Biotecnologìa y mejoramiento vegetal ii levitus, echenique, hopp

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Biotecnologìa y mejoramiento vegetal ii levitus, echenique, hopp

  1. 1. AuspiciosArgenBio es el Consejo Argentino para la Información y Desarrollo de laBiotecnología. Es una organización sin fines de lucro que tiene como misión divulgar Biotecnologíainformación sobre la biotecnología, contribuyendo a su comprensión a través de laeducación y estimulando su desarrollo. y Mejoramiento Vegetal IIConsideramos prioritario el apoyo a iniciativas relacionadas con la biotecnología ydirigidas a la comunidad educativa de todos los niveles. En este sentido, este libro Editores:cubre una necesidad importante ya que aporta información completa y actualizada Gabriela Levitus, Viviana Echenique,sobre las tecnologías de laboratorio que se aplican al mejoramiento vegetal, escrita Clara Rubinstein, Esteban Hopp y Luis Mroginskipor especialistas y en idioma español.Confiamos en que tanto estudiantes con profesionales encontrarán en este libro unaexcelente fuente de información. Consejo Argentino para la InformaciónPara conocer más sobre ArgenBio, visitar www.argenbio.org y el Desarrollo de la Biotecnología Ediciones Instituto Nacional de INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA ARGENBIO - Consejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología Tecnología Agropecuaria
  2. 2. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II Editores: Dra. Gabriela Levitus, Dra. Viviana Echenique, Dra. Clara Rubinstein, Dr. Esteban Hopp Ing. Agr. Luis Mroginski. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 1
  3. 3. 2 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  4. 4. ÍndicePrefacio ............................................................................................................................... 6Agradecimientos ................................................................................................................ 7Lista de Autores .................................................................................................................. 7Prólogo a la Primera Edición. Dr. Francisco García Olmedo ............................................. 11Prólogo a la Segunda Edición. Dr. Francisco García Olmedo ........................................... 11Parte I: Herramientas Básicas ........................................................................................... 15Capítulo 1: Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. Luis Mroginski, Pedro Sansberroy Eduardo Flaschland ………………………………………………………………………………………. 17Capítulo 2: Morfogénesis. Silvia Radice .………………………………………………….………………. 26Capítulo 3: La citogenética molecular e inmunocitogenética en el estudio de los genomas ve-getales. Guillermo Seijo, Graciela I. Lavia, Germán Robledo, Aveliano Fernández y Viviana G. SolísNeffa. .................................................................................................................................................. 34Capítulo 4: Herramientas básicas de ingeniería genética. Ingrid Garbus, Marisa Gómez y Vi-viana Echenique. ................................................................................................................................ 47Capítulo 5: Marcadores moleculares. María Carolina Martínez, Marcelo Helguera y Alicia Carrera. 70Capítulo 6: Construcción de mapas de ligamiento genético, localización de genes y regionescromosómicas asociadas a caracteres de interés en plantas. Gerardo D. L. Cervigni, Juan Pa-blo A. Ortiz y Sergio E. Feingold. ......................................................................................................... 86Capítulo 7: Genómica. Viviana Echenique, Juan P. Selva, Mauro Meier, Pablo Roncallo y GustavoSchrauf. .............................................................................................................................................. 100Capítulo 8: Transcriptómica. Silvina Pessino y Silvina Felitti. .......................................................... 121Capítulo 9: Proteómica. Paula Casati y María F. Drincovich ............................................................. 136Capítulo 10: Metabolómica. Fernando Carrari, Telma E. Scarpeci, Luciano A. Abriata, Alejandro J.Vila y Estela M. Valle. ......................................................................................................................... 146Capítulo 11: Metagenómica. O. Mario Aguilar y Daniel H. Grasso. ................................................... 157Capítulo 12: Bioinformática aplicada a la biotecnología vegetal. Norma Paniego, Ruth Heinz,Paula Fernández, Verónica Lia, Corina Fusari. ................................................................................... 170Parte II: Métodos para generar y analizar diversidad 183Capítulo 1: Polinización y fertilización in vitro. Susana Cardone, Gladys Pérez Camargo y AuroraPicca. .................................................................................................................................................. 185Capítulo 2: Hibridación somática. Pablo Polci y Pablo Friedrich. .................................................... 197 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 3
  5. 5. Capítulo 3: Epigenética y evolución. Ricardo W. Masuelli y Carlos F. Marfil .................................. 211Capítulo 4. Mutagénesis, TILLING y EcoTILLING. Alberto Prina, Alejandra Landau, María GabrielaPacheco y Esteban Hopp ................................................................................................................... 217Capítulo 5: Variación somaclonal. Susana Cardone, Sofía Olmos y Viviana Echenique. ............... 229Capítulo 6: Aplicación de la transformación genética al mejoramiento vegetal. Marina L. Díaz,Diego C. Zappacosta, Pascual M. Franzone y Raúl D. Ríos ............................................................... 243Capítulo 7: Usos del silenciamiento génico para el análisis funcional de genes candidatos.Cecilia Vázquez Rovere, Ariel Bazzini, Cecilia Rodríguez, Natalia Almasia y Sebastián Asurmendi .. 259Capítulo 8: Análisis de experimentos biológicos. Sofía Olmos, Miguel DiRenzo, Mercedes Ibá-ñez, Nélida Winzer .............................................................................................................................. 271Capítulo 9: Métodos multivariados para estimar variabilidad genética. Nélida Winzer, MiguelDiRenzo, Sofía Olmos y Mercedes Ibáñez. ......................................................................................... 283Parte III: Métodos para acelerar programas de mejoramiento e identificación varietal 295Capítulo 1: Obtención de plantas doblehaploides. Pablo Polci, Verónica Conti y Rubén Miranday Nicolás Gear. .................................................................................................................................... 297Capítulo 2: Aplicaciones de los marcadores moleculares. Alicia Carrera, Gabriela Tranquilli, An-tonio Garayalde y Marcelo Helguera. .................................................................................................. 311Capítulo 3: Marcadores moleculares y mejoramiento genético de cultivos. Carlos Sala, Maria-no Bulos, Analía Fresco y Emiliano Altieri. .......................................................................................... 325Capítulo 4: Identificación y registro de variedades. Ana Laura Vicario, Marcelo Labarta y MaríaAlicia Loray ......................................................................................................................................... 339Parte IV: Métodos de propagación y conservación de germoplasma 351Capítulo 1: Micropropagación. Sofía Olmos, Gabriela Luciani y Ernestina Galdeano .................... 353Capítulo 2: Semilla sintética. Hebe Rey y Luis Mroginski ................................................................. 363Capítulo 3: Conservación de germoplasma in vitro. Adriana Scocchi y Hebe Rey. ....................... 369Parte V: Ejemplos de aplicaciones de la biotecnología vegetal 377 Capítulo 1: Aportes de la citogenética al estudio de genomas vegetales. Lidia Poggio, Gra-ciela González, María Rosa Ferrari, Ana María García, Arturo Wulff, Eduardo Greizerstein, PabloTomas y Gustavo Schrauf. .................................................................................................................. 379Capítulo 2: Mejoramiento de plantas forrajeras en la era genómica. Germán Spangenberg,Mauro Meier y Viviana Echenique ....................................................................................................... 389 Capítulo 3: Caracterización molecular de la apomixis y su aplicación en la agricultura. Silvi-na C. Pessino y Juan Pablo A. Ortiz .................................................................................................... 403Capítulo 4: Avances de la biotecnología en cultivos ornamentales. Alejandro S. Escandón, Pa-blo A. Marinangeli y Mariana Pérez de la Torre. .................................................................................. 4214 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  6. 6. Capítulo 5: Aplicación de la biotecnología en la mejora y conservación de especies forestales.Susana Marcucci Poltri, Leonardo Gallo, Noga Zelener, Susana Torales, Sandra Sharry .................... 435Capítulo 6: Técnicas de ingeniería genética para conferir resistencia a virus en plantas. Maria-na del Vas, Ana Julia Distéfano, Cecilia Vázquez-Rovere, Esteban H. Hopp. ..................................... 447Capítulo 7: Obtención de plantas resistentes a enfermedades bacterianas. Adrián Vojnov, Mer-cedes Rivero y Diego Zappacosta ....................................................................................................... 457Capítulo 8: Aproximaciones biotecnológicas para un manejo sustentable del estrés fúngicoen la agricultura. Juan Carlos Díaz Ricci; Ursula Tonello; Gustavo Martínez-Zamora; Sergio Sala-zar; Nadia Chalfoun; Gabriel Vellicce; Carlos Grellet; Paula Filippone; Alicia Mamani; Marta Ontiveroy Atilio Pedro Castagnaro. ................................................................................................................... 467Capítulo 9: Utilización de cultivos de tejidos para la obtención y conservación de plantas li-bres de enfermedades. Vilma Conci. ................................................................................................ 481Capítulo 10: Obtención de plantas resistentes a insectos. Dalia Lewi y Clara Rubinstein ............... 495Capítulo 11: Aplicaciones biotecnológicas al manejo de malezas. Germán Ferrari y Julio E. De-lucchi. .................................................................................................................................................. 507Capítulo 12: Obtención de plantas tolerantes a distintos tipos de estreses abióticos. Florenciadel Viso, Andrea F. Puebla, Néstor Carrillo y Raquel L. Chan ............................................................. 519Capítulo 13: Manipulación genética del metabolismo secundario en plantas. Alicia Zelada, Ma-ría Binaghi ........................................................................................................................................... 529Capítulo 14: Mejoras de calidad en alimentos. Clara Rubinstein, Gabriela Levitus ............................. 539Capítulo 15: Fitorremediación. María Eugenia Segretín, Paula Bey y Alejandro Mentaberry ............. 545Capítulo 16: Plantas como biorreactores. Fernando Bravo Almonacid, Sonia Wirth, María EugeniaSegretin, Mauro Morgenfeld, Ezequiel Matías Lentz. ......................................................................... 559Parte VI: Manejo responsable de la tecnología 569Capítulo 1: Criterios científicos para la evaluación de la bioseguridad de Organismos Genéti-camente Modificados. Clara Rubinstein ........................................................................................... 571Capítulo 2: Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados - Marcos Regulatorios.Moisés Burachik .................................................................................................................................. 583Capítulo 3: Flujo génico y su posible impacto ambiental. Mónica Poverene, Soledad Ureta yAgustina Gutiérrez. ............................................................................................................................. 595Capítulo 4: Detección de OGM en la cadena agroalimentaria. Florencia Longo y Ana Vicario. ....... 603Capítulo 5: Manejo integrado de plagas – Programa de Refugios. Viviana Confalonieri y CeciliaRoca. ................................................................................................................................................... 613Capítulo 6: Resistencia de malezas a herbicidas: evolución y estrategias de manejo. DanielTuesca, Luisa Nisensohn, Mario R. Sabbatini, Guillermo Chantre. ..................................................... 621Parte VII: Biotecnología y sociedad 631Capítulo 1: La transformación tecnológica y los nuevos desafíos. Carmen Vicién. .......................... 633 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 5
  7. 7. Capítulo 2: Adopción de los cultivos genéticamente modificados en Argentina y en el mun-do. Gabriela Levitus ......................................................................................................................... 639Capítulo 3: Biotecnología en la mira: el problema de la percepción. Valeria Durand ............... 6436 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  8. 8. PREFACIO En oportunidad de la Primera Edición de “Biotecnología y Mejoramiento Vegetal”, nos habíamospropuesto responder a la necesidad de un texto en idioma español, dirigido a docentes y estudian-tes de los cursos de Agronomía y de otras formaciones relacionadas con las tecnologías aplicadasal mejoramiento vegetal, así como brindar un recurso de información general y consulta para noespecialistas. Esta Segunda Edición, intenta actualizar, profundizar y extender estas temáticas,atendiendo a la rápida evolución en este campo del conocimiento. En el contexto de los principios básicos del mejoramiento, es decir, generar variabilidad genéti-ca y seleccionar características deseables, las tecnologías evolucionan rápidamente y, del mismomodo, se acelera la transferencia del conocimiento básico a las aplicaciones. Esta edición intentareflejar este proceso dinámico y aportar información actualizada con ejemplos de aplicaciones almejoramiento de diferentes especies vegetales. En este trabajo se han reunido las contribuciones de investigadores y especialistas en diferentescampos relacionados con el mejoramiento. En las secciones dedicadas a las herramientas básicas,se ha hecho foco en las técnicas de cultivo de tejidos y micropropagación que se utilizan en sí mis-mas para generar variabilidad, conservar germoplasma, producir clones libres de enfermedades ocomo paso obligado en la construcción de plantas transgénicas. En la sección que se ocupa de lasaplicaciones de estas técnicas a casos específicos, se brindan ejemplos de mejoramiento logradoen diferentes especies. La tecnologías “omicas” (genómica, transcriptómica, metabolómica) constituyen una de las herra-mientas más importantes en el mejoramiento, por la potencialidad que presentan, tanto en el campode la investigación básica, en el mapeo de genes y la identificación de marcadores moleculares,como en la identificación de funciones y redes regulatorias que influyen en las características que sedesean mejorar: resistencia a enfermedades y plagas, rendimiento, calidad nutricional y respuestasa diferentes tipos de estrés ambiental, entre otras. Es claro que dentro de las tecnologías de mejoramiento, la transgénesis o transformación ge-nética es una de las herramientas más versátiles y poderosas, ya que permite resolver problemasque por vía del mejoramiento convencional no sería posible enfrentar. En esta edición se presentannumerosos ejemplos de transgénesis para la obtención de cultivos tolerantes a estrés biótico yabiótico, a plagas y enfermedades o con mejoras en su calidad nutricional. Desde 1996, cuando se cultivaron por primera vez, la superficie mundial de cultivos transgénicosaumentó 80 veces, alcanzando las 134 millones de hectáreas en 2009. Según el último informe delISAAA (Servicio Internacional para las Adquisiciones Agrobiotecnológicas) estas hectáreas fueroncultivadas por 14 millones de agricultores de 25 países, siendo Argentina uno de los líderes enadopción, con el 16% del área global. Por otro lado, es importante notar que se han establecido sistemas de control a nivel internacionalpara regular el desarrollo y la aplicación de la ingeniería genética al mejoramiento de organismosvivos (conocidos como organismos genéticamente modificados u OGMs). Si bien éstos no se limitana plantas, en este trabajo se presentan sólo los aspectos regulatorios y de bioseguridad relaciona-dos con los cultivos transgénicos. Esperamos que esta nueva edición constituya una herramienta útil y accesible para docentes,estudiantes y profesionales que se dedican y se dedicarán a la noble tarea de mejorar la agricultura. Los Editores Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 7
  9. 9. AGRADECIMIENTOSA todos y cada uno de los 141 autores, en su mayoría investigadores y profesionales de institu-ciones argentinas, que han contribuido con sus aportes.Al Dr. Francisco García Olmedo, reconocido investigador y catedrático español, por regalarnostambién el prólogo de esta segunda edición.Al Consejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología (ArgenBio), por aus-piciar la publicación del libro.A los revisores, colegas y personal de apoyo, por sus valiosas contribuciones para concretar esteproyecto. Los EditoresEl uso de fuentes y nombres comerciales en este documento es sólo para fines de identificacióny no implica ningún aval ni recomendación. Además, los contenidos u opiniones expresadas enesta publicación son de exclusiva responsabilidad de los autores.LISTAS DE AUTORES (por orden alfabético)Abriata Luciano A. Instituto de Biotecnología, INTA CastelarAguilar O. Mario IBBM, Facultad de Ciencias Exactas, UNLPAlmasia Natalia Instituto de Biotecnología, INTA CastelarAltieri Emiliano Nidera SemillasAsurmendi Sebastián Instituto de Biotecnología, INTA CastelarBazzini Ariel Instituto de Biotecnología, INTA CastelarBey Paula INGEBI, CONICETBinaghi María Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBABravo Almonacid Fernando INGEBI, CONICETBulos Mariano Nidera SemillasBurachik Moisés Dir. de Biotecnología, Min. de Agricultura, Ganadería y PescaCardone Susana Facultad de Agronomía, UBACarrari Fernando Instituto de Biotecnología, INTA CastelarCarrera Alicia Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurCarrillo Néstor IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNRCasati Paula CEFOBI, Universidad Nacional de RosarioCastagnaro Atilio Pedro EEAOC, TucumánCervigni Gerardo D. CEFOBI, Universidad Nacional de RosarioChalfoun Nadia INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánChan Raquel L. Universidad Nacional del LitoralChantre Guillermo CERZOS, CONICET, Universidad del SurConci Vilma INTA – IFFIVEConfalonieri Viviana Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA)Conti Verónica INTA-EEA Bordenavedel Vas Mariana Instituto de Biotecnología, INTA Castelardel Viso Florencia Instituto de Biotecnología, INTA CastelarDelucchi Julio E. Monsanto Argentina8 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  10. 10. Díaz Marina L. CERZOS, CONICET, Universidad del SurDíaz Ricci Juan Carlos INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánDiRienzo Miguel Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de CórdobaDistéfano Ana Julia Instituto de Biotecnología, INTA CastelarDrincovich María F. CEFOBI, Universidad Nacional de RosarioDurand Valeria Ketchum Argentina - ArgenBioEchenique Viviana Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurEscandón Alejandro S. Instituto de Floricultura, INTA CastelarFeingold Sergio E. INTA - EEA BalcarceFelitti Silvina Universidad Nacional de RosarioFernández Aveliano Fac. Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE IBONEFernández Paula Instituto de Biotecnología, INTA CastelarFerrari Germán Monsanto ArgentinaFerrari María Rosa Universidad Nacional de Buenos AiresFilippone Paula EEAOC, TucumánFlaschland Eduardo Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) – IBONEFranzone Pascual M. IGEAF INTA CastelarFresco Analía Nidera SemillasFriedrich Pablo Universidad Nacional del SurFusari Corina Instituto de Biotecnología, INTA CastelarGaldeano Ernestina Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) – IBONEGallo Leonardo INTA - EEA BarilocheGarayalde Antonio CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurGarbus Ingrid CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurGarcía Ana María Facultad de Agronomía, UBAGarcía Olmedo Francisco Universidad Politécnica de MadridGear Nicolás SyngentaGómez Marisa CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurGonzález Graciela Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAGrasso Daniel H. Instituto de Suelos, INTA CastelarGreizerstein Eduardo Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBAGrellet Carlos INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánGutiérrez Agustina Universidad Nacional del SurHeinz Ruth Instituto de Biotecnología, INTA CastelarHelguera Marcelo INTA EEA Marcos JuárezHopp Esteban Instituto de Biotecnología, INTA CastelarIbáñez Mercedes Universidad Nacional de Río CuartoLabarta Marcelo Instituto Nacional de Semillas – INASELandau Alejandra Instituto de Biotecnología, INTA CastelarLavia Graciela I. Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONELentz Ezequiel M. INGEBI, CONICETLevitus Gabriela ArgenBioLewi Dalia IGEAF INTA CastelarLia Verónica Instituto de Biotecnología, INTA CastelarLongo Florencia Instituto de Biotecnología, INTA CastelarLoray María Alicia Dirección de Calidad - INASELuciani Gabriela CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurMamani Alicia INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánMarcucci Poltri Susana Instituto de Biotecnología, INTA CastelarMarfil Carlos F. INTA - EEA MendozaMarinangeli Pablo A. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurMartínez Ma. Carolina Instituto de Biotecnología, INTA Castelar Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 9
  11. 11. Martínez-Zamora Gustavo INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánMasuelli Ricardo W. INTA - EEA MendozaMeier Mauro CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurMentaberry Alejandro Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAMiranda Rubén Asociación Cooperativas Argentinas (ACA), Univ. del SurMorgenfeld Mauro INGEBI, CONICETMroginski Luis Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) – IBONENisensohn Luisa Universidad Nacional de RosarioOlmos Sofía Laboratorio de Biotecnología, INTA PergaminoOntivero Marta INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánOrtiz Juan Pablo Facultad de Ciencias Agrarias, UNRPacheco Ma. Gabriela IGEAF INTA CastelarPaniego Norma Instituto de Biotecnología, INTA CastelarPérez Camargo Gladys Facultad de Agronomía, UBAPérez de la Torre Mariana Instituto de Floricultura, INTA CastelarPessino Silvina C. Facultad de Ciencias Agrarias, UNRPicca Aurora Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurPoggio Lidia Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAPolci Pablo Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurPoverene Mónica Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurPrina Alberto IGEAF INTA CastelarPuebla Andrea F. Instituto de Biotecnología, INTA Castelar Radice Silvia INTA CastelarRey Hebe Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONERíos Raúl D. IGEAF INTA CastelarRivero Mercedes Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBARobledo Germán Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONERoca Cecilia Dow AgrosciencesRodríguez Cecilia Instituto de Biotecnología, INTA CastelarRoncallo Pablo CERZOS, CONICETRubinstein Clara Monsanto Argentina – ILSISabbatini Mario R. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurSala Carlos Nidera SemillasSalazar Sergio INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánSansberro Pedro Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONEScarpeci Telma E. IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNRSchrauf Gustavo Facultad de Agronomía, UBAScocchi Adriana Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONESegretin Ma. Eugenia INGEBI, CONICETSeijo Guillermo Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONESelva Juan P. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurSharry Sandra Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de La PlataSolís Neffa Viviana G. Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) – IBONESpangenberg Germán Victorian Department of Primary Industries (DPI)Tomas Pablo FCA, Universidad Nacional del LitoralTonello Ursula INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánTorales Susana IRB, INTA CastelarTranquilli Gabriela IRB, INTA CastelarTuesca Daniel Facultad de Ciencias Agrarias, UNRUreta Soledad CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurValle Estela M. IBR - Facultad de Cs Bioquímicas y Farmaceuticas, UNRVázquez Rovere Cecilia Instituto de Biotecnología, INTA Castelar10 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  12. 12. Vellicce Gabriel EEAOC, TucumánVicario Ana Laura Dirección de Calidad – INASEVicién Carmen Facultad de Agronomía, UBAVila Alejandro J. IBR - Facultad de Cs Bioquímicas y Farmaceuticas, UNRVojnov Adrián Fundación Pablo CassaráWinzer Nélida Universidad Nacional del SurWirth Sonia INGEBI, CONICETWulff Arturo Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAZappacosta Diego C. Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurZelada Alicia Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAZelener Noga IRB, INTA CastelarPRÓLOGOSPrólogo a la primera edición Recientemente, un periodista, que compartía una ensalada con un biólogo, exclamó: ¡Si yosólo aspiro a que la lechuga que yo tenga que consumir no tenga genes! Cuando el biólogo leexplicó que al comer ésta no había más opción que engullir unos 25.000 genes del genoma deLactuca sativa y varios miles de genes adicionales correspondientes a los genomas de los mi-croorganismos que habitual y cómodamente habitan en la superficie de las turgentes hojas, elperiodista quedó atónito. Según un eurobarómetro de hace unos meses, más de dos tercios de los europeos estaban encontra de los alimentos transgénicos. Sin embargo, en la misma encuesta se incluía una aseve-ración - los tomates normales no tienen genes, los transgénicos sí - frente a la que también másde dos tercios de los encuestados se mostraban de acuerdo o confesaban su ignorancia. Es unalástima que dicho eurobarómetro no registrara la proporción correspondiente al encabezamiento“no saben, pero sí contestan”, aunque es fácil colegir que dicha fracción era alta y en extremovergonzante. Los avances del conocimiento biológico y de la biotecnología destacan en el panorama cien-tífico-técnico de este fin de siglo y han impregnado las más diversas vertientes de nuestra vidacotidiana sin que se haya aceptado que un mínimo de estos conocimientos debería formar parteintegral de la cultura general. La ignorancia de los hechos básicos relativos a nuestra herenciagenética o a nuestra alimentación se considera incluso de buen tono. Esto se refleja de entradaen el caos semántico que se ha creado en torno a la biotecnología, del que hay que culpar nosólo a la ignorancia del ciudadano sino también a la torpeza de los científicos y a la dictadura delos medios de comunicación. Es preciso despejar este caos si queremos entendernos a partir dela ciencia, y no a sus espaldas. Términos tales como organismos genéticamente modificados (OGMs), alimentos transgéni-cos, ingeniería genética, ADN recombinante, transferencia génica, clonación, alimentos natura-les, mejora genética e, incluso, biotecnología, han invadido nuestro lenguaje cotidiano sin ordenni concierto. A estas alturas empieza a ser difícil normalizar la situación, pero tratemos de con-tribuir a ello. La definición de biotecnología abarca a todas las tecnologías mediadas por un ser vivo o porpartes de él, sean éstas células o enzimas aisladas. Bajo esta definición se incluyen desde lapropia agricultura, inventada hace diez milenios, y la fabricación de las veinticuatro clases decerveza mesopotámica, que tanto gustaban a Nabucodonosor, hasta la última forma de producir Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 11
  13. 13. insulina humana. No es apropiado, por tanto, usar el término de forma restringida para referirseexclusivamente a los últimos avances basados en la biología molecular. Para esto último resultamás adecuado el uso de la expresión “biotecnología molecular”. Prácticamente la totalidad de lo que ponemos en nuestra mesa ha sido genéticamente modifi-cado. La domesticación de plantas y animales supuso una alteración muy drástica de sus geno-mas y la mejora genética subsiguiente ha ido añadiendo modificaciones extensas y sustanciales.Lo importante es la naturaleza de los cambios introducidos y no los métodos empleados paraello. De hecho, la ingeniería genética es sólo uno de esos métodos - una modalidad más de me-jora genética - y sólo sirve para modificar uno o pocos genes de forma muy selectiva. No serviríapara obtener razas de perro tan distintas - en su tamaño, morfología y temperamento - como elChihuahua y el Pit Bull Terrier, que en cambio han surgido de la mano del hombre gracias a losmétodos genéticos más tradicionales. En consecuencia, resulta absurdo denominar OGMs sóloa los productos de la ingeniería genética para contraponerlos a los supuestamente “naturales”. Casi nada de lo que ponemos en nuestra mesa es natural, hasta el punto que la mayoría delos organismos de los que derivamos nuestro alimento han perdido su capacidad de sobrevivirpor sí mismos en la naturaleza. Es más, para llegar a nuestra mesa han debido sufrir alteracionesgenéticas que les priven de infinidad de sustancias naturales que son tóxicas o inhibitorias parael ser humano. Una variedad moderna, modificada por ingeniería genética, está tan lejos de sernatural como las que la precedieron. ¡Por fortuna! Ya que es obvio que natural no es sinónimode inocuo. Se consideran organismos transgénicos aquellos cuyo genoma ha sido alterado por ingenieríagenética o, si se prefiere, por sastrería genética, ya que las operaciones fundamentales de estavía experimental consisten en cortar y coser (unir) piezas de ADN. Un gen es un tramo de ADN(una secuencia construida con las bases A, T, G, C) que, en general, determina una proteína (unasecuencia de aminoácidos), de acuerdo con las equivalencias plasmadas en la clave genética.Mediante la nueva tecnología se puede alterar un genoma por la adición de uno o varios (pocos)genes que previamente no formaban parte de él o por la inutilización de uno o varios genes entrelos ya existentes. Estas operaciones se hacen para conferir caracteres deseables y para eliminarcaracteres indeseables del organismo, respectivamente, objetivos que no difieren de los de lamejora genética tradicional. En lo que difieren la vieja y la nueva tecnología es en el repertorio génico que se puede mane-jar - genes de la misma especie, en el caso de la vieja, y de cualquier especie, en el de la nue-va - y en el modo de introducir y transferir la modificación genética, por vía sexual o por adiciónexógena (transformación), respectivamente. Los organismos modificados por transformación sesuelen denominar transgénicos. Llamar transgénicos a los alimentos derivados de dichos orga-nismos resulta menos apropiado porque, como dice el refrán, “degradado es todo gen que entrapor boca de cristiano”. Es absurdo llamar transgénico al azúcar procedente de una remolachatransgénica, ya que es un producto químico puro, esencialmente indistinguible del aislado de laremolacha normal o de la caña de azúcar. Con acertado criterio, los editores de esta obra han adoptado un tratamiento integral de todoslos métodos, objetivos y logros de la alteración genética de las plantas con fines prácticos. Faltanen nuestro idioma obras que acerquen con rigor a una parte tan importante de nuestra culturageneral. Las adaptaciones a los nuevos avances de textos preexistentes, hechas a menudo porun único autor, suelen adolecer de falta de familiaridad con la nueva tecnología. De aquí que laaproximación adoptada en esta obra, según la cual cada capítulo está a cargo de verdaderosespecialistas, sea la más apropiada en la actualidad. Dr. Francisco García Olmedo, 200412 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  14. 14. Prólogo a la segunda edición La buena fortuna de un libro lleva aparejada la esclavitud de su autor o autores, que quedanencadenados a la necesidad de mantenerlo vivo en sucesivas ediciones. Estamos ante la segundaedición de “Biotecnología y Mejoramiento Vegetal”, un texto que, hace seis años, supuso una es-pléndida y afortunada aportación a la recensión de un área tecno-científica en vigorosa ebullición yde gran relevancia práctica. La necesidad de esta edición surge de múltiples circunstancias, entrelas que cabe resaltar el enorme avance del conocimiento que ha tenido lugar, la redefinición delos retos entonces planteados y la aparición de otros nuevos que han diversificado los objetivosprácticos de la disciplina. Además, entre la aparición de la primera edición y la de esta segunda, haocurrido una crisis alimentaria significativa que no es separable de otras, tales como la económica,la climática o la energética. Según todos los indicios, la crisis alimentaria va a ser duradera y obedece a factores múltiples: lasubida del precio del petróleo, el bajo nivel de reservas, la especulación, el incremento de la pobla-ción y del consumo per capita, el desvío de una parte sustancial de la producción agraria hacia lafabricación de biocombustibles, la disminución de los rendimientos por el estrés debido al cambioclimático y la falta de inversión en innovación agropecuaria. Parece como si el éxito relativo de lasúltimas décadas hubiera hecho bajar la guardia. En particular, la tasa de crecimiento de la producción de alimentos ha ido por detrás de la delcrecimiento de la población durante la última década, justo el tipo de comportamiento relativo quepropuso Malthus hace más de dos siglos. En el último medio siglo, ha sido la mejora genética laque ha tenido el protagonismo técnico en la derrota de la amenaza maltusiana, ya que la superfi-cie de suelo laborable apenas ha crecido. En la actualidad, se ha adquirido de pronto concienciade que no se sabe bien cómo se va a conseguir el aumento de la producción de alimentos en un70-100 % para el año 2050, necesidad que se considera mínima para alimentar una población pro-yectada de unos 9.000 millones de seres humanos que, además, tendrán una demanda per cápitasignificativamente superior a la actual. Si se quiere lograr dicho objetivo, habremos de ser aún máseficaces en las próximas décadas de lo que lo hemos sido en las precedentes. Por supuesto, las respuestas a los retos planteados ni han sido ni serán exclusivamente técni-cas, pero todas las estrategias posibles han tenido y tendrán un importante componente técnico yes sobre este componente sobre el que se centra el libro que ahora se reedita. El cambio climático está alterando los estreses bióticos y abióticos a que deben hacer frente lascosechas, lo que hace prioritaria la investigación básica y aplicada tanto en el esclarecimiento delos mecanismos involucrados como en la adaptación de las cosechas tradicionales a las nuevascondiciones, así como el desarrollo de nuevas cosechas que sean más apropiadas para condicio-nes extremas. La crisis energética ha impulsado un nuevo interés por los biocombustibles, en los que se hancentrado algunas esperanzas infundadas que han dado lugar a la formulación de objetivos políticosque pueden tener consecuencias perjudiciales para la alimentación mundial. Así por ejemplo, losobjetivos declarados para fechas próximas, tanto por lo EEUU como por la UE, están determinandouna competencia por el suelo agrícola de la generación de biocombustibles con la producción dealimentos que no puede sino encarecer significativamente los alimentos y aumentar el número dehambrientos en el mundo, así como contribuir a la destrucción de bosque tropical. Por otra parte,La búsqueda de especies y variedades aptas para la producción de biocombustibles plantea retosformidables a la investigación de su agronomía y a su mejora convencional y biotecnológica. Es en el escenario que a grandes rasgos acabamos de esbozar, donde la presente edición de“Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II” manifiesta su pleno potencial y debe alcanzar su máxi-ma funcionalidad. Dr. Francisco García Olmedo, 2010 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 13
  15. 15. 14 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  16. 16. Parte IHerramientas básicas Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 15
  17. 17. 16 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  18. 18. I - CAPÍTULO 1 1. Objetivo del cultivo: si bien es difícil tratar de clasificar las aplicaciones que se persiguen con el cultivo de tejidos, se podría esquemati-Establecimiento de cultivos de zarlas en aplicaciones para:tejidos vegetales • Estudios básicos. En este caso, los explan- tes cultivados pueden ser diversos. Si lo únicoLuis Mroginski, Pedro Sansberro y que se quiere lograr es un sistema de callosEduardo Flaschland para estudiar algún proceso fisiológico, se puede cultivar cualquier órgano, tejido o célula 1 Introducción viva. En este caso –en que lo único que se bus- ca es la inducción de callos– lo ideal es cultivar El cultivo de tejidos –en su acepción amplia– explantes jóvenes, derivados de semillas enpuede ser definido como un conjunto muy hete- germinación, donde se obtienen respuestas rá-rogéneo de técnicas que presentan en común pidas y, en general, hay menores problemas deel hecho de que un explante (una parte sepa- contaminación con microorganismos. A vecesrada del vegetal que pueden ser protoplastos – se hace uso del cultivo de tejidos porque repre-células desprovistas de pared celular– células, senta un sistema experimental que simplificatejidos u órganos) se cultiva asépticamente en la complejidad generada por los fenómenosun medio artificial de composición química de- de correlación entre las distintas partes quefinida y se incuba en condiciones ambientales normalmente están presentes en una plantacontroladas. La imprecisión de esta definición entera. El explante que se usará estará condi-puede generar muchas polémicas, pero es ac- cionado por lo que se quiere estudiar. Un buentualmente aceptada. Generalmente es común ejemplo lo constituye el cultivo de ovarios fe-dividir las técnicas del cultivo de tejidos en dos cundados del tomate para estudiar los reque-grandes grupos: a) cultivos en medios semisó- rimientos nutricionales durante el crecimientolidos y b) cultivos en medios líquidos, los que de los frutos. Asimismo, el cultivo de óvulos haa su vez pueden ser agitados (mediante el em- sido muy útil para estudiar aspectos relaciona-pleo de agitadores de uso continuo) o estacio- dos con la formación de las fibras en algodón.narios. También es frecuente dividir al cultivo El cultivo de discos de tallos brindó una valiosade tejidos atendiendo a los niveles de comple- ayuda para estudiar la rizogénesis in vitro.jidad en cultivo de órganos, cultivos celulares y • Obtención de plantas con sanidad contro-cultivo de protoplastos. Para el establecimien- lada. Es muy común la utilización del cultivo deto de los cultivos utilizando cualquiera de los tejidos para la obtención de plantas libres desistemas es necesario tener en cuenta algunos virus (ver VIII.-9). El explante ideal para ello esaspectos generales comunes relacionados con el meristema (dependiendo de la especie, deel explante, la asepsia, el medio de cultivo y 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo ylas condiciones de incubación. La discusión de de un par de primordios foliares.estos aspectos constituye el objetivo de este • Micropropagación. En este caso depende-capítulo. Adicionalmente se incluye el tema de rá del sistema que se quiere utilizar. Si lo quela aclimatación de las plantas regeneradas in se quiere explotar es la brotación de meris-vitro, que es de gran importancia en la mayoría temas, los ápices terminales y los segmentosde las aplicaciones del cultivo de tejidos en la uninodales de ramas jóvenes constituyen ex-agricultura. celentes explantes. En este caso el cultiva- dor de tejidos debe conocer perfectamente la biología de la reproducción de la planta para 2 Explante aprovechar aquellos explantes que en formaVarios factores deben ser tenidos en cuenta natural son propágulos. En cambio, si se pre-en la elección del explante apropiado para el tende micropropagar mediante el empleo deestablecimiento de los cultivos in vitro, entre semillas sintéticas (ver Parte IV, capítulo 2) elellos: explante original deberá posibilitar la inducción Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 17
  19. 19. de la embriogénesis somática. En este caso, la • Establecimiento de suspensiones celula-utilización de embriones zigóticos inmaduros u res. En este caso se recomienda iniciar los cul-hojas, suelen ser frecuentes como explantes. tivos a partir de explantes extraídos de semillas • Obtención de híbridos interespecíficos. en germinación (hipocótilo, epicótilo, cotiledo-Una de las primeras aplicaciones del cultivo de nes, raíces).tejidos en la agricultura lo constituyó su empleocomo ayuda para la obtención de híbridos deri- 2. Posibilidad de contaminación con mi- croorganismos. De ser posible, se deben cul-vados de cruzamientos interespecíficos, donde tivar explantes de plantas donantes que crecense produce el aborto temprano de embriones. en condiciones de invernadero, con ello seEn estos casos, el explante cultivado es el reduce sustancialmente las tasas de contami-embrión cigótico en estadios tempranos de su nación. Por otra parte, es recomendable evitardesarrollo. Con la misma finalidad también se el uso de «explantes sucios» (raíces, rizomas)utilizan ovarios u óvulos fecundados. que provienen de plantas crecidas en macetas • Obtención de plantas de semillas con em- o en el campo, dado que en la mayoría de losbriones rudimentarios. Para esta finalidad los casos no es posible conseguir una buena des-explantes pueden ser semillas (por ej. orquí- infección de los mismos.deas) o bien, se aíslan los embriones en un es-tado temprano de desarrollo («corazón») como 3. Edad fisiológica. Este es un aspecto deen el caso de yerba mate o de algunas varieda- gran influencia en la morfogénesis. Como reglades de duraznero. general se puede decir que cuando más joven • Obtención de plantas haploides (consi- e indiferenciado se encuentre el explante a cul- tivar, mejor será su respuesta in vitro. Es porderando como haploide a un esporofito que ello que los meristemas apicales y axilares soncontiene el complemento gamético de cromo- ampliamente usados en numerosas especies.somas). En este caso, los explantes más uti- En el caso de la micropropagación de plan-lizados son las anteras, aunque también pue- tas leñosas, la edad del explante es un factorden emplearse microsporas aisladas, óvulos y crítico. Si los tejidos son jóvenes, la micropro-ovarios no fertilizados. pagación tiene mayores posibilidades de ser • Inducción de variación somaclonal. En este exitosa que con tejidos maduros. Este hechocaso se pueden utilizar varios explantes, pero genera la necesidad de realizar tratamientossi la finalidad de su utilización es la aplicación de rejuvenecimiento de las plantas donantesen planes de mejoramiento genético de plan- de explantes.tas, los explantes utilizados deben posibilitar laregeneración de plantas enteras. 4. Tamaño. En general, cuanto más grande • Producción y/o conversión de sustancias sea el explante mayores serán las posibilida-útiles. Se puede utilizar una gran variedad des de inducir la proliferación de callos o la re-de explantes. Los de raíces suelen ser muy generación directa de órganos. Sin embargo, a mayor tamaño de explante también son ma-utilizados. yores las probabilidades de que los cultivos se • Obtención de híbridos somáticos. Para esta contaminen con microorganismos. También esfinalidad se recurre a la fusión de protoplastos. necesario tener en cuenta que existe un ta-En la mayoría de los casos se aíslan los proto- maño mínimo del explante, que depende de laplastos de mesófilos de hojas y de suspensio- especie y del material vegetal, por debajo delnes celulares. cual no es fácil lograr el establecimiento de los • Conservación e intercambio de germo- cultivos. Los explantes muy pequeños suelenplasma. Los meristemas son los explantes requerir del empleo de medios más complejospreferidos para el desarrollo de sistemas de o de los denominados medios acondicionados.conservación a mediano y largo plazo (crío- 5. Epoca del año. Es un factor que suelenconservación con nitrógeno líquido) y para el tener mucha importancia en la micropropaintercambio de material genético. gación y que generalmente está asociado al18 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  20. 20. grado de dormición que presentan ciertos ex- te –con la ayuda de un microscopio estereos-plantes (yemas, por ejemplo) y también con la cópico– los cultivos en forma periódica (por loposibilidad de mayor o menor proliferación de menos semanalmente). También se puedenmicroorganismos. realizar pruebas con medios de cultivo dife- renciales y «test» bioquímicos específicos. 3 Asepsia Para evitar y/o minimizar las contaminacio- nes de los cultivos con microorganismos es Uno de los principales problemas que se necesario:presentan cuando se tratan de establecer loscultivos es el de la contaminación de los mis- 1) Conocer el material vegetal con que se tra-mos con diversos tipos de microorganismos baja y los posibles contaminantes específicos.(hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, vi-rus). El ambiente generado por explante-medio 2) Realizar una adecuada preparación de lade cultivo-condiciones físicas de incubación planta dadora de explantes, cultivándola pre-es altamente propicio para la proliferación de ferentemente en invernaderos tratadas conmuchos de estos microorganismos que pue- productos químicos que eliminen patógenos yden provocar la destrucción de los cultivos. Es eventuales microorganismos endófitos.difícil cuantificar el impacto de estas pérdidas,pero en promedio, en laboratorios dedicados a 3) Proceder a la desinfección superficial dela micropropagación se lo puede estimar en al- los explantes mediante el uso de compuestosrededor del 10%. En el mejor de los casos, es- químicos con el objeto de eliminar los micro-tos microorganismos no destruyen los cultivos organismos con el menor daño posible parapero compiten con el explante por los nutrien- el explante. Si bien no es posible recomendartes del medio de cultivo o bien lo modifican. un procedimiento general, se puede señalarEs muy difícil conseguir cultivos estrictamen- que el procedimiento más popularizado con-te asépticos dado que en la mayoría de los siste en una doble desinfección mediante lacasos es altamente probable que los mismos inmersión de los explantes en etanol (70%v/v)contengan virus y fitoplasmas, por lo que en durante 20-60 segundos seguido de hipoclo-la práctica, cuando se refiere a cultivos asép- rito de sodio 1 -3%, contenido en el agua deticos, en general se quiere significar que son lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos,cultivos donde no se produce la proliferación dependiendo de la naturaleza del explante.de hongos y bacterias. Algunos procedimientos se basan en el em- Dos son las fuentes de contaminaciones: a) pleo de únicamente etanol o de hipoclorito demicroorganismos presentes en el interior o en sodio. Finalmente, es necesario eliminar losla superficie de los explantes y b) fallas en los restos de estos productos mediante varios la-procedimientos de cultivo en el laboratorio. La vados con agua destilada estéril.correcta detección de estas fuentes y del tipo En este último punto hay que aconsejar quede microorganismo son aspectos importantes se utilice agua destilada estéril de recientepara el éxito de los cultivos, pues por un lado preparación, dado que está demostrado que elayuda a determinar la fuente de contaminación almacenaje prolongado del agua estéril puedey por otro lado, ayuda a la planificación de los ser la causa de contaminaciones con bacte-procedimientos para controlarlos. Varios géne- rias. Es aconsejable realizar estas operacio-ros de bacterias (Pseudomonas, Xanthomonas, nes de desinfección superficial en una cámaraErwinia, Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus, de transferencia con aire estéril. En lugar delMicrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, hipoclorito de sodio se puede utilizar hipoclori-Mycobacterium, Corynebacterium) y de hon- to de calcio (6 -12 %) o el cloruro de mercuriogos filamentosos (Aspergillus, Penicilium, (0,1%- 1,5%). Es preciso recomendar extremaFusarium, Alternaria, Cladosporium y cautela con el empleo de este último compues-Neurospora) están frecuentemente en los cul- to, dado que es altamente tóxico y además notivos. Es conveniente inspeccionar visualmen- es removido con facilidad del explante. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 19
  21. 21. En los casos en que no se utilice etanol, la croondas. El agua caliente también puede seradición de agentes tensoactivos junto con el usada. En el caso de sustancias termolábiles,desinfectante es una práctica recomendada. la esterilización se puede hacer mediante fil-Entre los más usados figuran Tween-20 (0,01 tración a través de filtros bacteriológicos.– 0.1%) o unas gotas de Triton. El lavado pre- No es posible recomendar ningún sistemavio de los explantes con agua corriente y de- de esterilización dado que la exitosa destruc-tergentes, ayuda a una mejor desinfección. La ción de los microorganismos depende de múl-inmersión de los explantes en soluciones con- tiples factores entre los que interesan el tama-teniendo sustancias antibióticas y /o antimicó- ño del recipiente, el tiempo de esterilización yticas (gentamicina, sulfato de estreptomicina, la naturaleza de la sustancia a esterilizar. Sinampicilina, tetraciclina, carbenicilina, sulfato de embargo, se pueden dar algunas sugerencias:gentamicina, pentacloronitrobenceno, rifam- • La esterilización en estufas mediante calorpicina, anfotericina B, benomil, carbendazim) seco (aire caliente) es recomendable para es-puede ser de utilidad, pero deben ser utilizados terilizar recipientes de vidrios secos (pipetas,en casos excepcionales. Estos productos tienen cápsulas de Petri, tubos). En estos casos, 2-4el inconveniente de que alteran la composición horas en estufas a 180-200 ºC brindan exce-de los medios de cultivo y además pueden ser lentes resultados.metabolizados por los explantes. • La esterilización con calor húmedo con va- Últimamente han aparecido soluciones bio- por bajo presión (en autoclave o en una «olla acidas que matan bacterias y hongos, previenen presión»). Es el procedimiento más empleadola germinación de esporas y a altas concen- para la esterilización de los medios de cultivotraciones pueden eliminar contaminaciones (salvo, como se indicó más arriba, para aque-de microorganismos endófitos. Uno de estos llos que posean componentes termolábiles).compuestos es el PPM (Plant Preaservative En este caso, lo más común es usar una pre-Mixture). Otro ejemplo es el denominado G-1, sión de 1.46 kg.cm-2 durante 20 minutos, conun compuesto derivado de los furfurales de la lo que prácticamente se destruyen todas lascaña de azúcar. Este compuesto, químicamen- formas de vida. Es importante que en todoste: 1-(5-bromofur-2-il)-2- bromo-2-nitroeteno los puntos del autoclave se alcance dicha tem-fue desarrollado en la Universidad Central de peratura, para lo cual hay disponibles cintaslas Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y detectoras colorimétricas.fungicida de amplio espectro. En los casos en que se utilicen plántulas cre- 5) Cultivar los explantes en una cámara decidas in vitro como plantas donantes de explan- transferencia con aire estéril («gabinete de flu-tes, es necesario desinfectar las semillas para jo laminar»), localizada en un ambiente limpiosu cultivo y germinación y luego es aconsejable y no expuesta a corrientes de aire. De no dis-desinfectar también las plántulas resultantes. poner este equipamiento, se pueden sustituir En algunos materiales vegetales se utiliza con cuartos esterilizados previamente con luzla preincubación de los explantes mediante lo ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV encual éstos son desinfectados suavemente y forma directa). La mesada de trabajo y las pa-precultivados durante 24 horas en un medio redes del gabinete deben ser desinfectadasconteniendo sacarosa, y finalmente son desin- previamente con etanol al 70%. De la mismafectados nuevamente y cultivados. manera deben ser desinfectados exteriormen- 4) Emplear medios e instrumentos de cultivo te todos los recipientes (conteniendo mediosesterilizados, es decir, liberados completamen- de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el áreate de cualquier microorganismo vivo o espo- del aire estéril.ras. Para la esterilización, en la mayoría de los Los operarios constituyen frecuentementecasos se hace uso del calor en sus diversas una importante fuente primaria de contamina-formas: llama directa, calor húmedo (en forma ción, porque es recomendable que, antes dede vapor abierto o bajo presión), calor seco comenzar a trabajar laven sus manos y ante-(aire caliente). Se pueden usar hornos a mi- brazos con abundante agua y jabón y se des-20 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  22. 22. infecten con etanol al 70 %. La utilización de Tabla 1: Composición de tres medios básicosguardapolvos, guantes y máscaras protectoras usados en el cultivo in vitro de tejidos.de la boca y de la nariz, así como los gorros 1 Compuestos Medio básicoprotectores de los cabellos, ayudan a reducir MS N6 B5sensiblemente los niveles de contaminación. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, NH 4NO3 1.650 ----- -----tijeras, agujas, cápsulas de Petri) deben ser KNO 3 1.900 2.830 2.500 KH 2PO4 170 400 -----esterilizados antes de su uso. Muchos de es- CaCl 2.2H 2O 440 166 150tos instrumentos pueden ser colocados en eta- (NH4) 2SO 4 ----- 463 134nol al 95% y, antes de ser usados, se deben MgSO4.7H 2O 370 185 250 NaH 2PO 4.4H 2O ----- ----- 150flamear cuidadosamente en la llama de un me- KI 0,83 0,80 0,75chero. También es necesario flamear la boca MnSO 4.H2O ----- ----- 10,00de los recipientes que contienen los medios de H 3BO 3 6,20 1,60 3,00 MnSO 4.4H 2O 22,30 4,40 -----cultivo antes y después de cultivar el explante. ZnSO 4.7H 2O 8,60 1,50 2,00 6) Incubar los cultivos en cámaras o cuar- Na2MoO 4.2H 2O 0,25 ----- 0,25 CuSO 4.5H 2O 0,025 ----- 0,025tos de cultivo, cerrados, libres de corrientes FeSO 4.7H 2O 27,80 27,85 27,80de aire y bien higienizados. En lo posible se Na2EDTA 37,30 37,25 37,30debe restringir la circulación de personas, y los CoCl 2.6H 2O 0,025 ----- 0,025 Glicina 2,00 2,00 -----recipientes con cultivos contaminados deben Tiamina -HCl 0,10 1,00 10,00ser rápidamente eliminados de este sector. Es Piridoxina -HCl 0,50 0,50 1,00conveniente que antes del lavado, estos culti- Ácido Nicotínico 0,50 0,50 1,00vos sean esterilizados. Mioinositol 100,00 ----- 100,00 Sacarosa 30.000,00 50.000,00 20.000,00 4 Medios de cultivo PH 5,7 5,8 5,5 -1- 1. Un medio de cultivo puede ser definido 1) Composición en mg·Lcomo una formulación de sales inorgánicas y MS = Medio de Murashige y Skoog (Physiol. Plant. 15: 473 - 97. 1962)compuestos orgánicos requeridos para la nu- N6 = Medio de Chu,C.C., Wang,C:C., Sun,C.S., Hsu, C., Yin, K,C.,trición y manipulación de los cultivos. Existen y Chu, C. (Sci. Sinica 18: 6 59- 668. 1975) B5 = Medio de Gamborg, O.L., Miller,R.A. y Ojima, K. (Exp.Cellnumerosas formulaciones, cada una de las Res. 50: 151 - 158. 1968)cuales comprende entre 6 y 40 compuestos.Para dar una idea de la cantidad de formu-laciones disponibles, George y col., luego de • Otros compuestos.revisar más de 3.000 trabajos científicos des-criben en dos tomos (casi 1.000 páginas en to- Fuente de carbono: Prácticamente todos lostal) más de 2.000 medios de cultivo. También cultivos son heterótrofos (comparativamentedos empresas multinacionales ofrecen para la unos pocos son autótrofos) y por ende necesi-venta más de 60 medios cada una, listos para tan del suministro de una fuente de carbono.su utilización especialmente en la micropropa- La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%,gación comercial de plantas. En la Tabla 1 se es el azúcar más utilizado. En algunos mediospresentan tres medios que son muy usados en se la reemplaza por glucosa. En casos particu-la actualidad. lares se cita el empleo de maltosa o galacto- Básicamente, los medios de cultivo se com- sa. También myo-inositol (100 mg/L) suele serponen de compuestos que suministran: incorporado a los medios resultando un mejor • Una fuente de carbono crecimiento de los cultivos. • Nutrientes minerales Nutrientes minerales: Los medios de cultivo • ·Sustancias vitamínicas deben suministrar los mismos macro y micro- • Sustancias reguladoras del crecimiento nutrientes que son esenciales para el creci- • Agente gelificante (en el caso de medios miento de las plantas enteras. En general sesemisólidos) destacan las concentraciones relativamente Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 21
  23. 23. altas de nitrógeno y potasio. El nitrógeno es agua de coco (5 a 15%), jugo de tomate y purésuministrado en forma de amonio y/o nitrato. de banana. También en ocasiones es necesa-También se pueden utilizar urea, glutamina y ria la incorporación de agentes antioxidantescaseína hidrolizada. Es fundamental que el hie- (L-cisteína, ácido ascórbico, polivinilpirrolido-rro sea incorporado juntamente con un agente na) para prevenir el ennegrecimiento tisularquelante (Na2EDTA), lo que lo hace disponible causado por la oxidación de polifenoles pre-es un amplio rango de pH. sentes en los explantes. Este ennegrecimiento puede causar la muerte de los mismos. Sustancias vitamínicas: De todas las que La preparación de los medios de cultivo pue-comúnmente se incorporan a los medios, pa- de llevarse a cabo de diferentes maneras, enreciera que la tiamina es la única realmente «lecturas recomendadas» se citan manualesimprescindible para el buen crecimiento de los de laboratorio donde se describen detallada-cultivos. mente este punto. Sustancias reguladoras del crecimiento: En 5. Condiciones ambientales para lala mayoría de los casos los medios utilizados incubación.para el establecimiento de los cultivos con-tienen auxinas (ANA, 2,4-D, AIA, AIB, NOA, La incubación de los cultivos se debe llevarDicamba, Picloram) y/o citocininas (BA, KIN, a cabo en condiciones controladas. Por lo me-ZEA, 2iP, Thidiazurón). Las giberelinas (es- nos en lo que se refiere a temperatura, calidadpecialmente GA3) son requeridas en algunas e intensidad de luz, fotoperíodo, humedad at-ocasiones para el cultivo de meristemas o para mosférica e higiene. Estas condiciones se lo-la elongación de brotes. El ABA, es usado en gran con el empleo de cámaras climatizadasalgunos casos. o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor) y una buena y uni- Agente gelificante (en el caso de medios se- forme circulación de aire en el interior y dota-misólidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el com- dos de un buen sistema de alarma para cortarpuesto más utilizado. También pueden em- la iluminación en caso de no funcionar el aireplearse «Agargel» (0,40-0,60%), «Transfergel» acondicionado. En general, los cultivos son in-(2,0-2,60%), «Phytagel» (0,25- 0,40%), agaro- cubados a temperatura constante de 25-28 ºC,sa (0,80-0.90%) y «Gelrite» (0,10-0,20%). con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lámparas fluo- Otros compuestos: Muchas sustancias, de rescentes del tipo «luz día» con una irradianciavariada composición química, suelen ser adi- de entre 50 y 200μmol m-2s-1. La humedad at-cionadas a los medios básicos. Además de la mosférica debe ser elevada (80- 90%).glicina, otros aminoácidos se pueden agregara los medios. Es el caso de L-tirosina, aspara- 6 Aclimatación de las plantas regenera-gina y cisteína, aunque hay que tener presente das in vitro.que en dosis altas pueden inhibir el crecimien-to de los cultivos. El carbón activado (0,1 a Durante el período de incubación, los cultivos5%) suele ser incorporado al medio, dado que son expuestos a condiciones ambientales disí-es probable que absorba metabolitos tóxicos miles al ambiente externo. La atmósfera internapara los cultivos. se caracteriza por presentar una considerable variación diurna en la concentración de CO2, En algunos medios se incorporan ácidos humedad relativa elevada, temperatura cons-orgánicos como el málico, el cítrico, el pirúvi- tante e intensidad lumínica baja. A su vez, elco y el succínico y es frecuente el empleo de medio de cultivo compuesto por concentracio-L-glutamina y de caseína hidrolizada. Aún hoy nes elevadas de azúcares (en aquellos siste-se siguen utilizando ciertos componentes de mas heterótrofos y semiautótrofos de micropro-composición química no bien definida como el pagación), sales y reguladores del crecimiento,22 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  24. 24. sumado a la ausencia de microorganismos, del substrato, para mantener la temperaturageneran anormalidades morfológicas, anató- por encima de los 18-20 ºC.micas y fisiológicas que las plantas deberán Sin lugar a dudas, la opción más económicacorregir cuando son transferidas al ambiente es el empleo de la luz natural, disminuyendo suexterno. Este período de adaptación al nuevo irradiancia (20-50%) mediante el agregado dehábitat es llamado fase o etapa de aclimata- mallas de sombreado («saram»). No obstante,ción. La estrategia a implementarse durante el en aquellas latitudes donde el nivel medio demencionado ciclo deberá contemplar el control luz natural es bajo y los días son cortos du-minucioso de los parámetros ambientales (hu- rante una parte considerable del año, la luz ar-medad, temperatura y luz) de tal manera que tificial puede ser aplicada como complementopermita disminuir la deshidratación y, al mismo de la luz natural. Las lámparas tubulares fluo-tiempo, estimular la fotosíntesis con el objeto de rescentes del tipo «luz día» son empleadasgenerar un rápido crecimiento de los plantines. en horticultura para prolongar el fotoperíodo. El retraso en el desarrollo de la cutícula y la Asimismo, las lámparas tubulares de sodio altaescasa funcionalidad del aparato estomático presión presentan una distribución espectralque presentan las hojas de la mayoría de las de la energía adecuada para estimular fotosín-especies cultivadas in vitro, determinan una tesis y se emplean para tal fin en una ampliaalta tasa de transpiración que puede ocasionar variedad de cultivos.la muerte por deshidratación. El control de este Otro aspecto importante a tener en cuentaproceso fisiológico es de vital importancia du- lo constituye la elección del substrato, siendorante la aclimatación, teniendo en cuenta que la el adecuado aquel que permita el normal creci-disminución de la transpiración será gradual y miento y desarrollo de las raíces. Se puede em-dependerá de la rehabilitación de los estomas, plear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mez-así como también del desarrollo de la cutícu- clas de ellos, teniendo la precaución de rea-la. El equipamiento necesario estará sujeto a la lizar una esterilización previa. Es convenienteespecie, pudiendo utilizarse desde túneles de el agregado de fertilizantes, sea a través delpolietileno para plantas que posean un elevado substrato (fertilizantes de liberación controla-control de la transpiración (por ej. Malus pumila da) o bien mediante el sistema de riego (fer-o Agave tequilana) o bien, a través del empleo tilizantes solubles); empleándose proporcio-de cámaras climatizadas (Fig.1) equipadas con nes ricas en fósforo (N-P-K: 9-45-15) y potasiosensores que permiten un descenso paulatino (N-P-K: 4-25-35) que favorecerán el desarrollode la humedad relativa. En algunos casos pue- radicular y la rustificación de las plantas.de resultar necesaria la aplicación exógena de En todo momento deberá realizarse un rigu-ABA (hormona involucrada en el control del cie- roso control fitosanitario empleándose antibióti-rre de los estomas) o bien, el empleo de sus- cos, fungicidas e insecticidas de uso universal.tancias antitranspirantes que forman una capa En la Figura 1, se detalla un modelo de cá-semipermeable en la superficie de la hoja. En mara de aclimatación diseñada por los autoreseste último caso deberán tomarse algunas pre- y empleada por el Laboratorio de Cultivo decauciones debido a que pueden observarse re- Tejidos del Instituto de Botánica del Nordeste.acciones de fitotoxicidad. Básicamente, está compuesta por una fase Resulta imprescindible evitar la exposición a aérea construida en aluminio y policarbonatotemperaturas extremas tanto en la fase aérea alveolar (9) y un recipiente o batea (11) quecomo en el substrato. Mediante el empleo de contiene gránulos de arcilla expandida a fin deextractores y/o acondicionadores de aire com- facilitar el drenaje. Mediante el agregado debinados con un sistema de niebla, es posible arena u otro substrato adecuado, esta cámaraestablecer la temperatura de la fase gaseosa puede ser utilizada tanto para el enraizamientoentre los 25 y 30 ºC durante la estación estival, ex vitro de los brotes obtenidos en la etapa demientras que en la época invernal es necesa- multiplicación, así como también, para el en-rio, a veces, el empleo de mantas térmicas o raizamiento convencional (a «raíz desnuda»)serpentinas, sea de agua o aire caliente a nivel de estacas de tallos u hojas. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 23
  25. 25. La humedad relativa de la fase aérea es con- Debido a la latitud geográfica en que se en-trolada por un sensor (6) ubicado por encima cuentra, la cámara está equipada con un acon-de la tubería de riego (4). El sistema humidifi- dicionador de aire (3000 frigorías) para evitarcador está compuesto por picos tipo «fog» y situaciones de estrés térmico en época estival.es alimentado por una bomba de bajo caudal A su vez, y dado que la mayoría de las espe-y alta presión (13). Con el propósito de evitar cies estudiadas son originarias de climas tro-el goteo que pudiese ocasionar el agua rema- picales y subtropicales, el sistema cuenta connente en las cañerías, el sistema consta de mantas térmicas que son colocadas por deba-una válvula solenoide de descarga y desagüe jo de los tubetes, manteniendo la temperatura(7). La fase gaseosa es renovada en forma in- del substrato durante el invierno. En este últi-termitente mediante el empleo de extractoresubicados en ambos extremos de la cámara (3) mo caso se agrega un material aislante entre lalos que, conjuntamente, introducen o extraen leca (10) y la malla de hierro (16) de tal maneraaire, generando un movimiento masal. de dirigir el calor hacia la fase aérea.24 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  26. 26. 7. Agradecimientos.Los autores agradecen al Ing. Pablo A. Lunapor la planificación digital de la cámara de acli-matación. A la Secretaría General de Cienciay Técnica (UNNE) y al Establecimiento La Ca-chuera por el aporte financiero recibido paraconstruir la misma. 8. Lecturas RecomendadasGEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEOR- GE. 1987. Plant Culture Media . Vol. 1 (Formu- lations and Uses). Exegetics Limited. England. 567 pág.GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEORGE. 1988. Plant Culture Media . Vol. 2 (Commentary and analysis). Exegetics Limited. England. 420 pág.HURTADO, D.V. y MERINO, M.E. 1991. Cultivo de Tejidos Vegetales. Ed.Trillas. México. 232 pág.PÉREZ PONCE, J.N. 1998. Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. Instituto de Biología de Plantas.Santa Clara. Cuba. 390 pág.POSPOSILOVA, J.; I. TICHA, P. KADLECEK, D. HAISEL, S. PLZAKOVA. 1999. Acclimatization of micropropagated plants to ex vitro conditions. Biologia Plantarum 42: 481-497.ROCA, W.M. y L.A. MROGINSKI. 1993 (segunda edición). Cultivo de tejidos en la Agricultura: Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Cali, Colom- bia, 970 pág.TORRES, A.C.; L.A. CALDAS y J.A. BUSO. 1998. Cultura de Tecidos e Transformacao Genética de Plantas. (Vol.1) Embrapa. Brasil.509 pág.TORRES, A.C.; L.A. CALDAS, y J.A. BUSO. 1999 Cultura de Tecidos e Transformacao Genética de Plantas. (Vol.2) Embrapa. Brasil.355 pág. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 25
  27. 27. I - CAPÍTULO 2 2.- Tipos de morfogénesis. Definiciones En condiciones de cultivo in vitro, las célulasMorfogénesis somáticas pueden regenerar embriones (FigSilvia Radice 1) o brotes, raíces y/o flores (Fig 2) como res- puesta a un determinado estímulo. La regene- 1.- Introducción ración es un proceso que comprende diferen- tes fases que se suceden de manera similarLa embriogénesis somática y la organogénesis para los tres tipos de morfogénesis citadas. Deson dos procesos morfogénicos muy frecuen- Klerk y colaboradores, en 1997, denominarontes en el cultivo in vitro de especies vegetales. a estas diferentes fases como adquisición deLa embriogénesis somática es el proceso por la competencia; fase de inducción y fase deel cual se obtiene una estructura similar a un realización.embrión cigótico sin que medie la fertilización En la primera fase, las células no respon-de las gametas, mientras que por organogé- den al estímulo organogénico pero adquierennesis pueden obtenerse tallos, raíces o flores. esa competencia durante una fase de desdi-Estos órganos son inducidos a partir de una ferenciación. En la segunda fase o fase de in-célula o de un grupo de células que, según las ducción, las células son receptivas al estímulocondiciones de cultivo, tienen la propiedad de morfogénico y hay una relación directa con elmantenerse en activa división. tipo, concentración y combinación de regula-Esta totipotencialidad celular fue enunciada dores del crecimiento agregados al medio depor Haberlandt en 1902, quien propuso la teo- cultivo y el órgano a desarrollar. En la fase dería de que todas las células vegetales tienen realización, la célula sufre las sucesivas divi-la capacidad de regenerar plantas completas. siones para formar el órgano determinado.Haberlandt no llegó a demostrar su hipótesis A partir de la siembra in vitro de diferentes ex-debido a que no pudo lograr la división celu- plantes relativamente grandes y en condicio-lar. Los medios de cultivo que empleaba no nes de cultivo adecuadas, puede inducirse laincluían reguladores del crecimiento debido a formación de nuevos órganos de manera direc-que esos compuestos eran aún desconocidos. ta, sin la formación de callo. Si la formación esLos avances en el cultivo de tejidos vegetales de brotes, raíces o flores se denomina organo-fueron muy lentos en sus inicios. En 1934, Whi- génesis directa. Si en cambio se induce la for-te pudo mantener, en forma ilimitada, el creci- mación de embriones somáticos, este procesomiento de raíces en medios líquidos a partir de se denominará embriogénesis directa (Figs. 1 yápices de tomate. Al mismo tiempo se identi- 3). Si por el contrario, a partir de la siembra deficó el ácido indol acético (AIA), que posibilitó un explante in vitro se observa la proliferaciónel mantenimiento indefinido de callos de za- de células en forma desordenada y sin ningunanahoria y tabaco in vitro. Posteriormente se función predeterminada, se iniciará la produc-descubrió el efecto de la leche de coco como ción de callos o suspensiones celulares (Figs.estimulante de la formación de callo sobre el 2 A y 3). La diferenciación de órganos a partircultivo de embriones de Datura stramonium. de callos, denominada morfogénesis indirecta,En 1948 Skoog y Tsui, trabajando con cultivos estará condicionada a la previa formación dede callo de tabaco, demostraron la existencia los meristemoides. Morfogénesis directa o in-de una regulación química en la parte aérea y directa fueron términos propuestos por Hicksen la raíz. Trabajos posteriores en callos de la en1980.misma especie, con el agregado de cinetina,la primera citocinina descubierta, permitieron 3.- Histología de la morfogénesisdemostrar que la diferenciación de brotes, raí-ces o de ambos, era regulada por el balance de Después de 48 horas de realizada la siembraauxinas/citocininas. del explante en el medio de cultivo adecuado,26 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  28. 28. Figura 1: A-F embriogénesis somática obtenida por cultivo in vitro. A-C-E, embriogénesis somática en di-ferentes fases de crecimiento observada en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivado en MS + 1 mg l-1 deBAP. B-D-F, embriogénesis somática obtenida en diversos cultivares de Prunus sp a partir de embrioneszigóticos inmaduros cultivados en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 de Kin con una previa inducción en MS+ 2 mg l-1 de 2,4-D. Las reglillas representan 5 mm.a partir de una célula epidérmica o del mesófilo renciación de los nuevos órganos. Este tipo defoliar, como ocurre en las coníferas, se suce- meristema puede iniciarse en forma directa, aden una serie de divisiones mitóticas. Así se partir de células diferenciadas pertenecientes apueden observar, a través del estudio histológi- un explante cultivado in vitro, o indirectamente,co, pequeñas masas de células que contienen a partir de una célula o grupo de células dife-citoplasma denso y grandes nucleolos. Este renciadas que promueven la proliferación celu-conjunto de células, agrupadas a modo de es- lar (Fig 4 A). Su evolución determinará el cre-feras, fueron denominadas meristemoides por cimiento de un órgano, por ejemplo una yemaTorrey en 1966, y son responsables de la dife- adventicia (Fig 4 B). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 27
  29. 29. Figura 2: A-E Organogénesis somática obtenida por cultivo in vitro. A, callo organogénico obtenido enAbelia sp. (André) Rehder cultivada en MS + 1 mg l-1 de picloran. B, Inicio de brotes (flechas) en hojascrecidas in vitro de “Crimson Gold” (Prunus persica L.) cultivadas en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 deKin. C, Brotes de Gerbera jamesonii Bolus obtenidos a partir del cultivo de capítulos florales en MS 0,05mg l-1 de IBA + 0.75 mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de GA3. D, brotes florecidos in vitro de Abelia sp. (André)Rehder cultivados en MS + 1 mg l-1 de BAP. E, raíces (flechas) crecidas de callo de Abelia sp. (André) Re-hder cultivadas en inducidas en MS + 1 mg l-1 de 2iP, previamente inducidas con 1 mg l-1 de picloran. Lasreglillas representan 5 mmLas células embriogénicas son similares a las po de células embriogénicas, el desarrollo decélulas meristemáticas debido a que no son las mismas no está sincronizado. Estas célulasdemasiado voluminosas, tienen gran cantidad son capaces de dividirse o de transformarsede ribosomas, citoplasma denso, un nucleolo en embriones según las condiciones del medioagrandado y pequeños granos de almidón. Es- de cultivo. Aquellas células que no desarrollantas células, que en general se agrupan, pueden proembriones comienzan el proceso de dife-variar en tamaño y número. Dentro de un gru- renciación, es decir se vacuolizan, disminuye28 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  30. 30. el volumen de núcleo y nucleolo y desaparecen noso, sufre divisiones polarizadas formando unlos gránulos de almidón. embrión globular. Previo a esta polarización seLas experiencias demuestran que las células deposita almidón, luego se forma la epidermisembriogénicas se desarrollan sólo cuando se y adquiere simetría bilateral. Sucesivamente semodifican las condiciones de cultivo. En gene- observa el crecimiento de uno o más cotiledo-ral, cuando se reducen las cantidades de auxi- nes, el desarrollo de los tejidos provasculares,na y citocinina o se elimina la auxina. la iniciación de los ápices radicales y de tallo yLas células embriogénicas desarrollan como una progresiva acumulación de almidón, lípidosembriones cuando las condiciones experimen- y proteínas.tales permiten que estas expresen su poten- En el caso de un origen multicelular de los em-cial. Pueden ocurrir dos condiciones ontogé- briones somáticos pueden observarse diversosnicas diferentes, es decir que el origen de los patrones. Los embriones somáticos se formanembriones sea unicelular o pluricelular. a partir de grupos de células epidérmicas yEn el caso de iniciarse a partir de una célula, la subepidérmicas (Fig 4 C). Este tipo de ontoge-misma se aísla de las demás por una importan- nia de origen multicelular se llama comúnmentete modificación en su pared celular, en particu- budding o embriogénesis adventicia. Estas cé-lar por la gelificación de la laminilla media. Esta lulas pequeñas tienen una alta relación núcleo/célula, rodeada por un polisacárido mucilagi- citoplasma, citoplasma denso y un nucleolo vo- luminoso que se tiñe fuerte- mente. Se diferencian de las células embriogénicas por la falta de sustancias de reser- va, por su delgada pared ce- lular y su frecuente división celular. Estas estructuras se denominan proembriones globulares (Fig 1 A, B). En una etapa posterior desarro- llan una epidermis, un tejido provascular, acumulan mate- rial de reserva y se polarizan. Estas estructuras globulares desarrollan cotiledones y se transforman en embriones somáticos que presentan ápices caulinar y radicular. Para una misma especie puede ocurrir uno u otro tipo de inicio según las condicio- nes de cultivo. El desarrollo de un embrión somático de origen unicelular es compa- rable a la de un embrión ci- gótico. En dicotiledóneas, la etapa globular es seguidaFig. 3: Esquema de los diferentes procesos morfogénicos obtenidos por una etapa corazón quea partir de la siembra in vitro de diferentes explantes. Las líneas con- se corresponde con la adqui-tinuas expresan organogénesis o embriogénesis directa mientras que sición de la simetría bilateral:las líneas quebradas indican que la morfogénesis se obtiene por vía desarrollo de la epidermis,indirecta. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 29
  31. 31. Figura 4: A-E Cortes histológicos de diferentes explantes cultivados in vitro. A, meristemoides (flechas)observados en cultivo de Silybum marianum L. en MS + 1 mg l-1 de AIA + 5 mg l-1 de BAP 10 x. B, yemasadventicias (flechas) en ápices de Fragaria x ananassa Duch. cultivados en Boxus + 0,1 mg l-1 de IBA + 0.5mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de GA3 4 x. C, grupo de células embriogénicas (flechas) en Codiaeum variegatum(L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón. 20 x. D, embriones somáticos en Codiaeum variegatum (L)Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón 10 x. E, embriogénesis secundaria en Codiaeum variegatum (L)Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón 10 x.de los estratos procambiales y de manera su- la raíz y al procambium en respuesta a la elon-cesiva el desarrollo del ápice radical. El ápice gación axial del embrión somático debido alde tallo se desarrolla más tarde, durante la eta- transporte de auxinas (Fig 1 C).pa cotiledonar. En los embriones somáticos de Los embriones de origen multicelular obtenidosalgunas especies hay una etapa intermedia en- por budding muestran la misma ontogenia quetre la globular y corazón llamada oblonga, que los cigóticos, como así también la produccióncorresponde a la individualización del ápice de de sustancias de reserva.30 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

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