Wayson: especial para endosporas, está clasificada como una coloraciónespecial, por demostrar la presencia de una estructura especial, que caracteriza a labacteria. Que se pueda observar dicha estructura es de gran importancia, paradeterminar el proceso de estudio que se va a seguir, realizar el diagnóstico exacto y darun tratamiento adecuado al agente infeccioso.Las endosporas son cuerpos ovales de pared gruesa, que se forman dentro de la célulavegetativa, donde se recoge el material celular y la célula se deshidrata (se sintetizadipicolinato de calcio y el endosporo se recubre de una serie de capas protectoras comoel oxosporium), dentro de la cual se encuentra la cubierta de la espora, que estácompuesta de una capa parecida a la de la pared celular, por debajo de la cubierta de la
  29. 29. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALespora se encuentra la corteza, y dentro de ella, el núcleo o corazón, que contiene a lapared celular usual. Así, la espora difiere de la estructura de la célula vegetativa.Las endosporas dan a la bacteria alta resistencia a factores físicos y químicosdesfavorables, son características del género Bacillus y Clostridium.-Coloración de rojo congo y tinta china (cápsula y glicocálix), los glicocálix son sustanciasdensas o pegajosas, constituidas por glucanos solubles e insolubles que secretan lamayoría de procariotas, sobre su pared: algunos forman una capa de poco espesollamada microcápsula, otros forman capas de mayor diámetro que constituyen unaverdadera cápsula.El glicocálix cumple la función de fijar los microorganismos patógenos a sus huéspedes,los cuales son difíciles de reconocer y destruir por fagocitosis.Esta sustancia tiene especial importancia en la patogenicidad bacteriana y les daespecial resistencia a la desecación.Las coloraciones utilizadas para la observación de estas estructuras son denominadasnegativas (rojo congo, nigrosina y tinta china). También se pueden utilizar colorantesbásicos, como en la coloración de Hiss, en la que la cápsula se colorea de azul pálido, labacteria de color púrpura y el fondo de color claro.Estas coloraciones, por tener el ión colorante cargado negativamente, son rechazadaspor la cápsula y el glicocálix, por eso la estructura queda incolora, pero si se colorea elmedio que a envuelve, el resultado es un fondo coloreado sobre el cual se observanpequeños agujeros incoloros que corresponden a la cápsula cuando es de escasodiámetro y al glicocálix cuando el diámetro es más amplio. Si en el proceso de coloraciónse incluye un colorante básico, este tiñe la pared de la bacteria, que se observacoloreada dentro de la cápsula o del glicocálix.Si se desea incrementar el contraste de las células para la microscopía son suficientesprocedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple queactúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tanintenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar lapresencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material nocelular no se tiñe.ELABORACION DEL FROTIS: Si el frotis se va a realizar a partir de una muestra sólida,se debe poner sobre una lámina limpia y desengrasada una pequeña gota de agua con elasa recta esterilizada, y con la punta del asa recta se toma ya sea una colonia bacterianaempleadas en este laboratorio, se emulsiona con la gota de agua y luego se extiendesobre la lámina en un área no mayor de 0.5 cm de diámetro, de manera que sobre unamisma lámina se pueden realizar hasta 3 frotis diferentes. El frotis se deja secar atemperatura ambiente y nunca con calor, debido a que se facilita la formación deabundantes aerosoles, precipitados de colorantes y alteraciones de la forma de losmicroorganismos. Si la muestra es líquida se emplea el asa con argolla y no se requiereemulsionar la muestra con agua, sino que directamente se extiende en un área de 0.5
  30. 30. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALcm, se deja secar a temperatura ambiente.FIJACION: en el proceso de fijación del frotis consiste en pasar la lámina por el ladocontrario de donde se hizo el frotis sobre la llama del mechero tres veces consecutivas,evitando que se caliente la lámina para que no se dañen las estructuras celulares, estose hace debido a que tiene como fundamento matar y fijar a la lámina losmicroorganismos presentes en el frotis.MATERALESOBLIGATORIO USO DE BATA DE MANGA LARGA-Por grupos llevar una toalla y jabón en polvo para lavar el material Microscopio Frasco lavador Portaobjetos Mechero de alcohol Cubreobjetos Papel de filtro Asa de siembra Cristal violeta Cubeta de tinción Lugol Pinzas Alcohol-acetona Yogur Safranina Vinagre PalillosBacterias del Yogur.1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra.2. Tomar una muestra (gota) de yogur y expandirla en el porta, mezclarla bien col el agua.3. Dejar secar y fijar con metanol.4. Teñir 2 o 3 minutos, lavar el exceso de colorante y dejar secar.5. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse.6. Observar en microscopio con los objetivos de 10x, 40x y 100 x. Para el objetivo de 100x aplicar aceite de inmersión, colocar cubre objetos y observar.
  31. 31. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALBacterias del Vinagre7. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra.8. Tomar una muestra (gota) de vinagre y expandirla en el porta.9. Dejar secar y fijar al calor10. Teñir 2 o 3 minutos, lavar el exceso de colorante y dejar secar.11. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse.12. Observar en microscopio con los objetivos de 10x, 40x y 100 x. Para el objetivo de 100x aplicar aceite de inmersión, colocar cubre objetos y observar.Bacterias del Sarro Dental13. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra.14. Tomar con una aguja enmanglada una porción del sarro dental y expandirla en el porta.15. Dejar secar y fijar al calor16. Teñir 2 o 3 minutos, lavar el exceso de colorante y dejar secar.17. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse.18. Observar en microscopio con los objetivos de 10x, 40x y 100 x. Para el objetivo de 100x aplicar aceite de inmersión, colocar cubre objetos y observar.FIJACIÓN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el porta entre los pases. Con metanol (para bacterias procedentes de medio líquido). Añadir unas gotas de metanol sobre la extensión completamente seca. Golpear el portaobjetos por su canto con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato el exceso de metanol. Esperar a que el metanol se evapore completamente.
  32. 32. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALUna vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden serobservadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con elproceso de tinción.RESUMEN 1. Preparar los frotis bacterianos. 2. Teñir con cristal violeta 1min. 3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. 4. Cubrir con Lugol 1min. 5. Lavar con agua el exceso de Lugol. 6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparación deje de perder color (30seg) 7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente. 8. Teñir con safranina 1min. 9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste. 10. Secar la preparación. 11. Examinar al microscopio fijándose sobre todo en el color de cada preparación.Los tiempos de exposición a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara labatería de colorantes para realizar la tinción Gram presentan algunas diferenciasrespecto a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar lostiempos.POST LABORATORIO Describa las características más importantes de las bacterias, realizar esquemas de las formas que presentan y los tipos de agrupaciones que presentan. Realizar una revisión de las aplicaciones de células bacterianas más importantes a nivel ambiental e industrial. Busque en esquemas (dibujos) las formas y agrupaciones bacterianas y dibujelas De 3 razones por las que a una muestra se le debe realizar la coloración de Gram De acuerdo a la localización y tamaño de las esporas como se clasifican. Mencione 5 bacterias Gram positivas y 5 Gram negativas. PREPARACION Y ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO. PRÁCTICA No 5INTRODUCCIONLos medios de cultivo son un sistema artificial que permite las condiciones óptimas ynecesarias (de cantidad de nutrientes, temperatura) para el desarrollo de determinados
  33. 33. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALmicroorganismos. De acuerdo con esto encontramos diferentes requerimientosnutricionales, distintos tipos de medios en cuanto a consistencia: líquidos, sólidos)alrededor de 1.6% de agar), semisólidos (0.8% de agar), que como se observa, laconsistencia depende de cantidad de agar o de su ausencia, el agar es componenteesencial que proviene de las algas rojas, además que es resistente a la acción dedegradación que realizan las bacterias. El conocimiento de la nutrición microbianapermite el cultivo de los microorganismos en el laboratorio. Todos los microorganismostienen parecidos requerimientos de macro y micronutrientes, aunque ha quedado caroque la forma en que cada nutriente es captado puede variar mucho entre unas bacteriasy otras, así como la cantidad relativa de cada nutriente.TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO:Un medio de cultivo es una solución acuosa (bien como tal, o bien incorporada a uncoloide en estado de gel) en la que están presentes todas las sustancias necesarias parael crecimiento de un(os) determinados microorganismos. Los medios de cultivo sepueden clasificar en primera instancia en tres grandes tipos:1. Medios complejos o indefinidos: su composición química exacta se desconoce, yaque son el producto de realizar infusiones y extractos de materiales naturales complejos:Ejemplos: Digeridos crudos de extracto de carne, extracto de levadura, peptona de carne,extracto de levadura y caseína (de la leche).Con ellos se logra un tipo de medio rico nutricionalmente, aunque indefinidoquímicamente. Si lo que pretendemos simplemente es obtener un buen crecimientobacteriano, este tipo de medios es ideal, ya que su confección es fácil y rápida (bastapesar cierta cantidad del extracto desecado, suministrado por casas comerciales,disolverlo en agua y esterilizar en autoclave, antes de inocular e incubar la bacteria con laque queramos trabajar). Estos medios contienen fuentes variadas de C y N orgánicos,sales minerales y micronutrientes. Sin embargo con ellos no podemos tener un controlnutricional preciso, ya que desconocemos la composición química y proporción exacta delos distintos nutrientes.2. Medios sintéticos o definidos: se obtienen disolviendo en agua destiladacantidades concretas de distintas sustancias químicas puras, orgánicas y/o orgánicas. Lacomposición concreta de un medio sintético dependerá de la bacteria que queramoscultivar: lógicamente un medio definido para una bacteria con grandes capacidadesbiosintéticas será más sencillo que el medio definido de otra bacteria con menoresposibilidades biosintéticas.3. En tercer lugar, podemos fabricar un tipo de medio “mezcla” de los anteriores,denominado medio semisintético: llevan algunas sustancias químicas cuya naturaleza ycantidad conocemos, junto con sustancias de naturaleza y composición indefinidas.Cualquiera que sea el tipo de medio, de los 3 que acabamos de citar, podemos elaborardos tipos de versiones, según su estado aparente:-Medios líquidos.
  34. 34. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL-Medios sólidos: derivan de los líquidos simplemente añadiendo a la solución nutritivaun coloide en estado gel, que solidifica (da consistencia) a esta solución.En los primeros tiempos de la microbiología solo se conocía como sustancia gelificante,la gelatina. Sin embargo, presenta muchos inconvenientes, ya que funde a 25C (porencima de esta temperatura el medio se licúa), y además, muchas bacterias presentangelatinasas que hidrolizan la gelatina.El gelificante más usado es el agar-agar, extraído de algas rojas (p.ej. Gelidium), del cualexisten versiones más o menos purificadas (las más puras están más enriquecidas en elpolisacárido agarosa, son las que se emplean para los medios definidos, con el objeto deevitar la introducción de sustancias contaminantes, inadvertidas que falseen lasinterpretaciones sobre el comportamiento nutricional de la bacteria).El agar presenta la ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de los 100C,lo que permite su uso para la inmensa mayoría de las bacterias, que son mesófilas.Para cultivar ciertas bacterias (sobre todo los quimioautótrofos) se suele recurrir a ungelificante inorgánico, el silicagel o gel de sílice.Medios selectivos son aquellos que permiten seleccionar un tipo (unos pocos tipos) demicroorganismos. En el laboratorio se emplean mucho medios selectivos sólidos queincorporan ciertas sustancias que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias, peropermite el crecimiento de otras (p. ej. Medios que llevan violeta cristal inhiben elcrecimiento de bacterias gran positivas).Medios diferenciales son aquellos que permite distinguir a simple vista dos o más tiposde bacterias en función de su distinto comportamiento respecto de algún nutriente delmedio. Este comportamiento diferencial se traduce normalmente en viraje de color deuna sustancia indicadora presente en el medio.Ejemplos:En el medio EMB (eosina azul de metileno) ciertos tipos de metabólicos de bacteriasproducen ácidos por fermentación de ciertas fuentes de carbono.El medio agar-sangre lleva un 5% de sangre de caballo o carnero, lo cual revela lacapacidad (y el tipo) de hemólisis de ciertas bacterias.CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVOSAntes de utilizar un medio de cultivo se debe realizar el control de calidad paracomprobar si las características del medio están dentro de las especificaciones dadas porla casa comercial y si la metodología de preparación es satisfactoria. Cada lote de mediopreparado debe someterse a un programa mínimo de ensayo que asegure su aceptacióny demuestre su actividad bacteriana típica.Valor de pH: compruebe el pH del medio, cuando este, tenga la temperatura ambiente, el
  35. 35. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALcual debe coincidir con el señalado en la etiqueta.Esterilidad: Tome al azar una muestra del 3 al 5% del lote preparado e incúbelo a 37Cdurante 2 a 5 días, para observar si hay crecimiento microbiano. Si hay presencia esindicativa de mala esterilización y debe repetirse toda la preparación.La esterilización es el proceso mediante el cual se destruyen los microorganismos seacual sean sus características (células viables, esporas etc.) patógenos o no, sobre elmaterial o dentro de él.Efectividad: Que en el medio preparado efectivamente hay un desarrollo demicroorganismos, se pone el medio de cultivo al ambiente o sirviendo una muestra.Estabilidad: con cierta periodicidad compruebe los datos mencionados en el mediopreparado y conservado, para determinar si las condiciones de conservación sonsatisfactoriasMATERIALESAutoclaveBalanzaEspátulaErlenmeyerCajas de petriGradillasAgua destiladaPapel kraftProbetasErlenmeyerTaponesMedios de cultivo (agar y caldo)METODOLOGIAEn la práctica, se realizará la preparación de medios de cultivo tales como: agar nutritivoy caldo nutritivo.Realizar los cálculos correspondientes para la preparación de los medios, teniendo encuenta el recipiente en el que se va a ensayar el medio, ya que los tubos de ensayo13X100 tapón algodón se ponen 3 ml y en las cajas de petri se envasan 20 ml.Agregar en un erlenmeyer el medio (gramos) y agregue la cantidad de agua calculada(ml). Agite el medio y póngalo a calentar con un tapón algodón ligeramente puesto, dejehervir. En el caso de los caldos no se calientan.Posteriormente esterilice en autoclave (calor húmedo). Es importante saber que haycondiciones que garantizan una verdadera esterilización: tiempo: 15-30 minutos, presiónde vapor 15 libras/pulgadas cuadradas o 1.2 atmósfera y temperatura de 121C.Deje enfriar a temperatura cachete y sirva en cajas de petri, en el caso de los tubos sirva5 o 6 mililitros con la pipeta.
  36. 36. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALPara conservar los medios de cultivo, se colocarán en el refrigerador para evitar que sedañen y se contaminen. Se recomienda guardar los medios dentro de bolsas de plásticoselladas.Realizar la prueba de esterilidad para 2 cajas, una como control sin esterilizar y unaprueba de efectividad exponiendo la caja al ambiente.PREGUNTAS PRELABORATORIO Qué efecto tiene el calor sobre los microorganismos?. Qué efecto tiene el método de calor seco en la célula (microorganismos)?. Qué efecto tiene la luz ultravioleta sobre la célula (microorganismos)?. Defina desinfectante, antiséptico, bactericida.PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS Haga un esquema del autoclave con sus partes y su función Esquematice etapas de esterilización en autoclave (en clase). Mencione los dos tipos principales de esterilización y explique cada uno de ellos. PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA CELULAR. FENÓMENOS DE DIFUSIÓN, OSMOSIS Y PRESION OSMÓTICA LABORATORIO No. 6Toda célula posee un sistema complejo de membranas, cuya función general es elintercambio de materiales entre la célula y el medio acuoso externo o fluido extracelular yentre los organelos y el citoplasma de las células. Las membranas sirven igualmentepara compartimentar enzimas y metabolitos celulares. Estas poseen la propiedadfuncional de PERMEABILIDAD SELECTIVA, por ser permeables a las moléculas deagua, pero más o menos impermeables a los solutos. Sin embargo, esta permeabilidadpuede verse afectada por cambios de temperatura, tóxicos, solventes orgánicas y lacomposición química del medio que rodea la célula.OBJETIVO: Observar el efecto de la concentración del medio sobre las células ycomprobar el proceso de ósmosis en un osmómetro.PRIMERA PARTEMATERIALES:Azul de metilenoSolución rojo neutroSolución salina (NaCl) al 2%, 0.6%
  37. 37. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERALAgua destiladaHieloTermómetroTubos de ensayoGradillasPipetasVasos de precipitadoPinzas, porta y cubreobjetos.PROCEDIMIENTO:DIFUSIÓN ESPONTÁNEA:Ponga 2 ml de agua destilada en 5 tubos de ensayo marcados respectivamente del 1 al5. Tome la temperatura. Agregue azúl de metileno a cada uno de los tubos así: Tubo 1:Una gota, Tubo 2: Dos gotas, Tubo 3: Tres gotas, Tubo 4: Cuatro gotas, Tubo 5: Cincogotas. Mida el tiempo de difusión en cada uno de los tubos, para ello registre el tiempo enel que colocó las gotas de azúl de metileno y el momento en que la distribución de éstees uniforme. Registre el tiempo de difusión en una gráfica (papel milimetrado) y diga quéefecto tiene la concentración sobre la velocidad de difusión.Tome cuatro tubos de ensayo marcados del 1 al 4. En el tubo 1 adicione 2 ml de agua a0°C, al tubo 2 adicione 2 ml de agua a temperatura ambiente, al tubo 3 adicione 2 ml deagua a 45°C y en cuarto tubo 2 ml de agua a 75°C. Inmediatamente después deadicionar el agua en los tubos coloque dos gotas de azul de metileno en cada uno deellos y mida el tiempo de difusión. Registre gráficamente los resultados y diga el efectoque tiene la temperatura sobre la velocidad de difusión (realice una tabla y una gráfica).OSMOSIS A TRAVES DE LA MEMBRANA CELULARUtilizando los eritrocitos como osmómetros, marque 3 tubos del 1 al 3 tresrespectivamente y deposite en cada uno de ellos 2 ml de solución así: tubo 1: soluciónsalina al 2%, tubo 2: agua destilada, tubo 3: solución salina al 0.6%. Luego adicione 1gota de sangre en los tres tubos de ensayo. Transcurridos 2 minutos transfiera con unapipeta limpia a un portaobjetos previamente marcado (1 a 3) una gota de cada tubo ycúbrala con una laminilla. Observe la muestra al microscopio y describa la forma quepresentan los eritrocitos o glóbulos rojos. Con el ocular micrométrico indique el tamañode los eritrocitos en cada caso y compare. El tamaño promedio de un eritrocito humanoes de 7.5 um. Haga sus esquemas.PREGUNTAS: Qué procesos se desarrollaron durante la práctica, hubo hemólisis o normalidad en cada caso? La solución era isotónica, hipotónica o hipertónica en cada caso. Qué le sucedería a una persona si se le inyectara agua destilada en el torrente
  38. 38. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA ALIDA MARCELA GÓMEZ RODRÍGUEZ BIOLOGÍA GENERAL sanguíneo.SEGUNDA PARTEDETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN OSMÓTICA CELULAR Y CÁLCULO DELA PRESIÓN OSMÓTICA MEDIANTE EL MÉTODO PLASMOLÍTICO.Coloque al lado izquierdo de una lámina dos gota de solución de sacarosa al 0.1M ysobre ésta una hoja de elodea. Luego cubra el montaje con una laminilla. Al lado derechode la misma lámina coloque en una gota de agua de acuario otra hoja de tamañosemejante. No permita que se seque el líquido en los montajes. Observe al microscopio20 células de la hoja y determine si se presenta plasmólisis en algunas de ellas. Paraefectos prácticos se considera que una solución de determinada concentración produceplasmólisis cuando el 50% están plasmolizadas. Compare su observación con el montajede control. Repita el procedimiento con las soluciones restantes de sacarosa (0.2, 0.3,0.4 y 0.5M) y registre sus resultados en una gráfica. Indique la (s) concentración (es)hipo-osmótica, iso-osmótica e hiper-osmótica. Determine la concentración osmótica de lacélula y calcule la Presión Osmótica (PO).Preguntas:  Qué factores determinan el paso de sustancias a través de las membranas celulares.  Explique por qué las heladas afectan a los cultivos.  Indique algunos procesos biológicos en plantas y animales relacionados con la ósmosis.  Qué es transporte activo. De un ejemplo de este proceso.  Qué es diálisis y de un ejemplo.  En que consiste la electrodiálisis.  Dé un ejemplo de una aplicación práctica de la diálisis en el campo de la salud.

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