Biotecnología Aplicadaa la Identificación y Validaciónde Dianas TerapéuticasInforme de Vigilancia Tecnológica
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BIOTECNOLOGÍA APLICADAA LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓNDE DIANAS TERAPÉUTICASEl presente informe de Vigilancia Tecnológica ...
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Genoma humano: 20.000-25.000 genes                                        5.000 fármacos que             5.000 Genes      ...
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Identificación de dianas mediante técnicas de análisis de la expresión génica            Técnicas basadas                 ...
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Ribosomas                                                                    Comienzo de la síntesis de proteínas         ...
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Como solución a este tipo de problemas se han diseñado moléculas de ARN interferente modificadasquímicamente que evitan la...
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La principal ventaja de esta técnica frente al resto                   a la función de la proteína completa. Por estede té...
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  1. 1. Biotecnología Aplicadaa la Identificación y Validaciónde Dianas TerapéuticasInforme de Vigilancia Tecnológica
  2. 2. Biotecnología Aplicadaa la Identificacióny Validación de DianasTerapéuticasInforme de VigilanciaTecnológica
  3. 3. BIOTECNOLOGÍA APLICADAA LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓNDE DIANAS TERAPÉUTICASEl presente informe de Vigilancia Tecnológica ha sidorealizado en el marco del convenio de colaboraciónconjunta entre Genoma España y la Fundación Generalde la Universidad Autónoma de Madrid (FGUAM), entidadque gestiona el Círculo de Innovación en Biotecnología(CIBT), perteneciente al Sistema de Promoción Regionalde la Innovación MADRID+D.Genoma España y la Fundación General de la UniversidadAutónoma de Madrid (FGUAM) agradecen la colaboraciónofrecida a:– Dr. Miguel Ángel Piris Pinilla Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO)– Dr. Arcadio García de Castro Andrews PharmaMar– Dr. Luis del Peso Ovalle Hospital Universitario de la Princesa– D.ª Rosario Ambite Domínguez Círculo de Innovación en BiotecnologíaLa reproducción parcial de este informe está autorizada bajola premisa de incluir referencia al mismo, indicando:Biotecnología aplicada a la identificación y validación dedianas terapéuticas. GENOMA ESPAÑA/CIBT-FGUAM.Genoma España no se hace responsable del uso que serealice de la información contenida en esta publicación. Lasopiniones que aparecen en este informe corresponden a losexpertos consultados y a los autores del mismo.© Copyright: Fundación Española para el Desarrollo de la Investigación en Genómica y Proteómica/Fundación General de la Universidad Autónoma de Madrid.Autores: Marta López (CIBT) Paloma Mallorquín (CIBT) Ion Arocena (CIBT) José Antonio Mesa (Genoma España) Miguel Vega (Genoma España)Edición: Silvia Enríquez (Genoma España)Referencia: GEN-ES05009Fecha: Abril 2005Depósito Legal: M-51618-2005ISBN: 84-609-8741-8Diseño y realización: Spainfo, S.A.4
  4. 4. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICASÍndice de contenido• RESUMEN EJECUTIVO 71. INTRODUCCIÓN A LA VALIDACIÓN DE DIANAS 82. TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN DE DIANAS 11 2.1. Análisis de la expresión génica 11 2.1.1. Análisis serial de la expresión génica (SAGE) 12 2.1.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) 13 2.1.3. Microarrays de ADN 13 2.2. Interacciones proteína-proteína 14 2.2.1. Microarrays de proteínas 15 2.2.2. Sistema doble híbrido 163. TÉCNICAS DE VALIDACIÓN DE DIANAS 17 3.1. Modulación de la expresión génica 17 3.1.1. Oligonucleótidos antisentido 17 3.1.2. ARN de interferencia 18 3.1.3. Ribozimas 20 3.1.4. Proteínas de dedos de zinc 21 3.2. Inactivación de proteínas 22 3.2.1. Química genética 22 3.2.2. Anticuerpos monoclonales 23 3.2.3. Aptómeros 24 3.2.4. Péptidos 24 3.2.5. Inactivación por láser mediante cromóforos y fluoróforos 25 3.3. Análisis de la expresión génica in situ 25 3.3.1. Microarrays de tejidos 26 3.3.2. Microarrays de células 26 3.4. Modelos vivos de la enfermedad 27 3.4.1. Ratones knock-out y knock-in 28 3.4.2. Ratones transgénicos 29 3.4.3. Mutagénesis de ratones al azar 30 3.4.4. Levaduras como modelo de enfermedad 30 3.4.5. Otros organismos modelo 31 3.4.6. Células madre embrionarias 32 3.5. Técnicas bioinformáticas 344. ESTRATEGIAS DE VALIDACIÓN DE DIANAS 37 5
  5. 5. 5. APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS DE VALIDACIÓN DE DIANAS 40 5.1. Enfermedades que requieren nuevas dianas 40 5.1.1. Enfermedades neurodegenerativas 40 5.1.2. Enfermedades cardiovasculares 42 5.1.3. Enfermedades psiquiátricas 43 5.1.4. Enfermedades metabólicas 45 5.1.5. Enfermedades autoinmunes 46 5.1.6. Cáncer 48 5.2. Naturaleza de las dianas terapéuticas para los fármacos actuales 496. ENTORNO ECONÓMICO EN LA VALIDACIÓN DE DIANAS 51 6.1. Validación de dianas en el desarrollo de fármacos 52 6.2. Estrategias de implantación de validación de dianas en la industria farmacéutica 54 6.3. Estrategias comerciales en la validación de dianas 557. EMPRESAS Y PROYECTOS EN VALIDACIÓN DE DIANAS 58 7.1. Empresas internacionales en validación de dianas 58 7.2. Empresas españolas en validación de dianas 59 7.3. Proyectos de I+D españoles en validación de dianas 608. CONCLUSIONES 61ANEXOS 65 ANEXO I. Proyectos de I+D españoles en validación de dianas 65 ANEXO II. Empresas internacionales en validación de dianas 92 ANEXO III. Empresas españolas en validación de dianas 103 ANEXO IV. Principales dianas terapéuticas 111REFERENCIAS 116GLOSARIO 1196
  6. 6. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICASResumen ejecutivoLas dianas terapéuticas son moléculas localizadas correcta validación de dianas terapéuticas reduceen cualquier parte de la célula, capaces de por tanto el tiempo y coste necesario para elreconocer un fármaco y producir una respuesta desarrollo de un fármaco eficaz, ya que se evitacelular que modifique el curso de una continuar con los esfuerzos empleados en elenfermedad. La evaluación de dianas terapéuticas desarrollo de fármacos cuyas dianas no han sidoconstituye un proceso que incluye las etapas de validadas adecuadamente. De este modo, laidentificación, caracterización y validación de industria farmacéutica conseguiría optimizar susdianas, siendo este último el paso final en la esfuerzos de I+D orientándolos hacia los proyectosdeterminación de la implicación de la diana en el basados en dianas validadas correctamente, conproceso patológico. La secuenciación del genoma mayores posibilidades de salir adelante.humano ha revelado la presencia de un grannúmero de potenciales dianas terapéuticas, sin Las técnicas genómicas y proteómicas que seembargo, la mayoría de estas dianas no han sido emplean en la identificación y validación de dianascompletamente caracterizadas ni se ha son de diversa naturaleza, y se empleanestablecido su asociación con una enfermedad generalmente en combinación con otras técnicasconcreta. Se ha estimado que el número de complementarias. La identificación de dianas sedianas potenciales terapéuticas se encuentra en realiza principalmente mediante técnicas detorno a 600 y 1.500, no obstante, los fármacos análisis de la expresión génica o bien mediante elque actualmente se encuentran en el mercado análisis de interacciones proteína-proteína, comoactúan sobre alrededor de 500 dianas diferentes. los microarrays de ADN y microarrays de proteínasEl reto actual consiste en seleccionar a partir del respectivamente. En cuando a las tecnologíasconjunto de genes del genoma humano aquellos relacionadas con la validación de dianas, lagenes que dan lugar a proteínas que pueden modulación de la expresión génica mediantellegar a ser dianas terapéuticas. tecnologías antisentido y el empleo de modelos vivos de la enfermedad como los ratones knock-outLa tasa de fracaso a lo largo del proceso de son las técnicas más relevantes. No obstante, otrasinvestigación farmacéutica es elevada, más del tecnologías complementarias como los microarrays80% de los proyectos se abandonan durante la de células y tejidos, células madre embrionarias, yfase de descubrimiento anterior a los ensayos técnicas de inactivación de proteínas comoclínicos, de modo que sólo uno de cada cinco CALI/FALI, son alternativas cada vez másproyectos consigue iniciar los ensayos clínicos. Una empleadas en las etapas de validación de dianas. 7
  7. 7. 1. Introducción a la validación de dianasEl presente informe tiene por objeto el estudio de las por el organismo. Las moléculas que reconocentécnicas que se emplean en la actualidad en la estos fármacos se denominan dianas terapéuticas,validación de dianas prestando especial atención a las y su modulación permite modificar el curso de unaplicaciones de las técnicas genómicas y proteómicas. proceso patológico. Las dianas sobre las que actúan los fármacos pueden ser de diferenteLos fármacos se componen de sustancias activas naturaleza, pudiendo ser azúcares, proteínas oo compuestos responsables del efecto terapéutico, ácidos nucleicos (ADN o ARN), sin embargo, lalos cuales ejercen su acción sobre la enfermedad mayoría de los fármacos que se encuentran en elcuando el compuesto es absorbido y distribuido mercado actúan sobre dianas proteicas1. Diana terapéutica Molécula localizada en cualquier parte de la célula, capaz de reconocer a un fármaco y producir una respuesta celular que modifique el curso de una enfermedad.El desarrollo de nuevos fármacos constituye un largo preclínicas y clínicas. Por tanto, una buenaproceso que se puede dividir en una serie de fases, caracterización de la actividad biológica de lasla primera de las cuales consiste en la identificación dianas moleculares que han sido identificadas en lasde nuevas dianas terapéuticas. La identificación de primeras fases, es fundamental para la obtención decompuestos activos con actividad biológica un mayor número de fármacos. No obstante, debidorelacionada con las dianas previamente descritas a la complejidad de los procesos biológicos que danconforma la segunda etapa de este proceso. El lugar a distintas patologías, no siempre es posibleúltimo paso consiste en el desarrollo y optimización identificar una diana que permita desarrollar undel fármaco a lo largo de las distintas fases fármaco eficaz. Validación de dianas Proceso que tiene por objeto demostrar que una determinada diana molecular está implicada en la aparición y progresión de una enfermedad. La validación de una diana permite establecer una relación entre la alteración de la diana y su potencial terapéutico.La validación de dianas consiste por tanto en alterar el curso de una enfermedad. Sin embargo,determinar si una diana molecular está implicada la validación de dianas puede realizarseen una enfermedad concreta, y por tanto es igualmente tanto a nivel molecular como genéticopotencialmente susceptible de ser considerada mediante herramientas genómicas y proteómicas,como diana terapéutica a la hora de diseñar que permiten relacionar una diana con un estadonuevos fármacos. Para algunos autores la patológico determinado. El grado de validación devalidación de una diana se consigue únicamente una diana estará por tanto relacionado con lacuando un fármaco se emplea con éxito para cantidad de datos preclínicos y clínicos que se1 Smith, M. B. (2003). Hitting the target. Nature, vol. 422, 341-347.8
  8. 8. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICASreúnan respecto al mecanismo biológico de la activos3. Sin embargo, no se debe olvidar que endiana y su relación con la eficacia del fármaco2. la realidad muy pocas dianas identificadasEl paso de una fase a otra del desarrollo de durante las primeras fases del proceso de I+Dfármacos depende en gran medida del grado de conducen al desarrollo de un fármaco eficaz, porvalidación de la diana en cuestión y del avance en lo que el grado de incertidumbre del proceso deel descubrimiento de potenciales compuestos desarrollo farmacológico es muy elevado. Descubrimiento Descubrimiento Desarrollo de dianas de fármacos de fármacos Optimización Identificación Validación Selección de Fase Fase de de dianas de dianas compuestos Preclínica Clínica compuestosFigura 1. Fases principales del desarrollo farmacológico.Fuente: Whittaker, P. A. (2003). What is the relevance of bioinformatics to pharmacology? Trends In PharmacologicalSciences, 24 (8):434-439.La identificación y desarrollo de fármacos ha sido Los fármacos que actualmente se encuentran entradicionalmente un proceso lineal que consistía el mercado actúan sobre aproximadamente 500en la búsqueda de compuestos químicos mediante dianas diferentes. Las estimaciones más recientesensayos sobre cultivos celulares, tejidos o calculan que existen entre 20.000 y 25.000 genesanimales4. Las dianas no se validaban con las en el genoma humano, de los cuales en torno atecnologías complejas que se emplean hoy en día, 5.000 podrían estar implicados en procesosy se desconocían los mecanismos moleculares patológicos. De estos últimos, sólo ciertos genes yresponsables de las enfermedades. Los avances las proteínas que codifican serán de interés paraen genómica y proteómica han permitido a la el desarrollo de fármacos que modifiquen elindustria farmacéutica descubrir un gran número proceso patológico. De este modo, el número dede fármacos por medio del estudio de las dianas terapéuticas potenciales se estima enrelaciones existentes entre los genes y las torno a 600 y 1.500 dianas6. La secuenciación delenfermedades. Como consecuencia, la validación genoma humano en el año 20017 supuso elde dianas al nivel del genoma ha surgido como descubrimiento de la secuencia de un granuna necesidad que a su vez ofrece numerosas número de dianas terapéuticas potenciales. Elventajas, ya que permite la posibilidad de conocer reto actual consiste en seleccionar a partir delde antemano algunos de los efectos biológicos de conjunto de genes del genoma humano aquelloslas proteínas, que mediante las técnicas clásicas genes que dan lugar a proteínas y que puedende validación no era posible anticipar5. llegar a ser dianas terapéuticas.2 Epstein, D. M., et al. (2002). Target Validation with Nucleic Acid Aptamers. Mimicking small molecule therapeutics by attacking the protein, and not the gene. Pharmaceutical Discovery and Development. PharmaVentures Ltd.3 Whittaker, P. A. (2003). What is the relevance of bioinfomatics to phamacology? Trends In Pharmacological Sciences, 24 (8), 434-439.4 Douglas S. A., et al. (2004). Techniques: Cardiovascular pharmacology and drug discovery in the 21st century. Trends in Pharmacological Sciences. Vol. 25 Nº 4: 225-233.5 Liu, R., et al. (2004). New approaches in identifying drugs to inactivate oncogene products. Seminars in Cancer Biology 14: 13-21.6 Hopkins. A. L. et Groom, C. R. (2004). The druggable genome. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 1 727-730.7 Lander, E. S., et al. (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409(6822), 860-921. Venter, J. C., et al. (2001). The sequence of the human genome. Science. 291(5507). 1304-51. 9
  9. 9. Genoma humano: 20.000-25.000 genes 5.000 fármacos que 5.000 Genes actúan sobre el implicados en genoma patologías 600-1.500 dianas terapéuticasFigura 2. Estimación del número de dianas terapéuticas del genoma humano.Fuente: Adaptado de Hopkins, A. L. et Groom, C. R. (2004). The druggable genome. Nature Reviews: Drug Discovery.Vol. 1, 727-730.Debido a que existen múltiples técnicas tempranas como técnicas de apoyo en lamoleculares que permiten relacionar genes y validación de dianas.proteínas con un determinado efecto ligado a unaenfermedad, las técnicas con una aplicación El presente informe realiza una descripción de estaspotencial a la validación de dianas son muy últimas técnicas, para posteriormente describir condiversas. Por esta razón, algunas técnicas más detalle las técnicas de validación de dianasmoleculares de identificación de nuevas dianas relacionadas con la genómica y proteómica,terapéuticas pueden emplearse en etapas clasificadas en función de las estrategias empleadas.Múltiples dianas Identificación de dianas candidatas Interacciones Cribado virtual Análisis de la proteína-proteína (“in silico”) expresión génica Algunas dianas Validación de dianas potenciales Modulación Inactivación Modelos “in vitro” Modelos “in vivo” de la transcripción de proteínas Múltiples Cribado de compuestos compuestos candidatos Desarrollo clínico Fármaco Seguridad Dosificación Efectividad candidato Fármaco finalFigura 3. Papel de la validación de dianas en el proceso de desarrollo de nuevos fármacos.Fuente: elaboración propia.10
  10. 10. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS2. Técnicas de identificación de dianasAl buscar un gen asociado a una enfermedad Las técnicas genómicas y proteómicas másgenética, los investigadores se concentran destacadas que se emplean en la identificación degeneralmente en genes candidatos8. Se considera nuevas dianas terapéuticas se pueden clasificarque un gen es candidato si la proteína que en tres grupos en función de la estrategia quecodifica representa una posibilidad lógica de que siguen. El análisis de la expresión génica, elesté involucrado en la enfermedad, o bien si el estudio de las interacciones proteína-proteína, ygen está localizado físicamente dentro de una el cribado virtual, son las tres estrategiasregión del genoma asociada o ligada a la principales descritas en el presente informe.enfermedad. La segunda situación se encuentrafrecuentemente en proyectos de clonajeposicional, donde el gen buscado se identifica deacuerdo a su posición dentro del genoma. 2.1. Análisis de la expresión génicaEn un proyecto de clonaje posicional típico, seidentifica primero una región pequeña del genoma El estudio del perfil de expresión de genesque contiene el gen que estamos buscando. engloba un conjunto de técnicas que permitenEntonces todos los genes ubicados en esa región identificar los genes implicados en el procesose convierten inmediatamente en posibles genes patológico mediante la observación de sucandidatos. Si se sabe o se puede deducir algo de fenotipo10 molecular. La expresión génica es ella proteína codificada de un determinado gen proceso por medio del cual la informacióncandidato o si se puede demostrar que la proteína codificada en el ADN se transforma en lasestá involucrada en la enfermedad, entonces ese proteínas necesarias para el desarrollo ygen se puede considerar un candidato fuerte y se funcionamiento de la célula. Este proceso tieneintensifican los esfuerzos para encontrar lugar por medio de una molécula intermediariamutaciones en él9. que transmite la información genética denominada ARN mensajero (ARNm)11. Transcripción Traducción ARNm ADN Proteína Análisis de la expresión génica al nivel de la transcripciónFigura 4. Análisis de la expresión génica en la validación de dianas.Fuente: elaboración propia. 8 Gen candidato: gen localizado en una región de un cromosoma sospechosa de estar involucrada en una enfermedad y cuyos productos proteicos sugieren que podría ser el gen de la enfermedad en cuestión (http://www.conocimientosweb.net/portal/term1494.html). 9 ConocimientosWeb.net (http://www.conocimientosweb.net/portal/term1494.html).10 Fenotipo: rasgos o características visibles de un organismo, determinado por su constitución genética (genotipo) y por el ambiente en el que crece y se desarrolla.11 El ADN (ácido desoxirribonucleico) es una molécula de gran tamaño que se encuentra en todos los seres vivos y que es portadora de la información genética. El ARN (ácido ribonucleico) es una molécula parecida al ADN en cuanto a sus características químicas, que también está relacionada con la transmisión de la información genética, ya que actúa como intermediario en el proceso de traducción o formación de proteínas. 11
  11. 11. Aunque todas las células contienen la misma expresan de modo diferencial en dos muestrasinformación genética, los genes se expresan en diferentes. Los resultados que se obtienen nodiferentes momentos dependiendo de la función proporcionan información acerca de la cantidad dede la célula o tejido y de su estado fisiológico. El ARNm y no se pueden comparar resultadosanálisis del perfil de expresión de genes consiste obtenidos en experimentos distintos13. Por esteen la identificación y cuantificación de los genes motivo, aunque son de gran utilidad en lasque se expresan en una célula o tejido concreto primeras etapas de identificación de dianas, no seen un determinado momento. El estudio del perfil suelen emplear con el fin de validar dianas14.de expresión de genes se puede realizar a partirde la identificación y cuantificación del ARN o biende las proteínas expresadas directamente. 2.1.1. Análisis serial de la expresión génica (SAGETM)Las técnicas de análisis de la expresión génicaemplean el primer tipo de abordaje, de modo que El análisis serial de la expresión génica (SAGETM)la comparación de los genes expresados en se basa en la presunción por la cual un segmentomuestras distintas permite descubrir los genes corto procedente de ARNm posee una complejidadque se encuentran activados e inactivados en suficiente como para identificar un gen completo.diferentes estados metabólicos y patológicos. Por Esta técnica fue desarrollada por la empresatanto, comparando la expresión de genes de Genzyme como plataforma tecnológica detejidos sanos y enfermos, es posible descubrir los descubrimiento de nuevas dianas oncológicas15, ygenes implicados en el desarrollo y progresión de ha sido adoptada por el Instituto Nacional della enfermedad, así como establecer una Cáncer (NCI) como método de análisis de laasociación entre el estado patológico y expresión génica dentro del Proyecto Anatomíadeterminados genes que se encuentran alterados del Genoma del Cáncer16.en esa enfermedad, y por tanto validar posiblesdianas terapéuticas. Estos segmentos cortos se obtienen mediante la acción de enzimas de restricción, que cortan enLas principales técnicas de identificación de lugares específicos el ADN complementariodianas basadas en el análisis de la expresión sintetizado a partir del ARN mensajero total de lagénica son los microarrays de ADN, el Análisis muestra. Midiendo la cantidad de copias de cadaserial de expresión génica (SAGE), y la fragmento específico se puede estudiar el nivel deElectroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). expresión de un gen concreto, identificarOtras técnicas alternativas de análisis de la simultáneamente miles de fragmentos de esteexpresión génica son variantes de la PCR como tipo en una célula o tejido y cuantificar susRaSH, RDA, RSDD, DDRT-PCR12. La principal niveles de expresión. La comparación de dichoslimitación de estas últimas radica en que son perfiles en muestras sanas y enfermas permitelaboriosas y requieren la inversión de un tiempo asociar la presencia de genes con enfermedadesconsiderable para identificar los genes que se concretas17.12 Pillutla, R. C. et al. (2002). Target Validation and drug discovery using genomic and protein-protein interaction technologies. Expert Opinion on Therapeutic Targets, 6 (4): 517-531.13 Chanda, S. K. et Caldwell, J. S. (2003). Fulfulling the promise: drug discovery in the post-genomic era. Drug Discovery today. Vol. 8, Nº 4. 168-174. Allen, N. L. et al. (2003). Representational difference análisis: critical appraisal and metod development for the identification of unique DNA sequences from prokaryotes. Journal of microbiological methods. 55: 73-81.14 Coleman, R. A. and Clark, K. L. (2003). Target validation using human tissue. Targets Vol. 2, No. 2: 58-64.15 Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), Genzyme (http://www.genzyme.com/research/gzmo/discovery/discoveryplatforms2_sage_gzmo.asp).16 SAGE Genie, Cancer Genome Anatomy Project, CGAP. (http://cgap.nci.nih.gov/SAGE).17 Serial Analysis of Gene Expression, Sagenet web page (http://www.sagenet.org).12
  12. 12. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS2.1.2. Electroforesis en geles 2.1.3. Microarrays de ADN de poliacrilamida (PAGE) Las técnicas de análisis de la expresión génicaLa electroforesis en gel de poliacrilamida mediante microarrays se basan en la capacidades una técnica que permite la separación de de los ácidos nucleicos para hibridar entre sí, esproteínas de una muestra compleja en función de decir, para unirse a otros ácidos nucleicos desu masa molecular mediante la aplicación de forma específica mediante un fenómenocorrientes eléctricas. La distribución de las denominado complementariedad19.proteínas en el gel y la intensidad de los puntospermite obtener un perfil de la expresión de Los microarrays de ADN son herramientasproteínas así como la identificación y moleculares que permiten analizar la expresióncuantificación de las mismas. Este último paso se génica por medio de la cuantificación del ARNsuele realizar mediante espectrometría de masas, expresado en una muestra concreta20. Ununa técnica analítica que brinda información microarray de ADN consiste en un soporte sobre elcualitativa y cuantitativa acerca de la composición cual se inmovilizan en posiciones concretasatómica y molecular de materiales inorgánicos y pequeños fragmentos de ADN de secuencia conocidaorgánicos. denominados sondas. El ARN procedente de la muestra que se desea analizar se transcribe a ADNLa comparación de los perfiles de expresión en un copia mediante transcripción inversa, ya que estastejido enfermo y uno sano permite analizar los moléculas son más estables que el ARN y es posiblecambios en la expresión de proteínas. De esta añadir marcadores que permitan su detección.forma, aquellas proteínas implicadas en procesos Mediante la hibridación del ADNc procedente depatológicos se expresarán en cantidades muestras diferentes con las sondas inmovilizadas endiferentes en tejidos enfermos en comparación el soporte, es posible identificar el gen concreto quecon los tejidos normales, y por tanto podrían se expresa en cada muestra. La intensidad de losconstituir dianas potenciales. La principal puntos del microarray indicará la cantidad de ARNlimitación de esta técnica se debe a que el presente en ese punto. Las principales limitacionesprocedimiento resulta laborioso y consiste en una de los microarrays se refieren a su elevado coste portécnica de bajo rendimiento18. unidad.18 Kramer, R. et Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews. Vol. 3: 965-972.19 El ADN está compuesto por dos cadenas enrolladas alrededor de sí mismas que forman una “doble hélice”, cada una de ellas formada por millones de bloques químicos llamados “bases”, y denominadas por las letras A, T, G y C. Estas bases poseen la capacidad de unirse entre sí de forma específica, de modo que las uniones entre las bases A-T y G-C son complentarias entre sí.20 López, M.; Mallorquín, P.; Vega, M. (2002). Microarrays y Biochips de ADN: Informe de Vigilancia Tecnológica. Genoma España, Círculo de Innovación en Biotecnología y Fundación General de la Universidad Autónoma de Madrid. 13
  13. 13. Identificación de dianas mediante técnicas de análisis de la expresión génica Técnicas basadas Técnicas basadas Técnicas basadas en la PCR en la secuenciación en la hibridación ARN Transcripción inversa ADN copia Electroforesis en geles Análisis serial de expresión Microarrays de poliacrilamida (PAGE) génica (SAGE) Proteína A Proteína B Hibridación sobre un soporte con sondas de ADN complementarias ARN – S-S– Desnaturalización Liberación de fragmentos específicos de cada ARN –SH HS– Detección por fluorescencia Secuenciación – Cuantificación + Separación mediante electroforesisFig. 5. Validación de dianas mediante técnicas de análisis de la expresión génica.Fuente: Velculescu, V. E. et al. (2000). Analysing uncharted transcriptomes with SAGE. Trends Genet. Oct;16(10): 423-5;University of Miami Department of Biology Homepage(http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255hist/ecbxp4x—SDS.jpg).2.2. Interacciones genes presentes en el ADN. Dado que la mayoría de las dianas de fármacos son proteínas, su proteína-proteína estudio resulta esencial en el proceso de validación de dianas.Las técnicas genómicas anteriormentemencionadas determinan la expresión de los La proteómica permite comprender elgenes en una célula o tejido, pero no permiten el funcionamiento de la célula a través del estudioestudio de las interacciones entre proteínas21. Las del conjunto de proteínas que contiene una célulaproteínas son las moléculas responsables de o tejido o proteoma22. Por medio de técnicasdesempeñar las funciones controladas por los proteómicas es posible comparar perfiles de21 Kramer, R. et Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews. Drug discovery. Vol. 3: 965-972.22 Lindsay, M. A. (2003). Target discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 2: 831-838.14
  14. 14. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICASexpresión de proteínas de tejidos y células sanas Los microarrays de proteínas consisten en uncon los perfiles de expresión en muestras soporte sólido sobre el que se inmovilizan proteínasenfermas, lo que permite asociar dianas proteicas específicas en posiciones concretas. Los microarraysa determinados procesos patológicos. Por otro de proteínas y anticuerpos permiten el análisis alado, existen técnicas que permiten estudiar las gran escala de los perfiles de expresión de proteínasinteracciones entre proteínas a gran escala y y el estudio de las interacciones entre las mismas26.establecer redes de interacciones entre las Por medio del empleo de muestras procedentes deproteínas de la célula. El conocimiento de estas tejidos sanos y enfermos, los microarrays deredes permite conocer las rutas implicadas en proteínas permiten estudiar la expresión diferencialprocesos patológicos y el conjunto de las de proteínas en tejidos enfermos y relacionar lasproteínas implicadas en una determinada diferencias en el perfil de expresión proteica con elenfermedad, es decir, potenciales dianas fenotipo de la enfermedad, lo que permite identificar 23 y validar dianas potenciales de una enfermedad.terapéuticas . Existen tres tipos de microarrays de proteínas en función de las moléculas que interaccionan entre sí. De esta forma, nos encontramos con microarrays de2.2.1 Microarrays de proteínas interacciones proteína-proteína, ADN-proteína, y enzima-sustrato27.Los microarrays de proteínas se basan en latecnología desarrollada para la fabricación de los Las principales limitaciones técnicas de losmicroarrays de ADN. En este caso, en vez de microarrays de proteínas se refieren a la dificultadácidos nucléicos, las moléculas que se inmovilizan para detectar e identificar proteínas de modosobre el soporte son de naturaleza proteica, como específico en comparación con los microarrays deanticuerpos24, enzimas o proteínas de otro tipo25. ácidos nucléicos, que no poseen esta limitación28. Interacción Interacción Interacción Interacción Interacción prot-prot ADN-prot prot-molécula antic-prot enzima-sustratoFigura 6. Interacciones de proteínas en validación de dianas.Fuente: Smith, M. G. & Snyder, M. (2005). Global analysis of protein function using protein microarrays.Mech. Ageing Dev. 126(1):171-5.23 Brown, D. & Superti-Furga, G. (2003). Rediscovering the sweet spot in drug discovery. Drug Discovery today. 8 (23): 1067-1077. Pillutla, R. C., et al. (2002). Target validation and drug discovery using genomic and protein-protein interaction technologies. Expert Opin. Ther. Targets, 6(4): 517-53124 Los anticuerpos son proteínas especializadas producidas por el sistema inmunológico que se unen a partículas extrañas denominadas antígenos.25 Kramer, R. et Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews. Vol. 3: 965-972.26 Kumble, K. D. (2003). Protein microarrays: new tools for pharmaceutical development. Anal Bioanal Chem. 377: 812-819.27 Wang, S., et al. (2004). Tools for target identification and validation. Curr. Op. in Chem. Biol. 8: 371-377.28 Kramer, R. et Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews. Vol. 3: 965-972. 15
  15. 15. 2.2.2. Sistema doble híbrido La identificación de dianas terapéuticas mediante el sistema doble híbrido analiza las interacciones entre dos proteínas diferentes, que se unen a losEl sistema doble híbrido es una herramienta dominios de unión de ADN y activación de un genmolecular que permite el estudio a gran escala de que se utiliza como indicador respectivamente. Lalas interacciones proteína-proteína a través de las unión de los dos dominios a través de las proteínasproteínas que regulan la expresión génica, fusionadas permite la activación de la expresión deldenominadas factores de transcripción29. Estas gen indicador, por lo que su presencia pondrá deproteínas son las encargadas de regular la manifiesto la existencia de una interacción entreexpresión de los genes mediante su activación o las dos proteínas31. El sistema doble híbridorepresión. La mayoría de los factores de aprovecha la maquinaria celular de la levadura S.transcripción presentan dos regiones o dominios, cerevisiae, que se utiliza como sistema deun dominio de unión al ADN y un dominio expresión de ambas proteínas de fusión. Por otroresponsable de la activación del gen. Ambos lado, esta técnica permite estudiar la interaccióndominios son esenciales para que tenga lugar la entre proteínas y construir redes de interaccionesexpresión génica, aunque no tienen porqué de todo el proteoma, proporcionando una visiónformar parte de una misma proteína30. global de la maquinaria molecular32. Dom. Activ. Dom. Activ. Proteína 2 Proteína Proteína Proteína 1 2 3 Dom. Expresión del Dom. Sin expresión del unión gen indicador unión gen indicador ADN ADN Promotor Gen indicador Promotor Gen indicadorFigura 7. Funcionamiento del sistema doble híbrido.Fuente: Elaboración propia.La principal limitación de esta técnica radica en que positivos provocados por la activación del genno permite analizar las interacciones entre indicador por parte de otras proteínas de laproteínas localizadas en compartimentos diferentes levadura, además de falsos negativos debido ade la célula, limitando por tanto su aplicación. Por problemas en la unión de las dos proteínas33.otra parte, es habitual la presencia de falsos29 Factor de transcripción: proteínas que regulan la expresión de determinados genes, mediante la activación o represión de su expresión.30 Coates, P. J. & Hall, P. A. (2003). The yeast two-hybrid system for identifying protein-protein interactions. Journal of Pathology 199:4-9.31 Pillutla, R. C. et al. (2002). Target validation and drug discovery using genomic and protein-protein interaction technologies. Target Validation and Drug Discovery. 6 (4): 517-531.32 Parsons, A. B. et al. (2003). Yeast genomics and proteomics in drug discovery and target validation. Progress in Cell Cycle Research. Vol 5. 159-166.33 Coates, P. J. & Hall, P. A. (2003). The yeast two-hybrid system for identifying protein-protein interactions. Journal of Pathology 199:4-9.16
  16. 16. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS3. Técnicas de validación de dianasA pesar de que las técnicas anteriormente estrategia de validación permite comprobar lamencionadas arrojan información relevante sobre existencia de modificaciones en el fenotipo dela función de las dianas, su objetivo principal organismos o células en ausencia de expresiónradica en la identificación a gran escala de nuevas del gen. De este modo, se consigue reproducir eldianas terapéuticas y no en la validación de las efecto que produciría la ausencia o inactivación demismas. A continuación se describen aquellas la proteína, lo que resulta de suma utilidad paratécnicas empleadas en etapas posteriores del validar dianas al permitir relacionar el fenotipoproceso de I+D, en las cuales es necesaria la asociado a la enfermedad con un gen envalidación de la función de las dianas moleculares concreto. Otras técnicas de validación de dianasya identificadas. Las principales estrategias están basadas en la modulación de la expresiónencaminadas a la modulación de la expresión permiten activar la expresión de genes específicosgénica, la inactivación de la función de las dianas provocando la transcripción de ARN a partir delproteicas, y el análisis de la expresión génica a ADN.gran escala. Por último, se describen las técnicasde desarrollo de modelos vivos de enfermedad. 3.1.1. Oligonucleótidos antisentido3.1. Modulación Los oligonucleótidos antisentido son pequeños de la expresión génica fragmentos de nucleótidos de unos 15 o 20 pares de bases de ADN o ARN de cadena sencilla, queLa técnicas de modulación de la expresión génica son complementarios a un fragmento del ARNpersiguen bloquear o activar de forma específica la diana. Esta complementariedad permite su unión alexpresión de genes mediante diferentes estrategias ARN de forma específica, bloqueando su expresióna nivel del ARN mensajero, a través del empleo de e impidiendo la producción de la proteína diana.oligonucleótidos modificados34. Estasmodificaciones les permiten conseguir una serie de Los oligonucleótidos antisentido inhiben lapropiedades entre las que se encuentran la entrada expresión proteica mediante dos mecanismosal interior de las células, la resistencia a la diferentes. En algunos casos el ARN emparejadodegradación y el aumento en la afinidad por la con el oligonucleótido es fragmentado por acciónmolécula de ARN. Las tecnologías antisentido se de una enzima que reconoce el ARN emparejadoemplean en validación de dianas sobre cultivos de con ADN. Tras este corte, el ARN queda dañado ytejidos o células, así como en modelos animales35. el oligonucleótido antisentido en cambio no sufre alteración alguna de modo que puede seguirLas técnicas de modulación de la expresión génica uniéndose al ARN. En otros casos no se producemás habituales consisten en el bloqueo de la un corte en el ARN, pero el emparejamiento conexpresión génica a nivel del ARN impidiendo que el oligonucleótido puede impedir procesosun gen concreto se exprese y por tanto esenciales para la producción de proteínas a partirconsiguiendo que la proteína no se sintetice. Esta del ARN36.34 Los oligonucleótidos son moléculas de ácido nucléico de longitud reducida que se pueden emplear para bloquear el ARN mensajero e impedir su función.35 Ilag, LL, et al. (2002). Emerging high-throughput drug target validation technologies. Drug Discovery Today 7(18 Suppl):S136-42.36 Stone, L. S. et Vulchanova, L. (2003). The pain of antisense: in vivo application of antisense oligonucleotides for functional genomics in pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews 55, 1081-1112. 17
  17. 17. Ribosomas Comienzo de la síntesis de proteínas ARNm Oligo antisentido Unión de un oligonucleótido antisentido Corte del ARNm por la enzima Ribonucleasa H Inhibición de la expresión de la proteínaFigura 8. Tecnologías de oligonucleótidos antisentido en validación de dianas.Fuente: Silencing code. Chemsoc, Royal Society of Chemistry (http://www.chemsoc.org/chembytes/ezine/1997/dna.htm).En general, el empleo de oligonucléotidos duración. Este problema se ha solucionadoantisentido es una herramienta de validación de mediante el empleo de estructuras de ADNdianas que proporciona una elevada especifidad. denominadas vectores de expresión, las cualesSin embargo, esta selectividad requiere como contienen la información necesaria para dirigir lacontrapartida el diseño detallado de oligonucleótidos síntesis de oligonucleótidos antisentido en elya que existen numerosas variables que afectan a interior de la célula. Estos vectores ofrecen lala especificidad de los oligos37. Otra desventaja que ventaja de ser más estables que losplantea el uso de los oligonucleótidos antisentido es oligonucleótidos antisentido desnudos, por lo queque son muy inestables y se degradan rápidamente se consigue una inhibición de la expresión génicaen células y tejidos. Esta limitación puede ser más prolongada39.atenuada mediante modificaciones químicas quemejoren su estabilidad. Asímismo, la administracióny distribución de oligonucleótidos a los cultivoscelulares constituye un paso limitante y 3.1.2. ARN de interferenciahabitualmente es necesario combinarlos concompuestos que facilitan la entrada de los El ARN de interferencia (ARNi) es una tecnologíaoligonucleótidos a las células, como los liposomas38. que se basa en el empleo de moléculas de ARN de doble cadena para bloquear la expresión deLa inhibición de la expresión génica mediante genes específicos. El mecanismo del ARNi estáoligonucleótidos antisentido es un proceso que presente en la naturaleza y es una respuestatiene lugar de manera transitoria, lo que supone celular innata que permite combatir lasuna limitación en el silenciamiento de la expresión infecciones virales regulando la expresiónde proteínas con una vida media de larga del ARN.37 Hall, J. (2004). Unravelling the general properties of siRNAs: strength in numbers and lessons form the past. Nature Reviews. Genetics 5: 552-557.38 Lee, L. K. et Roth, C. M. (2003). Antisense technology in molecular and cellular bioengineering. Current Opinion in Biotechnology. 14: 505-511.39 Dykxhoorn, D. M., et al. (2003). Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 4, 457–467.18
  18. 18. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICASEn los ensayos de validación de dianas, el ARNi ARNsi son reconocidos por el complejo RISCde doble cadena se introduce en el interior de las (“RNA-induced silencing complex”), el cual se unecélulas mediante distintos métodos. a moléculas de ARNm complementarias,Posteriormente, este ARNi de doble cadena es facilitando la degradación de éstas. Asimismo, esprocesado enzimáticamente dando lugar a posible administrar directamente el ARNsi a lamoléculas de ARN más pequeñas denominadas célula, en cuyo caso no sería necesaria ningunapequeños ARNs de interferencia o ARNsi (“small de las etapas anteriores. De este modo, tanto elinterfering RNAs”). Estos ARNsi son de doble ARNi como el ARNsi son herramientas útiles paracadena y están por tanto formados por dos la inactivación específica de la expresión dehebras complementarias y emparejadas. Los genes40. ARN de doble cadena ARNi de doble cadena Activación del complejo RISC por ARNi de cadena sencilla ARNm Reconocimiento de la diana Rotura del ARNmFigura 9. Tecnologías de ARNi en validación de dianas.Fuente: Dykxhoorn, D. M., et al. (2003). Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nature Reviews.Molecular Cell Biology. Vol. 4,457-467.Las principales ventajas de los ARNi radican en su El empleo de ARNi presenta básicamente losbajo coste y alta especificidad, por lo que mismos problemas que las tecnologías antisentidoconstituyen una herramienta molecular que está y se refieren principalmente a las dificultades desustituyendo a los oligonucleótidos antisentido administración y distribución en cultivos celularescomo método de modulación de la expresión y tejidos, viéndose agravada la situación engénica41. Por otro lado, el ARNi puede emplearse estudios in vivo. Estos problemas se hancomo herramienta para el estudio de la biología solucionado en parte mediante el empleo dede organismos completos a escala genómica vehículos de administración como liposomas, omediante microarrays de células transfectadas vectores de expresión como plásmidos y virus43.con ARNi. Esta estrategia ha sido empleada con Por otra parte, las técnicas de ARN interferenteéxito en líneas celulares procedentes de modelos pueden dar lugar a efectos inespecíficos debidos aanimales, siendo inminente su aplicación en la unión de alguna de las dos hebras del ARNsi acélulas humanas42. moléculas de ARNm distintas del ARN diana44.40 Wang, S., et al. (2004). Tools for target identification and validation. Current Opinion in Chemical Biology. 8: 371-377.41 Lindsay, M. A. (2003). Target discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. 2: 831-838.42 Gunsalus, K. C. & Piano, F. (2005). RNAi as a tool to study cell biology: building the genome-phenome bridge. Curr. Op. in Cell Biology 17:3-8.43 Cocks, B. G. & Theriault, T. P. (2004). Developments in effective applicaction of small inhibitory RNA (siRNA) technology in mammalian cells. DDT: Targets. Vol. 3(4):165-171.44 Lee, L. K. & Roth, C. M. (2003). Antisense technology in molecular and cellular bioengineering. Current Opinion in Biotechnology. 14: 505-511. 19
  19. 19. Como solución a este tipo de problemas se han diseñado moléculas de ARN interferente modificadasquímicamente que evitan la aparición de efectos no específicos45. Por otra parte, mientras que la tecnologíade ARNi ha sido aplicada con éxito in vitro en numerosas ocasiones en la validación de dianas terapéuticas,su empleo in vivo todavía no ha alcanzado el mismo grado de desarrollo.Otro tipo de mejoras que se están desarrollando en tecnologías de ARN interferente incluyen laadministración directa de ARNsi de cadena sencilla en células, que ha demostrado ser efectivo en muchostipos celulares aunque de forma transitoria. Para solucionar este problema se ha recurrido a los ARNsh(“short hairpin”), moléculas de ARN con secuencias repetidas invertidas que forman estructuras en formade horquilla, y que dan lugar a una inhibición mucho más estable de la expresión génica46. Similitudes y diferencias entre Oligonucleótidos antisentido y ARNsi47 Similitudes Diferencias • Fragmentos cortos de ácidos nucleicos • Dos hebras para el ARNsi, una hebra para (aprox. 20 bases). oligos antisentido. • Metodología común para la administración a • ARN de doble hebra es más estable que cultivos celulares. ácidos nucleicos de una sola hebra. • Inducen el silenciamiento de la expresión • Las modificaciones químicas no son tan génica mediante su unión al ARNm. necesarias para su administración en cultivos • Los ARNsi y ciertos oligos antisentido celulares en el caso de los ARNi. provocan la ruptura del ARNm. • Mediación del complejo RISC en el ARNi. • Sus propiedades pueden alterarse mediante • Activación de la enzima ARNasa en oligos modificación de las bases. antisentido. • Perfiles de biodistribución similares. • Aplicación más extendida de la técnica de ARNi.3.1.3. RibozimasLas ribozimas son pequeñas moléculas de ARN que actúan como enzimas y que pueden cortar otrasmoléculas de ARN en sitios específicos. La unión entre el ribozima y el ARN diana se produce porcomplementariedad y apareamiento entre ambas moléculas. De este modo, se pueden diseñar ribozimasque reconozcan cualquier ARN diana simplemente variando la región de reconocimiento del ribozima. ARNm RibozimaFigura 10. Ribozimas en la validación de dianas.Fuente: Chattterton, J. E. et al. (2004). Ribozymes in gene identification, target validation and drug discovery.DDT: Targets, Vol. 3(1):10-17.45 Samarsk, D. & Datta, M. (2003). Expediting target identification and validation through RNAi. Expert Rev. Mol. Diagn. 4(1):11-14.46 Walgren, J. L. & Thompson, D. C. (2004). Application of proteomic technologies in the drug development process. Toxicol Lett. 149:377-85.47 Paroo, Z. & Corey, D. R. (2004). Challenges for RNAi in vivo. Trends in Biotechnology. Vol. 22, No. 8: 390-394.20
  20. 20. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICASLas principales limitaciones de los ribozimas se bloqueo o activación de la expresión génica endeben a su inestabilidad y sensibilidad a la cultivos celulares. Los dedos de zinc son regionesdegradación, menor especificidad y restricciones presentes en proteínas tales como los factores deen el diseño. Los ribozimas pueden ser transcripción que participan en la iniciación de lamodificados químicamente para incrementar su transcripción, es decir, el paso de ADN a ARNestabilidad. Por otro lado, es posible introducir en previo a la síntesis de proteínas. Estos factores dela célula vectores que dirigen la síntesis de transcripción poseen unas estructurasribozimas de tal modo que dicha síntesis ocurra características en forma de dedos unidos por undirectamente en el interior de las mismas. En este ión de zinc, los cuales reconocen secuenciascaso, el nivel de producción de ribozima en la específicas del ADN. Esta particularidad es decélula será de suma importancia para que se gran utilidad en la validación de dianas ya que seproduzca una reducción significativa en el nivel de pueden diseñar proteínas con dedos de zinc queARN diana48. reconozcan específicamente la secuencia de ADN que se desea bloquear o activar. La activación o represión de la expresión génica se consigue mediante la unión de dominios activadores o3.1.4. Proteínas de dedos de zinc represores respectivamente a las proteínas de dedos de zinc. La asociación entre la modulaciónUna alternativa a las anteriores técnicas de de la expresión génica de la diana con el fenotipomodulación de la expresión génica es el diseño de o estado patógico, será la que determineproteínas de dedos de zinc como agentes de finalmente la validación de la diana49. Activación de la expresión génica ADN Bloqueo de la expresión génica Proteína de 3 dedos de Zinc ADNFigura 11. Modulación de la expresión génica mediante proteínas de dedos de Zinc.Fuente: Jamieson, A.C. et al. (2003). Drug discovery with engineered zinc-finger proteins. Nature Reviews: DrugDiscovery. Vol. 2: 361-368.48 Chatterton, J. E., et al. (2004). Ribozymes in gene identification and drug discovery. Drug Discovery Today: Targets, vol. 3, No. 1, 10-17.49 Jamieson, A. C., et al. (2004). Drug Discovery with Engineered Zinc-finger Proteins. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 2, 361-368. Wang, S., et al. (2004). Tools for target identification and validation. Current Opinion in Chemical Biology. 8: 371-377. 21
  21. 21. La principal ventaja de esta técnica frente al resto a la función de la proteína completa. Por estede técnicas de modulación de la expresión génica motivo, las técnicas basadas en la inactivación deconsiste en que es más estable que las proteínas son esenciales en la validación deestrategias que emplean ácidos nucleicos. Por numerosas dianas terapéuticas54.otro lado, el diseño de estas proteínas requiere laidentificación previa de las secuencias de ADN En el presente apartado se agrupan técnicas quesusceptibles de ser reconocidas por los dedos de permiten el bloqueo o inactivación de proteínaszinc, que se corresponden con regiones del específicas de modo que éstas dejan de ejercer sugenoma de baja condensación. Este mapeado se función. El efecto observado tras la inactivaciónrealiza mediante enzimas ADNasas, que de la proteína diana permite relacionar dichareconocen regiones del ADN con baja proteína con su función concreta, y de esta formacondensación y por tanto más accesibles a los resulta posible asociar un fenotipo determinado afactores de transcripción50. Otra limitación a tener una proteína concreta.en cuenta es la dificultad en la administración deproteínas de dedos de zinc, que afecta por igual atodas las tecnologías de modulación de la 3.2.1. Química genéticaexpresión génica mencionadas en el presenteinforme. Este problema se puede solucionar pormedio del empleo de vehículos moleculares La estrategia clásica de validación de dianas ollamados vectores que permitan introducir genes química genética consiste en el empleo deen las células . 51 pequeñas moléculas que se unen a las dianas de modo específico provocando su inactivación. De esta forma, se consigue inactivar la función de una proteína específica, lo que permite establecer3.2. Inactivación de proteínas una relación entre la actividad de la misma y los efectos que se manifiesten en los cultivos deDebido a que la mayoría de los fármacos que células, tejidos o animales55. A diferencia de lasactualmente se encuentran en el mercado actúan estrategias genéticas, la química genética permitesobre proteínas, parece lógico pensar que la la alteración del fenotipo de forma directa yvalidación de dianas proteicas ha de ser una ocurre en tiempo real. Esta modificación en laestrategia fundamental en el proceso de función proteica no es permanente, ya que sudesarrollo de un fármaco52. La validación de efecto es reversible si se eliminan los restos dedianas mediante técnicas de modulación de la estas moléculas del medio. Este enfoque resultaexpresión génica no siempre está relacionada de muy útil a la hora de validar dianas mediante elforma directa con la expresión de la proteína. En empleo de pequeñas moléculas, ya que permitenumerosas ocasiones, se ponen en marcha una asociar un fenotipo de interés con la acción deserie de mecanismos moleculares que modifican una determinada molécula sobre una dianala proteína hasta dar lugar a la molécula concreta56.responsable del fenotipo final, y que por tantoserían imposibles de identificar únicamente Además de permitir analizar la función celular ymediante tecnologías de modulación de la validar dianas moleculares, estas pequeñasexpresión génica53. Así mismo, algunas proteínas moléculas pueden emplearse como base paraestán formadas por varios dominios obtener potenciales fármacos. A partir delmultifuncionales, por lo que la inhibición de la conocimiento de la estructura química delexpresión de uno de los genes que codifica un compuesto activo, es posible diseñar nuevasúnico dominio no proporciona datos extrapolables moléculas de cara a su potencial aplicación50 Liu, P-G., et al. (2001). Regulation of an endogenous locus using a panel of designed zinc finger proteins targeted to accessible chromatin regions. Activation of vascular endothelial growth factor. J. Biol. Chem., 276:11323-11334.51 Peet, N. P. (2003). What constitutes target validation? Targets 2 (4): 125-127.52 Smith, M. B. (2003). Hitting the target. Nature, vol. 422, 341-347.53 Walgren, J. L. & Thompson, D. C. (2004). Application of proteomic technologies in the drug development process. Toxicol Lett. 149:377-85.54 Ilag, L. L., et al. (2002). Emerging high-throughput drug target validation technologies. DDT Vol. 7. Nº 18 (Suppl.) S136-142.55 Peet, N. P. (2003). What constitutes target validation? Targets. Vol. 2, No. 4: 125-127.56 Chanda, S. K., et al. (2003). Fulfilling the promise: drug discovery in the post-genomic era. Drug Discovery Today. Vol. 8, No. 4: 168-174.22
  22. 22. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICASfarmacéutica. Una de las principales limitaciones 3.2.2. Anticuerpos monoclonalesde esta estrategia consiste en que requiere ladisposición de pequeñas moléculas que sean Los anticuerpos son proteínas desarrolladas por elcapaces de interaccionar de modo selectivo con organismo con el fin de combatir infeccionesproteínas, lo que no es posible en todas las mediante el bloqueo de agentes infecciosos de formaocasiones57. específica. Esta selección y acción inhibitoria es de gran utilidad en la validación de dianas proteicas, porLas estrategias de química genética son de gran lo que se han desarrollado diferentes técnicas deutilidad en aquellos casos en los cuales los genes fabricación de anticuerpos monoclonales58 a grande interés son esenciales para la supervivencia escala como el “phage-display” y el doble híbrido59.del organismo, y su alteración es inviable para el En el caso de que las dianas se encuentren en elfuncionamiento de la célula. La principal limitación interior de la célula, es necesaria la administración dede esta técnica consiste en que no siempre se anticuerpos mediante microinyección, o bien ladispone de pequeñas moléculas que actúen de expresión de los mismos en el interior de la célulamodo específico sobre la proteína celular de mediante vectores de expresión, denominándose eninterés. este caso intracuerpos. Anticuerpo intracelular Proteína diana Interacción de la Proteína diana y el anticuerpo monocionalFigura 12. Inactivación de proteínas mediante anticuerpos, aplicación en la validación de dianas.Fuente: Iclectus Ltd. (http://www.iclectus.com/technology/intrabodies.htm#figure1).Una de las limitaciones de los anticuerpos es su El principal problema que presentan losinestabilidad en el interior de las células, por lo anticuerpos como agentes de validación de dianasque las estrategias que se están desarrollando en es el bajo número de estas moléculas que danla actualidad van encaminadas al diseño de lugar a una inactivación efectiva de sus dianasanticuerpos más estables y eficientes. proteicas60.57 Williams, M. (2003). Target validation. Curr Opin Pharmacol. 3(5): 571-7.58 Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos específicos que pueden ser producidos en grandes cantidades por células que se originan a partir de una línea celular (hibridoma). Todos los anticuerpos monoclonales producidos por una célula híbrida son idénticos.59 Pillutla, R. C., et al. (2002). Target Validation and drug discovery using genomic and protein-protein interaction technologies. Expert Opinion on Therapeutic Targets, 6 (4): 517.531.60 Ilag, L. L., et al. (2002). Emerging high throughput drug target validation technologies. Drug Discovery Today 7 (18): 136-142. 23
  23. 23. 3.2.3. AptómerosLos aptómeros son nucleótidos artificiales capaces de reconocer y unirse a moléculas específicas debido asu particular estructura terciaria. Es posible diseñar y construir aptómeros que unan e inhibanprácticamente cualquier proteína diana. Aptómero Proteína diana Interacción de la Proteína diana y aptómeroFigura 13. Inactivación de proteínas mediante Aptómeros, aplicación en la validación de dianas.Fuente: Archemix Corp. (http://www.archemix.com/tech_aptapp.html).Los aptómeros presentan problemas de aptómeros se consigue mediante la construccióninestabilidad que se han solucionado mediante de aptozimas, aptómeros conjugados conmodificaciones químicas que incrementan su dominios de ribozimas, o bien pares deestabilidad. Al igual que en el caso de los aptómeros que reconocen simultáneamente a laanticuerpos, una solución al problema de proteína diana. En el primer caso, la unión de laadministración consiste en el empleo de vectores aptozima a la diana provoca un cambiode expresión que permiten la síntesis de conformacional que altera la actividad de laaptómeros en el interior de la célula61. Otra de ribozima. En el segundo caso, la unión desus principales limitaciones reside en la aptómeros adyacentes a la diana crea un puentepreferencia de unión de los aptómeros hacia de oligonucleótidos que provoca el ligamiento delformas determinadas de la superficie de las nucleótido conector, que posteriormente esproteínas, lo que implica una limitación a la hora amplificado y detectado por PCR. Esta últimade validar dianas proteicas. Por otro lado, la estrategia ofrece una sensibilidad potencialmentenaturaleza negativa de las moléculas de ácidos superior al ELISA hasta 1.000 veces63.nucleicos que conforman los aptómeros suponeun impedimento a la hora de bloquear proteínascon dominios cargados negativamente62. 3.2.4. PéptidosLos aptómeros también pueden ser inmovilizadossobre microarrays de manera similar a los Los péptidos son fragmentos de proteínas quemicroarrays de ADN, con el objeto de ser pueden ser diseñados como agentes de unión aempleados en la validación de dianas proteicas. dianas proteicas bloqueando su función o bienLas ventajas de esta técnica radican en su alta inhibendo su interacción con proteínasespecificidad y sensibilidad. La detección de los intracelulares64.61 Epstein, D. M., et al. (2002). Target Validation with Nucleic Acid Aptamers. Mimicking small molecule therapeutics by attacking the protein, and not the gene. Pharmaceutical Discovery and Development. PharmaVentures Ltd.62 Ilag, L. L., et al. (2002). Emerging high throughput drug target validation technologies. Drug Discovery Today 7 (18): 136-142.63 Walgren, J. L. & Thomson, D. C. (2004). Application of proteomic technologies in the drug development process. Toxicology Letters 149: 377-385.64 Ilag, L. L., et al. (2002). Emerging high throughput drug target validation technologies. Drug Discovery Today 7 (18): 136-142.24
  24. 24. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICASLos péptidos presentan ciertas ventajas Al exponer estas moléculas a luz láser, se inducencomo agentes de validación de dianas daños fotoquímicos en la proteína diana de modoprincipalmente debido a su fácil producción. Por irreversible en las zonas de unión al anticuerpo,otro lado, existen diversos sistemas que permiten péptido o aptómero, inactivando la proteína deidentificar los péptidos que inhiben dianas modo específico68. Esta técnica de validación deconcretas, entre las que cabe destacar la técnica dianas ha demostrado ser eficaz en el caso de sudel doble híbrido y el phage display . 65 empleo con anticuerpos, ya que se aprovecha deLa principal limitación de los péptidos consiste en la selectividad de los anticuerpos y mejoraque presentan problemas de afinidad y sensiblemente su poder de inhibición de la funciónselectividad, por lo que no es una técnica que por de la proteína diana69.sí sola permita la validación de una dianaterapéutica66. Una alternativa a esta técnica consiste en la utilización de fluoróforos que reaccionan ante luz difusa y que por tanto no requieren fuentes de luz especiales. Esta técnica se denomina FALI70 o3.2.5. Inactivación por láser inactivación por láser mediante fluoróforos71. La mediante cromóforos principal ventaja de esta ténica radica en que y fluoróforos permite modificar un área más amplia de la proteína, asegurando una inactivación másLa técnica CALI67 o inactivación por láser efectiva de la proteína diana. Tras la inactivaciónmediante cromóforos, consiste en el empleo de de la diana es necesario purificar el complejocromóforos, moléculas que absorben la luz de una formado por el anticuerpo unido al cromóforo odeterminada longitud de onda, unidos a un fluorocromo junto con la proteína diana, yanticuerpo, péptido o aptómero. posteriormente identificar esta última72. Proteína Unión proteína-ligando Emisión Inactivación del dominio diana (anticuerpo, péptido de luz láser funcional de la proteína o aptómero) dianaFigura 14. Inactivación por láser mediante cromóforos y fluoróforos aplicado a la validación de dianas.Fuente: Hanash, S. (2003) Disease proteomics. Nature 422, 226-232.3.3. Análisis de la expresión génica in situLas técnicas de análisis de la expresión génica como los microarrays de ADN permiten la identificación degenes implicados en procesos patológicos. Sin embargo, la mayoría de los patrones de expresión obtenidosrequieren de pasos posteriores de validación que posibiliten realizar una asociación entre la expresión deun gen y su fenotipo. Las técnicas de análisis de la expresión génica mediante microarrays de tejidos ycélulas son dos técnicas empleadas en la validación clínica y funcional de dianas respectivamente.65 Caponigro, G., et al. (2003). Functional analisis of expressed peptides that bind yeast STE proteins. Journal of Biotechnology 103: 213-225.66 Henning, S. W. & Beste, G. (2002). Loss-of-function strategies in drug target validation. Current Drug Discovery May. 17-21.67 CALI: Chromophore assisted lasser inactivation.68 Peet, N.P. (2003). What constitutes target validation? Targets. Vol. 2, No. 4: 125-127.69 Henning, S. W. & Beste, G. (2002). Loss-of-function strategies in drug target validation. Current Drug Discovery May. 17-21.70 FALI: Fluorophore assisted lasser inactivation.71 Beck, S., et al. (2202). Fluorophore-assisted light inactivation: A high-throughput tool for direct target validation of proteins. Proteomics 2: 247-255.72 Ilag, LL. (2003). Direct methods for modulating protein function. Current Opinion in Drug Discovery & Development 6(2): 262-268. 25
  25. 25. 3.3.1. Microarrays de tejidos Las principales ventajas que ofrecen los microarrays de tejidos frente a otras técnicas deLos microarrays de tejidos (TMAs, Tisssue validación se basan en la naturaleza in vivo delMicroarrays) consisten en colecciones ensayo, que posibilita observar cambiosminiaturizadas de hasta 1.000 muestras de fenotípicos que no son obvios mediante técnicastejidos inmovilizadas sobre un soporte, que moleculares. En la actualidad, los principalespermiten el análisis in situ de dianas moleculares desarrollos encaminados a mejorar esta técnicasimultáneamente (ADN, ARN o proteínas). se centran en la mejora de la instrumentaciónPrácticamente la mayoría de los artículos dedicada a la inmovilización de los tejidos en elpublicados sobre microarrays de tejidos están array, automatización de la obtención derelacionados con el análisis de tumores, aunque imágenes digitalizadas, así como almacenamiento,se ha demostrado su valor en otro tipo de análisis y estandarización de la informaciónpatologías relacionadas en el sistema nervioso73. obtenida74. Características de los Microarrays de Tejidos en la validación de dianas: • Determinación de la distribución celular y subcelular de las dianas. • Integración de la información procedente del análisis de las dianas a nivel del ADN, ARN y proteínas. • Confirmación de los resultados obtenidos mediante técnicas de validación in vivo basadas en modelos animales y microarrays de ADNc. • Análisis de la prevalencia de dianas en diferentes etapas de progresión de la patología (ej.: progresión tumoral). • Correlación de los datos moleculares con los datos clínicos.3.3.2. Microarrays de células introducen en las células, que posteriormente expresan las proteínas codificadas por su secuencia.Hasta la fecha, el análisis in vivo de la expresión Los cambios fenotípicos que se observen en lasgénica se realizaba únicamente gen a gen, por células serán empleados para valorar la implicaciónmedio de la introducción de un gen en una célula, y de las dianas terapéuticas de interés76.la posterior observación de su efecto fisiológico ofenotipo. Los microarrays de células permiten el Una estrategia alternativa consiste en transfectaranálisis de la expresión génica in vivo a gran escala las células inmovilizadas en el array con ARNen células humanas, y por tanto son una interferente, de modo que en vez de activarse laherramienta valiosa a la hora de validar dianas expresión de un gen, se produzca el 75terapéuticas . La estrategia empleada para su silenciamiento del mismo. Este bloqueo de ladiseño consiste en el cultivo de células sobre expresión génica define un conjunto de puntos enfragmentos de ADN inmovilizados en un microarray. el array que se corresponderán con la expresiónEstos fragmentos de ADN se transfectan o del fenotipo esperado77.73 Sauter, G., et al. (2003).Tissue microarrays in drug discovery. Nature Review: Drug discovery 2: 962-972.74 Mousses, S., et al. (2001). Clinical and functional target validation using tissue and cell microarrays. Curr. Op. in Chem. Biology, 6: 97-101.75 Wang, S., et al. (2004). Tools for target identification and validation. Curr. Op. in Chem. Biol. 8: 371-377.76 Mousses, S., et al. (2001). Clinical and functional target validation using tissue and cell microarrays. Curr. Op. in Chem. Biology, 6: 97-101. Ziauddin, J. & Sabatini, D. M. (2001). Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature 411:107-110.77 Silva, J. M., et al. (2004). RNA interference microarrays: High-throughput loss-of-function genetics in mammalian cells. PNAS 101, nº 17: 548-6552.26
  26. 26. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE DIANAS TERAPÉUTICAS Microarrays de Tejidos Microarrays de Células b c a a b Inmovilización de Transfección de las d células en un células con múltiples Microarray de ADNc genes de interés c Inmovilización de secciones de tejidos en un array e Visualización de la expresión de los genes en las células in vivoFigura 15. Esquema de funcionamiento de un microarray de tejidos aplicado a la validación de dianas.Fuente: Sauter, G., et al. (2003). Tissue microarrays in drug discovery. Nature Reviews. Drug discovery 2: 962-972;Ziauddin, J. & Sabatini, D. M. (2001). Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature 411: 107-110.3.4. Modelos vivos de la enfermedadEl avance en el conocimiento del genoma de diferentes organismos que se ha producido a lo largo de losúltimos años ha puesto de manifiesto la existencia de un alto grado de conservación de la secuencia delADN y proteínas, así como una similitud en la función de los genes y rutas de señalización en diferentesorganismos. Este elevado grado de conservación permite el empleo de otros organismos diferentes del serhumano como sistemas modelo en el proceso de desarrollo de fármacos. De hecho, se ha descubierto queexiste un elevado grado de similitud con las rutas moleculares implicadas en enfermedades humanas, loque hace que el valor de los organismos modelo en la validación de dianas sea mayor78. Vertebrados Ratón Pez cebra Mosca de la fruta Invertebrados C. elegans Unicelulares LevaduraFigura 16. Principales sistemas modelo en validación de dianas.Fuente: Lindsay, M. A. (2003). Target discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. 2: 831-838.78 Doan, T. N. (2004). High-throughput target validation in model organisms. Drug Discovery Today: Targets. Vol. 3, Nº 5: 191-197. 27

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