Biotecnologìa y mejoramiento vegetal ii   levitus, echenique, hopp
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Biotecnologìa y mejoramiento vegetal ii levitus, echenique, hopp Document Transcript

  • 1. AuspiciosArgenBio es el Consejo Argentino para la Información y Desarrollo de laBiotecnología. Es una organización sin fines de lucro que tiene como misión divulgar Biotecnologíainformación sobre la biotecnología, contribuyendo a su comprensión a través de laeducación y estimulando su desarrollo. y Mejoramiento Vegetal IIConsideramos prioritario el apoyo a iniciativas relacionadas con la biotecnología ydirigidas a la comunidad educativa de todos los niveles. En este sentido, este libro Editores:cubre una necesidad importante ya que aporta información completa y actualizada Gabriela Levitus, Viviana Echenique,sobre las tecnologías de laboratorio que se aplican al mejoramiento vegetal, escrita Clara Rubinstein, Esteban Hopp y Luis Mroginskipor especialistas y en idioma español.Confiamos en que tanto estudiantes con profesionales encontrarán en este libro unaexcelente fuente de información. Consejo Argentino para la InformaciónPara conocer más sobre ArgenBio, visitar www.argenbio.org y el Desarrollo de la Biotecnología Ediciones Instituto Nacional de INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA ARGENBIO - Consejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología Tecnología Agropecuaria
  • 2. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II Editores: Dra. Gabriela Levitus, Dra. Viviana Echenique, Dra. Clara Rubinstein, Dr. Esteban Hopp Ing. Agr. Luis Mroginski. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 1
  • 3. 2 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 4. ÍndicePrefacio ............................................................................................................................... 6Agradecimientos ................................................................................................................ 7Lista de Autores .................................................................................................................. 7Prólogo a la Primera Edición. Dr. Francisco García Olmedo ............................................. 11Prólogo a la Segunda Edición. Dr. Francisco García Olmedo ........................................... 11Parte I: Herramientas Básicas ........................................................................................... 15Capítulo 1: Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. Luis Mroginski, Pedro Sansberroy Eduardo Flaschland ………………………………………………………………………………………. 17Capítulo 2: Morfogénesis. Silvia Radice .………………………………………………….………………. 26Capítulo 3: La citogenética molecular e inmunocitogenética en el estudio de los genomas ve-getales. Guillermo Seijo, Graciela I. Lavia, Germán Robledo, Aveliano Fernández y Viviana G. SolísNeffa. .................................................................................................................................................. 34Capítulo 4: Herramientas básicas de ingeniería genética. Ingrid Garbus, Marisa Gómez y Vi-viana Echenique. ................................................................................................................................ 47Capítulo 5: Marcadores moleculares. María Carolina Martínez, Marcelo Helguera y Alicia Carrera. 70Capítulo 6: Construcción de mapas de ligamiento genético, localización de genes y regionescromosómicas asociadas a caracteres de interés en plantas. Gerardo D. L. Cervigni, Juan Pa-blo A. Ortiz y Sergio E. Feingold. ......................................................................................................... 86Capítulo 7: Genómica. Viviana Echenique, Juan P. Selva, Mauro Meier, Pablo Roncallo y GustavoSchrauf. .............................................................................................................................................. 100Capítulo 8: Transcriptómica. Silvina Pessino y Silvina Felitti. .......................................................... 121Capítulo 9: Proteómica. Paula Casati y María F. Drincovich ............................................................. 136Capítulo 10: Metabolómica. Fernando Carrari, Telma E. Scarpeci, Luciano A. Abriata, Alejandro J.Vila y Estela M. Valle. ......................................................................................................................... 146Capítulo 11: Metagenómica. O. Mario Aguilar y Daniel H. Grasso. ................................................... 157Capítulo 12: Bioinformática aplicada a la biotecnología vegetal. Norma Paniego, Ruth Heinz,Paula Fernández, Verónica Lia, Corina Fusari. ................................................................................... 170Parte II: Métodos para generar y analizar diversidad 183Capítulo 1: Polinización y fertilización in vitro. Susana Cardone, Gladys Pérez Camargo y AuroraPicca. .................................................................................................................................................. 185Capítulo 2: Hibridación somática. Pablo Polci y Pablo Friedrich. .................................................... 197 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 3
  • 5. Capítulo 3: Epigenética y evolución. Ricardo W. Masuelli y Carlos F. Marfil .................................. 211Capítulo 4. Mutagénesis, TILLING y EcoTILLING. Alberto Prina, Alejandra Landau, María GabrielaPacheco y Esteban Hopp ................................................................................................................... 217Capítulo 5: Variación somaclonal. Susana Cardone, Sofía Olmos y Viviana Echenique. ............... 229Capítulo 6: Aplicación de la transformación genética al mejoramiento vegetal. Marina L. Díaz,Diego C. Zappacosta, Pascual M. Franzone y Raúl D. Ríos ............................................................... 243Capítulo 7: Usos del silenciamiento génico para el análisis funcional de genes candidatos.Cecilia Vázquez Rovere, Ariel Bazzini, Cecilia Rodríguez, Natalia Almasia y Sebastián Asurmendi .. 259Capítulo 8: Análisis de experimentos biológicos. Sofía Olmos, Miguel DiRenzo, Mercedes Ibá-ñez, Nélida Winzer .............................................................................................................................. 271Capítulo 9: Métodos multivariados para estimar variabilidad genética. Nélida Winzer, MiguelDiRenzo, Sofía Olmos y Mercedes Ibáñez. ......................................................................................... 283Parte III: Métodos para acelerar programas de mejoramiento e identificación varietal 295Capítulo 1: Obtención de plantas doblehaploides. Pablo Polci, Verónica Conti y Rubén Miranday Nicolás Gear. .................................................................................................................................... 297Capítulo 2: Aplicaciones de los marcadores moleculares. Alicia Carrera, Gabriela Tranquilli, An-tonio Garayalde y Marcelo Helguera. .................................................................................................. 311Capítulo 3: Marcadores moleculares y mejoramiento genético de cultivos. Carlos Sala, Maria-no Bulos, Analía Fresco y Emiliano Altieri. .......................................................................................... 325Capítulo 4: Identificación y registro de variedades. Ana Laura Vicario, Marcelo Labarta y MaríaAlicia Loray ......................................................................................................................................... 339Parte IV: Métodos de propagación y conservación de germoplasma 351Capítulo 1: Micropropagación. Sofía Olmos, Gabriela Luciani y Ernestina Galdeano .................... 353Capítulo 2: Semilla sintética. Hebe Rey y Luis Mroginski ................................................................. 363Capítulo 3: Conservación de germoplasma in vitro. Adriana Scocchi y Hebe Rey. ....................... 369Parte V: Ejemplos de aplicaciones de la biotecnología vegetal 377 Capítulo 1: Aportes de la citogenética al estudio de genomas vegetales. Lidia Poggio, Gra-ciela González, María Rosa Ferrari, Ana María García, Arturo Wulff, Eduardo Greizerstein, PabloTomas y Gustavo Schrauf. .................................................................................................................. 379Capítulo 2: Mejoramiento de plantas forrajeras en la era genómica. Germán Spangenberg,Mauro Meier y Viviana Echenique ....................................................................................................... 389 Capítulo 3: Caracterización molecular de la apomixis y su aplicación en la agricultura. Silvi-na C. Pessino y Juan Pablo A. Ortiz .................................................................................................... 403Capítulo 4: Avances de la biotecnología en cultivos ornamentales. Alejandro S. Escandón, Pa-blo A. Marinangeli y Mariana Pérez de la Torre. .................................................................................. 4214 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 6. Capítulo 5: Aplicación de la biotecnología en la mejora y conservación de especies forestales.Susana Marcucci Poltri, Leonardo Gallo, Noga Zelener, Susana Torales, Sandra Sharry .................... 435Capítulo 6: Técnicas de ingeniería genética para conferir resistencia a virus en plantas. Maria-na del Vas, Ana Julia Distéfano, Cecilia Vázquez-Rovere, Esteban H. Hopp. ..................................... 447Capítulo 7: Obtención de plantas resistentes a enfermedades bacterianas. Adrián Vojnov, Mer-cedes Rivero y Diego Zappacosta ....................................................................................................... 457Capítulo 8: Aproximaciones biotecnológicas para un manejo sustentable del estrés fúngicoen la agricultura. Juan Carlos Díaz Ricci; Ursula Tonello; Gustavo Martínez-Zamora; Sergio Sala-zar; Nadia Chalfoun; Gabriel Vellicce; Carlos Grellet; Paula Filippone; Alicia Mamani; Marta Ontiveroy Atilio Pedro Castagnaro. ................................................................................................................... 467Capítulo 9: Utilización de cultivos de tejidos para la obtención y conservación de plantas li-bres de enfermedades. Vilma Conci. ................................................................................................ 481Capítulo 10: Obtención de plantas resistentes a insectos. Dalia Lewi y Clara Rubinstein ............... 495Capítulo 11: Aplicaciones biotecnológicas al manejo de malezas. Germán Ferrari y Julio E. De-lucchi. .................................................................................................................................................. 507Capítulo 12: Obtención de plantas tolerantes a distintos tipos de estreses abióticos. Florenciadel Viso, Andrea F. Puebla, Néstor Carrillo y Raquel L. Chan ............................................................. 519Capítulo 13: Manipulación genética del metabolismo secundario en plantas. Alicia Zelada, Ma-ría Binaghi ........................................................................................................................................... 529Capítulo 14: Mejoras de calidad en alimentos. Clara Rubinstein, Gabriela Levitus ............................. 539Capítulo 15: Fitorremediación. María Eugenia Segretín, Paula Bey y Alejandro Mentaberry ............. 545Capítulo 16: Plantas como biorreactores. Fernando Bravo Almonacid, Sonia Wirth, María EugeniaSegretin, Mauro Morgenfeld, Ezequiel Matías Lentz. ......................................................................... 559Parte VI: Manejo responsable de la tecnología 569Capítulo 1: Criterios científicos para la evaluación de la bioseguridad de Organismos Genéti-camente Modificados. Clara Rubinstein ........................................................................................... 571Capítulo 2: Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados - Marcos Regulatorios.Moisés Burachik .................................................................................................................................. 583Capítulo 3: Flujo génico y su posible impacto ambiental. Mónica Poverene, Soledad Ureta yAgustina Gutiérrez. ............................................................................................................................. 595Capítulo 4: Detección de OGM en la cadena agroalimentaria. Florencia Longo y Ana Vicario. ....... 603Capítulo 5: Manejo integrado de plagas – Programa de Refugios. Viviana Confalonieri y CeciliaRoca. ................................................................................................................................................... 613Capítulo 6: Resistencia de malezas a herbicidas: evolución y estrategias de manejo. DanielTuesca, Luisa Nisensohn, Mario R. Sabbatini, Guillermo Chantre. ..................................................... 621Parte VII: Biotecnología y sociedad 631Capítulo 1: La transformación tecnológica y los nuevos desafíos. Carmen Vicién. .......................... 633 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 5
  • 7. Capítulo 2: Adopción de los cultivos genéticamente modificados en Argentina y en el mun-do. Gabriela Levitus ......................................................................................................................... 639Capítulo 3: Biotecnología en la mira: el problema de la percepción. Valeria Durand ............... 6436 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 8. PREFACIO En oportunidad de la Primera Edición de “Biotecnología y Mejoramiento Vegetal”, nos habíamospropuesto responder a la necesidad de un texto en idioma español, dirigido a docentes y estudian-tes de los cursos de Agronomía y de otras formaciones relacionadas con las tecnologías aplicadasal mejoramiento vegetal, así como brindar un recurso de información general y consulta para noespecialistas. Esta Segunda Edición, intenta actualizar, profundizar y extender estas temáticas,atendiendo a la rápida evolución en este campo del conocimiento. En el contexto de los principios básicos del mejoramiento, es decir, generar variabilidad genéti-ca y seleccionar características deseables, las tecnologías evolucionan rápidamente y, del mismomodo, se acelera la transferencia del conocimiento básico a las aplicaciones. Esta edición intentareflejar este proceso dinámico y aportar información actualizada con ejemplos de aplicaciones almejoramiento de diferentes especies vegetales. En este trabajo se han reunido las contribuciones de investigadores y especialistas en diferentescampos relacionados con el mejoramiento. En las secciones dedicadas a las herramientas básicas,se ha hecho foco en las técnicas de cultivo de tejidos y micropropagación que se utilizan en sí mis-mas para generar variabilidad, conservar germoplasma, producir clones libres de enfermedades ocomo paso obligado en la construcción de plantas transgénicas. En la sección que se ocupa de lasaplicaciones de estas técnicas a casos específicos, se brindan ejemplos de mejoramiento logradoen diferentes especies. La tecnologías “omicas” (genómica, transcriptómica, metabolómica) constituyen una de las herra-mientas más importantes en el mejoramiento, por la potencialidad que presentan, tanto en el campode la investigación básica, en el mapeo de genes y la identificación de marcadores moleculares,como en la identificación de funciones y redes regulatorias que influyen en las características que sedesean mejorar: resistencia a enfermedades y plagas, rendimiento, calidad nutricional y respuestasa diferentes tipos de estrés ambiental, entre otras. Es claro que dentro de las tecnologías de mejoramiento, la transgénesis o transformación ge-nética es una de las herramientas más versátiles y poderosas, ya que permite resolver problemasque por vía del mejoramiento convencional no sería posible enfrentar. En esta edición se presentannumerosos ejemplos de transgénesis para la obtención de cultivos tolerantes a estrés biótico yabiótico, a plagas y enfermedades o con mejoras en su calidad nutricional. Desde 1996, cuando se cultivaron por primera vez, la superficie mundial de cultivos transgénicosaumentó 80 veces, alcanzando las 134 millones de hectáreas en 2009. Según el último informe delISAAA (Servicio Internacional para las Adquisiciones Agrobiotecnológicas) estas hectáreas fueroncultivadas por 14 millones de agricultores de 25 países, siendo Argentina uno de los líderes enadopción, con el 16% del área global. Por otro lado, es importante notar que se han establecido sistemas de control a nivel internacionalpara regular el desarrollo y la aplicación de la ingeniería genética al mejoramiento de organismosvivos (conocidos como organismos genéticamente modificados u OGMs). Si bien éstos no se limitana plantas, en este trabajo se presentan sólo los aspectos regulatorios y de bioseguridad relaciona-dos con los cultivos transgénicos. Esperamos que esta nueva edición constituya una herramienta útil y accesible para docentes,estudiantes y profesionales que se dedican y se dedicarán a la noble tarea de mejorar la agricultura. Los Editores Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 7
  • 9. AGRADECIMIENTOSA todos y cada uno de los 141 autores, en su mayoría investigadores y profesionales de institu-ciones argentinas, que han contribuido con sus aportes.Al Dr. Francisco García Olmedo, reconocido investigador y catedrático español, por regalarnostambién el prólogo de esta segunda edición.Al Consejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología (ArgenBio), por aus-piciar la publicación del libro.A los revisores, colegas y personal de apoyo, por sus valiosas contribuciones para concretar esteproyecto. Los EditoresEl uso de fuentes y nombres comerciales en este documento es sólo para fines de identificacióny no implica ningún aval ni recomendación. Además, los contenidos u opiniones expresadas enesta publicación son de exclusiva responsabilidad de los autores.LISTAS DE AUTORES (por orden alfabético)Abriata Luciano A. Instituto de Biotecnología, INTA CastelarAguilar O. Mario IBBM, Facultad de Ciencias Exactas, UNLPAlmasia Natalia Instituto de Biotecnología, INTA CastelarAltieri Emiliano Nidera SemillasAsurmendi Sebastián Instituto de Biotecnología, INTA CastelarBazzini Ariel Instituto de Biotecnología, INTA CastelarBey Paula INGEBI, CONICETBinaghi María Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBABravo Almonacid Fernando INGEBI, CONICETBulos Mariano Nidera SemillasBurachik Moisés Dir. de Biotecnología, Min. de Agricultura, Ganadería y PescaCardone Susana Facultad de Agronomía, UBACarrari Fernando Instituto de Biotecnología, INTA CastelarCarrera Alicia Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurCarrillo Néstor IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNRCasati Paula CEFOBI, Universidad Nacional de RosarioCastagnaro Atilio Pedro EEAOC, TucumánCervigni Gerardo D. CEFOBI, Universidad Nacional de RosarioChalfoun Nadia INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánChan Raquel L. Universidad Nacional del LitoralChantre Guillermo CERZOS, CONICET, Universidad del SurConci Vilma INTA – IFFIVEConfalonieri Viviana Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA)Conti Verónica INTA-EEA Bordenavedel Vas Mariana Instituto de Biotecnología, INTA Castelardel Viso Florencia Instituto de Biotecnología, INTA CastelarDelucchi Julio E. Monsanto Argentina8 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 10. Díaz Marina L. CERZOS, CONICET, Universidad del SurDíaz Ricci Juan Carlos INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánDiRienzo Miguel Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de CórdobaDistéfano Ana Julia Instituto de Biotecnología, INTA CastelarDrincovich María F. CEFOBI, Universidad Nacional de RosarioDurand Valeria Ketchum Argentina - ArgenBioEchenique Viviana Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurEscandón Alejandro S. Instituto de Floricultura, INTA CastelarFeingold Sergio E. INTA - EEA BalcarceFelitti Silvina Universidad Nacional de RosarioFernández Aveliano Fac. Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE IBONEFernández Paula Instituto de Biotecnología, INTA CastelarFerrari Germán Monsanto ArgentinaFerrari María Rosa Universidad Nacional de Buenos AiresFilippone Paula EEAOC, TucumánFlaschland Eduardo Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) – IBONEFranzone Pascual M. IGEAF INTA CastelarFresco Analía Nidera SemillasFriedrich Pablo Universidad Nacional del SurFusari Corina Instituto de Biotecnología, INTA CastelarGaldeano Ernestina Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) – IBONEGallo Leonardo INTA - EEA BarilocheGarayalde Antonio CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurGarbus Ingrid CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurGarcía Ana María Facultad de Agronomía, UBAGarcía Olmedo Francisco Universidad Politécnica de MadridGear Nicolás SyngentaGómez Marisa CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurGonzález Graciela Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAGrasso Daniel H. Instituto de Suelos, INTA CastelarGreizerstein Eduardo Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBAGrellet Carlos INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánGutiérrez Agustina Universidad Nacional del SurHeinz Ruth Instituto de Biotecnología, INTA CastelarHelguera Marcelo INTA EEA Marcos JuárezHopp Esteban Instituto de Biotecnología, INTA CastelarIbáñez Mercedes Universidad Nacional de Río CuartoLabarta Marcelo Instituto Nacional de Semillas – INASELandau Alejandra Instituto de Biotecnología, INTA CastelarLavia Graciela I. Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONELentz Ezequiel M. INGEBI, CONICETLevitus Gabriela ArgenBioLewi Dalia IGEAF INTA CastelarLia Verónica Instituto de Biotecnología, INTA CastelarLongo Florencia Instituto de Biotecnología, INTA CastelarLoray María Alicia Dirección de Calidad - INASELuciani Gabriela CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurMamani Alicia INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánMarcucci Poltri Susana Instituto de Biotecnología, INTA CastelarMarfil Carlos F. INTA - EEA MendozaMarinangeli Pablo A. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurMartínez Ma. Carolina Instituto de Biotecnología, INTA Castelar Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 9
  • 11. Martínez-Zamora Gustavo INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánMasuelli Ricardo W. INTA - EEA MendozaMeier Mauro CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurMentaberry Alejandro Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAMiranda Rubén Asociación Cooperativas Argentinas (ACA), Univ. del SurMorgenfeld Mauro INGEBI, CONICETMroginski Luis Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) – IBONENisensohn Luisa Universidad Nacional de RosarioOlmos Sofía Laboratorio de Biotecnología, INTA PergaminoOntivero Marta INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánOrtiz Juan Pablo Facultad de Ciencias Agrarias, UNRPacheco Ma. Gabriela IGEAF INTA CastelarPaniego Norma Instituto de Biotecnología, INTA CastelarPérez Camargo Gladys Facultad de Agronomía, UBAPérez de la Torre Mariana Instituto de Floricultura, INTA CastelarPessino Silvina C. Facultad de Ciencias Agrarias, UNRPicca Aurora Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurPoggio Lidia Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAPolci Pablo Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurPoverene Mónica Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurPrina Alberto IGEAF INTA CastelarPuebla Andrea F. Instituto de Biotecnología, INTA Castelar Radice Silvia INTA CastelarRey Hebe Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONERíos Raúl D. IGEAF INTA CastelarRivero Mercedes Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBARobledo Germán Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONERoca Cecilia Dow AgrosciencesRodríguez Cecilia Instituto de Biotecnología, INTA CastelarRoncallo Pablo CERZOS, CONICETRubinstein Clara Monsanto Argentina – ILSISabbatini Mario R. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurSala Carlos Nidera SemillasSalazar Sergio INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánSansberro Pedro Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONEScarpeci Telma E. IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNRSchrauf Gustavo Facultad de Agronomía, UBAScocchi Adriana Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONESegretin Ma. Eugenia INGEBI, CONICETSeijo Guillermo Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONESelva Juan P. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurSharry Sandra Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de La PlataSolís Neffa Viviana G. Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) – IBONESpangenberg Germán Victorian Department of Primary Industries (DPI)Tomas Pablo FCA, Universidad Nacional del LitoralTonello Ursula INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánTorales Susana IRB, INTA CastelarTranquilli Gabriela IRB, INTA CastelarTuesca Daniel Facultad de Ciencias Agrarias, UNRUreta Soledad CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurValle Estela M. IBR - Facultad de Cs Bioquímicas y Farmaceuticas, UNRVázquez Rovere Cecilia Instituto de Biotecnología, INTA Castelar10 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 12. Vellicce Gabriel EEAOC, TucumánVicario Ana Laura Dirección de Calidad – INASEVicién Carmen Facultad de Agronomía, UBAVila Alejandro J. IBR - Facultad de Cs Bioquímicas y Farmaceuticas, UNRVojnov Adrián Fundación Pablo CassaráWinzer Nélida Universidad Nacional del SurWirth Sonia INGEBI, CONICETWulff Arturo Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAZappacosta Diego C. Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurZelada Alicia Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAZelener Noga IRB, INTA CastelarPRÓLOGOSPrólogo a la primera edición Recientemente, un periodista, que compartía una ensalada con un biólogo, exclamó: ¡Si yosólo aspiro a que la lechuga que yo tenga que consumir no tenga genes! Cuando el biólogo leexplicó que al comer ésta no había más opción que engullir unos 25.000 genes del genoma deLactuca sativa y varios miles de genes adicionales correspondientes a los genomas de los mi-croorganismos que habitual y cómodamente habitan en la superficie de las turgentes hojas, elperiodista quedó atónito. Según un eurobarómetro de hace unos meses, más de dos tercios de los europeos estaban encontra de los alimentos transgénicos. Sin embargo, en la misma encuesta se incluía una aseve-ración - los tomates normales no tienen genes, los transgénicos sí - frente a la que también másde dos tercios de los encuestados se mostraban de acuerdo o confesaban su ignorancia. Es unalástima que dicho eurobarómetro no registrara la proporción correspondiente al encabezamiento“no saben, pero sí contestan”, aunque es fácil colegir que dicha fracción era alta y en extremovergonzante. Los avances del conocimiento biológico y de la biotecnología destacan en el panorama cien-tífico-técnico de este fin de siglo y han impregnado las más diversas vertientes de nuestra vidacotidiana sin que se haya aceptado que un mínimo de estos conocimientos debería formar parteintegral de la cultura general. La ignorancia de los hechos básicos relativos a nuestra herenciagenética o a nuestra alimentación se considera incluso de buen tono. Esto se refleja de entradaen el caos semántico que se ha creado en torno a la biotecnología, del que hay que culpar nosólo a la ignorancia del ciudadano sino también a la torpeza de los científicos y a la dictadura delos medios de comunicación. Es preciso despejar este caos si queremos entendernos a partir dela ciencia, y no a sus espaldas. Términos tales como organismos genéticamente modificados (OGMs), alimentos transgéni-cos, ingeniería genética, ADN recombinante, transferencia génica, clonación, alimentos natura-les, mejora genética e, incluso, biotecnología, han invadido nuestro lenguaje cotidiano sin ordenni concierto. A estas alturas empieza a ser difícil normalizar la situación, pero tratemos de con-tribuir a ello. La definición de biotecnología abarca a todas las tecnologías mediadas por un ser vivo o porpartes de él, sean éstas células o enzimas aisladas. Bajo esta definición se incluyen desde lapropia agricultura, inventada hace diez milenios, y la fabricación de las veinticuatro clases decerveza mesopotámica, que tanto gustaban a Nabucodonosor, hasta la última forma de producir Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 11
  • 13. insulina humana. No es apropiado, por tanto, usar el término de forma restringida para referirseexclusivamente a los últimos avances basados en la biología molecular. Para esto último resultamás adecuado el uso de la expresión “biotecnología molecular”. Prácticamente la totalidad de lo que ponemos en nuestra mesa ha sido genéticamente modifi-cado. La domesticación de plantas y animales supuso una alteración muy drástica de sus geno-mas y la mejora genética subsiguiente ha ido añadiendo modificaciones extensas y sustanciales.Lo importante es la naturaleza de los cambios introducidos y no los métodos empleados paraello. De hecho, la ingeniería genética es sólo uno de esos métodos - una modalidad más de me-jora genética - y sólo sirve para modificar uno o pocos genes de forma muy selectiva. No serviríapara obtener razas de perro tan distintas - en su tamaño, morfología y temperamento - como elChihuahua y el Pit Bull Terrier, que en cambio han surgido de la mano del hombre gracias a losmétodos genéticos más tradicionales. En consecuencia, resulta absurdo denominar OGMs sóloa los productos de la ingeniería genética para contraponerlos a los supuestamente “naturales”. Casi nada de lo que ponemos en nuestra mesa es natural, hasta el punto que la mayoría delos organismos de los que derivamos nuestro alimento han perdido su capacidad de sobrevivirpor sí mismos en la naturaleza. Es más, para llegar a nuestra mesa han debido sufrir alteracionesgenéticas que les priven de infinidad de sustancias naturales que son tóxicas o inhibitorias parael ser humano. Una variedad moderna, modificada por ingeniería genética, está tan lejos de sernatural como las que la precedieron. ¡Por fortuna! Ya que es obvio que natural no es sinónimode inocuo. Se consideran organismos transgénicos aquellos cuyo genoma ha sido alterado por ingenieríagenética o, si se prefiere, por sastrería genética, ya que las operaciones fundamentales de estavía experimental consisten en cortar y coser (unir) piezas de ADN. Un gen es un tramo de ADN(una secuencia construida con las bases A, T, G, C) que, en general, determina una proteína (unasecuencia de aminoácidos), de acuerdo con las equivalencias plasmadas en la clave genética.Mediante la nueva tecnología se puede alterar un genoma por la adición de uno o varios (pocos)genes que previamente no formaban parte de él o por la inutilización de uno o varios genes entrelos ya existentes. Estas operaciones se hacen para conferir caracteres deseables y para eliminarcaracteres indeseables del organismo, respectivamente, objetivos que no difieren de los de lamejora genética tradicional. En lo que difieren la vieja y la nueva tecnología es en el repertorio génico que se puede mane-jar - genes de la misma especie, en el caso de la vieja, y de cualquier especie, en el de la nue-va - y en el modo de introducir y transferir la modificación genética, por vía sexual o por adiciónexógena (transformación), respectivamente. Los organismos modificados por transformación sesuelen denominar transgénicos. Llamar transgénicos a los alimentos derivados de dichos orga-nismos resulta menos apropiado porque, como dice el refrán, “degradado es todo gen que entrapor boca de cristiano”. Es absurdo llamar transgénico al azúcar procedente de una remolachatransgénica, ya que es un producto químico puro, esencialmente indistinguible del aislado de laremolacha normal o de la caña de azúcar. Con acertado criterio, los editores de esta obra han adoptado un tratamiento integral de todoslos métodos, objetivos y logros de la alteración genética de las plantas con fines prácticos. Faltanen nuestro idioma obras que acerquen con rigor a una parte tan importante de nuestra culturageneral. Las adaptaciones a los nuevos avances de textos preexistentes, hechas a menudo porun único autor, suelen adolecer de falta de familiaridad con la nueva tecnología. De aquí que laaproximación adoptada en esta obra, según la cual cada capítulo está a cargo de verdaderosespecialistas, sea la más apropiada en la actualidad. Dr. Francisco García Olmedo, 200412 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 14. Prólogo a la segunda edición La buena fortuna de un libro lleva aparejada la esclavitud de su autor o autores, que quedanencadenados a la necesidad de mantenerlo vivo en sucesivas ediciones. Estamos ante la segundaedición de “Biotecnología y Mejoramiento Vegetal”, un texto que, hace seis años, supuso una es-pléndida y afortunada aportación a la recensión de un área tecno-científica en vigorosa ebullición yde gran relevancia práctica. La necesidad de esta edición surge de múltiples circunstancias, entrelas que cabe resaltar el enorme avance del conocimiento que ha tenido lugar, la redefinición delos retos entonces planteados y la aparición de otros nuevos que han diversificado los objetivosprácticos de la disciplina. Además, entre la aparición de la primera edición y la de esta segunda, haocurrido una crisis alimentaria significativa que no es separable de otras, tales como la económica,la climática o la energética. Según todos los indicios, la crisis alimentaria va a ser duradera y obedece a factores múltiples: lasubida del precio del petróleo, el bajo nivel de reservas, la especulación, el incremento de la pobla-ción y del consumo per capita, el desvío de una parte sustancial de la producción agraria hacia lafabricación de biocombustibles, la disminución de los rendimientos por el estrés debido al cambioclimático y la falta de inversión en innovación agropecuaria. Parece como si el éxito relativo de lasúltimas décadas hubiera hecho bajar la guardia. En particular, la tasa de crecimiento de la producción de alimentos ha ido por detrás de la delcrecimiento de la población durante la última década, justo el tipo de comportamiento relativo quepropuso Malthus hace más de dos siglos. En el último medio siglo, ha sido la mejora genética laque ha tenido el protagonismo técnico en la derrota de la amenaza maltusiana, ya que la superfi-cie de suelo laborable apenas ha crecido. En la actualidad, se ha adquirido de pronto concienciade que no se sabe bien cómo se va a conseguir el aumento de la producción de alimentos en un70-100 % para el año 2050, necesidad que se considera mínima para alimentar una población pro-yectada de unos 9.000 millones de seres humanos que, además, tendrán una demanda per cápitasignificativamente superior a la actual. Si se quiere lograr dicho objetivo, habremos de ser aún máseficaces en las próximas décadas de lo que lo hemos sido en las precedentes. Por supuesto, las respuestas a los retos planteados ni han sido ni serán exclusivamente técni-cas, pero todas las estrategias posibles han tenido y tendrán un importante componente técnico yes sobre este componente sobre el que se centra el libro que ahora se reedita. El cambio climático está alterando los estreses bióticos y abióticos a que deben hacer frente lascosechas, lo que hace prioritaria la investigación básica y aplicada tanto en el esclarecimiento delos mecanismos involucrados como en la adaptación de las cosechas tradicionales a las nuevascondiciones, así como el desarrollo de nuevas cosechas que sean más apropiadas para condicio-nes extremas. La crisis energética ha impulsado un nuevo interés por los biocombustibles, en los que se hancentrado algunas esperanzas infundadas que han dado lugar a la formulación de objetivos políticosque pueden tener consecuencias perjudiciales para la alimentación mundial. Así por ejemplo, losobjetivos declarados para fechas próximas, tanto por lo EEUU como por la UE, están determinandouna competencia por el suelo agrícola de la generación de biocombustibles con la producción dealimentos que no puede sino encarecer significativamente los alimentos y aumentar el número dehambrientos en el mundo, así como contribuir a la destrucción de bosque tropical. Por otra parte,La búsqueda de especies y variedades aptas para la producción de biocombustibles plantea retosformidables a la investigación de su agronomía y a su mejora convencional y biotecnológica. Es en el escenario que a grandes rasgos acabamos de esbozar, donde la presente edición de“Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II” manifiesta su pleno potencial y debe alcanzar su máxi-ma funcionalidad. Dr. Francisco García Olmedo, 2010 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 13
  • 15. 14 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 16. Parte IHerramientas básicas Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 15
  • 17. 16 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 18. I - CAPÍTULO 1 1. Objetivo del cultivo: si bien es difícil tratar de clasificar las aplicaciones que se persiguen con el cultivo de tejidos, se podría esquemati-Establecimiento de cultivos de zarlas en aplicaciones para:tejidos vegetales • Estudios básicos. En este caso, los explan- tes cultivados pueden ser diversos. Si lo únicoLuis Mroginski, Pedro Sansberro y que se quiere lograr es un sistema de callosEduardo Flaschland para estudiar algún proceso fisiológico, se puede cultivar cualquier órgano, tejido o célula 1 Introducción viva. En este caso –en que lo único que se bus- ca es la inducción de callos– lo ideal es cultivar El cultivo de tejidos –en su acepción amplia– explantes jóvenes, derivados de semillas enpuede ser definido como un conjunto muy hete- germinación, donde se obtienen respuestas rá-rogéneo de técnicas que presentan en común pidas y, en general, hay menores problemas deel hecho de que un explante (una parte sepa- contaminación con microorganismos. A vecesrada del vegetal que pueden ser protoplastos – se hace uso del cultivo de tejidos porque repre-células desprovistas de pared celular– células, senta un sistema experimental que simplificatejidos u órganos) se cultiva asépticamente en la complejidad generada por los fenómenosun medio artificial de composición química de- de correlación entre las distintas partes quefinida y se incuba en condiciones ambientales normalmente están presentes en una plantacontroladas. La imprecisión de esta definición entera. El explante que se usará estará condi-puede generar muchas polémicas, pero es ac- cionado por lo que se quiere estudiar. Un buentualmente aceptada. Generalmente es común ejemplo lo constituye el cultivo de ovarios fe-dividir las técnicas del cultivo de tejidos en dos cundados del tomate para estudiar los reque-grandes grupos: a) cultivos en medios semisó- rimientos nutricionales durante el crecimientolidos y b) cultivos en medios líquidos, los que de los frutos. Asimismo, el cultivo de óvulos haa su vez pueden ser agitados (mediante el em- sido muy útil para estudiar aspectos relaciona-pleo de agitadores de uso continuo) o estacio- dos con la formación de las fibras en algodón.narios. También es frecuente dividir al cultivo El cultivo de discos de tallos brindó una valiosade tejidos atendiendo a los niveles de comple- ayuda para estudiar la rizogénesis in vitro.jidad en cultivo de órganos, cultivos celulares y • Obtención de plantas con sanidad contro-cultivo de protoplastos. Para el establecimien- lada. Es muy común la utilización del cultivo deto de los cultivos utilizando cualquiera de los tejidos para la obtención de plantas libres desistemas es necesario tener en cuenta algunos virus (ver VIII.-9). El explante ideal para ello esaspectos generales comunes relacionados con el meristema (dependiendo de la especie, deel explante, la asepsia, el medio de cultivo y 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo ylas condiciones de incubación. La discusión de de un par de primordios foliares.estos aspectos constituye el objetivo de este • Micropropagación. En este caso depende-capítulo. Adicionalmente se incluye el tema de rá del sistema que se quiere utilizar. Si lo quela aclimatación de las plantas regeneradas in se quiere explotar es la brotación de meris-vitro, que es de gran importancia en la mayoría temas, los ápices terminales y los segmentosde las aplicaciones del cultivo de tejidos en la uninodales de ramas jóvenes constituyen ex-agricultura. celentes explantes. En este caso el cultiva- dor de tejidos debe conocer perfectamente la biología de la reproducción de la planta para 2 Explante aprovechar aquellos explantes que en formaVarios factores deben ser tenidos en cuenta natural son propágulos. En cambio, si se pre-en la elección del explante apropiado para el tende micropropagar mediante el empleo deestablecimiento de los cultivos in vitro, entre semillas sintéticas (ver Parte IV, capítulo 2) elellos: explante original deberá posibilitar la inducción Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 17
  • 19. de la embriogénesis somática. En este caso, la • Establecimiento de suspensiones celula-utilización de embriones zigóticos inmaduros u res. En este caso se recomienda iniciar los cul-hojas, suelen ser frecuentes como explantes. tivos a partir de explantes extraídos de semillas • Obtención de híbridos interespecíficos. en germinación (hipocótilo, epicótilo, cotiledo-Una de las primeras aplicaciones del cultivo de nes, raíces).tejidos en la agricultura lo constituyó su empleocomo ayuda para la obtención de híbridos deri- 2. Posibilidad de contaminación con mi- croorganismos. De ser posible, se deben cul-vados de cruzamientos interespecíficos, donde tivar explantes de plantas donantes que crecense produce el aborto temprano de embriones. en condiciones de invernadero, con ello seEn estos casos, el explante cultivado es el reduce sustancialmente las tasas de contami-embrión cigótico en estadios tempranos de su nación. Por otra parte, es recomendable evitardesarrollo. Con la misma finalidad también se el uso de «explantes sucios» (raíces, rizomas)utilizan ovarios u óvulos fecundados. que provienen de plantas crecidas en macetas • Obtención de plantas de semillas con em- o en el campo, dado que en la mayoría de losbriones rudimentarios. Para esta finalidad los casos no es posible conseguir una buena des-explantes pueden ser semillas (por ej. orquí- infección de los mismos.deas) o bien, se aíslan los embriones en un es-tado temprano de desarrollo («corazón») como 3. Edad fisiológica. Este es un aspecto deen el caso de yerba mate o de algunas varieda- gran influencia en la morfogénesis. Como reglades de duraznero. general se puede decir que cuando más joven • Obtención de plantas haploides (consi- e indiferenciado se encuentre el explante a cul- tivar, mejor será su respuesta in vitro. Es porderando como haploide a un esporofito que ello que los meristemas apicales y axilares soncontiene el complemento gamético de cromo- ampliamente usados en numerosas especies.somas). En este caso, los explantes más uti- En el caso de la micropropagación de plan-lizados son las anteras, aunque también pue- tas leñosas, la edad del explante es un factorden emplearse microsporas aisladas, óvulos y crítico. Si los tejidos son jóvenes, la micropro-ovarios no fertilizados. pagación tiene mayores posibilidades de ser • Inducción de variación somaclonal. En este exitosa que con tejidos maduros. Este hechocaso se pueden utilizar varios explantes, pero genera la necesidad de realizar tratamientossi la finalidad de su utilización es la aplicación de rejuvenecimiento de las plantas donantesen planes de mejoramiento genético de plan- de explantes.tas, los explantes utilizados deben posibilitar laregeneración de plantas enteras. 4. Tamaño. En general, cuanto más grande • Producción y/o conversión de sustancias sea el explante mayores serán las posibilida-útiles. Se puede utilizar una gran variedad des de inducir la proliferación de callos o la re-de explantes. Los de raíces suelen ser muy generación directa de órganos. Sin embargo, a mayor tamaño de explante también son ma-utilizados. yores las probabilidades de que los cultivos se • Obtención de híbridos somáticos. Para esta contaminen con microorganismos. También esfinalidad se recurre a la fusión de protoplastos. necesario tener en cuenta que existe un ta-En la mayoría de los casos se aíslan los proto- maño mínimo del explante, que depende de laplastos de mesófilos de hojas y de suspensio- especie y del material vegetal, por debajo delnes celulares. cual no es fácil lograr el establecimiento de los • Conservación e intercambio de germo- cultivos. Los explantes muy pequeños suelenplasma. Los meristemas son los explantes requerir del empleo de medios más complejospreferidos para el desarrollo de sistemas de o de los denominados medios acondicionados.conservación a mediano y largo plazo (crío- 5. Epoca del año. Es un factor que suelenconservación con nitrógeno líquido) y para el tener mucha importancia en la micropropaintercambio de material genético. gación y que generalmente está asociado al18 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 20. grado de dormición que presentan ciertos ex- te –con la ayuda de un microscopio estereos-plantes (yemas, por ejemplo) y también con la cópico– los cultivos en forma periódica (por loposibilidad de mayor o menor proliferación de menos semanalmente). También se puedenmicroorganismos. realizar pruebas con medios de cultivo dife- renciales y «test» bioquímicos específicos. 3 Asepsia Para evitar y/o minimizar las contaminacio- nes de los cultivos con microorganismos es Uno de los principales problemas que se necesario:presentan cuando se tratan de establecer loscultivos es el de la contaminación de los mis- 1) Conocer el material vegetal con que se tra-mos con diversos tipos de microorganismos baja y los posibles contaminantes específicos.(hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, vi-rus). El ambiente generado por explante-medio 2) Realizar una adecuada preparación de lade cultivo-condiciones físicas de incubación planta dadora de explantes, cultivándola pre-es altamente propicio para la proliferación de ferentemente en invernaderos tratadas conmuchos de estos microorganismos que pue- productos químicos que eliminen patógenos yden provocar la destrucción de los cultivos. Es eventuales microorganismos endófitos.difícil cuantificar el impacto de estas pérdidas,pero en promedio, en laboratorios dedicados a 3) Proceder a la desinfección superficial dela micropropagación se lo puede estimar en al- los explantes mediante el uso de compuestosrededor del 10%. En el mejor de los casos, es- químicos con el objeto de eliminar los micro-tos microorganismos no destruyen los cultivos organismos con el menor daño posible parapero compiten con el explante por los nutrien- el explante. Si bien no es posible recomendartes del medio de cultivo o bien lo modifican. un procedimiento general, se puede señalarEs muy difícil conseguir cultivos estrictamen- que el procedimiento más popularizado con-te asépticos dado que en la mayoría de los siste en una doble desinfección mediante lacasos es altamente probable que los mismos inmersión de los explantes en etanol (70%v/v)contengan virus y fitoplasmas, por lo que en durante 20-60 segundos seguido de hipoclo-la práctica, cuando se refiere a cultivos asép- rito de sodio 1 -3%, contenido en el agua deticos, en general se quiere significar que son lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos,cultivos donde no se produce la proliferación dependiendo de la naturaleza del explante.de hongos y bacterias. Algunos procedimientos se basan en el em- Dos son las fuentes de contaminaciones: a) pleo de únicamente etanol o de hipoclorito demicroorganismos presentes en el interior o en sodio. Finalmente, es necesario eliminar losla superficie de los explantes y b) fallas en los restos de estos productos mediante varios la-procedimientos de cultivo en el laboratorio. La vados con agua destilada estéril.correcta detección de estas fuentes y del tipo En este último punto hay que aconsejar quede microorganismo son aspectos importantes se utilice agua destilada estéril de recientepara el éxito de los cultivos, pues por un lado preparación, dado que está demostrado que elayuda a determinar la fuente de contaminación almacenaje prolongado del agua estéril puedey por otro lado, ayuda a la planificación de los ser la causa de contaminaciones con bacte-procedimientos para controlarlos. Varios géne- rias. Es aconsejable realizar estas operacio-ros de bacterias (Pseudomonas, Xanthomonas, nes de desinfección superficial en una cámaraErwinia, Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus, de transferencia con aire estéril. En lugar delMicrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, hipoclorito de sodio se puede utilizar hipoclori-Mycobacterium, Corynebacterium) y de hon- to de calcio (6 -12 %) o el cloruro de mercuriogos filamentosos (Aspergillus, Penicilium, (0,1%- 1,5%). Es preciso recomendar extremaFusarium, Alternaria, Cladosporium y cautela con el empleo de este último compues-Neurospora) están frecuentemente en los cul- to, dado que es altamente tóxico y además notivos. Es conveniente inspeccionar visualmen- es removido con facilidad del explante. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 19
  • 21. En los casos en que no se utilice etanol, la croondas. El agua caliente también puede seradición de agentes tensoactivos junto con el usada. En el caso de sustancias termolábiles,desinfectante es una práctica recomendada. la esterilización se puede hacer mediante fil-Entre los más usados figuran Tween-20 (0,01 tración a través de filtros bacteriológicos.– 0.1%) o unas gotas de Triton. El lavado pre- No es posible recomendar ningún sistemavio de los explantes con agua corriente y de- de esterilización dado que la exitosa destruc-tergentes, ayuda a una mejor desinfección. La ción de los microorganismos depende de múl-inmersión de los explantes en soluciones con- tiples factores entre los que interesan el tama-teniendo sustancias antibióticas y /o antimicó- ño del recipiente, el tiempo de esterilización yticas (gentamicina, sulfato de estreptomicina, la naturaleza de la sustancia a esterilizar. Sinampicilina, tetraciclina, carbenicilina, sulfato de embargo, se pueden dar algunas sugerencias:gentamicina, pentacloronitrobenceno, rifam- • La esterilización en estufas mediante calorpicina, anfotericina B, benomil, carbendazim) seco (aire caliente) es recomendable para es-puede ser de utilidad, pero deben ser utilizados terilizar recipientes de vidrios secos (pipetas,en casos excepcionales. Estos productos tienen cápsulas de Petri, tubos). En estos casos, 2-4el inconveniente de que alteran la composición horas en estufas a 180-200 ºC brindan exce-de los medios de cultivo y además pueden ser lentes resultados.metabolizados por los explantes. • La esterilización con calor húmedo con va- Últimamente han aparecido soluciones bio- por bajo presión (en autoclave o en una «olla acidas que matan bacterias y hongos, previenen presión»). Es el procedimiento más empleadola germinación de esporas y a altas concen- para la esterilización de los medios de cultivotraciones pueden eliminar contaminaciones (salvo, como se indicó más arriba, para aque-de microorganismos endófitos. Uno de estos llos que posean componentes termolábiles).compuestos es el PPM (Plant Preaservative En este caso, lo más común es usar una pre-Mixture). Otro ejemplo es el denominado G-1, sión de 1.46 kg.cm-2 durante 20 minutos, conun compuesto derivado de los furfurales de la lo que prácticamente se destruyen todas lascaña de azúcar. Este compuesto, químicamen- formas de vida. Es importante que en todoste: 1-(5-bromofur-2-il)-2- bromo-2-nitroeteno los puntos del autoclave se alcance dicha tem-fue desarrollado en la Universidad Central de peratura, para lo cual hay disponibles cintaslas Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y detectoras colorimétricas.fungicida de amplio espectro. En los casos en que se utilicen plántulas cre- 5) Cultivar los explantes en una cámara decidas in vitro como plantas donantes de explan- transferencia con aire estéril («gabinete de flu-tes, es necesario desinfectar las semillas para jo laminar»), localizada en un ambiente limpiosu cultivo y germinación y luego es aconsejable y no expuesta a corrientes de aire. De no dis-desinfectar también las plántulas resultantes. poner este equipamiento, se pueden sustituir En algunos materiales vegetales se utiliza con cuartos esterilizados previamente con luzla preincubación de los explantes mediante lo ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV encual éstos son desinfectados suavemente y forma directa). La mesada de trabajo y las pa-precultivados durante 24 horas en un medio redes del gabinete deben ser desinfectadasconteniendo sacarosa, y finalmente son desin- previamente con etanol al 70%. De la mismafectados nuevamente y cultivados. manera deben ser desinfectados exteriormen- 4) Emplear medios e instrumentos de cultivo te todos los recipientes (conteniendo mediosesterilizados, es decir, liberados completamen- de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el áreate de cualquier microorganismo vivo o espo- del aire estéril.ras. Para la esterilización, en la mayoría de los Los operarios constituyen frecuentementecasos se hace uso del calor en sus diversas una importante fuente primaria de contamina-formas: llama directa, calor húmedo (en forma ción, porque es recomendable que, antes dede vapor abierto o bajo presión), calor seco comenzar a trabajar laven sus manos y ante-(aire caliente). Se pueden usar hornos a mi- brazos con abundante agua y jabón y se des-20 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 22. infecten con etanol al 70 %. La utilización de Tabla 1: Composición de tres medios básicosguardapolvos, guantes y máscaras protectoras usados en el cultivo in vitro de tejidos.de la boca y de la nariz, así como los gorros 1 Compuestos Medio básicoprotectores de los cabellos, ayudan a reducir MS N6 B5sensiblemente los niveles de contaminación. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, NH 4NO3 1.650 ----- -----tijeras, agujas, cápsulas de Petri) deben ser KNO 3 1.900 2.830 2.500 KH 2PO4 170 400 -----esterilizados antes de su uso. Muchos de es- CaCl 2.2H 2O 440 166 150tos instrumentos pueden ser colocados en eta- (NH4) 2SO 4 ----- 463 134nol al 95% y, antes de ser usados, se deben MgSO4.7H 2O 370 185 250 NaH 2PO 4.4H 2O ----- ----- 150flamear cuidadosamente en la llama de un me- KI 0,83 0,80 0,75chero. También es necesario flamear la boca MnSO 4.H2O ----- ----- 10,00de los recipientes que contienen los medios de H 3BO 3 6,20 1,60 3,00 MnSO 4.4H 2O 22,30 4,40 -----cultivo antes y después de cultivar el explante. ZnSO 4.7H 2O 8,60 1,50 2,00 6) Incubar los cultivos en cámaras o cuar- Na2MoO 4.2H 2O 0,25 ----- 0,25 CuSO 4.5H 2O 0,025 ----- 0,025tos de cultivo, cerrados, libres de corrientes FeSO 4.7H 2O 27,80 27,85 27,80de aire y bien higienizados. En lo posible se Na2EDTA 37,30 37,25 37,30debe restringir la circulación de personas, y los CoCl 2.6H 2O 0,025 ----- 0,025 Glicina 2,00 2,00 -----recipientes con cultivos contaminados deben Tiamina -HCl 0,10 1,00 10,00ser rápidamente eliminados de este sector. Es Piridoxina -HCl 0,50 0,50 1,00conveniente que antes del lavado, estos culti- Ácido Nicotínico 0,50 0,50 1,00vos sean esterilizados. Mioinositol 100,00 ----- 100,00 Sacarosa 30.000,00 50.000,00 20.000,00 4 Medios de cultivo PH 5,7 5,8 5,5 -1- 1. Un medio de cultivo puede ser definido 1) Composición en mg·Lcomo una formulación de sales inorgánicas y MS = Medio de Murashige y Skoog (Physiol. Plant. 15: 473 - 97. 1962)compuestos orgánicos requeridos para la nu- N6 = Medio de Chu,C.C., Wang,C:C., Sun,C.S., Hsu, C., Yin, K,C.,trición y manipulación de los cultivos. Existen y Chu, C. (Sci. Sinica 18: 6 59- 668. 1975) B5 = Medio de Gamborg, O.L., Miller,R.A. y Ojima, K. (Exp.Cellnumerosas formulaciones, cada una de las Res. 50: 151 - 158. 1968)cuales comprende entre 6 y 40 compuestos.Para dar una idea de la cantidad de formu-laciones disponibles, George y col., luego de • Otros compuestos.revisar más de 3.000 trabajos científicos des-criben en dos tomos (casi 1.000 páginas en to- Fuente de carbono: Prácticamente todos lostal) más de 2.000 medios de cultivo. También cultivos son heterótrofos (comparativamentedos empresas multinacionales ofrecen para la unos pocos son autótrofos) y por ende necesi-venta más de 60 medios cada una, listos para tan del suministro de una fuente de carbono.su utilización especialmente en la micropropa- La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%,gación comercial de plantas. En la Tabla 1 se es el azúcar más utilizado. En algunos mediospresentan tres medios que son muy usados en se la reemplaza por glucosa. En casos particu-la actualidad. lares se cita el empleo de maltosa o galacto- Básicamente, los medios de cultivo se com- sa. También myo-inositol (100 mg/L) suele serponen de compuestos que suministran: incorporado a los medios resultando un mejor • Una fuente de carbono crecimiento de los cultivos. • Nutrientes minerales Nutrientes minerales: Los medios de cultivo • ·Sustancias vitamínicas deben suministrar los mismos macro y micro- • Sustancias reguladoras del crecimiento nutrientes que son esenciales para el creci- • Agente gelificante (en el caso de medios miento de las plantas enteras. En general sesemisólidos) destacan las concentraciones relativamente Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 21
  • 23. altas de nitrógeno y potasio. El nitrógeno es agua de coco (5 a 15%), jugo de tomate y purésuministrado en forma de amonio y/o nitrato. de banana. También en ocasiones es necesa-También se pueden utilizar urea, glutamina y ria la incorporación de agentes antioxidantescaseína hidrolizada. Es fundamental que el hie- (L-cisteína, ácido ascórbico, polivinilpirrolido-rro sea incorporado juntamente con un agente na) para prevenir el ennegrecimiento tisularquelante (Na2EDTA), lo que lo hace disponible causado por la oxidación de polifenoles pre-es un amplio rango de pH. sentes en los explantes. Este ennegrecimiento puede causar la muerte de los mismos. Sustancias vitamínicas: De todas las que La preparación de los medios de cultivo pue-comúnmente se incorporan a los medios, pa- de llevarse a cabo de diferentes maneras, enreciera que la tiamina es la única realmente «lecturas recomendadas» se citan manualesimprescindible para el buen crecimiento de los de laboratorio donde se describen detallada-cultivos. mente este punto. Sustancias reguladoras del crecimiento: En 5. Condiciones ambientales para lala mayoría de los casos los medios utilizados incubación.para el establecimiento de los cultivos con-tienen auxinas (ANA, 2,4-D, AIA, AIB, NOA, La incubación de los cultivos se debe llevarDicamba, Picloram) y/o citocininas (BA, KIN, a cabo en condiciones controladas. Por lo me-ZEA, 2iP, Thidiazurón). Las giberelinas (es- nos en lo que se refiere a temperatura, calidadpecialmente GA3) son requeridas en algunas e intensidad de luz, fotoperíodo, humedad at-ocasiones para el cultivo de meristemas o para mosférica e higiene. Estas condiciones se lo-la elongación de brotes. El ABA, es usado en gran con el empleo de cámaras climatizadasalgunos casos. o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor) y una buena y uni- Agente gelificante (en el caso de medios se- forme circulación de aire en el interior y dota-misólidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el com- dos de un buen sistema de alarma para cortarpuesto más utilizado. También pueden em- la iluminación en caso de no funcionar el aireplearse «Agargel» (0,40-0,60%), «Transfergel» acondicionado. En general, los cultivos son in-(2,0-2,60%), «Phytagel» (0,25- 0,40%), agaro- cubados a temperatura constante de 25-28 ºC,sa (0,80-0.90%) y «Gelrite» (0,10-0,20%). con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lámparas fluo- Otros compuestos: Muchas sustancias, de rescentes del tipo «luz día» con una irradianciavariada composición química, suelen ser adi- de entre 50 y 200μmol m-2s-1. La humedad at-cionadas a los medios básicos. Además de la mosférica debe ser elevada (80- 90%).glicina, otros aminoácidos se pueden agregara los medios. Es el caso de L-tirosina, aspara- 6 Aclimatación de las plantas regenera-gina y cisteína, aunque hay que tener presente das in vitro.que en dosis altas pueden inhibir el crecimien-to de los cultivos. El carbón activado (0,1 a Durante el período de incubación, los cultivos5%) suele ser incorporado al medio, dado que son expuestos a condiciones ambientales disí-es probable que absorba metabolitos tóxicos miles al ambiente externo. La atmósfera internapara los cultivos. se caracteriza por presentar una considerable variación diurna en la concentración de CO2, En algunos medios se incorporan ácidos humedad relativa elevada, temperatura cons-orgánicos como el málico, el cítrico, el pirúvi- tante e intensidad lumínica baja. A su vez, elco y el succínico y es frecuente el empleo de medio de cultivo compuesto por concentracio-L-glutamina y de caseína hidrolizada. Aún hoy nes elevadas de azúcares (en aquellos siste-se siguen utilizando ciertos componentes de mas heterótrofos y semiautótrofos de micropro-composición química no bien definida como el pagación), sales y reguladores del crecimiento,22 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 24. sumado a la ausencia de microorganismos, del substrato, para mantener la temperaturageneran anormalidades morfológicas, anató- por encima de los 18-20 ºC.micas y fisiológicas que las plantas deberán Sin lugar a dudas, la opción más económicacorregir cuando son transferidas al ambiente es el empleo de la luz natural, disminuyendo suexterno. Este período de adaptación al nuevo irradiancia (20-50%) mediante el agregado dehábitat es llamado fase o etapa de aclimata- mallas de sombreado («saram»). No obstante,ción. La estrategia a implementarse durante el en aquellas latitudes donde el nivel medio demencionado ciclo deberá contemplar el control luz natural es bajo y los días son cortos du-minucioso de los parámetros ambientales (hu- rante una parte considerable del año, la luz ar-medad, temperatura y luz) de tal manera que tificial puede ser aplicada como complementopermita disminuir la deshidratación y, al mismo de la luz natural. Las lámparas tubulares fluo-tiempo, estimular la fotosíntesis con el objeto de rescentes del tipo «luz día» son empleadasgenerar un rápido crecimiento de los plantines. en horticultura para prolongar el fotoperíodo. El retraso en el desarrollo de la cutícula y la Asimismo, las lámparas tubulares de sodio altaescasa funcionalidad del aparato estomático presión presentan una distribución espectralque presentan las hojas de la mayoría de las de la energía adecuada para estimular fotosín-especies cultivadas in vitro, determinan una tesis y se emplean para tal fin en una ampliaalta tasa de transpiración que puede ocasionar variedad de cultivos.la muerte por deshidratación. El control de este Otro aspecto importante a tener en cuentaproceso fisiológico es de vital importancia du- lo constituye la elección del substrato, siendorante la aclimatación, teniendo en cuenta que la el adecuado aquel que permita el normal creci-disminución de la transpiración será gradual y miento y desarrollo de las raíces. Se puede em-dependerá de la rehabilitación de los estomas, plear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mez-así como también del desarrollo de la cutícu- clas de ellos, teniendo la precaución de rea-la. El equipamiento necesario estará sujeto a la lizar una esterilización previa. Es convenienteespecie, pudiendo utilizarse desde túneles de el agregado de fertilizantes, sea a través delpolietileno para plantas que posean un elevado substrato (fertilizantes de liberación controla-control de la transpiración (por ej. Malus pumila da) o bien mediante el sistema de riego (fer-o Agave tequilana) o bien, a través del empleo tilizantes solubles); empleándose proporcio-de cámaras climatizadas (Fig.1) equipadas con nes ricas en fósforo (N-P-K: 9-45-15) y potasiosensores que permiten un descenso paulatino (N-P-K: 4-25-35) que favorecerán el desarrollode la humedad relativa. En algunos casos pue- radicular y la rustificación de las plantas.de resultar necesaria la aplicación exógena de En todo momento deberá realizarse un rigu-ABA (hormona involucrada en el control del cie- roso control fitosanitario empleándose antibióti-rre de los estomas) o bien, el empleo de sus- cos, fungicidas e insecticidas de uso universal.tancias antitranspirantes que forman una capa En la Figura 1, se detalla un modelo de cá-semipermeable en la superficie de la hoja. En mara de aclimatación diseñada por los autoreseste último caso deberán tomarse algunas pre- y empleada por el Laboratorio de Cultivo decauciones debido a que pueden observarse re- Tejidos del Instituto de Botánica del Nordeste.acciones de fitotoxicidad. Básicamente, está compuesta por una fase Resulta imprescindible evitar la exposición a aérea construida en aluminio y policarbonatotemperaturas extremas tanto en la fase aérea alveolar (9) y un recipiente o batea (11) quecomo en el substrato. Mediante el empleo de contiene gránulos de arcilla expandida a fin deextractores y/o acondicionadores de aire com- facilitar el drenaje. Mediante el agregado debinados con un sistema de niebla, es posible arena u otro substrato adecuado, esta cámaraestablecer la temperatura de la fase gaseosa puede ser utilizada tanto para el enraizamientoentre los 25 y 30 ºC durante la estación estival, ex vitro de los brotes obtenidos en la etapa demientras que en la época invernal es necesa- multiplicación, así como también, para el en-rio, a veces, el empleo de mantas térmicas o raizamiento convencional (a «raíz desnuda»)serpentinas, sea de agua o aire caliente a nivel de estacas de tallos u hojas. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 23
  • 25. La humedad relativa de la fase aérea es con- Debido a la latitud geográfica en que se en-trolada por un sensor (6) ubicado por encima cuentra, la cámara está equipada con un acon-de la tubería de riego (4). El sistema humidifi- dicionador de aire (3000 frigorías) para evitarcador está compuesto por picos tipo «fog» y situaciones de estrés térmico en época estival.es alimentado por una bomba de bajo caudal A su vez, y dado que la mayoría de las espe-y alta presión (13). Con el propósito de evitar cies estudiadas son originarias de climas tro-el goteo que pudiese ocasionar el agua rema- picales y subtropicales, el sistema cuenta connente en las cañerías, el sistema consta de mantas térmicas que son colocadas por deba-una válvula solenoide de descarga y desagüe jo de los tubetes, manteniendo la temperatura(7). La fase gaseosa es renovada en forma in- del substrato durante el invierno. En este últi-termitente mediante el empleo de extractoresubicados en ambos extremos de la cámara (3) mo caso se agrega un material aislante entre lalos que, conjuntamente, introducen o extraen leca (10) y la malla de hierro (16) de tal maneraaire, generando un movimiento masal. de dirigir el calor hacia la fase aérea.24 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 26. 7. Agradecimientos.Los autores agradecen al Ing. Pablo A. Lunapor la planificación digital de la cámara de acli-matación. A la Secretaría General de Cienciay Técnica (UNNE) y al Establecimiento La Ca-chuera por el aporte financiero recibido paraconstruir la misma. 8. Lecturas RecomendadasGEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEOR- GE. 1987. Plant Culture Media . Vol. 1 (Formu- lations and Uses). Exegetics Limited. England. 567 pág.GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEORGE. 1988. Plant Culture Media . Vol. 2 (Commentary and analysis). Exegetics Limited. England. 420 pág.HURTADO, D.V. y MERINO, M.E. 1991. Cultivo de Tejidos Vegetales. Ed.Trillas. México. 232 pág.PÉREZ PONCE, J.N. 1998. Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. Instituto de Biología de Plantas.Santa Clara. Cuba. 390 pág.POSPOSILOVA, J.; I. TICHA, P. KADLECEK, D. HAISEL, S. PLZAKOVA. 1999. Acclimatization of micropropagated plants to ex vitro conditions. Biologia Plantarum 42: 481-497.ROCA, W.M. y L.A. MROGINSKI. 1993 (segunda edición). Cultivo de tejidos en la Agricultura: Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Cali, Colom- bia, 970 pág.TORRES, A.C.; L.A. CALDAS y J.A. BUSO. 1998. Cultura de Tecidos e Transformacao Genética de Plantas. (Vol.1) Embrapa. Brasil.509 pág.TORRES, A.C.; L.A. CALDAS, y J.A. BUSO. 1999 Cultura de Tecidos e Transformacao Genética de Plantas. (Vol.2) Embrapa. Brasil.355 pág. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 25
  • 27. I - CAPÍTULO 2 2.- Tipos de morfogénesis. Definiciones En condiciones de cultivo in vitro, las célulasMorfogénesis somáticas pueden regenerar embriones (FigSilvia Radice 1) o brotes, raíces y/o flores (Fig 2) como res- puesta a un determinado estímulo. La regene- 1.- Introducción ración es un proceso que comprende diferen- tes fases que se suceden de manera similarLa embriogénesis somática y la organogénesis para los tres tipos de morfogénesis citadas. Deson dos procesos morfogénicos muy frecuen- Klerk y colaboradores, en 1997, denominarontes en el cultivo in vitro de especies vegetales. a estas diferentes fases como adquisición deLa embriogénesis somática es el proceso por la competencia; fase de inducción y fase deel cual se obtiene una estructura similar a un realización.embrión cigótico sin que medie la fertilización En la primera fase, las células no respon-de las gametas, mientras que por organogé- den al estímulo organogénico pero adquierennesis pueden obtenerse tallos, raíces o flores. esa competencia durante una fase de desdi-Estos órganos son inducidos a partir de una ferenciación. En la segunda fase o fase de in-célula o de un grupo de células que, según las ducción, las células son receptivas al estímulocondiciones de cultivo, tienen la propiedad de morfogénico y hay una relación directa con elmantenerse en activa división. tipo, concentración y combinación de regula-Esta totipotencialidad celular fue enunciada dores del crecimiento agregados al medio depor Haberlandt en 1902, quien propuso la teo- cultivo y el órgano a desarrollar. En la fase dería de que todas las células vegetales tienen realización, la célula sufre las sucesivas divi-la capacidad de regenerar plantas completas. siones para formar el órgano determinado.Haberlandt no llegó a demostrar su hipótesis A partir de la siembra in vitro de diferentes ex-debido a que no pudo lograr la división celu- plantes relativamente grandes y en condicio-lar. Los medios de cultivo que empleaba no nes de cultivo adecuadas, puede inducirse laincluían reguladores del crecimiento debido a formación de nuevos órganos de manera direc-que esos compuestos eran aún desconocidos. ta, sin la formación de callo. Si la formación esLos avances en el cultivo de tejidos vegetales de brotes, raíces o flores se denomina organo-fueron muy lentos en sus inicios. En 1934, Whi- génesis directa. Si en cambio se induce la for-te pudo mantener, en forma ilimitada, el creci- mación de embriones somáticos, este procesomiento de raíces en medios líquidos a partir de se denominará embriogénesis directa (Figs. 1 yápices de tomate. Al mismo tiempo se identi- 3). Si por el contrario, a partir de la siembra deficó el ácido indol acético (AIA), que posibilitó un explante in vitro se observa la proliferaciónel mantenimiento indefinido de callos de za- de células en forma desordenada y sin ningunanahoria y tabaco in vitro. Posteriormente se función predeterminada, se iniciará la produc-descubrió el efecto de la leche de coco como ción de callos o suspensiones celulares (Figs.estimulante de la formación de callo sobre el 2 A y 3). La diferenciación de órganos a partircultivo de embriones de Datura stramonium. de callos, denominada morfogénesis indirecta,En 1948 Skoog y Tsui, trabajando con cultivos estará condicionada a la previa formación dede callo de tabaco, demostraron la existencia los meristemoides. Morfogénesis directa o in-de una regulación química en la parte aérea y directa fueron términos propuestos por Hicksen la raíz. Trabajos posteriores en callos de la en1980.misma especie, con el agregado de cinetina,la primera citocinina descubierta, permitieron 3.- Histología de la morfogénesisdemostrar que la diferenciación de brotes, raí-ces o de ambos, era regulada por el balance de Después de 48 horas de realizada la siembraauxinas/citocininas. del explante en el medio de cultivo adecuado,26 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 28. Figura 1: A-F embriogénesis somática obtenida por cultivo in vitro. A-C-E, embriogénesis somática en di-ferentes fases de crecimiento observada en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivado en MS + 1 mg l-1 deBAP. B-D-F, embriogénesis somática obtenida en diversos cultivares de Prunus sp a partir de embrioneszigóticos inmaduros cultivados en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 de Kin con una previa inducción en MS+ 2 mg l-1 de 2,4-D. Las reglillas representan 5 mm.a partir de una célula epidérmica o del mesófilo renciación de los nuevos órganos. Este tipo defoliar, como ocurre en las coníferas, se suce- meristema puede iniciarse en forma directa, aden una serie de divisiones mitóticas. Así se partir de células diferenciadas pertenecientes apueden observar, a través del estudio histológi- un explante cultivado in vitro, o indirectamente,co, pequeñas masas de células que contienen a partir de una célula o grupo de células dife-citoplasma denso y grandes nucleolos. Este renciadas que promueven la proliferación celu-conjunto de células, agrupadas a modo de es- lar (Fig 4 A). Su evolución determinará el cre-feras, fueron denominadas meristemoides por cimiento de un órgano, por ejemplo una yemaTorrey en 1966, y son responsables de la dife- adventicia (Fig 4 B). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 27
  • 29. Figura 2: A-E Organogénesis somática obtenida por cultivo in vitro. A, callo organogénico obtenido enAbelia sp. (André) Rehder cultivada en MS + 1 mg l-1 de picloran. B, Inicio de brotes (flechas) en hojascrecidas in vitro de “Crimson Gold” (Prunus persica L.) cultivadas en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 deKin. C, Brotes de Gerbera jamesonii Bolus obtenidos a partir del cultivo de capítulos florales en MS 0,05mg l-1 de IBA + 0.75 mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de GA3. D, brotes florecidos in vitro de Abelia sp. (André)Rehder cultivados en MS + 1 mg l-1 de BAP. E, raíces (flechas) crecidas de callo de Abelia sp. (André) Re-hder cultivadas en inducidas en MS + 1 mg l-1 de 2iP, previamente inducidas con 1 mg l-1 de picloran. Lasreglillas representan 5 mmLas células embriogénicas son similares a las po de células embriogénicas, el desarrollo decélulas meristemáticas debido a que no son las mismas no está sincronizado. Estas célulasdemasiado voluminosas, tienen gran cantidad son capaces de dividirse o de transformarsede ribosomas, citoplasma denso, un nucleolo en embriones según las condiciones del medioagrandado y pequeños granos de almidón. Es- de cultivo. Aquellas células que no desarrollantas células, que en general se agrupan, pueden proembriones comienzan el proceso de dife-variar en tamaño y número. Dentro de un gru- renciación, es decir se vacuolizan, disminuye28 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 30. el volumen de núcleo y nucleolo y desaparecen noso, sufre divisiones polarizadas formando unlos gránulos de almidón. embrión globular. Previo a esta polarización seLas experiencias demuestran que las células deposita almidón, luego se forma la epidermisembriogénicas se desarrollan sólo cuando se y adquiere simetría bilateral. Sucesivamente semodifican las condiciones de cultivo. En gene- observa el crecimiento de uno o más cotiledo-ral, cuando se reducen las cantidades de auxi- nes, el desarrollo de los tejidos provasculares,na y citocinina o se elimina la auxina. la iniciación de los ápices radicales y de tallo yLas células embriogénicas desarrollan como una progresiva acumulación de almidón, lípidosembriones cuando las condiciones experimen- y proteínas.tales permiten que estas expresen su poten- En el caso de un origen multicelular de los em-cial. Pueden ocurrir dos condiciones ontogé- briones somáticos pueden observarse diversosnicas diferentes, es decir que el origen de los patrones. Los embriones somáticos se formanembriones sea unicelular o pluricelular. a partir de grupos de células epidérmicas yEn el caso de iniciarse a partir de una célula, la subepidérmicas (Fig 4 C). Este tipo de ontoge-misma se aísla de las demás por una importan- nia de origen multicelular se llama comúnmentete modificación en su pared celular, en particu- budding o embriogénesis adventicia. Estas cé-lar por la gelificación de la laminilla media. Esta lulas pequeñas tienen una alta relación núcleo/célula, rodeada por un polisacárido mucilagi- citoplasma, citoplasma denso y un nucleolo vo- luminoso que se tiñe fuerte- mente. Se diferencian de las células embriogénicas por la falta de sustancias de reser- va, por su delgada pared ce- lular y su frecuente división celular. Estas estructuras se denominan proembriones globulares (Fig 1 A, B). En una etapa posterior desarro- llan una epidermis, un tejido provascular, acumulan mate- rial de reserva y se polarizan. Estas estructuras globulares desarrollan cotiledones y se transforman en embriones somáticos que presentan ápices caulinar y radicular. Para una misma especie puede ocurrir uno u otro tipo de inicio según las condicio- nes de cultivo. El desarrollo de un embrión somático de origen unicelular es compa- rable a la de un embrión ci- gótico. En dicotiledóneas, la etapa globular es seguidaFig. 3: Esquema de los diferentes procesos morfogénicos obtenidos por una etapa corazón quea partir de la siembra in vitro de diferentes explantes. Las líneas con- se corresponde con la adqui-tinuas expresan organogénesis o embriogénesis directa mientras que sición de la simetría bilateral:las líneas quebradas indican que la morfogénesis se obtiene por vía desarrollo de la epidermis,indirecta. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 29
  • 31. Figura 4: A-E Cortes histológicos de diferentes explantes cultivados in vitro. A, meristemoides (flechas)observados en cultivo de Silybum marianum L. en MS + 1 mg l-1 de AIA + 5 mg l-1 de BAP 10 x. B, yemasadventicias (flechas) en ápices de Fragaria x ananassa Duch. cultivados en Boxus + 0,1 mg l-1 de IBA + 0.5mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de GA3 4 x. C, grupo de células embriogénicas (flechas) en Codiaeum variegatum(L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón. 20 x. D, embriones somáticos en Codiaeum variegatum (L)Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón 10 x. E, embriogénesis secundaria en Codiaeum variegatum (L)Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón 10 x.de los estratos procambiales y de manera su- la raíz y al procambium en respuesta a la elon-cesiva el desarrollo del ápice radical. El ápice gación axial del embrión somático debido alde tallo se desarrolla más tarde, durante la eta- transporte de auxinas (Fig 1 C).pa cotiledonar. En los embriones somáticos de Los embriones de origen multicelular obtenidosalgunas especies hay una etapa intermedia en- por budding muestran la misma ontogenia quetre la globular y corazón llamada oblonga, que los cigóticos, como así también la produccióncorresponde a la individualización del ápice de de sustancias de reserva.30 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 32. Sin el seguimiento histológico detallado, la for- nos. Por esta causa, no es posible generalizarmación del embrión somático sólo puede ser metodologías o protocolos de trabajo debido aconfirmada por la germinación (Fig 1 F). Sin que los medios de cultivo, así como las condi-embargo, debido al bajo porcentaje de embrio- ciones de cultivo seleccionados, deben ser es-nes que llegan a esta etapa, esta tarea es casi pecíficos para cada situación en particular. Unimprescindible para una correcta evaluación de ejemplo de ello es el protocolo empleado porlas respuestas encontradas con los diversos Stamp and Meredith en diferentes cultivares demedios de cultivo empleados. Vitis vinifera. En cuatro de ellos fue posible laComparados con los embriones cigóticos de la obtención de embriones somáticos a partir demisma especie, los embriones somáticos fre- embriones cigóticos, pero estos resultados nocuentemente desarrollan de manera anormal se repitieron con el cultivar "Pinot Noir".o son inmaduros. La anomalía más frecuente-mente encontrada es la formación doble o tri- 4.2.- Varios son los compuestos químicos queple del sistema vascular, causada por la pobre influyen en los patrones morfogénicos in vitropolarización del transporte de auxinas. También dentro de los cuales podemos considerar:se puede encontrar un contenido excesivamen- 4.2.1.- la composición salina del medio de culti-te alto, reducido o ausente de las reservas de vo. La composición salina más empleada paraalmidón y/o proteicas, que el meristema apical o inducir la formación de callo, la organogénesisradical no estén desarrollados o que la embrio- directa o indirecta en la mayoría de las espe-génesis sea repetitiva o secundaria (Fig 4 E). cies vegetales, es la de Murashige & SkoogLa falta del meristema apical o una escasa (1962) (MS). Sin embargo, existen otras formu-deposición de sustancias lipoproteicas en los laciones diseñadas para inducir determinadosembriones somáticos de algunas especies no patrones morfogénicos. Existe además una es-debe ser tomada como una anormalía. Esto trecha relación entre la composición hormonalpuede ser un síntoma de inmadurez debido del explante y la concentración de reguladoresa la rápida formación de los mismos. En este del crecimiento agregada al medio de cultivo.caso una etapa intermedia que permita la ma- 4.2.2.- reguladores del crecimiento. Estosduración de las estructuras formadas permitirá compuestos pueden promover la morfogénesisincrementar el porcentaje de embriones somá- aún cuando la concentración salina no sea laticos capaces de germinar. adecuada. En condiciones óptimas de cultivo pueden aumentar significativamente la dife- 4.- Factores que afectan los procesos renciación de órganos. Para la inducción demorfogénicos embriones somáticos en muchas especies ve- getales es necesario el agregado de auxinas,Los cuatro principales factores que condicio- como ocurre en Tilia spp. Sin embargo paranan la obtención y el crecimiento de nuevos otras, como es el caso del crotón (Codiaeumórganos in vitro son: variegatum), es suficiente con el agregado de thidiazurón. El genotipo y el tipo y concentra-4.1.- el genotipo ción de reguladores del crecimiento empleados4.2.- las condiciones químicas seleccionadas están estrechamente relacionados.para realizar el cultivo. 4.2.3.- antibióticos. En procesos de transfor-4.3.- las condiciones físicas seleccionadas mación con Agrobacterium tumefaciens espara realizar el cultivo. muy común el agregado de antibióticos del tipo4.4.- el explante. cefotaxime; kanamicina y carbenicilina para la eliminación de la bacteria. En explantes de4.1.- El genotipo es un factor determinante en hoja de diferentes cultivares de Malus domes-todos los procesos morfogénicos, desde la ca- tica se encontró que 250 mg L–1 de cefotaximepacidad del explante para su establecimiento en aumentan significativamente la regeneracióncondiciones in vitro a la proliferación de callo, o de brotes mientras que 500 mg L–1 de carbe-la diferenciación y crecimiento de nuevos órga- nicilina promueven la formación de callo y la Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 31
  • 33. kanamicina inhibe los procesos morfogénicos. dicionada por el tipo y tamaño del envase selec-4.2.4.- carbón activado. En general se usa para cionado para el cultivo, así como también por eladsorber compuestos tóxicos de la micro atmós- sistema de cobertura del mismo. Las tapas usa-fera gaseosa o el exceso de reguladores del cre- das en cultivo in vitro varían desde el tapón decimiento presentes en el medio de cultivo pero algodón; papel de aluminio; película de resiniteE.K. Pettersson y su equipo de colaboradores de transparente o tapas rígidas de polipropileno. Ella Swedish University of Agriculture, demostraron intercambio gaseoso es diferente para cada tipoque puede promover la embriogénesis somática de tapa, en consecuencia la atmósfera internadebido a la incorporación de ciertos compuestos también sufrirá variaciones.al medio de cultivo por difusión. En condiciones in vivo la atmósfera contiene 784.2.5.- agar. Otro aspecto importante a tener en % de nitrógeno; 21 % de oxígeno y 0,035 % decuenta es la consistencia del medio de cultivo. dióxido de carbono. En cultivos in vitro se hanPuede emplearse como semi-sólido o líquido. El registrado además, etileno y otros compuestosagente gelificante más utilizado en el cultivo in hidrocarbonados.vitro es el agar, extraído de diversas algas ma- El nivel de oxígeno disponible para el explanterinas. Las diferentes calidades existentes en el condiciona el crecimiento y los procesos morfo-mercado modifican la expresión morfogénica génicos. En general se necesita una buena airea-debido a que pueden contener sustancias inhi- ción para obtener cualquier tipo de proceso mor-bitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el fogénico. En alfalfa se puede obtener un buencaso del cultivo de hojas de Actinidia chilensis incremento de material a partir de suspensiones(en medio de MS con el agregado de 0,1 mg/L de celulares embriogénicas cuando la solución seAIA + 1 mg/L de BAP) cuya respuesta morfogéni- satura con 70% de oxígeno. Por el contrario, unaca varió según el tipo de agar utilizado. Cuando tensión de oxígeno del 5 % estimula la produc-el gelificante empleado fue Chubut-agar, de pro- ción de plantas a partir de anteras de tabaco.ducción nacional, se observó una gran diferen- La concentración de dióxido de carbono (CO2) enciación de yemas adventicias, mientras que con la atmósfera gaseosa in vitro varía según la res-el agregado de agar SIGMA R sólo se indujo la piración y la actividad fotosintética de las plantas.proliferación de callo. En condiciones de oscuridad, el CO2 incrementa En caso de seleccionar medios de cultivo líqui- mientras que en condiciones de luz, disminuye.dos, la respuesta morfogénica observada varía En trabajos realizados con Ficus lyrata se hande manera considerable. El cultivo líquido es im- encontrado concentraciones variables, entre 0,5prescindible cuando se busca promover la mor- % y 8,5 %, según el tipo de sello o tapa emplea-fogénesis indirecta a través de suspensiones ce- dos. Concentraciones superiores al 1 %, que sonlulares. Para ello es necesario cultivar los callos generalmente tóxicas en condiciones in vivo, pro-en medio líquido con agitación para permitir que bablemente no fueron limitantes para la actividadlas células se disgreguen y puedan diferenciar fotosintética.raíces, brotes o embriones somáticos en forma La presencia de etileno en condiciones in vitroaislada. promueve diversas respuestas. Su acumulación La elección de un medio de cultivo líquido o tiene efectos inhibitorios sobre el cultivo de cé-sólido depende, además, de la especie con la lulas, callos y anteras, La cantidad de etilenoque se trabaja. En Cymbidium, por ejemplo, se producida in vitro varía con la especie, el tipo deha observado que el empleo de medio líquido explante, la concentración de citocininas en elpromueve una mayor diferenciación de proto- medio de cultivo, el tipo de agar utilizado y con lacormos respecto del mismo gelificado. A su vez, luz. Una forma de incorporar etileno al envase deeste proceso puede mantenerse durante varios cultivo es a través de la esterilización del materialsubcultivos, mientras que en medio de cultivo ge- de disección realizada con el material embebidolificado se observó que los protocormos tienden en alcohol y flameado con mechero Bunsen. Ena formar tallos. muchos casos el etileno actúa como promotor de4.2.6.- atmósfera gaseosa. Es un factor determi- la morfogénesis pero luego es inhibitorio del cre-nante en los procesos morfogénicos y esta con- cimiento de los órganos diferenciados32 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 34. 4.3.- Entre las condiciones físicas podemos men- cultivadas en un mismo medio de cultivo, segúncionar los efectos de la temperatura, la humedad la porción de la lámina utilizada (Pedroso y Pais,relativa y la luz. 1993). Estos investigadores cultivaron estas ho-4.3.1.- La temperatura de incubación de los cul- jas in vitro durante seis semanas previa inmersióntivos es un factor importante a tener en cuenta. del explante en una solución de IBA (1 mg l–1) du-Si bien en condiciones naturales las plantas ex- rante 20 minutos (Fig 5).perimentan diferencias térmicas durante el día yla noche, las temperaturas in vitro se mantienencasi estables. Es importante señalar que cuantomás se asemejen las condiciones in vitro a lasóptimas de crecimiento de la especie estudiada,mayor será la respuesta obtenida. En cultivos dehojas de Streptocarpus x hybridus sometidos adiferentes temperaturas se observó que la rege-neración mayor de brotes se producía a 12 ºCmientras que por encima de los 30 ºC, práctica-mente no se observó diferenciación.4.3.2.- La humedad relativa (HR), como medidade la cantidad de vapor de agua contenida enla atmósfera gaseosa, es otro de los parámetrosfísicos a tener en cuenta. La HR dependerá del Figura. 5: Esquema de las diferentes respuestassello o cobertura del envase empleado. Si este morfogénicas obtenidas después de seis semanascierre es hermético, la humedad interior será del de cultivo in vitro de hojas de Camellia japonica L. según la porción de la lámina. 1, callo organogéni-100 %. Si en cambio existe la posibilidad de un co. 2 embriogénesis somática directa. 3, regenera-intercambio gaseoso la humedad interna pue- ción directa de raíces. 4, callo organogénico.de descender a niveles cercanos al 50 %. Esteimportante descenso de la HR puede promoveruna pérdida veloz de agua del medio de cultivovariando la concentración de sus compuestos Lecturas recomendadashasta llegar a niveles tóxicos (Debergh, comuni-cación personal). Buddendorf-Joosten J.M.C. and Woltering E.J.4.3.3.- La luz suministrada a los cultivos debe 1994. Components of the gaseous environmentser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad and their effects on plant growth and develop-y período de suministro. La respuesta morfogé- ment in vitro. Plant Growth Regulation 15: 1-16.nica de un explante puede variar según si se le De Klerk G.J., Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. and Neumann K.H. 1997. Regeneration of roots,proporciona luz o no. Para estimular la formación shoots and embryos: physiological, biochemicalde callo, es común que se prefiera la oscuridad. and molecular aspects. Biologia Plantarum 39El suministro de luz favorece la diferenciación de (1): 53-66.órganos. George E. 1993. Plant propagation by tissue culture Part 1 The technology. Butler and Tanner Ltd4.4.- Tal como ya se señaló anteriormente, los (ed). Gran Bretaña. 1361pp.proceso morfogénicos dependen del genotipo, Hicks G.S. 1980. Patterns of organ development inpero a esto debe sumarse el efecto del explante plant tissue culture and the problem of organ de-seleccionado. El tratamiento de la planta madre, termination. Bot. Rev. 46: 1-23.las condiciones físicas y fisiológicas en las que Williams E.G. and Maheswaran G. 1986. Somatic embryogenic factors influencing coordinated be-ésta se encuentre y el sector del cual se tome havior of cells as an embryogenic group. Ann.el explante determinarán a su vez la respuesta Bot. 57: 443-597.morfogénica en condiciones in vitro. Un ejemplomuy interesante es la diferente respuesta morfo-génica observada en hojas de Camellia japonica Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 33
  • 35. I - CAPÍTULO 3 mosómico). Esta caracterización se realiza en metafase mitótica debido a que, en esta fase, los cromosomas han alcanzado su máxi-La citogenética molecular e inmu- mo grado de condensación y sus límites estánnocitogenética en el estudio de perfectamente definidos. Para este análisis ge-los genomas vegetales neralmente se emplean tejidos meristemáticos porque presentan un alto índice mitótico (i.e.Guillermo Seijo; Graciela I. Lavia; la razón entre el número de células en divisiónGermán Robledo; Aveliano Fernández; y el número total de células observadas). LosViviana G. Solís Neffa órganos (ápices radicales o caulinares, óvulos, etc.) son pre-tratados con diversas sustancias 1 Introducción que inhiben la formación del huso mitótico (col- chicina, 8-hidroxiquinoleína, paclosol, etc.) a La comprensión de la organización de los los efectos de acumular metafases, dispersargenomas lograda a través del análisis citoge- los cromosomas en el citoplasma y producirnético ha tenido un gran impacto en la evalua- una mayor condensación de los mismos. Losción y utilización de la biodiversidad, así como materiales se fijan y luego se tiñen con colo-en el mejoramiento genético y la ingeniería ge- rantes nucleares (fucsina básica, orceína, car-nética, en particular, desde el desarrollo de las mín, giemsa, etc.). Finalmente, se confeccio-técnicas de citogenética molecular. El empleo nan los preparados por macerado y aplastadosondas de ADN y de anticuerpos conjugados (“squash”) del material sobre un portaobjetos.con fluorocromos en un número creciente de Con estos métodos de tinción, los cromoso-especies vegetales ha permitido, entre otros lo- mas metafásicos observados con un micros-gros, la localización de secuencias específicas, copio óptico aparecen uniformemente teñidos,la identificación de cromosomas particulares, el excepto en el centrómero (constricción pri-estudio del origen y la estructura de los geno- maria) y en algunas constricciones menoresmas de híbridos y poliploides, la comparación (secundarias).de regiones genómicas homólogas, el estudio Mediante la observación microscópica sedel comportamiento cromosómico y el análisis determina el número cromosómico somáti-de la expresión génica. Por ello, las técnicas de co (2n) y, a través del análisis de microfotogra-hibridación in situ (ISH) e inmunocitogenética fías o dibujos de metafases con cromosomasconstituyen actualmente herramientas indis- bien definidos y separados (Fig. 1A), se esta-pensables para la comprensión de la organiza- blecen los cariotipos. Para ello, se analiza lación y la expresión del genoma de las plantas. morfología de los cromosomas determinando En este capítulo se describen, en primera la posición del centrómero y la longitud deinstancia, algunos de los criterios empleados los brazos corto (bc) y largo (bl), así comotradicionalmente para la caracterización cario- la longitud total (lt) de cada cromosoma. Atípica y, posteriormente, se presentan los prin- partir de estas medidas, se calcula el índicecipios y las aplicaciones de diferentes técnicas centromérico [IC = (bc / lt) × 100], según elde hibridación in situ de ácidos nucleicos y de cual los cromosomas se clasifican en cuatro ti-inmunodetección de modificaciones epigenéti- pos morfológicos: metacéntricos (m, IC = 50 -cas de nucleótidos e histonas. 37,5), submetacéntricos (sm, IC = 37,5 - 25), subtelocéntricos (st, IC = 25-12,5), acrocén- 2 Citogenética clásica tricos (t, IC = 12,5 - 0) y telocéntricos (T, IC = 0). Otro aspecto a considerar para caracte- La caracterización cromosómica de espe- rizar morfológicamente a los cromosomas escies o variedades de plantas se inicia con la la presencia y la posición de las constriccionesdescripción del cariotipo a través del análisis secundarias, así como la presencia y el tipodel número, el tamaño y la forma de los cro- de satélites. En general, las primeras corres-mosomas que presentan (complemento cro- ponden a regiones organizadoras de los nu-34 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 36. cleolos (NORs) y los últimos a las porciones tricos) y, dentro de cada tipo, según su tamañocromosómicas distales delimitadas por la cons- (de mayor a menor) ubicando los centrómerostricción secundaria y el telómero de los brazos alineados a una misma altura y los brazos cor-que los portan. Los cromosomas que presen- tos hacia arriba. En las plantas diploides (Fig.tan satélites se denominan cromosomas SAT 1C y E) y alopoliploides, el cariotipo se com-(Fig. 1A, E y F). pone de pares de cromosomas homólogos; Para la confección del cariotipo los cromo- mientras que en las autopoliploides (Fig. 1D ysomas del complemento se ordenan según su F) se compone de grupos de tres o más cro-morfología (de metacéntricos a submetacéntri- mosomas de acuerdo con el nivel de ploidía.cos, subtelocéntricos, acrocéntricos y telocén- El orden que ocupa en el cariotipo cada par oFIGURA 1. A-D: Metafases mitóticas teñidas con coloración de Feulgen. A: Lathyrus macropus, 2n = 2x =14, las flechas señalan los satélites de los cromosomas SAT. B: Oziroe argentinensis [citada en Fernándezy Daviña (1991) como Fortunatia biflora], 2n = 2x = 30, con un cariotipo asimétrico. C y D: Turnera sidoidessubsp. pinnatifida, C: citotipo diploide, 2n = 2x = 14 y D: citotipo tetraploide, 2n = 4x = 28. E-F: Idiogramasde los citotipos diploide y tetraploide de Turnera sidoides subsp. pinnatifia ilustrados en C y D, respectiva-mente. En gris se representan los satélites de los cromosomas SAT. La barra representa 10 micras en A yB, 5 micras en C y D y 2,5 micras en E y F. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 35
  • 37. grupo de cromosomas se indica mediante un (Fig. 2A). Además, pueden utilizarse diversosnúmero y, mediante una letra, el tipo cromosó- fluorocromos que tienen la capacidad de inter-mico al que pertenece de acuerdo a su morfo- calarse preferentemente en regiones del ADNlogía. La representación gráfica del cariotipo se con una composición de bases particular. Pordenomina idiograma (Fig. 1E y F). La compo- ejemplo, las regiones ricas en adenina y timinasición de un complemento cromosómico tam- son reveladas con DAPI (4,6-diamidino-2-feni-bién se puede expresar mediante una fórmula lindol diclorhidrato) o quinacrina, mientras quecariotípica, en la que se indica el número de las ricas en guanina y citosina lo son con CMA3cada tipo morfológico de cromosomas que pre- (cromomicina A3). Las bandas pueden ser desenta el material analizado (ej. 16 m + 10 sm tamaño e intensidad diferentes y presentar una+ 2 st + 2 t). Entre los parámetros cuantitativos distribución particular sobre los cromosomasmás utilizados para caracterizar los cariotipos de un complemento generando un patrón dese encuentra el grado de asimetría que pre- bandeo característico (Fig. 2B). Estas técnicassentan los mismos. Para ello, se emplean ca- de bandeo cromosómico han permitido, entegorías o índices de asimetría cromosómi- muchos casos, la identificación inequívoca deca que consideran las diferencias de tamaño cromosomas homólogos, la caracterización deentre los cromosomas del cariotipo (asimetría genomas así como el seguimiento de cromo-intercromosómica), y las diferencias morfoló- somas o bloques cromosómicos en híbridos ygicas de los cromosomas derivadas de la pro- líneas de introgresión.porción entre sus brazos (asimetría intracro- La diferenciación lineal de los cromosomasmosómica). Un cariotipo simétrico es aquel por técnicas de bandeo no siempre es eviden-cuyos cromosomas son aproximadamente del te en todos los grupos de plantas y, aún enmismo tamaño y en su mayoría metacéntricos, aquellas especies que presentan buenos pa-mientras que uno asimétrico es aquel que trones de bandas, a menudo no se cuenta conpresenta cromosomas de diferentes tamaños un número significativo de marcadores comoy predominantemente submetacéntricos, acro- para integrar los mapas de ligamiento con loscéntricos o telocéntricos (Fig. 1B). La informa- mapas físicos. La posibilidad de posicionar se-ción obtenida a partir del análisis de los cario- cuencias particulares sobre los cromosomas y,tipos permite identificar cromosomas, clasificar de esta forma, generar un gran número de mar-los cariotipos, realizar análisis comparativos cadores cromosómicos ha sido posible graciasentre grupos de especies más o menos rela- al desarrollo de las técnicas de hibridación incionadas e inferir sus tendencias evolutivas. situ, cuyo uso se ha generalizado a partir delAsimismo, permite detectar las anomalías nu- desarrollo de sistemas de marcado y de detec-méricas y estructurales en los complementos ción de sondas no radiactivas.cromosómicos de células o individuos. En numerosos grupos de plantas, la identi- 3 Hibridación in situ fluorescente (FISH)ficación de los diferentes pares de homólogosdel cariotipo puede resultar engorrosa debido Esta técnica se basa en reacciones de re-a que presentan cromosomas con morfología conocimiento y asociación de bases entre unmuy similar. En estos casos, la aplicación de segmento del ADN cromosómico (secuen-determinados tratamientos en combinación cia blanco) y una secuencia complementariacon diferentes tipos de tinción, puede revelar marcada (sonda). La misma se aplica a pre-regiones cromosómicas con condensación o paraciones de células somáticas o germinales,composición cromatínica diferencial (bandas), previamente incubadas con enzimas (celulasa,generando marcadores cromosómicos adicio- pectinasa y citohelicasa) que remueven lasnales. Así, el tratamiento de los cromosomas paredes celulares. Las preparaciones son tra-con un álcali y la posterior tinción con Giemsa tadas con ARNasa A para evitar hibridacionesrevela regiones de heterocromatina consti- inespecíficas de la sonda con ARNs y, poste-tutiva, mientras que la impregnación argénti- riormente, son permeabilizadas mediante laca (bandeo Ag-NOR) revela las NORs activas incubación con proteasas. Las sondas pueden36 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 38. ser marcadas con nucleótidos unidos a hapte- Desde el desarrollo inicial de la técnica denos (digoxigenina, biotina, etc.) o a fluorocro- FISH, se han mejorado sustancialmente tantomos (Cy3, Cy5, etc.) por la reacción en cadena la sensibilidad (i.e. el tamaño mínimo de unade la polimerasa (PCR), por una transferasa secuencia que puede ser detectada bajo el mi-terminal o por medio de la actividad exonu- croscopio) como el poder de resolución es-cleotídica y de la subsiguiente polimerización pacial (i.e. la distancia física mínima a la querealizadas por la ADN pol I a partir de escisio- dos secuencias pueden ser identificadas comones simples causadas por una ADNasa (nick independientes). Bajo condiciones óptimas detranslation). La sonda marcada, componiendo hibridación y de detección, la sensibilidad deuna mezcla de hibridación que contiene forma- esta técnica depende de la accesibilidad demida y ADN bloqueante (entre otros compo- la sonda a la región complementaria sobre elnentes) es colocada sobre las preparaciones ADN. La misma, a su vez, está determinadacromosómicas, para luego realizar una desna- por el grado de condensación de la cromati-turalización conjunta del ADN de los cromoso- na. El éxito de FISH se debe a las indudablesmas y de la sonda, a temperaturas que varían ventajas que ofrece frente a las técnicas clási-entre 70 ºC y 90 ºC durante unos 10 minutos. cas para identificar homologías y, sobre todo, aPosteriormente, los preparados son incubados la posibilidad de contar con una amplia bateríaa 37 ºC durante al menos 1 hora (normalmente de sondas disponibles de acuerdo con la na-toda la noche) a fin de inducir la hibridación. turaleza de la secuencia blanco que se quieraEn este paso, la sonda y la secuencia cromo- detectar.sómica complementaria al blanco compiten en- En general, se pueden utilizar sondas detre sí, pero debido a la alta concentración de ADN de copia única, moderadamente repe-la primera y a su menor tamaño, bajo condi- titivo o altamente repetitivo. Las secuenciasciones óptimas, la sonda hibrida en todos los repetitivas pueden ser conservadas o varia-sitios complementarios a lo largo de los cro- bles y estar dispuestas en tándem (i.e. una co-mosomas. En el caso de las sondas marcadas pia está seguida de otra en arreglos de decenascon haptenos, la detección de los sitios de hi- a miles de copias formando un locus definido)bridación se realiza mediante una o dos rondas o dispersas (i.e. las repeticiones pueden estarde anticuerpos conjugados con fluorocromos. dispuestas a lo largo de una región cromosómi-Los preparados se analizan con microscopios ca, de algunos cromosomas o de todo el com-de epifluorecencia utilizando filtros específicos plemento). Entre las secuencias repetitivas, laspara cada fluorocromo, registrando la presen- sondas de los genes ribosomales (ADNr) 45Scia, el tamaño y el número de señales fluo- y 5S son las empleadas con mayor frecuenciarescentes por complemento. Normalmente, para la generación de marcadores cromosómi-se obtiene una microfotografía monocromática cos por FISH. Esto es debido a que son se-por cada sonda utilizada y una del complemen- cuencias altamente conservadas y a que pre-to cromosómico teñido con DAPI o ioduro de sentan una disposición en tándem que facilita lapropidio. Estas microfotografías son super- detección de los loci. Los mismos pueden estarpuestas e integradas en una sola imagen. El presentes en más de un sitio por complemen-posicionamiento relativo de las señales con to cromosómico, proporcionando marcadoresrespecto al centrómero, los telómeros u otros útiles para la identificación de cromosomas ymarcadores cromosómicos permite mapear para realizar comparaciones cariotípicas (Fig.con precisión cada sonda sobre el complemen- 2C). Otra de las sondas de secuencias conser-to cromosómico y representarlas en un idiogra- vadas y repetidas en tándem que se empleanma. A diferencia de la citogenética clásica, la habitualmente en experimentos de FISH sonidentificación de cromosomas o de segmentos las teloméricas (Fig. 2D). Las mismas soncromosómicos particulares usando sondas de utilizadas tanto para establecer con precisiónFISH es independiente de la morfología cromo- los límites cromosómicos como para revelar in-sómica y, por lo tanto, es posible reconocerlos versiones que comprenden los segmentos cro-en diferentes estados del ciclo celular. mosómicos distales y la ocurrencia de fusiones Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 37
  • 39. cromosómicas. Las sondas de secuencias no mosómicos; mientras que las de secuenciasconservadas repetidas en tándem son muy repetidas dispersas lo son para definir regio-útiles para el desarrollo de marcadores especí- nes cromosómicas o genomios, en particular,ficos de cromosomas y de complementos cro- para identificar los genomas parentales en losFIGURA 2. A: Bandeo Ag-NOR en una metafase de Arachis hypogaea donde se identifican las regionesorganizadoras del nucleolo en marrón oscuro (flechas). B: bandeo con quinacrina que distingue las regio-nes heterocromáticas ricas en AT (en amarillo intenso) de las regiones eucromaticas (amarillo pálido) enlos cromosomas prometafásicos de Oziroe argentinensis. C: FISH doble en una metafase de A. batizocoien donde se localizan los genes ribosomales 5S (en verde) y 45S (en rojo), la contratinción realizada conDAPI diferencia bandas heterocromáticas centroméricas ricas en AT (en blanco) de las porciones cromo-sómicas eucromáticas (en azul). D: FISH que revela las regiones teloméricas (verde) de A. hypogaea. E:FISH que revela la distribución preferencial de un retroelemento en el genoma A de A. hypogaea. F: GISHdoble sobre una metafase de A. hypogaea utilizando como sondas ADN genómico de A. ipaensis (rojo) yde A. duranensis (verde) que demuestra la constitución alopoliploide del cultígeno y las especies diploidesprogenitoras más probables. G y H: ARN-FISH en antera y ovario de Paspalum notatum utilizando comosonda un ARN marcado de expresión diferencial y tejido-específica en plantas apomícticas pero no sexua-les. La intensidad del color violeta indica cantidades relativas del ARN analizado presente en los diferentestejidos de plantas apomícticas. La barra representa 5 micras en A, C-F, 10 micras en B, 200 micras en Gy 100 micras en H.38 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 40. híbridos interespecíficos y en los alopoliploi- genómico total y no por un fragmento de ADNdes (Fig. 2E). Ambos tipos de secuencias re- de secuencia conocida. El ADN utilizado parapetidas pueden mostrar diferencias notorias en construir estas sondas es extraído mediantelos motivos que las componen, así como en su protocolos estándares y luego es marcado porabundancia y distribución, aún entre especies nick translation o por amplificaciones al azarestrechamente emparentadas. El análisis del usando cebadores cortos (random priming).conjunto de las secuencias repetitivas consti- El éxito de GISH depende del grado de dife-tuye una herramienta excelente, en sí misma o renciación que presenten los genomios que secomo complemento de otras técnicas, para la pretende analizar. Por lo general, las secuen-identificación de cromosomas y genomios, el cias codificantes de los genomas de dos es-estudio de la arquitectura nuclear y los análisis pecies más o menos relacionadas no varíanfilogenéticos. También nos permiten realizar substancialmente entre sí, por lo tanto, la hi-estudios detallados de aberraciones cromosó- bridación diferencial de las sondas en GISHmicas estructurales y numéricas, hacer infe- está determinada principalmente por el gradorencias sobre los mecanismos involucrados en de divergencia del componente repetitivo dela evolución cromosómica y realizar el segui- los genomas en cuestión. En la medida en quemiento de cromosomas o regiones particulares los dos genomas presenten más secuenciasen las sucesivas generaciones de los progra- en común, mayor será la dificultad para distin-mas de mejoramiento. Las sondas de secuen- guirlos. Una estrategia para mejorar la capaci-cias únicas hibridan con el ADN cromosómico dad discriminante de esta técnica consiste encorrespondiente a un locus específico. A dife- realizar un GISH simple utilizando ADN de unrencia de las secuencias repetidas que pueden genoma marcado (sonda) junto con una deter-ser localizadas fácilmente por FISH, la detec- minada proporción de ADN sin marcar del ge-ción de las secuencias únicas es más laboriosa noma que no se va a detectar (sonda fría). Endebido a que, por lo general, las regiones codi- cambio, cuando la diferencia entre las secuen-ficantes de los genes presentan longitudes me- cias de los genomas considerados es alta senores que las detectables por FISH convencio- puede utilizar GISH doble o triple, colocandonal (10 kb). El empleo de grandes bloques de sobre el preparado mezclas equimolares de lasADN genómico clonado en vectores, como los sondas marcadas diferencialmente para cadacromosomas artificiales de bacterias (BACs), uno de los genomas que se quiere distinguir enen combinación con FISH (BAC-FISH), cons- una metafase. Las regiones cromosómicas quetituye un método efectivo para el mapeo físico hibridan con una sola sonda se visualizan conde secuencias únicas de ADN. Sin embargo, el el color original del fluorocromo, mientras queADN repetitivo presente en las regiones no co- las que presentan complementariedad con dosdificantes de los insertos muchas veces genera o más sondas presentan colores intermedios.patrones de señales dispersas o inespecíficas Entre las diferentes aplicaciones de GISH,(background). A pesar de esta dificultad, hasta se destaca el estudio de la composición ge-el momento, BAC-FISH constituye una de las nómica de los alopoliploides y de los híbri-mejores técnicas para correlacionar los mapas dos naturales o artificiales. En estos casos,genéticos con los físicos, ya que se pueden de- la técnica se basa en la hibridación del ADNsarrollar sondas específicas para cada cromo- genómico marcado de los probables ancestrossoma o locus en particular. o progenitores sobre las preparaciones cromo- sómicas del material en estudio. La hibridación 4 Hibridación in situ genómica (GISH) diferencial de las sondas con sólo un subgrupo de cromosomas en una metafase constituye Esta técnica se utiliza para identificar los di- una clara evidencia de que el material estudia-ferentes genomios presentes en un organismo do está compuesto por diferentes genomios.híbrido o alopoliploide. Aunque aplica todos los Mediante el empleo de GISH se han deter-principios de FISH, difiere de ésta porque las minado los progenitores probables de algunassondas que utiliza están constituidas por ADN especies alopoliploides cultivadas como el ta- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 39
  • 41. baco, la avena, el trigo y el maní (Fig. 2F). Otra 5 Mapeo por amplificación directa de se-de las ventajas de analizar los híbridos y los cuencias de interés por PCR in situ (PRINS)alopoliploides con GISH doble o múltiple, con-siste en la capacidad que ofrece esta técnica La técnica de PRINS (“primed in situ”) espara detectar translocaciones intergenó- considerada como una alternativa a ISH paramicas, las que pueden pasar inadvertidas la detección de ciertos tipos de secuenciascon los métodos convencionales de aná- de ácidos nucleicos. Esta técnica involucra lalisis genómico. Aplicado a células meióti- extensión de cebadores diseñados para lascas, GISH proporciona un método preciso secuencias blanco por medio de la Taq poli-para el análisis de los apareamientos cro- merasa. Durante la extensión, se incorporanmosómicos que ocurren en los genomas nucleótidos marcados con fluorocromos ohíbridos. El estudio de la capacidad de los haptenos a fin de permitir la localización físicacromosomas de aparearse en meiosis es el de las secuencias en forma directa o indirectaprocedimiento utilizado tradicionalmente mediante protocolos adicionales de detección.para establecer las relaciones genómicas Comparada con FISH convencional, PRINSentre diferentes especies. Sin embargo, ofrece algunas ventajas tales como: 1) el em-en muchas configuraciones metafásicas pleo de cebadores diseñados a partir de un mí-resulta difícil distinguir los apareamientos nimo de información de la secuencia blanco, 2)ocurridos entre cromosomas homólogos dichos cebadores pueden hibridar con secuen-de aquellos ocurridos entre cromosomas cias de ADN más fácil y rápidamente que lashomeólogos (i.e. parcialmente homólogos). sondas (de mayor tamaño) usadas en FISH,Mediante GISH es posible “pintar” los cro- aún en cromatina compacta, 3) no requiere elmosomas y, de este modo, determinar el marcado de sondas y 4) los cebadores puedenorigen genómico de los cromosomas apa- ser extendidos aún dentro de las secuenciasreados y no apareados, tanto en profase adyacentes (a diferencia de FISH que dependecomo en metafase de la meiosis I. La técnica de una secuencia específica), reforzando la in-de GISH también constituye una herramienta tensidad de la señal para una secuencia corta.irreemplazable para el desarrollo de progra- Mediante PRINS se han localizado secuenciasmas de mejoramiento vegetal que involucran repetitivas en tándem (secuencias teloméricas,hibridaciones interespecíficas o intergenéricas elementos móviles y ADNr) en cromosomas deya que permite: 1) confirmar el origen híbrido leguminosas (Vicia faba y Pisum sativum) y dede la progenie, 2) determinar el origen de los gramíneas (Hordeum vulgare, Avena sativa ycromosomas en las distintas generaciones, Lolium multiflorum). Todos los loci encontradosen particular, cuando los híbridos F1 muestran fueron coincidentes con los hallados por FISH.inestabilidad cromosómica tal como la elimi- Los resultados demuestran que la técnica denación cromosómica uniparental, 3) identificar PRINS es apropiada para la localización rá-bivalentes interparentales en la meiosis de los pida de repeticiones en tándem sobre cromo-híbridos F1 sexuales y 4) comprobar si los cro- somas vegetales cuando la distancia entre losmosomas recombinantes son transmitidos a lassiguientes generaciones. Esta técnica también cebadores es pequeña (1 kb) y los blancos sonha sido utilizada para detectar regiones croma- largos (100 – 500 kb). Sin embargo, no se ob-tínicas introgresantes, especialmente aquellas tienen buenas señales cuando las secuenciasque portan caracteres agronómicos de interés. repetidas están muy separadas entre sí, comoUn ejemplo de ello es el análisis de una línea ocurre con el gen de la vicilina. Este gen estáélite de cebada introgresada con Hordeum bul- repetido muchas veces en el genoma de Viciabosum resistente a roya. Mediante una combi- faba, pero cada copia está separada por unanación de GISH y FISH se pudo determinar la distancia mayor de 12 kb. En estos casos, ellocalización de los fragmentos cromosómicos empleo de FISH resulta más adecuado dadode H. bulbosum introgresados en el comple- que se obtienen mejores señales. Por otra par-mento cromosómico de cebada que le confe- te, PRINS no ha presentado ventajas con res-rían dicha resistencia. pecto a FISH convencional para la detección40 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 42. de secuencias simples en la mayoría de los características hacen que los cromosomas pa-casos, aún utilizando PRINS cíclico que invo- quiténicos constituyan el material de elecciónlucra de 5 a 10 ciclos de amplificación. Una de para los estudios de FISH de alta resolución,las mayores desventajas de PRINS es el alto en particular, para identificar secuencias blan-grado de aparición de señales inespecíficas, co de alrededor de 10 kb y resolver dos lociprobablemente debido a la incorporación de separados por menos de 100 kb.nucleótidos marcados en los extremos 3´OH Por otra parte, la técnica de FISH sobrelibres que resultan de roturas espontáneas de cromosomas mitóticos extendidos utilizalos cromosomas durante el procesamiento del cromosomas metafásicos seleccionados pormaterial. Estas incorporaciones indeseables citometría de flujo a partir de meristemas ra-pueden disminuirse mediante el tratamiento dicales sincronizados. El estiramiento de loscon ligasa o incorporando 2´, 3´ - didesoxinu- cromosomas se realiza mediante una digestióncleótidos (ddNTP) antes de PRINS. moderada con proteinasa K, antes de la fija- En síntesis, esta técnica es útil para la de- ción con etanol-ácido acético (3:1). Mediantetección rápida de repeticiones en tándem gran- este procedimiento, se pueden obtener cromo-des, pero no constituye una alternativa a FISH somas con una longitud de 10 a 100 veces ma-para la detección de genes de copia simple o yor que la original. Esto permite aumentar la re-para el pintado de los cromosomas en plantas solución de los arreglos de secuencias génicasmediante el uso de un cóctel de cebadores y repetidas sobre los cromosomas, sin perdercromosoma-específicos. la información sobre la orientación relativa con respecto al centrómero y los telómeros. Esta 6 FISH de alta resolución técnica posee una resolución similar a la que utiliza cromosomas paquiténicos y es muy útil Bajo este concepto se agrupan una serie de en aquellas especies en las que la obtencióntécnicas que, utilizando los mismos principios de buenos preparados meióticos es dificultosade FISH convencional, permiten hacer hibri- o en aquellas que poseen cromosomas paqui-daciones sobre cromosomas profásicos o aún ténicos difíciles de resolver.sobre núcleos interfásicos. Estas estrategias - FISH en núcleos interfásicos: esta técni-permiten aumentar tanto la resolución como la ca se aplica a núcleos en cortes de tejidos asísensibilidad de la detección. como a núcleos aislados, y permite incremen- tar tanto la sensibilidad como la resolución de - FISH sobre cromosomas poco conden- FISH.sados: consiste en el análisis de cromosomas Para el análisis de los núcleos en tejidos,meióticos en paquitene o de cromosomas mi- los órganos de la planta se fijan con formalde-tóticos extendidos. hído o glutaraldehído (este último en baja pro- La técnica de cromosomas paquiténicos porción ya que puede inducir autofluorescen-se aplica a células madres del polen fijadas en cia), luego se cortan con micrótomo y los cortesetanol : ácido acético (3:1) y tratadas con una se montan directamente sobre un portaobjetos.mezcla de enzimas (celulasa, pectiolasa y cito- Debido a que la sonda necesita penetrar en elhelicasa) que digieren la calosa de las paredes tejido para alcanzar el interior del núcleo, secelulares. En general, los cromosomas paqui- realizan diversos pre-tratamientos tendientesténicos vegetales son de 7 a 40 veces más a incrementar la permeabilidad de los tejidoslargos que aquellos de metafases mitóticas, y, además, se emplean como sondas frag-están compuestos por cuatro hebras de ADN mentos marcados cuyo tamaño no supera los(iguales en los homocigotos), son más acce- 100-500 pb. El análisis de las hibridaciones sesibles a las sondas (debido a que tienen una realiza con un microscopio confocal, debido aestructura cromatínica menos condensada) y que este tipo de microscopio permite visuali-presentan marcadores cromosómicos particu- zar las estructuras mediante la reconstrucciónlares (bloques heterocromáticos y knobs) que tridimensional de las secciones ópticas de lapermiten individualizarlos con facilidad. Estas muestra. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 41
  • 43. Para el análisis de núcleos aislados, los rondas de amplificación con anticuerpos paratejidos se disgregan en un buffer de estabiliza- obtener una buena intensidad de las señales.ción apropiado y la fracción de interés se ob- La principal ventaja de fiber-FISH frente a FISHtiene por centrifugación y tamizado en mallas en núcleos interfásicos es que se logra unacon diferentes diámetros de poro. Los núcleos mayor sensibilidad (200 pb) y una resoluciónaislados se colocan directamente sobre un por- a nivel genómico de 1 kb. Esta técnica es detaobjetos y se secan al aire y deshidratan en gran utilidad para analizar clones solapantes,serie alcohólica. Este procedimiento, que tam- detectar rearreglos cromosómicos pequeños,bién puede ser aplicado a suspensiones celu- determinar distancias físicas entre genes y sulares, no presenta mayores problemas de per- orientación, medir tamaños de loci y acelerarmeabilidad para las sondas. Las regiones de el clonado posicional. Sin embargo, su utilidadhibridación de las sondas sobre las secuencias para el mapeo de secuencias es limitada de-de copia simple se observan como señales in- bido a que sólo permite establecer posicionesdividuales dentro del núcleo (dos señales en relativas, perdiendo la orientación real de laslos núcleos diploides), cada una de ellas co- sondas con respecto al centrómero y a los teló-rrespondiente a cada uno de los cromosomas meros. Una variante de esta técnica es el em-homólogos. pleo de cromatina estirada, un procedimiento Mediante estas técnicas también se ha es- que involucra la extensión de las fibras croma-tudiado la organización y la disposición de los tínicas sin remover las proteínas, la que resultacentrómeros, de los telómeros y de los cro- muy útil para examinar las interacciones ADN-mosomas en núcleos interfásicos de diferen- proteínas.tes órganos y tejidos de trigo, arroz, tabaco yArabidopsis thaliana. En particular, las mismas 7 Mapas cromosómicosresultan muy útiles para el análisis de los cam-bios que se producen durante el ciclo celular Estos mapas constituyen una herramientaen las diferentes estructuras cromosómicas fundamental para integrar los mapas físicosdependientes de secuencias. También se em- (basados en el ordenamiento de secuencias yplean para el mapeo de secuencias separadas el armado de contiguos) y los mapas genéti-por distancias menores a 500-1000 kb, ya que cos (derivados de los análisis de ligamiento).en los cromosomas metafásicos las señales de Los mapas cromosómicos permiten posicionarlas sondas separadas por estas distancias se genes y/o marcadores ligados a éstos, consuperponen. respecto a marcadores estructurales propios de los cromosomas (por ejemplo, centrómeros, - FISH en fibras de ADN extendidas (fiber- telómeros, bandas heterocromáticas y cons-FISH): se basa en la hibridación de las sondas tricciones secundarias) o a otros marcadoressobre fibras extendidas de ADN. Esta técnica cromosómicos desarrollados por FISH. Estainvolucra los siguientes pasos: 1) se aíslan los integración facilita el mapeo y el aislamiento denúcleos por medio de mallas de nylon de di- genes particulares por métodos convenciona-ferentes diámetros de poro, 2) se deposita un les y son indispensables para el aislamiento depequeño volumen de la suspensión de núcleos secuencias por microdisección y microclonado.en uno de los extremos de un portaobjetos tra- Para el clonado posicional de secuencias estado con poli-L-lisina (este compuesto reduce importante tener una estimación precisa de laal mínimo la aparición de señales inespecíficas razón kb/cM existente en la región del locusy favorece la extensión de las fibras de ADN), de interés. Esto posibilita la conversión de las3) se agrega un buffer de lisis y se realiza la distancias genéticas establecidas entre losextensión usando un cubreobjetos de manera marcadores y el gen en estudio en distanciassimilar a como se hace un frotis de sangre, y físicas. En general, se ha observado que la dis-4) sobre estos extendidos se realizan las hibri- tancia entre loci en los mapas genéticos (y nodaciones siguiendo el protocolo convencional el orden) puede diferir mucho de la distanciade FISH. Normalmente, se realizan dos o tres establecida en los mapas físicos. Los estudios42 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 44. de los nódulos de recombinación en complejos detectar está poco representado en las mues-sinaptonémicos han revelado que la discrepan- tras, se pueden utilizar protocolos que amplifi-cia entre los mapas físicos y genéticos es el can la señal mediante el precipitado enzimáti-resultado de la distribución no al azar de los co de tiramida sobre los sitios blancos (TSA,eventos de crossing-over a lo largo de los cro- Tyramide Signal Amplification). La aplicaciónmosomas. En este marco, el desarrollo de los de TSA en los protocolos estándares de ISH,mapas cromosómicos ha cobrado importancia consiste en una detección inicial de la sondadebido a que, dependiendo de las regiones marcada con anticuerpos o estreptavidina con-cromosómicas que se analicen y a la frecuen- jugados con una peroxidasa (por ejemplo lacia de recombinación propia de cada una, los de rábano picante, horseradish peroxidase omapas genéticos pueden ser mejores o peores HRP). Posteriormente, se agrega al preparadoestimadores de las distancias físicas reales. tiramida conjugada con algún hapteno o fluoro- Por tal motivo, en varias especies modelo se cromo, la cual es precipitada masivamente porha puesto especial énfasis en el desarrollo de la HRP y unida en forma covalente al sitio demarcadores cromosómicos por las técnicas de detección inicial. El sistema resultante es de-ISH (principalmente BAC-FISH, y Fiber FISH) tectado mediante anticuerpos conjugados conpara poder integrar los grupos de ligamiento fosfatasas alcalinas (para detecciones cromo-genético con cromosomas, y para relacionar génicas estándares) o directamente con mi-las estimaciones de distancia por recombina- croscopía de epifluorescencia. Debido a que lación con la distancia física real (Ver capítulo de tiramida adicionada sólo se deposita en las re-Genómica). giones próximas a la enzima, se logra aumen- tar significativamente la sensibilidad sin perder 8 Análisis de la expresión génica en teji- resolución. La principal limitante de ARN-ISHdos por ARN-ISH radica en que, generalmente, se puede anali- zar una sola sonda por cada hibridación. No Los protocolos de ISH de ARN resultan apro- obstante, esta técnica se ha utilizado parapiados para describir los patrones temporales y comparar los niveles y sitios de expresión deespaciales de expresión de un determinado gen secuencias en numerosas especies de plan-a nivel celular o subcelular. En los organismos tas. Uno ejemplo de ello, es el análisis espacialmulticelulares, ISH constituye un complemento de transcritos expresados diferencialmente ende los análisis de northern blotting, RT-PCR y plantas con reproducción sexual y apomícticasmicroarrays, en los que la extracción de ARN de Paspalum notatum (Fig 2 G y H).de los tejidos resulta invariablemente en la pér-dida de información espacial. Asimismo, si bien 9 FISH cuantitativo para estimar la expre-los microarrays constituyen una de las técnicas sión génica (QUISH)más poderosas para analizar la expresión demuchos genes simultáneamente, con frecuen- A diferencia de la técnica de ARN-FISH, quecia los resultados que se obtienen deben ser utiliza anticuerpos sobre cortes de tejidos paraverificados por métodos independientes tales la detección de la expresión génica, QUISHcomo ISH. El análisis de la expresión génica se basa en la hibridación de oligonucleótidospor ISH generalmente se efectúa sobre cortes gen-específicos marcados con fluorocromosde tejido, aunque también puede realizarse so- directamente sobre porciones de tejidos u ór-bre órganos enteros (“whole-mount ISH”, ISH- ganos enteros, combinada con el análisis deWISH). La técnica se basa en la utilización de secciones ópticas realizadas con un microsco-una sonda (generalmente cDNA) marcada con pio láser confocal de barrido. De este modo,haptenos que se hibridará directamente sobre se logra mejorar notablemente la calidad de loslos cortes de tejido. Las detecciones se reali- resultados debido a que se eliminan los pasoszan con anticuerpos conjugados con fosfata- que generan artefactos e impiden realizar unasas alcalinas o con fluorocromos. cuantificación precisa. La característica clave Para aquellos casos en los que el ARNm a de QUISH es la cuantificación de la expresión Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 43
  • 45. génica utilizando como estándar a los genes de giada para realizar estudios de este tipo ya quemantenimiento celular (genes “housekeeping”, permite unir estructuras nucleares con carac-GAPDH y 18S ARNr). El empleo de este es- terísticas bioquímicas, tales como la actividadtándar permite corregir la variación de la razón transcripcional, la replicación del ADN, las mo-citoplasma/vacuola en los diferentes tipos ce- dificaciones de las histonas y la metilación dellulares, los efectos ópticos de los tejidos y las ADN mediante la inmunodetección de distintosseñales no específicas. La naturaleza cuantita- blancos celulares con anticuerpos conjugadostiva de esta técnica hace posible el análisis de con fosfatasa alcalina o con fluorocromos. Lala expresión génica en órganos, a nivel tisular preparación del material, la fijación, la diges-o celular, independientemente de las diferen- tión de las paredes celulósicas, la permeabi-cias debidas a la edad o a los tipos de tejidos. lización y la incubación con anticuerpos seEste método es mas rápido que los métodos realizan de igual modo que en FISH, aunquetradicionales y puede utilizarse para estudiar la se omiten los pasos de desnaturalización e hi-localización celular de la expresión de uno o bridación. Las técnicas de inmunocitogenéticavarios genes en un período relativamente corto se emplean para analizar la estructura croma-de tiempo. Asimismo, con QUISH es posible in- tínica y la disposición de las diferentes molécu-vestigar los cambios en los niveles de los trans- las que intervienen en las divisiones celulares.criptos durante la ontogenia o, en respuesta a En particular, estas técnicas son útiles paracambios de las condiciones ambientales en di- estudiar la distribución de las modificacionesferentes líneas de plantas modelo. histónicas y la metilación del ADN en relación con la estructura cromatínica en cromosomas 10 Identificación de modificaciones y núcleos durante el ciclo celular. Merecen es- cromatínicas por inmunocitogenética pecial mención aquellos análisis relacionados con las modificaciones que indican estructuras La identidad celular está determinada por cromatínicas abiertas, con potencialidad deun programa nuclear establecido por un pa- transcripción, y las que delimitan estructurastrón complejo de interacciones entre el ADNy las proteínas. La organización del ADN en cromatínicas cerradas, con actividad transcrip-la cromatina regula la expresión y el manteni- cional reprimida. El advenimiento de las técni-miento de la información genética (replicación, cas de citogenética molecular y de inmunocito-reparación, recombinación y segregación) en genética ha permitido disectar progresivamen-forma dinámica. Las colas N-terminales de te el núcleo a nivel de microscopía óptica. Lalas histonas que conforman el núcleo de los detección individual de complejos proteicos ynucleosomas están sujetas a diferentes modi- de secuencias de ARNs y ADN ha revelado laficaciones pos-traduccionales (acetilación, me- existencia de muchos compartimientos nuclea-tilación, fosforilación, ubiquitinación, etc.) las res. Las variaciones en la arquitectura nuclearque, conjuntamente con la metilación del ADN, reflejan la relación existente entre la organiza-controlan el empaquetamiento de los nucleo- ción nuclear y la regulación génica. El análisissomas en arreglos de orden superior y proveen de dicha arquitectura incluye varios paráme-señales para diversos procesos celulares. tros cuantitativos y cualitativos, tales como elAunque las histonas y sus modificaciones son tamaño y forma nuclear, el contenido relativoaltamente conservadas, la distribución de las y la distribución de heterocromatina, los patro-mismas en los cromosomas puede variar a lo nes generales de modificación cromatínica, lalargo de los procesos de diferenciación y del presencia de compartimientos nucleares (nu-ciclo celular, así como dentro y entre grupos cleolos, cromocentros, territorios cromosómi-de eucariotas. Recientemente, se han produci- cos y cuerpos nucleares) y la organización dedo grandes avances en el esclarecimiento del los cromosomas en el núcleo (ie. la posición yllamado código de las histonas y del intrincado la orientación de los cromosomas en el núcleo)mecanismo de regulación epigenética. La cito- y las diferencias en la condensación cromatíni-genética se encuentra en una posición privile- ca a nivel local.44 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 46. 11 Análisis de la posición de la inserción Fernández A. and Daviña J.R. 1991. Heterochroma-de los transgenes tin and genome size in Fortunatia and Camassia (Hyacinthaceae). Kew Bulletin, 46, 307-316. Fransz P.F., Alonso-Blanco C., Liharska T.B., Pee- Diferentes ensayos han demostrado que ters A.J.M., Zabel P. and Jong J.H. 1996. High-la expresión de los transgenes puede variar resolution physical mapping in Arabidopsissignificativamente entre especies diploides thaliana and tomato by fluorescence in situ hy-relacionadas, entre líneas transformadas inde- bridization to extended DNA fibers. The Plant Jo-pendientes, y aún entre generaciones de las urnal, 9, 421-430.líneas trasformadas. Los niveles de expresión Küper H., Ort Seib L., Sivaguru M., Hoekenga O.A.de estas secuencias pueden ser afectados por and Kochian L.V. 2007. A method for cellular lo-diversos factores, entre ellos, la presencia de calization of gene expression via quantitative innumerosas copias de la construcción en uno situ hybridization in plants. The Plant Journal,o varios loci y el contexto genómico en que 50, 159-175. Laspina N.V., Vega T., Seijo J.G., González A.M.,se encuentran las copias. La técnica de FISH Martelotto L.G., Stein J., Podio M., Ortiz J.P.A.,permite mapear los trangenes en cromosomas Echenique V.C., Quarín C.L. and Pessino S.C.metafásicos, en núcleos interfásicos o en fi- 2008. Gene expression analysis at the onsetbras extendidas de ADN y, a su vez, determi- of aposporous apomixis in Paspalum notatum.nar el número de loci en que se encuentran los Plant Molecular Biology, 67, 615-628.mismos. Para el mapeo se utiliza una sonda Lavia G.I., Fernández A. and Seijo J.G. 2008. Cyto-marcada correspondiente al transgen y otras genetic and molecular evidences on the evolu-sondas que permitan identificar los pares cro- tionary relationships among Arachis species. In:mosómicos, un genoma o un subgenoma par- Sharma A.K. and Sharma A. (eds.). Plant Ge-ticular (en el caso de híbridos o alopoliploides). nome: Biodiversity and Evolution. Volume 1E: Phanerogam-Angiosperm. Science Publishers,Uno de los ejemplos clásicos, en el cual se Enfield, NH, USA, 2008. pp 101-134.combinaron diferentes técnicas moleculares y Moscone E.A., Matzke M.A. and Matzke A.J.M.citogenéticas para analizar los efectos del con- 1996. The use of combined FISH/GISH in con-texto genómico en la expresión de los transge- junction with DAPI counterstaining to identifynes fue realizado en tabaco. En el mismo se chromosomes containing transgene inserts inempleó FISH para mapear los trangenes sobre amphidiploid tobacco. Chromosoma, 105, 231-los cromosomas y GISH para identificar los ge- 236.nomas del alopoliploide. A partir de estos es- Robledo G., Lavia G.I. and Seijo G. 2009. Speciestudios, se ha demostrado que, en general, los relations among wild Arachis species with the Atransgenes con expresión estable están locali- genome as revealed by FISH mapping of rDNA loci and heterochromatin detection. Theoreticalzados en las proximidades de las regiones te- and Applied Genetics, 118, 1295-1307.loméricas y ricas en genes, mientras que los de Schwarzacher T. and Heslop-Harrison P. 2000.expresión inestable se localizan en las regio- Practical in situ hybridization. BIOS Scientificnes intercalares o paracentroméricas que son Publishers, Oxford, 2000. pp. 203.más pobres en genes. Por otra parte, la combi- Seijo J.G., Lavia G.I., Fernández A., Krapovickas A.,nación de FISH con técnicas de inmunocitoge- Ducasse D. and Moscone E.A. 2004. Physicalnética permite analizar el contexto epigenético mapping of 5S and 18S-25S rRNA genes evi-de la cromatina circundante a los transgenes dences that Arachis duranensis and A. ipaensisy su relación con la expresión de los mismos. are the wild diploid species involved in the origin of A. hypogaea (Leguminosae). American Jour- nal of Botany, 91, 1294-1303. Lecturas / sitios recomendados Seijo J.G., Lavia G.I., Fernández A., Krapovickas A., Ducasse D., Bertioli D.J. and Moscone E.A.Bennett M.D. 1995. The development and use of ge- 2007. Genomic relationships between the culti- nomic in situ hybridization (GISH) as a new tool vated peanut (Arachis hypogaea - Leguminosae) in plant biosystematics. In: Brandham P.E. and and its close relatives revealed by double GISH. Bennett M.D. (eds.). Kew Chromosome Confe- American Journal of Botany, 94, 1963-1971. rence IV. Royal Botanic Gardens, Kew, 1995. pp Solís Neffa V.G. and Fernández A. Karyotypic stu- 167-183. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 45
  • 47. dies in Turnera sidoides complex (Turneraceae, Leiocarpae). 2002. American Journal of Botany, 89, 551-558.Stein N., Ponelies N., Musket T., McMullen M. and Weber G. 1998. Chromosome micro-dissection and region-specific libraries from pachytene chromosomes of maize (Zea mays L.). The Plant Journal, 13, 281–289.Terkelsen C., Koch J., Kølvraa S., Hindkjær J., Pe- dersena S. and Bolund L. 1993. Repeated pri- med in situ labeling: formation and labeling of specific DNA sequences in chromosomes and nuclei. Cytogenetics and Genome Research, 63, 235-237.46 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 48. I.-Capítulo 4 replicación y reparación de ADN así como de la replicación de virus y plásmidos y la síntesis química de secuencias de nucleótidos. De estaHerramientas Básicas de manera, puede decirse que la tecnología delIngeniería Genética ADN recombinante esta integrada por diversas estrategias metodológicas, muchas de las cua-Ingrid Garbus, Marisa Gómez les son adaptaciones de procesos naturales dey Viviana Echenique la genética microbiana que han sido estudia- dos y se conocen en profundidad. Introducción LA CLONACIÓN MOLECULAR O Hasta principios de los años 70, el ADN CLONACIÓN DE GENESera la molécula de la célula que planteabamás dificultades para su análisis bioquímico. La finalidad de la clonación molecular es laExcesivamente larga y químicamente monóto- obtención de un determinado fragmento dena, la secuencia de nucleótidos del DNA tan ADN, que puede corresponder a un gen, inser-solo podía ser estudiada por caminos indirectos to en un vector capaz de replicarse, pudiéndo-tales como la determinación de la secuencia de se posteriormente amplificar a varios millonesproteínas, o del RNA. Actualmente, es posible de copias, por ejemplo para análisis de se-separar regiones determinadas del ADN, ob- cuencia o para obtener grandes cantidades detener cantidades ilimitadas de esos fragmen- un producto génico.tos y determinar incluso la secuencia de esos El desarrollo de la tecnología del ADN re-nucleótidos. Estos adelantos técnicos forman combinante y la clonación molecular han apor-parte de la tecnología del ADN recombinante, tado sofisticados procedimientos que permitende cuyo desarrollo han sido pilares fundamen- el aislamiento, purificación y replicación detales el conocimiento de las enzimas de res- fragmentos específicos de ADN. La clonacióntricción, el esclarecimiento de los procesos de de segmentos de ADN, también llamada crea- ción del ADN recombinante requiere esencialmente de las etapas que se enume- ran a continuación (Fig. 1) 1. Obtención del ADN a clonar Según la estrategia ex- perimental involucrada, el ADN a clonar puede tener diferentes procedencias. Puede tratarse de ADN de origen genómico, de un producto de amplifica- ción por PCR, provenir de la síntesis in vitro, a partir de una retrotranscripciónFigura 1. Etapas básicas en la clonación de un fragmento de ADN. En (ADNc) tomando comoprimer lugar el ADN a clonar y el vector (plásmido) se cortan con la mis- molde el ARNm o de lama enzima de restricción. Luego se ponen en contacto en presencia de síntesis in vitro de secuen-la enzima ligasa para obtener una molécula de ADN recombinante que cias previamente defini-se introduce en bacterias que multiplicarán el plásmido junto con el frag- das. Cuando el material demento de interés. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 47
  • 49. partida es el ADN genómico, los fragmentos a copias idénticas. Los organismos hospeda-ser clonados deben ser escindidos mediante el dores utilizados en biología molecular debenempleo de enzimas de restricción. En algunas contener toda la maquinaria genética para lasituaciones, particularmente cuando se trata amplificación del ADN recombinante. Puedede la clonación de productos de PCR, los frag- tratarse de organismos procariotas (bacterias)mentos deben ser aislados en función de su o eucariotas (levaduras, células de mamíferostamaño. Este aislamiento se lleva a cabo a tra- cultivadas). En el caso de la utilización de sis-vés de electroforesis en geles de poliacrilamida temas bacterianos, la introducción se realizao agarosa. valiéndose de los procesos naturales de la ge- nética microbiana o modificaciones específicas 2. Elección del vector de clonación de los mismos. De estos métodos modificados, el más ampliamente utilizado es el de transfor- Un vector de clonación es una molécula de mación en célula competente (ver vectores deADN que vehiculizará al fragmento de interés y clonación). Otra forma de introducir el ADN enpermitirá su amplificación, resultando de esta la célula hospedadora, de elección para molé-manera indispensable para la creación del culas de ADN de gran tamaño, es el procesoADN recombinante. Uno de los principales re- de electroporación, que consiste en la creaciónquisitos para que una molécula de ADN pueda de poros en la membrana celular inducida poractuar como vector, es la capacidad de auto- descargas eléctricas que permiten la introduc-rreplicación que irá acompañada de la replica- ción del ADN. Los plásmidos híbridos, introdu-ción del fragmento inserto. También es nece- cidos a través de alguno de estos procesos,sario que los vectores tengan un tamaño que continuarán replicándose en la célula hospeda-permita su manipulación fuera de la célula. Los dora mientras ésta crezca y se divida, siempremás pequeños se manipulan con mayor facili- que sea mantenida la presión de selección.dad que las moléculas de ADN más grandes,que tienden a ser más frágiles. Los vectores de 5. Identificación y selección de las célulasclonación más utilizados derivan del genoma que contienen al ADN recombinanteviral o de plásmidos bacterianos. Los compo-nentes esenciales de un vector de clonación En el esquema de transferencia del ADN re-son el origen de replicación, un gen marcador combinante al hospedador descripto anterior-responsable de alguna característica fenotípi- mente, se asume que durante la transforma-ca para la selección y al menos un sitio único ción, no todas las bacterias reciben una copiade restricción. del vector híbrido. Es necesario seleccionar aquellas células que han incorporado el vector, 3. Generación del ADN recombinante a través de la utilización de marcadores géni- cos presentes en los vectores de clonación. Los El término ADN recombinante se emplea más comúnmente empleados son los genes depara hacer referencia al material genético a resistencia a antibióticos y el fragmento funcio-clonar unido al vector de clonación. Para su nal de lac Z, el gen de E. coli que codifica paraobtención es requisito contar con los dos frag- la enzima β-galactosidasa (β-gal). Estos genesmentos de ADN en forma pura, y ligarlos en- marcadores tienen insertado un sitio múltiple dezimáticamente por acción de la enzima ADN restricción (polylinker), de manera que cuandoligasa, en presencia de ATP. los fragmentos de ADN son clonados en el po- lylinker del gen lacZ, anulan la actividad de la 4. Introducción del ADN recombinante en β-galactosidasa. Esta enzima hidroliza un com-el organismo hospedador puesto químico denominado X-gal, y se libera un colorante azul relativamente insoluble. El Este proceso es realmente el verdadero X-gal se incorpora al medio de cultivo en placaevento de clonación, en el cual el ADN re- de Petri donde desarrollarán las células hospe-combinante es “clonado” para producir varias dadoras del ADN recombinante. Si el ADN clo-48 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 50. nado se insertó en el polylinker y desactivó la al lector en las herramientas metodológicas deβ-galactosidasa, no se producirá pigmento azul biología molecular más ampliamente utilizadas.y las células formarán colonias que se veránblancas en la placa de Petri. Caso contrario las 1. VECTORES DE CLONACIÓNcolonias de las células hospedadoras se veránde color azul. Cuando el marcador es un gen Como hemos mencionado, un vector es unade resistencia a los antibióticos, las células se molécula de ADN a la que se unirá el fragmen-inoculan en medio agarificado que contiene el to de interés resultando en el ADN recombi-antibiótico cuya resistencia confiere el vector, nante y, debido a su capacidad de autorrepli-de manera que sólo sobrevivirán aquellas cé- cación, permitirá la amplificación del fragmentolulas que lo contienen. Luego deberá buscarse insertado. Los vectores de clonación de últimaespecíficamente aquellas células que poseen generación son muy prácticos y sencillos deel fragmento de interés. Estos dos marcadores manejar. Incluyen un sitio múltiple de clonaciónsuelen ser utilizados en forma conjunta de ma- o sitio de restricción múltiple (“polylinker”) quenera que solo las colonias portadoras del vec- es un segmento corto de ADN con sitios de res-tor crecerán en medio con antibiótico, y, para- tricción para varias enzimas diferentes, cadalelamente, las colonias que poseen el plásmido uno de ellos único para el vector (Fig. 2). Esterecombinante serán de color blanco. sitio suele formar parte del marco abierto de Una vez obtenidas las colonias recombinan- lectura (“ORF”) de un gen responsable de algu-tes los pasos a seguir incluyen la amplificación na característica fenotípica, por lo que resultade la colonia en medio líquido con antibiótico, sencillo confirmar si tras la restricción se ha ob-purificación del plásmido a partir de la suspen- tenido el plásmido híbrido, ya que la inclusiónsión de bacterias y comprobación de la presen- del inserto produce la pérdida de funcionalidadcia del inserto esperado. Para la detección del del gen mediante inactivación por inserción.inserto, pueden utilizarse diversas estrategias. Existen diferentes tipos de vectores de clo-La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) nación, entre los que se incluyen:se puede utilizar cuando la secuencia del frag-mento clonado es conocida o para identificarla secuencia de los fragmentos clonados por A) Plásmidos:amplificación con sondas complementarias a Son moléculas de ADN circular, de doblela secuencia terminal del vector. La hibridación cadena, extracromosómicas, presentes en lasmolecular con una sonda específica marcada bacterias, que poseen propiedades muy útilespuede ser utilizada cuando se conoce la se- como vectores de clonación, a saber:cuencia de interés y se dispone de dicha son- 1. Pequeño tamaño que hace sean fáciles deda. En otros casos, se realiza la selección en aislar y manipular.función del tamaño del inserto, para lo que el 2. Son circulares, lo que hace que el ADN seaplásmido recombinante es digerido median- más estable durante su aislamiento químico.te enzimas de restricción y posteriormente se 3. Su replicación transcurre independiente-realiza una corrida electroforética en gel de mente del ADN nuclear en la célula bacteriana.agarosa. 4. Existen múltiples copias en la célula, de- pendiendo del plásmido y de la especie hos- Herramientas y Procedimientos pedadora puede haber de varias a numerosasImplicados. copias (por ej. 1000 a 3000 copias de pBR322 por célula). A pesar de que la obtención de ADN recom- 5. La presencia de genes de resistencia abinante pudo ser explicada a través de cinco los antibióticos que actúan como marcadorespasos sencillos, es muy amplio el conjunto de seleccionables facilita la detección y selecciónherramientas y metodologías experimentales de los clones que los contienen.que están involucradas en su desarrollo. El El tamaño de los insertos que se pueden clo-objetivo de esta parte del capitulo es introducir nar puede ser considerable, sin embargo si son Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 49
  • 51. Figura 2. Elementos genéticos que constituyen un vector de clonación. a) Sitio de restricción múltiple queconsiste en un corto segmento de ADN con varios sitios de restricción, cada uno de ellos único para elvector. b) representación esquemática del plásmido pBR322 con el origen de replicación (Ori) y los genesmarcadores de resistencia a tetraciclina (TETR) y ampicilina (AMPR) que contienen los sitios de restricción deBamHI y PstI, respectivamente;mayores de 10 kb, el plásmido se hace gene- tanto, cuando pBR322 es digerido con BamHIralmente inestable. y se liga a un ADN, y luego se aíslan los clones Aunque en el ambiente natural los plásmidos transformados, aquellos transformantes queconjugativos generalmente se transfieren por posean resistencia a la tetraciclina y ampicilinacontacto célula a célula, los plásmidos vecto- no portan ningún ADN clonado. Aquellas célu-res de clonación generalmente han sido modi- las que continúan siendo resistentes a la ampi-ficados a fin de evitar su transferencia por con- cilina pero sensibles a la tetraciclina, contienenjugación y así lograr su contención biológica. el plásmido con el fragmento del ADN clonado.Sin embargo, en el laboratorio es posible rea- Como la resistencia a la ampicilina y a la te-lizar la transferencia a la célula hospedadora traciclina puede determinarse independiente-por transformación, utilizando choque térmico mente en placas con agar, resulta fácil aislaren presencia de cloruro de calcio o mediante bacterias que contengan los clones deseadoselectroporación. y eliminar las células que no los contengan. Aunque los primeros plásmidos utilizadosexistían en forma natural, los vectores de clo- B) Bacteriófagos o fagos:nación actuales constituyen una generaciónposterior de vectores construidos in vitro, como Fago λ: se caracteriza por ser un fago es-el plásmido pBR322 (Fig. 2). En este plásmi- pecializado en la transducción (transduccióndo, el sitio de restricción de BamHI está dentro especializada) por lo tanto este fago puede uti-del gen de resistencia a la tetraciclina, y el sitio lizarse también como vector de clonación parapara PstI está dentro del gen de resistencia ala ampicilina. Si se inserta un fragmento de un la recombinación in vitro. Es un vector de clo-ADN en uno de estos sitios, la resistencia al an- nación particularmente útil porque:tibiótico conferida por el gen que contiene este 1. Se conoce bien su estructura, genéticasitio se pierde (inactivación por inserción). Por molecular y funcionamiento50 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 52. Puede insertar mayor cantidad de ADN que coli y la capacidad de empaquetamiento in vitrola mayoría de los plásmidos (entre 10 y 20 kb) del cromosoma de λ y contienen el origen de El ADN puede ser eficientemente empaque- replicación y los genes de resistencia a los anti-tado in vitro dentro de las partículas del fago bióticos de su plásmido parental. Cos proviene Las partículas del fago son mucho más efi- de sitio cohesivo (“cohesive site”) en referen-cientes en la infección de las células hospeda- cia a la terminal de simple cadena de 12 basesdoras (transfección) que la transformación. complementaria en el cromosoma de λ madu- El fago λ tiene un mapa genético comple- ro. El sitio cos es reconocido por el sistemajo. El tercio central del cromosoma, que con- de empaquetamiento de ADN de λ, haciendotiene genes requeridos para la lisogenia pero cortes escalonados que originan los extremosno para el ciclo lítico, puede ser escindido por cohesivos complementarios en el cromosomarestricción y substituido por ADN foráneo (Fig maduro del fago. La principal ventaja de los3a). El ADN recombinante resultante puede ser cósmidos como vectores es su habilidad paraempaquetado en las cabezas del fago in vitro, insertar fragmentos de ADN de 35 a 45 kb.pudiéndolas el fago inyectar en E. coli, que sereplica produciendo colonias bacterianas que D) Fásmidos (fagémidos):contienen los fragmentos a clonar. Dado que el fago λ silvestre tiene excesiva Son vectores híbridos entre el fago M 13 ycantidad de sitios de restricción, no es indica- el plásmido pBR323 que contienen los oríge-do como vector de clonación por lo que se han nes de replicación de ambos. Normalmente laconstruido fagos λ modificados (Charon), en replicación depende del plásmido, pero cuandolos cuales los sitios de restricción no deseados una célula que contiene un fásmido se infectahan sido modificados con un fago de tipo salvaje, el origen del fago Fago M13 es un fago filamentoso que con- es responsable de la replicación y se generantiene ADN monocatenario y se replica sin ma- copias monocatenarias. Este ADN monocate-tar a su hospedador. Sin embargo, para po- nario es empaquetado en viriones y puede ais-der usar M13 para la clonación es necesario larse fácilmente y ser utilizado para secuenciar.disponer de una forma bicatenaria ya que las Habitualmente los fásmidos pueden transportarenzimas de restricción sólo trabajan sobre de forma estable un fragmento de ADN clonadoADN bicatenario. El ADN bicatenario de M13 mayor que un vector típico derivado de M13.puede obtenerse de células infectadas, dondese encuentra en forma replicativa bicatenaria. E) Cromosomas artificiales:La mayor parte del genoma del tipo silvestrecontiene información genética esencial para A partir de la creación de proyectos de se-la replicación. Sin embargo existe una peque- cuenciación de genomas completos se gestaña región, llamada secuencia intergénica, que la necesidad de obtener vectores que alber-puede ser utilizada como sitio de clonación. guen porciones de ADN de mayor tamaño paraEs posible clonar ADN de longitudes variables efectuar el análisis genómico y obtener mapashasta 5kb sin afectar la viabilidad del fago. El físicos de cromosomas. El primer sistema deADN monocatenario de M13 y de sus vectores clonado de grandes fragmentos de ADN fuederivados, ha sido extremadamente útil para informado en 1987 por Burke y colaborado-secuenciar ADN. res, los cromosomas artificiales de levaduras Tanto en el fago λ como el M13 se ha inser- (YACs), minicromosomas con la capacidad detado como marcador el gen lacZ. contener insertos de ADN de 200-500 kbp (Fig. 3b). Los YACs son vectores de DNA lineares C) Cósmidos: que contienen los elementos esenciales de los cromosomas de la levadura, como por ejemplo Son híbridos entre plásmidos y el fago λ y el origen de replicación ARS (Autonomouslycombinan las ventajas de ambos como vecto- Replicating Sequence). Introducidos en la cé-res. Poseen la habilidad del plásmido para re- lula de levadura, los YACs se replican y segre-plicarse autónomamente en las células de E. gan junto con el complemento cromosómico Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 51
  • 53. Figura 3. Vectores de clonación. Se muestran los elementos genéticos que constituyen los vectores declonación. a) Fago lambda. El cromosoma se organiza de acuerdo con las proteínas codificadas por losgenes: C&C: cabeza y cola, genes de proteínas de la cápside, de unión cabeza-cola y de estabilización yempaquetamiento de ADN, rec: genes de recombinación, proteínas para la integración y escisión del ADNdel fago en el cromosoma de la bacteria hospedadora, reg: genes regulatorios, para el cambio entre losdistintos ciclos del fago, rep: región de replicación, con el origen de replicación y los genes O y P, lisis:genes que posibilitan la lisis celular, b) Cromosoma artificial de levadura (YAC). ARS: origen de replicación,CEN: centrómero, TEL: telómeros, URA: gen marcador seleccionable para el desarrollo en medio con ura-cilo. Amp: gen marcador seleccionable en medio con ampicilina. El ADN es clonado en el sitio BamHI. C)Cromosoma artificial de bacterias (BAC). Deriva del factor bacteriano F. Su esqueleto contiene regionesesenciales que le otorgan estabilidad y bajo número de copias en cada bacteria, parA, parB y parC. oriS:origen de replicación unidireccional. CMr: gen marcador seleccionable en medio con cloranfenicol, repE:gen de proteína autoregulatoria esencial para la replicación desde oriS. pBeloBAC11, el vector BAC masutilizado, tiene tres sitios únicos de clonado, HindIII, BamHI y SphI dentro del gen marcador lacZ.habitual. El marcador seleccionable suele ser junto con la falta de familiaridad en el manejoun gen de tipo silvestre que le confiere la ca- de levaduras entre biólogos moleculares, limi-pacidad prototrófica a la célula hospedadora. taron el uso de los YACs. Para superar estasEl mas comúnmente utilizado es URA3+, que dificultades fueron desarrollados los cromo-confiere a las auxótrofos URA3- la capacidad somas artificiales de bacterias (BACs) consti-de desarrollarse en un medio de cultivo sin ura- tuyen un sistema de clonación que mantienecilo. Durante la meiosis los YACs se aparean un bajo número de copias en cada bacteria,con cualquier YAC homólogo presente, resul- garantizando una recombinación mínima entretando en una alta frecuencia de recombina- diferentes fragmentos de ADN y son de sencillación entre los fragmentos clonados. Esta alta manipulación. Los BACs se basan en el plás-frecuencia de quimerismo lleva a predicciones mido F de 7kb de E. coli y pueden llevar inser-inexactas en los mapas físicos moleculares y, tos de 300 kb aunque el promedio es de 10052 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 54. kb (Fig. 3c). Contienen como elementos esen- la de ADN y ser transformadas se denominanciales una copia del origen de replicación de E. competentes. Estas células secretan el factorcoli, un marcador de selección que suele ser de competencia, que es una pequeña proteínaun gen de resistencia a antibióticos y un siste- que induce la síntesis de otras 8 a 10 nuevasma de recombinación sitio-especifico (cre-lox), proteínas requeridas para la transformación.cuyo rol consiste en forzar la circularización de La transformación es un proceso que ocurregrandes insertos. Los cromosomas artificiales sólo en algunas especies bacterianas.derivados del fago P1 (PACs) permiten la clo-nación de fragmentos de 80-100 Kpb y, al igual Transducción: se refiere a la transferen-que los BACs, presentan bajo grado de qui- cia del ADN de una célula a otra por medio demerismo. El fago P1 se replica primero como un fago, denominación utilizada para los virusplásmido de bajo número de copias y luego cuando se trata de hospedadores bacterianos.como un largo segmento de ADN compuesto Esta transferencia de genes puede ocurrir depor múltiples copias de la secuencia repetida dos maneras:(concatemero), que es empaquetado en la ca- a) transducción generalizada: una frac-beza del fago por un mecanismo similar al del ción del ADN celular, que puede proceder delfago lambda. Las propiedades de los clones cromosoma o del plásmido del hospedador,PAC permiten la iniciación de empaquetamien- durante el ensamblaje del virus pasa a formarto en las etapas de clonación, escisión de las parte del ADN de la partícula vírica madura, re-secuencias de alto número de copias después emplazado el genoma del fago. Una vez quede la infección bacteriana y la inducción de la son liberados, estos fagos anormales puedenreplicación inmediatamente antes la amplifica- pegarse a otras células y donar ADN, pero noción del ADN. Utilizan al igual que los BACs el dan lugar a lisogenia ni a lisis dado que no pue-sistema cre-lox. den replicarse independientemente por carecer de gran parte del ADN fágico. Si los genes del Introducción del vector en la célula donador no sufren recombinación homólogahospedadora con el cromosoma de la bacteria de la célula receptora se perderán. En el caso de la utilización de sistemas bac- b) transducción especializada (restringi-terianos, la introducción del vector en la célula da): ocurre sólo en algunos virus atempera-hospedadora se realiza valiéndose de los me- dos, es decir, aquellos que se integran en elcanismos naturales de la genética microbiana genoma como parte de su ciclo biológico. Endado que en los procariotas existen mecanis- este mecanismo el ADN de una región especí-mos de intercambio genético, que permiten fica del cromosoma del hospedador se integratanto la transferencia de genes como la recom- directamente en el genoma del fago, reempla-binación del inserto, a través de uno de los si- zando algunos de sus genes. El genoma fági-guientes procesos genéticos: co recombinante puede empaquetarse segui- damente en una cabeza de fago y el resto del Transformación: es un proceso por cual fago puede ensamblarse normalmente. Esteel ADN libre del medio ambiente se incorpora fago puede carecer de la capacidad de repli-en una célula receptora, trayendo aparejado car, no obstante puede inyectar su ADN, queun cambio genético. Una cadena de este ADN contiene además algunos genes de la célulalibre, llamado donador, es captada y puede receptora a una nueva célula receptora. Pue-transformar genéticamente la célula receptora de también ocurrir recombinación homóloga,por recombinación con una región homóloga sin embargo, como el ADN donador bacteria-del cromosoma. El movimiento de las molécu- no está formando parte del genoma de un fagolas de ADN a través de la membrana y den- atemperado se presentan dos posibilidades:tro del citoplasma de la célula receptora es un que el ADN se integre en el cromosoma delproceso activo, que requiere energía. Las cé- hospedador durante la lisogenización, o que ellulas que son capaces de tomar una molécu- ADN se replique en el receptor como parte de Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 53
  • 55. cada extremo del transposón porta con ella (generalmente) seis nucleótidos de la moléculauna infección lítica. En ambos casos, la partí- hospedadora. (Estas secuencias terminales decula vírica transductora es normalmente defec- simple cadena se denominan secuencias aco-tiva como virus, ya que los genes víricos han plantes). El transposón escindido se circularizasido reemplazados. Si bien no todos los fagos entonces como resultado del apareamiento detienen la capacidad de transducir, ni todas las entre las secuencias acoplantes. Parece pro-bacterias son transducibles, el fenómeno está bable que sólo se transfiera una simple cadenalo suficientemente extendido como para asu- al receptor, y que la cadena complementaria semir que desempeña un importante papel en las sintetice, en el receptor, antes de la inserción.transferencias genéticas que se producen en Las estrategias de introducción de vectoresla naturaleza. en células hospedadoras utilizadas en las téc- nicas in vitro del ADN recombinante, han sido Conjugación: mecanismo de transferencia desarrolladas en base a modificaciones de es-genética mediada por un plásmido que requiere tos procesos naturales de transferencia de ma-contacto de célula a célula. Ciertos plásmidos y terial genético en procariotas.transposones conjugativos confieren a sus cé-lulas hospedadoras la capacidad de transferir 2. Enzimas utilizadas eN laADN a otras células por conjugación. La conju- generación de ADN recombinantegación requiere una célula donadora, que con-tiene un tipo particular de plásmido conjugativo, El requisito primordial para la clonacióny una célula receptora que carece de él. El pro- de un gen o segmento de ADN de interés esceso de conjugación, presenta características poder contar con dicho fragmento en formadiferenciales según se trate de bacterias Gram individual, aislado desde su entorno génico.positivas o Gram negativas. En el primer caso, Para ello, la tecnología del ADN recombinan-las células receptoras secretan un péptido de te cuenta con una herramienta indispensa-pequeño tamaño que provoca que la célula do- ble, las endonucleasas de restricción. Estasnadora sintetice un componente adhesivo en la enzimas reconocen secuencias específicassuperficie celular. El ADN plasmídico es pos- de ADN de 4 a 8 bases de extensión y es-teriormente transferido desde el donador a la cinden los enlaces fosfodiéster del materialcélula receptora adherida. Estos cruzamientos genético en dichos sitios, denominados sitiospueden tener lugar en medios líquidos. En el de restricción. Para actuar como sustrato desegundo caso, el plásmido codifica, entre otras estas enzimas, el ADN debe hallarse comoproteínas, las subunidades de la proteína del doble hebra.pelo sexual, mediante el cual se realiza el con- Son extraídas de organismos procarióti-tacto. El pelo constituye un puente de conjuga- cos, donde actúan como un mecanismo deción a través del cual pasa el ADN permitiendo defensa para degradar material genéticoel apareamiento específico. Durante la conju- extraño que entra en la célula, provenientegación, pueden resultar movilizados otros ele- principalmente de fagos. Para diferenciar elmentos genéticos, como grandes bloques del ADN propio del extraño, las bacterias tienencromosoma del hospedador u otros plásmidos. la capacidad de metilar su propio ADN inme- diatamente después de la replicación, ha- Transposición conjugativa: es una con- ciéndolo de este modo irreconocible por lasjugación independiente del plásmido, un tipo endonucleasas.de conjugación facilitada por un transposón Las endonucleasas se nombran en relaciónconjugativo, que pueden encontrarse tanto en a las bacterias de las que fueron aisladas porel cromosoma como en los plásmidos. El con- primera vez, considerando que la primera le-tacto entre las bacterias donadora y receptora tra representa el género de la bacteria, lasinduce la escisión del transposón en el dona- próximas dos indican la especie, una cuartador: en cada extremo del transposón (integra- letra indica la cepa, y un número al final indi-do), se producen un par de cortes alternos de ca el orden en que fue identificada la enzimamodo que al escindirse una de las cadenas en en esa cepa. Según este criterio, la enzima EcoRI, representa a la primer endonucleasa54 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 56. Figura 4. Corte del ADN por enzimas de restricción. Reconocimiento y escisión de secuencias palindró-micas originando: a) extremos cohesivos o b) extremos romos. En este caso puede utilizarse la enzimatransferasa terminal para la incorporación de extremos cohesivos. c) reconocimiento y corte de secuenciasno palindrómicas. Las flechas indican los sitios de corte mientras que las secuencias reconocidas se se-ñalan en negrita.aislada en el género Escherichia, especie Las escisiones realizadas por las endo-coli, cepa RV 13. Se utiliza el término isoqui- nucleasas de tipo II, pueden resultar enzómeros para las enzimas que reconocen la extremos romos o cohesivos. En el primermisma secuencia de ADN pero han sido ob- caso, se producen cortes escalonadostenidas de diferentes especies de bacterias. que crean colas cortas de cuatro bases de Pueden diferenciarse tres tipos de enzi- cadena simple en cada extremo del frag-mas de restricción. Las de tipo I y III escin- mento. Estas colas tienden a asociarseden en sitios alejados de la secuencia de re- con una cadena complementaria por apa-conocimiento, requiriendo de ATP para reali- reamiento de bases (Fig. 4a), a secuen-zar el traslado del sitio de reconocimiento al cias complementarias de otro fragmentode acción y tienen actividad de restricción y con colas generadas por la misma enzima.metilación simultáneamente. En cambio, las Cuando se generan extremos romos, elde tipo II cortan en el sitio de reconocimien- ADN es clivado en el centro de la secuen-to, tienen actividad de restricción exclusiva- cia de reconocimiento, en el mismo puntomente y reconocen secuencias palindrómi- en ambas cadenas, no quedando basescas (secuencias que se leen igual en ambas desapareadas en los extremos por lo quedirecciones). Estas últimas son las utiliza- no presentan tendencia a unirse con otrosdas para el clonado de ADN, aunque tienen fragmentos por complementariedad (Fig.otras aplicaciones como las construcción de 4b).mapas de restricción de un plásmido o bac- Aunque por su especificad y versatilidadteriófago, fragmentación del ADN genómico las endonucleasas de restricción son laspara su separación por electroforesis con enzimas las mas renombradas, la tecno-aplicación en técnicas como “Southern Blot” logía del ADN recombinante no sería fac-o fingerprinting o la generación de fragmen- tible sin la participación en el proceso detos para ser usados como sondas. otras enzimas de roles diversos (Tabla 1). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 55
  • 57. Enzima Acción Aplicación Endonucleasas de tipo Clivaje sitio -especifico del ADN Generación de fragmentos de II ADN Ligasa de ADN Unión de dos fragmentos de Forma enlaces covalentes ADN con extremos romos, en entre el extremo 5’ de una presencia de ATP. cadena polinucleotídica y el extremo 3’ de otra cadena Transcriptasa reversa Síntesis de una hebra de ADNc Construcción de bibliotecas de utilizando como molde ARN. cDNA. Amplificación por PCR Polinucleotido kinasa Incorporación de un grupo Permite ligado con otro fosfato al e xtremo 5´de un polinucleótido o incorporación polinucleótido. de fosfato marcado. Transferasa Terminal Adición de colas Genera extremos cohesivos homopoliméricas al extremo oligo dT u oligo dA 3´OH de ADN doble hebra lineal Exonucleasa III Remoción de nucleótidos del Expone los extremos 5´. extremo 3´ de un ADN doble hebra. Exonucleasa del fago l Remoción de nucleótidos del Expone los extremos 3´. extremo 5´ de ADN doble hebra. Fosfatasa alcalina Remoción de fosfatos Impide autoligado de vectores. terminales de extremos 5´ Permite la incorporación de fosfato 5´ marcado. Fragmento klenow Fragmento de una enzima ADN Genera extremos romos desde polimerasa, con actividad DNA el ext remo 3´, por síntesis polimerasa y exonucleasa en complementaria o clivaje de dirección 3?5. nucleótidos desapareados. Tabla 1. Algunas enzimas utilizadas en la tecnología del ADN recombinante 3. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE ciones (0,5 - 2%) forman un gel semisólido alADN: Electroforesis en gel enfriarse, constituido por una matriz o trama tri- dimensional de fibras poliméricas, que retarda La electroforesis es una técnica que permite el paso de las moléculas de ácido nucleico a sula separación de moléculas en función de su di- través, en función de su tamaño. Los geles deferente movilidad en un campo eléctrico, sien- poliacrilamida se forman por la polimerizacióndo el parámetro esencial su diferencia en carga de acrilamida y bis-acrilamida, catalizada poreléctrica. Sin embargo, determinados soportes el agente oxidante persulfato de amonio y lacomo los geles de agarosa o poliacrilamida, amina terciaria TEMED como agente reductor.ofrecen una resistencia notable al avance de La variación de la concentración de acrilamidalas moléculas. Aunque el parámetro que rige posibilita la modificación controlada el tamañoel avance es la relación carga/masa, como en del poro. Estos geles presentan menor rangolos ácidos nucleicos la carga eléctrica es pro- de separación que los geles de agarosa, peroporcional a la longitud en nucleótidos, la rela- mayor poder de resolución, pudiendo discrimi-ción carga/masa es la misma para todas las nar fragmentos de ADN con diferencia de ta-moléculas. Como resultado, el efecto de retar- maño de sólo una base. Se usan además parado del gel depende del tamaño molecular por la separación y caracterización de proteínas.lo que la electroforesis separa los fragmentos Para establecer el tamaño de fragmentosde ácido nucleico según su tamaño o longitud. separados se utilizan marcadores moleculares,La agarosa es un polisacárido, cuyas disolu- que consisten en una mezcla de fragmentos de56 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 58. ADN de tamaño conocido, a partir de los quese puede inferir el tamaño de la muestra anali-zada. Se establece una curva de calibrado enla que se consigue la linealidad graficando eltamaño en función de la inversa de la movili-dad o el logaritmo del tamaño respecto de lamovilidad. Dentro de las aplicaciones más comunes dela electroforesis en gel en biología molecular,podemos mencionar chequeo de la amplifica-ción de fragmentos de PCR, identificación depolimorfismos y la identificación de genes me-diante el establecimiento de sus patrones derestricción.4. Hibridación. Análisis molecularde ADN, ARN y proteínas La hibridación es la construcción artificial deun ácido nucleico bicatenario por apareamien-to (emparejamiento) de bases complementa-rias de dos ácidos nucleicos monocatenarios.Para que exista la formación de híbridos esta-bles debe haber un alto grado de complemen-taridad. Se define formalmente como sonda(“probe”) a un fragmento determinado de ARNo ADN marcado química o radioactivamente,utilizado para localizar determinadas secuen-cias de ácidos nucleicos mediante hibridación. A) Análisis de ADN por hibridacionesSouthern Blot Figura 5. Método de hibridación de Southern. a) Es- Los procedimientos utilizados, para separar cisión enzimática o mecánica del ADN; b) inclusiónácidos nucleicos y proteínas se rigen por el del ADN en el gel de agarosa y corrida electroforé-mismo principio, pero involucran algunas dife- tica; c) transferencia de las moléculas de ADN des-rencias de técnicas debidas a las característi- de el gel de agarosa hacia un filtro de nitrocelulosacas particulares de cada clase de moléculas. por capilaridad, previa desnaturalización del ADN; En 1975, E. M. Southern, publicó un nuevo d) hibridación con la sonda monohebra, seguida de lavados y detección por autorradiografía.procedimiento que permitió a los investiga-dores ubicar los genes y otras secuencias deADN sobre fragmentos de restricción separa-dos por electroforesis en gel. La principal ca- sus dos cadenas), ya sea antes o durante laracterística de esta técnica es la transferencia transferencia, mediante tratamiento alcalino.de las moléculas de ADN que han sido digeri- Una vez completada la transferencia, el ADNdas por endonucleasas de restricción y separa- es inmovilizado sobre la membrana por expo-das por electroforesis en gel a una membrana sición a elevada temperatura o a radiación UV.de nylon o nitrocelulosa. Esta transferencia se Una sonda de ADN conteniendo la secuenciadenomina Southern Blot, en honor al científi- de interés es entonces incubada con el ADNco que desarrolló la técnica (Fig. 5). Para rea- inmovilizado. La sonda sólo va a hibridar conlizarla, el ADN es desnaturalizado (abierto en moléculas de ADN que contienen la secuencia Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 57
  • 59. de nucleótidos complementaria a su secuencia. agente desnaturalizante de las proteínas. LosEl excedente de sonda no hibridada se elimina polipéptidos separados por electroforesis tam-mediante repetidos lavados de la membrana. bién pueden ser transferidos del gel a una mem-Las sondas pueden marcarse por diferentes brana de nitrocelulosa y pueden ser detectadosmétodos: con elementos radioactivos, o com- utilizando anticuerpos específicos. Esta trans-puestos que producen color o luminiscencia, ferencia de proteínas se denomina Westernetc. Luego de la hibridación, la membrana se blotting y se realiza utilizando una corrientesomete a diferentes procedimientos para poner eléctrica para trasladar las proteínas desde elen evidencia la sonda, de acuerdo al método gel a la superficie de la membrana. Despuéscon el que haya sido marcada. de la transferencia, la proteína de interés es identificada mediante la unión a un anticuerpo B) Análisis de ARN por transferencia e hi- específico que está conjugado (marcado) yabridación: Northern Blot sea con isótopos radioactivos, que permiten la De manera similar al tratamiento realizado detección por autoradiografía, o con enzimascon las moléculas de ADN, las moléculas de que producen un producto visible cuando se adiciona el sustrato correspondiente.ARN también pueden ser separadas por elec-troforesis en geles de agarosa, transferidas a 5. amplIficacion del adn: reacciónmembranas y analizadas. La transferencia de en cadena de la polimerasa (PCR)ARN se denomina Northern blot, en reconoci-miento al hecho de que el procedimiento es laimagen de espejo de la técnica Southern blot. La PCR constituye una tecnología poderosa Ambos procedimientos son esencialmen- que involucra la síntesis enzimática in vitro dete idénticos. Sin embargo, las moléculas de millones de copias de un segmento específicoARN son muy sensibles a la degradación por de ADN. La reacción se basa en la hibridaciónenzimas ARNasas. Por lo tanto, se debe tener de un par de oligonucleótidos, diseñados enmucha precaución para evitar la contaminación base a la secuencia de interés y sintetizadosde los materiales con estas enzimas. Además, artificialmente, a la secuencia de ADN (Fig 6).la mayoría de las moléculas de ARN contienen Estos oligonucleótidos funcionan como inicia-estructuras secundarias (producidas por apa- dores o cebadores (“primers”) que delimitan lareamiento complementario intracadenas), por secuencia a ser amplificada. La primera etapalo tanto deben mantenerse desnaturalizadas de la reacción involucra la desnaturalizacióndurante la electroforesis para poder separar- del ADN de doble cadena, por elevación delas en base a su tamaño. La desnaturalización la temperatura a 92-95°C. Posteriormente co-se provoca incorporando formaldehído u otro mienzan los ciclos de PCR, que comprenden:químico desnaturalizante a la solución tampón desnaturalización de la doble cadena, unión(“buffer”) utilizada en la electroforesis. Después por complementariedad del cebador al ADNde la transferencia a la membrana apropiada, de simple hebra y replicación del ADN a par-las moléculas de ARN pueden hibridar con tir del cebador, catalizada por la enzima Taqsondas de ADN o ARN. polimerasa. La temperatura de unión de los cebadores al ADN de cadena simple depende C) Análisis de proteínas por transferencia de la secuencia y tamaño del oligonucleótido,e inmunodetección o Western Blot así como de la estrategia especifica de trabajo, La electroforesis en gel de poliacrilamida es comprendiéndose en términos generales entreuna herramienta muy importante para la sepa- los 35-60°C. La fase de síntesis de ADN com-ración y caracterización de proteínas. Debido a plementario se lleva a cabo a la temperaturaque muchas de las proteínas están compues- óptima para que la Taq polimerasa realice latas por dos o más subunidades, las cadenas replicación a partir de cada extremo 3´ de lospolipeptídicas individuales son separadas por cebadores. Se trata de una ADN polimerasaelectroforesis en presencia del detergente do- termo-resistente aislada de Thermus aqua-decil sulfato de sodio (SDS), que actúa como ticus, bacteria que vive en fuentes termales.58 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 60. Figura 6. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). a) Representación de una reacción de PCR de tresciclos. En cada ciclo se suceden tres etapas: i- desnaturalización por calor del ADN (94°C) para separarlas hebras, ii- unión por complementariedad de los cebadores a las monohebras (en este ejemplo 55°C),iii- reacción de polimerización de por la enzima TAQ polimerasa, dando la hebra complementaria al moldede ADN (72°C); b) Comportamiento de una fragmento de ADN blanco de los cebadores, a través de losmencionados ciclos de PCR. En cada ciclo, se incrementa la cantidad de ADN blanco, siguiendo la relacion2n, donde n es el número de ciclos. En el ejemplo, con tres ciclos de PCR, se obtienen 23 copias. c) Verifi-cación de un producto de PCR sobre un gel de agarosa. En la calle de la izquierda se muestra el marcadorde peso molecular. En la primera calle, se observan dos fragmentos de 700 y 650 pares de bases (bp),respectivamente, sugiriendo que el cebador ha encontrado complementariedad en más de un sitio en elgenoma. Las calles 2 y 3 presentan banda única de 700 y 550 bp aaproximadamente en cada caso.Este ciclo es repetido por algunas decenas de Después de apenas 20 ciclos se logra másveces y, como el producto de cada polimeri- de un millón de veces la cantidad inicial de lazación sirve como molde para el siguiente, en secuencia de interés. Esta escala de amplifi-cada ciclo se duplica la cantidad de producto cación permite, por lo tanto, iniciar el procesosintetizado. Es necesario tener en cuenta que, con cantidades mínimas de ADN (del orden deademás de la enzima, los cebadores y el ADN pico o nanogramos) y terminar la reacción conde interés, para que se produzca la amplifica- grandes cantidades de una secuencia de inte-ción es necesaria la presencia de un medio rés. La versatilidad de esta reacción es enormetamponado y desoxinucleótidos (dNTPs) y clo- y la combinación de la PCR y la secuenciaciónruro de magnesio que actúa como cofactor de constituye una poderosa herramienta para ella enzima. El resultado de la reacción es un análisis de genes.fragmento de ADN de doble cadena cuyos ex- Como hemos mencionado, la técnica detremos corresponden a los extremos 5´ de los PCR es de suma utilidad para amplificar ADNcebadores y su tamaño a la distancia entre los a partir de fragmentos clonados en distintosmismos. A pesar de que se forman moléculas vectores, donde los cebadores son comple-más largas a partir del molde original en cada mentarios a los sitios del vector que flanqueanciclo, se acumulan solo a una tasa lineal y no el fragmento inserto. La versatilidad de la PCRcontribuyen significativamente a la masa final incluye la amplificación a partir de ADN de ma-de secuencia blanco. terial embebido en parafina por varios años, Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 59
  • 61. de material momificado, de restos fósiles, etc. sigla (RT- PCR). De lo expuesto es obvio, la ne-Dentro de los usos mas frecuentes, podemos cesidad de ser específicos en las denominacio-mencionar la detección de enfermedades gené- nes, sobre todo cuando se combinan ambas téc-ticas, determinación del sexo en embriones hu- nicas: “Real Time de RT – PCR”manos, clonación de genes, mutagénesis in vitroy mapeo y secuenciación de genomas. B) PCR cuantitativa (qPCR) o PCR en tiem- po real (RT-PCR). A) RT-PCR Una variante de la PCR convencional que se Se trata de una reacción de PCR, secundaria basa en la detección y cuantificación simultáneaa la transcripción reversa del ARNm, catalizada de la fluorescencia emitida por los productos depor la enzima transcriptasa reversa (RT). Esta PCR que se acumulan durante el proceso deenzima es capaz de sintetizar ADN utilizando amplificación. La PCR cuantitativa ofrece la po-ARN como molde y forma parte de la batería sibilidad de detectar, en tiempo real, el nivel deenzimática de los retrovirus, virus de ARN que amplificación de una secuencia de interés, conrequieren la síntesis de ADN para ser integrados el objeto de estimar la cantidad de esa secuen-en el genoma del hospedador. El esquema ge- cia presente en la muestra original. En la PCR aneral de la RT-PCR consiste en un primer paso tiempo real, los procesos de amplificación y de-de síntesis de ADN complementario (ADNc) de tección se producen en el mismo vial cerrado, sincadena simple tomando como molde el ARN. En necesidad de ninguna acción posterior. Además,esta etapa, llamada síntesis de la primera hebra mediante detección por fluorescencia se puede(first strand synthesis) se utilizan cebadores que medir durante la amplificación la cantidad depueden ser específicos para el gen de interés, ADN sintetizado en cada momento, ya que lahexámeros de secuencia al azar u oligodT, se- emisión de fluorescencia producida en la reac-gún se busque sintetizar sólo el ADNc específico ción es proporcional a la cantidad de ADN forma-o los ADNc correspondientes a todos los ARNs do. Esto permite conocer y registrar en todo mo-del tejido en cuestión. Por lo tanto, mientras que mento la cinética de la reacción de amplificación.el uso de primers específicos aumenta la espe- Los termocicladores para llevar a cabo la PCRcificidad, los otros dos tipos de cebadores maxi- a tiempo real incorporan un lector de fluorescen-mizan el número de moléculas de ARNm que cia y están diseñados para poder medir, en cual-pueden ser analizadas en una muestra peque- quier momento, la fluorescencia emitida en cadaña de ARN. El uso de hexámeros al azar, puede uno de los viales donde se realice la amplifica-ocasionar distorsiones por exceso en el número ción. Los sistemas de detección por fluorescen-de copias de un determinado ARNm, compara- cia empleados en la PCR a tiempo real puedendo con los cebadores específicos. La segunda ser de dos tipos: agentes intercalantes y sondasetapa consiste en subsecuentes ciclos de PCR específicas marcadas. Los agentes intercalantescon los cebadores específicos para la secuen- son fluorocromos cuya emisión de fluorescenciacia de interés, lo que permite obtener cantida- aumenta notablemente cuando se unen a ADNdes apropiadas del ADN para diversas mani- de doble hélice. El más empleado en PCR apulaciones genéticas. Esta estrategia conjunta tiempo real es el SYBR Green I. El incrementode retrotranscripción y PCR puede ser utilizada de ADN en cada ciclo se refleja en un aumen-para el estudio de ARNm a nivel de una célula to proporcional de la fluorescencia emitida. Esteindividual. Los principales alcances de esta téc- sistema de detección es de fácil implementaciónnica incluyen la determinación de la presencia o y mas económico que el uso de sondas especí-ausencia de un transcripto, estimación del nivel ficas. Sin embargo, presenta baja especificidad.de expresión y para el clonado de ADNc sin la El riesgo de amplificaciones inespecíficas pue-construcción de una genoteca. de disminuirse iniciando la reacción de PCR a La técnica de PCR por transcriptasa reversa temperaturas elevadas (hot-start PCR). Puedenes denominada como “RT-PCR”, la cual desafor- utilizarse polimerasas recombinantes que funcio-tunadamente, puede ser confundida con la PCR nan después de ser activadas por temperaturade Tiempo Real, ya que ambas tienen la misma o polimerasas unidas a anticuerpos que mantie-60 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 62. nen bloqueado el centro activo de la enzima has- lidad en la eficiencia de amplificación es menosta que son desnaturalizados por calor. Además, importante.la mayoría de los equipos de RT-PCR tienen laposibilidad de determinar el Tm de los fragmen- C) Variantes de la qPCRtos amplificados, que depende de su longitud y PCR múltiple: es una variante de la PCRde la composición de sus bases, resultando ca- cuantitativa en la que se amplifican simultánea-racterístico de cada fragmento. Las sondas de mente dos o más secuencias blanco en unasecuencia específica, están marcadas con dos única reacción. Este análisis en simultáneo detipos de fluorocromos, un donador y un aceptor. varias secuencias optimiza el aprovechamientoLas más utilizadas son las sondas de hidrólisis, de la muestra cuando se trata de materiales dedenominadas también sondas TaqMan que con- disponibilidad limitada y ofrece la posibilidad detienen un fluorocromo de extinción de fluores- realizar controles internos, por ejemplo, la expre-cencia (Q, quencher) unido en el extremo 3´ y sión de un gen constitutivo en ensayos de expre-otro reportero (R) en el extremo 5´. Cuando se sión. La PCR múltiple suele ser más complicadaproduce la extensión de la cadena de la sonda que la simple adición de varios cebadores a lapor acción de la Taq polimerasa, como resultado PCR cuantitativa simple. Se requiere extremardel clivaje del extintor por su actividad de exo- los cuidados en cuanto al diseño específico denucleasa es emitida la fluorescencia. La fluores- cebadores, sugiriéndose que tengan igual tem-cencia detectada durante cada ciclo de la PCR peratura de fusión (meeting point, Tm), un conte-será proporcional a la cantidad de ADN que se nido de GC del 45-60% y que carezcan de homo-está amplificando. logía entre sí. La alta eficiencia de los cebadores La confiabilidad de los resultados obtenidos en la PCR individual, no asegura el éxito en lamediante esta técnica requiere de la realización PCR múltiple, pero aumenta considerablementeen paralelo una curva patrón en las mismas con- las posibilidades de obtenerlo. La combinacióndiciones para conocer la cantidad total de ADN de flouróforos a utilizar en los diferentes cebado-que se está amplificando. res también debe elegirse de manera cuidadosa, Ente las principales aplicaciones de PCR en para que no exista superposición entre los es-tiempo real, podemos mencionar: pectros absorción y emisión entre ellos. Amplificación y detección de ADN o ARN Análisis de curvas de disociación. Se basaespecífico en una muestra. Los blancos de de- en la aplicación de un gradiente de temperatu-tección pueden estar asociados a la presencia ras creciente después de la PCR para monitori-de agentes patógenos, resultando una herra- zar la cinética de disociación de los fragmentosmienta de extrema utilidad para fines de diag- amplificados, pudiéndose establecer su Tm paranóstico clínico. En el caso del ARNm, debe ser comprobar su especificidad. También permite elpreviamente retrotranscripto a cDNA, mediante análisis de mutaciones puntuales, usando unauna transcriptasa reversa que posee actividad sonda complementaria con el ADN de tipo salva-endo H, es decir, remueve el ARNm permitiendo je, que abarque la posición del polimorfismo. Elque se forme la segunda hebra de ADN. Tam- híbrido formado entre sonda y ADN de tipo salva-bién puede aplicarse al estudio de las variantes je tendrá una estabilidad mayor que el formadode “splicing” (corte y empalme de intrones) del entre la sonda y el ADN mutado, puesto que enARNm. este caso la complementariedad no es absoluta, Cuantificación del ADN o ARN diana en la reflejándose en una Tm superior. Adicionalmen-muestra. Se puede cuantificar la concentración te, permite establecer además, de forma relati-inicial de ADN (o ARN) diana en la muestra de va, la cantidad de ADN de tipo salvaje y la demanera muy sencilla, a través de la construcción tipo mutado cuando ambos están presentes ende una curva de calibrado. El control de la am- la misma muestra.plificación como medida de la concentración en En la Sección IX, Capítulo 4, se detalla másla muestra se obtiene en las fases iniciales de este punto y se aplica esta técnica para la de-la reacción, en las que la concentración de los tección de organismos genéticamente modifi-reactivos no es limitante y el efecto de la variabi- cados (OGMs). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 61
  • 63. 6. Genotecas nitrógeno liquido para impedir cambios cuali o cuantitativos de la expresión. La susceptibili- Una genoteca (“gene library”) es una colec- dad del ARN al clivaje por ARNasas, requiereción de fragmentos de ADN clonados que re- de cuidados especiales en el material del labo-presentan en su conjunto el ADN total de un ratorio a ser empleado en el aislamiento. A par-organismo de interés o bien el ADNc, que re- tir del ARN total es posible separar el ARNm,presenta el conjunto de genes que se están tomando ventaja de la característica cola deexpresando en un órgano o tejido determinado poliadeninas que posee en el extremo 3´, me-o bajo una situación particular o momento de diante cromatografía de afinidad, utilizandocrecimiento o desarrollo. En el primer caso ha- columnas de celulosa que tienen ligados oligo-blamos de una genoteca genómica, donde se nucleótidos compuestos solo por desoxitiminaencuentran todas las secuencias que se expre- -oligo(dT). Al pasar el ARN por la columna, elsan y no se expresan en el organismo mientras ARNm queda unido por complementariedadque en el segundo se trata de una genoteca de al oligo(dT), a través de la cola de poliA. UnaADNc, donde se encuentran solo las secuen- vez separado del ARN total, el ARNm es eluídocias expresadas. de la columna utilizando una solución tampón Estas genotecas consisten en una colección adecuada.bacterias, conteniendo cada una un vector con Estas colas de poliA también son utilizadasel ADN inserto, dispuestas en pocillos. Las ge- en el próximo paso de clonado, donde fun-notecas carecen de un catálogo a través del cionan como sitio de unión de los cebadorescual se pueda saber cuál es el clon que con- oligo(dT), para la reacción catalizada por latiene una secuencia de interés, por lo que es enzima transcriptasa reversa. El producto denecesario realizar un relevamiento de las colo- la reacción es un híbrido ARN-ADN. La princi-nias bacterianas. Para ello se utiliza una sonda pal limitación de esta técnica radica en que ende ADN complementaria a la secuencia o gen los casos en los que el ADNc es muy largo, albuscados, que puede ser conocida o deducirse comenzar en el extremo 3´, muchas veces noa partir de la secuencia de aminoácidos de la llega la retrotranscripción al extremo 5´. Paraproteína purificada. subsanar esta dificultad, se utilizan primers al Una de las principales dificultades en el clo- azar de 6 a 10 nucleótidos de longitud y es-nado de ADN genómico es que algunas se- tán confeccionados de manera de representarcuencias están representadas una sola vez en muchas secuencias diferentes, por lo que lael genoma y es difícil hallarlas. Para superar reacción comienza a partir de muchos sitiosesta limitación de la metodología, puede clo- diferentes, no solo del extremo 3´. Cualquieranarse directamente el ADNc, ya que el número de estas estrategias conduce a la obtención dede copias del ARNm en el tejido correspondien- un híbrido ARN-ADN, a partir del cual median-te a un gen que se esta expresando es más te PCR, se obtiene ADN de doble cadena queelevado. El problema se plantea cuando no se puede clonarse en el vector apropiado.sabe en qué circunstancias o en qué tejido se Para obtener la segunda cadena, se desarro-expresa un gen en particular. Actualmente es lló inicialmente un método que tomaba ventajaposible clonar un ADNc a partir de mensajeros de una “vuelta” o “giro” que da la hebra reciénpoco abundantes en la célula, con concentra- sintetizada, como un efecto de cambio de rum-ciones de 1 a 2 moléculas por célula. bo de la transcriptasa reversa al llegar al final de la cadena de ARN. Este artefacto provee un A) Genotecas de ADNc cebador adecuado para la síntesis de la segun- El primer paso en la construcción de una ge- da cadena de ADN y puede eliminarse, una veznoteca de ADNc consiste en el aislamiento del obtenida la segunda cadena, con una nucleasaARN a partir del tejido o condición experimental S1, perdiéndose parte de la secuencia corres-planteada. Los cambios en la expresión génica pondiente al extremo 5’ del mensajero.asociados a la exposición a estímulos diversos, Existe una segunda técnica, que presentahacen necesaria la preservación del material dos ventajas sobre la anterior. Una es que ge-62 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 64. nera moléculas de ADNc más largas y la se- do del fago . Para ello se utiliza la transferasagunda es que contiene prácticamente toda la terminal, que adiciona colas de poliA o poliT,secuencia correspondiente al extremo 5´. Se o se agregan adaptadores, que son sitios ar-basa en la utilización de la enzima RNasaH, tificiales de reconocimiento de alguna enzimaque reconoce moléculas híbridas ARN-ADN y de restricción que se unen a los extremos dedigiere la cadena de ARN dejando trozos pe- la secuencia. Se trata de oligonucleótidos ar-queños que permanecen unidos a la primera tificiales (8-12 bp) que se unen al fragmentocadena del ADNc y sirven como primers para utilizando una ligasa de ADN y son cortadosla ADN polimerasa I, que usa el ADNc original con la enzima de restricción apropiada (Fig.como molde para sintetizar la hebra comple- 7). Ambos procedimientos sirven para generarmentaria de ADN. Solo queda un pequeño seg- extremos cohesivos a fin de unir el fragmentomento de ARN en el extremo 5´. La segunda al vector, que posee extremos cohesivos corta-cadena de ADN tiene algunos sectores no uni- dos por la misma enzima.dos que son sellados por una ligasa de ADN. Si se utilizan como vectores los plásmidos, Estas moléculas de ADNc de doble cadena se introducen en las células huésped (bacte-están listas ahora para ser insertadas en un rias) por transformación, Si se eligen los fa-vector, que puede ser un plásmido o un deriva- gos, son empaquetados in vitro para formarFigura 7. Clonado de ADNc de doble cadena en un fago. El ADN del fago contiene dos sitios de restricciónEcoRI. El ADN de la región central no esencial del fago se reemplaza por ADN foráneo, uniendo los frag-mentos del fago con el ADN a clonar a través de la enzima ADN ligasa. Es necesario previamente adicionaral ADNc adaptadores que llevan sitios EcoRI, para generar extremos cohesivos para acoplarse con el ADNdel fago. Se genera así una serie de moléculas recombinantes dispuestas en tandem, flanquedas por sitioscos. Este ADN recombinante se empaqueta formando partículas infecciosas del fago, que se utilizaránpara infectar un césped de bacterias. Esto se visualizará como placas o calvas. Cada placa surge de unamolécula recombinante individual, que se propaga ahora como un fago. Para la localización del gen deinterés en la genoteca, es necesario hacer una copia de la placa en membrana de nylon, que luego seráhibridada con una sonda para el gen marcada apropiadamente. Si la marcación es radiactiva, por ejemplo,será revelada por autoradiografía y el clon se identifica por comparación entre la marca de la membranade nylon y la placa de bacterias. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 63
  • 65. partículas víricas, que introducirán su ADN en Por ello, estas sondas oligonucleotídicas estánel hospedador apropiado por infección de un constituídas por una mezcla de todas las com-césped de bacterias crecido sobre la superficie binaciones posibles. Una de ellas correspon-de una placa de agar (Fig. 7). Si bien los vecto- derá a la secuencia correcta del gen buscado.res plasmídicos son más fáciles de manipular, El problema de esta estrategia es el elevadolas genotecas construídas en los fagos poseen número de falsos positivos que pueden dar lasfragmentos de mayor tamaño. secuencias adicionales. Una variante consiste Como resultado del cultivo en placa (plaqueo) en usar un menor número de oligonucleótidosde la genoteca, se obtienen cientos de miles a o uno solo pero de mayor longitud (35-75 nu-un millón colonias bacterianas o de placas de cleótidos), eligiendo una región de la proteínafagos (zonas claras o de lisis resultado de la que contenga el menor número posible de co-producción de particulas víricas), dependiendo dones degenerados, utilizando el conocimientodel vector utilizado, cada una conteniendo un de los codones más probables para la especiefragmento clonado, distribuidas sobre la placa en estudio.de agar. A fin de realizar la búsqueda de un gen Existen otras técnicas para localizar genesparticular (“screening”), la genoteca es replica- en las genotecas de ADNc, como hibridaciónda en membranas de nylon o nitrocelulosa, de diferencial, si se trata de genes expresados enmanera tal que el patrón de placas en la caja diferentes tejidos o la utilización de sondas deoriginal se vea exactamente reproducido en la regiones conservadas en familias de proteínasmembrana de nylon o filtro (Fig. 7). La búsque- para encontrar genes relacionados o bien lada se lleva a cabo por hibridación con una son- utilización de vectores de expresión.da de ácido nucleico, lo cual requiere un cono-cimiento previo de la secuencia de interés. B) Genotecas Genómicas Elección de la sonda: En algunos casos, Un genoteca genómica puede obtenerse dedonde parte del gen ha sido clonado, este se cualquier tejido ya que todas las células de unutiliza para buscar las partes faltantes. Si se organismo tienen la misma constitución genéti-usa un sonda donde la homología es completa ca. Se encuentran en ella, no solo las secuen-el “screening” puede realizarse en condiciones cias expresadas sino también las correspon-de alta rigurosidad (es decir, con lavados más dientes secuencias regulatorias. Pueden utili-fuertes, que tienden a despegar lo que se ha zarse fagos como vectores, pero sucede queunido inespecíficamente). Si la sonda no es muchos de los genomas eucariotas son muycompletamente homóloga el “screening” de- grandes, el de mamíferos por ejemplo contie-berá realizarse a menores temperaturas y uti- ne 3x109 pb de ADN. Si el promedio típico delizando concentraciones salinas más elevadas inserto es de 15.000 pb, se necesitarán unosen los lavados. Si no se tiene conocimiento 200.000 fagos para contener el genoma com-previo de la secuencia puede construirse una pleto. Para asegurar que todas las secuenciassonda a partir de la secuencia de aminoácidos estén representadas al menos una vez, losde la proteína. Cuando se utiliza esta estrate- cálculos estadísticos dicen que deberán ana-gia, el tamaño mínimo de la sonda debe ser lizarse aproximadamente de 1 a 2 millones dede 15 a 16 nucleótidos (que permite encontrar fagos.secuencias únicas en genotecas de ADNc eu- Por este motivo, especialmente cuando secarióticos. Generalmente se utilizan sondas de trata de genomas muy grandes, como es el17 a 20 nucleótidos (correspondientes a 6 ami- caso del genoma humano o de varias especiesnoácidos contiguos). Otra consideración a te- vegetales y animales, se utilizan las genotecasner en cuenta cuando se construye la sonda es de YACs o BACs.que existe más de un codón o triplete para defi-nir la mayoría de los aminoácidos (es lo que se Genotecas genómicas en cromosomasconoce como la “degeneración” del código ge- artificialesnético) por lo que un aminoácido puede estar La capacidad de clonar fragmentos de másespecificado por hasta 6 codones diferentes. de 100 kb es crucial para la genómica estruc-64 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 66. tural, funcional y comparativa de organismos Separación de grandes trozos de ADN:complejos. Las primeras genotecas genómicas electroforesis de campo pulsáti. Las técni-fueron construidas utilizando como vectores los cas estándar de separación de ADN en gelesYACs, aunque por sus limitaciones se prefiere de agarosa no son adecuadas para moléculasactualmente el uso BACs y PACs como vecto- mayores de 10 kb. Esta limitación ha sido sub-res. Cuando se trata de genomas de plantas, sanada con la electroforesis de campo pulsátil,pueden utilizarse como vectores los cromoso- en la que el campo eléctrico en el gel de aga-mas artificiales de bacterias binarios (BIBACs), rosa cambia periódicamente de orientación. Deque presentan la ventaja adicional de pueden esta manera pueden separarse moléculas tanusarse directamente para transformar plantas grandes como los cromosomas de levadurasutilizando Agrobacterium tumefaciens. (200 a 3000 kb) (ver VII.-1). La separación de Para preparar una genoteca genómica el las moléculas de este tamaño depende de suADN es escindido con enzimas de restricción relativa facilidad o dificultad para reorientarseo mecánicamente al azar, si se desea evitar la en respuesta a direcciones cambiantes de unpresencia de fragmentos demasiado largos o campo eléctrico. Esta técnica puede utilizarsecortos. Un paso crítico en el proceso es el ais- para hacer mapas físicos a gran escala.lamiento de moléculas intactas de ADN de ele- Preparación de una genoteca de BACs.vado peso molecular, esencialmente ADN cro- Como todo proceso de clonación, consiste enmosómico. Para ello las células se embeben la preparación del vector, aislamiento y diges-en bloques de agarosa de baja temperatura tión del ADN, selección de los fragmentos porde gelificación y se tratan con enzimas y otros tamaño, transformación de las bacterias y en-reactivos para separar el ADN de las proteínas samblado de la genoteca.celulares y del RNAs. La función del bloque de El vector debe estar purificado, digerido yagarosa es proteger a las grandes moléculas, defosforilado (cuando se corta con una solaque, embebidas en esta matriz, se someten enzima, se eliminan los fosfatos terminales,a la digestión con enzimas de restricción que para evitar la recircularización). La digestiónrealicen cortes poco frecuentes (“rare cutters”). del ADN es crítica para obtener fragmentosLa preparación de ADN de alta calidad en plan- adecuados para clonar. Los fragmentos sontas es más complicada que la correspondiente seleccionados por electroforesis de campo pul-para el caso de animales debido a la presencia sátil y se separan de la matriz de agarosa porde la pared celular, que dificulta el embebido digestión de la misma con agarasa o gelasa, oen bloques de azarosa. Para superar esta difi- por elusión del ADN desde el gel. Esto permitecultad se trabaja directamente con los núcleos construir genotecas con fragmentos de tama-aislados. Si se desea separar estos fragmen- ños similares, de aproximadamente 150 kb.tos por electroforesis, los bloques de agarosa Estas genotecas de grandes insertos sonconteniendo el DNA digerido pueden ser direc- consideradas recursos de largo plazo para in-tamente embebidos en la matriz del gel que se vestigación genómica y deben ser mantenidascorrerá. continuamente, especialmente cuando son uti- La cantidad de clones BACs que constitu-yen una genoteca, se relaciona con el tama- lizadas para proyectos de secuenciación y ma-ño del genoma, el tamaño promedio de los peo a gran escala. En general, cuando se vainsertos y la cobertura genómica esperada. a construir una genoteca debe elegirse cuida-Considerando el tamaño de inserto promedio dosamente el genotipo de la especie utilizadade los clones BACs, para cubrir cinco veces el como fuente de ADN, el tipo de inserto, etc.,genoma, una genoteca de BACs de la especie dado que la misma puede utilizarse para varia-modelo Arabidopsis thaliana, cuyo genoma es dos propósitos.pequeño, requerirá la obtención de 7.000 clo- En la Fig. 8 se esquematiza la búsqueda denes BACs, mientras que una de trigo candeal, un gen en una genoteca de BACs. Más de-cuyo genoma es dos ordenes de magnitud ma- talles acerca del ensamblado de los distintosyor, tendrá que estar compuesta por 500.000 fragmentos clonados puede encontrarse en elclones. capítulo correspondiente a genómica. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 65
  • 67. Figura 8. Búsqueda de un gen específico en una genoteca de BACs mediante PCR. Las 180 placas decultivo, de 96 pocillos cada una, contienen un genoma vegetal completo. Estas placas se replican, agru-padas de a 4, en filtros o membranas. Se realiza luego una reacción de PCR con el cebador específico alADN obtenido de un tubo que contiene los clones correspondientes a tres filtros, representando 12 placas,que fueron previamente agrupados. Como control positivo se utiliza el ADN vegetal total, también amplifi-cado por PCR. La reacción se analiza sobre un gel de agarosa. Un resultado positivo indica la presenciadel gen en el ADN genómico del vegetal y también en uno de los tubos, conteniendo el ADN de 12 placasde 96 pocillos, en la figura, corresponde al tubo 1, que contiene los clones de las placas 1, 2 y 3. Se rea-liza en mismo procedimiento con tubos que contienen los clones de cada placa. Cuando se chequean losconjuntos individuales se encuentra que el clon positivo pertenece al filtro 3. El producto de PCR se hibridaluego con este filtro y esto nos dará la posición exacta en la placa de 96 pocillos donde se encuentra elgen de interés. C) Genotecas de cromosomas específi- dora reconoce el patrón fluorescente típico decos o de segmentos de cromosomas cada cromosoma. Algunos cromosomas son Cuando se busca un gen que se sabe está muy similares por lo que no pueden ser sepa-ubicado en un cromosoma específico simplifica rados. Se necesita un millón de cromosomasmucho el trabajo hacer una genoteca de ese para hacer una genoteca. Equipos automáti-cromosoma solamente. Se trata de una técnica cos pueden hacer este trabajo en unas pocasque permite separar cromosomas metafásicos horas.teñidos con el colorante fluorescente Hoechst También puede microdisectarse un cromo-33258 para regiones ricas en AT y cromomicina soma, tomando un segmento del mismo queA, para regiones ricas en GC. Los cromosomas tenga la región de interés. En principio se uti-teñidos fluorescerán cuando se expongan a luz lizó esta técnica para cromosomas grandes,UV (de longitudes de onda de 361 y 363 nm fácilmente distinguibles por microscopía de(Hoechst 33258) o 458 nm (cromomicina A). contraste de fase. Actualmente, la combinaciónLas cantidades y proporciones de colorantes con PCR posibilita la aplicación de la técnica avarían para cada cromosoma y una computa- cualquier cromosoma. Estos son teñidos con66 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 68. Giemsa-tripsina y las bandas deseadas son crilamida donde, mediante autorradiografía, secortadas con agujas de vidrio ultrafinas y clo- determina el patrón de bandas, que refleja la se-nadas. Cebadores posicionados en el vector cuencia del ADN (Fig 9). Actualmente se utilizanpermiten amplificar secuencias desconocidas. digitalizadores de imágenes para la lectura de laEl ADN amplificado se clona en un vector apro- autorradiografía.piado y la localización cromosómica de cada Messing desarrolló una serie de vectores declon se determina utilizando hibridación in situ clonado basados en el fago filamentoso M13,(ver III.5) muy útiles para el secuenciado enzimático, con los que se utiliza un cebador universal que se 7. Secuenciación del ADN clonado posiciona en un lugar adyacente al sitio de po- liclonado del vector. La ventaja es que solo una Una vez que se ha obtenido el clon con el frag- de las cadenas del vector es empaquetada enmento de interés, el paso siguiente es secuen- las cabezas del fago. Este ADN de simple cade-ciarlo. La determinación de la secuencia puede na es ideal para utilizar con el método de Sanger.realizarse por el método químico de Maxam y Actualmente se utilizan fásmidos. La adición deGilbert o por el método enzimático de Sanger. El un “fago ayudante” (“helper phage”) a las célulasprimero consiste en la utilización de compuestos que lo contienen, hace que el ADN del mismo,que destruyen selectivamente una o dos de las de simple cadena, sea replicado, empaquetadobases que constituyen el ADN, partiendo de mo- y extruído de la célula. Al ser de menor tamañoléculas de ADN marcadas radiactivamente en un (aprox. 3000 bp) que M13 permite la inserciónextremo. La destrucción no debe ser total, sino de fragmentos de ADN más largos.que en promedio cada molécula de ADN indivi- Los proyectos de secuenciación genómica han requerido métodos de secuenciado más velocesdual, debe ser clivada una vez. En función del y económicos. Para ello se ha desarrollado unacompuesto químico utilizado y de las condiciones técnica llamada Multiplex, que permite manejarde reacción, se obtienen fragmentos de ADN hi- mayor cantidad de muestras en menor tiempo.drolisados a la altura de las bases G, A+G, T+C o Se utilizan 20 vectores plasmídicos que permi-C. Se generan fragmentos de distinto tamaño en ten construir 20 genotecas diferentes a partir delfunción de la distancia de la base destruida al ex- mismo ADN. Cada vector lleva dos secuenciastremo marcado del fragmento a secuenciar. Los únicas que flanquean al sitio de clonado, queproductos de las 4 reacciones se corren en un pueden ser usadas como etiquetas (“tags”) paragel de poliacrilamida que es revelado por auto- el ADN clonado y estarán presentes sobre cadarradiografía y la secuencia del fragmento queda fragmento a ser secuenciado. Se toma un clondeterminada por el patrón de bandas. de cada una de las genotecas plaqueadas (20 El método de Sanger, se basa en la interrup- colonias) y se mezclan. Se hace crecer el culti-ción controlada de la replicación enzimática del vo, se aísla el ADN y se secuencian los plásmi-ADN, añadiendo a la reacción de síntesis junto dos utilizando el método Maxam y Gilbert. Loscon los cuatro desoxinucleótidos, un 2´,3´- di- productos de 12 conjuntos de reacciones de se-desoxinucleótido (ddNTP) marcado. Los ddN- cuenciación se corren en un gel y se transfierenTPs pueden ser incorporados al ADN por la ADN a una membrana de nylon. El filtro se hibrida se-polimerasa pero interrumpe la síntesis de la ca- cuencialmente (es decir, se despega una sondadena por carecer del OH en posición 3´, nece- para luego hibridar con las siguiente y así su-sario para la formación del enlace con la base cesivamente), utilizando como sonda la etiquetasiguiente. Se preparan cuatro reacciones con de cada uno de los 20 vectores. En cada casoel ADN molde, el cebador, los cuatro dNTPs, y se van leyendo las secuencias correspondien-en cada una de ellas diferencialmente un ddN- tes a cada uno de los distintos vectores. De estaTPS. Con la proporción ddNTP:dNTP adecua- manera, una sola reacción produce datos de 20da, se generan fragmentos de distinta longitud, clones a la vez.dependiendo de la distancia de la última base Actualmente existen equipos robotizadosincorporada al extremo marcado del ADN. Estos que pueden llevar a cabo dos de las reaccio-fragmentos son separados en un gel de polia- nes más limitantes en el proceso de secuen- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 67
  • 69. Figura 9. Esquema de la secuenciación de ADN por el método de didesoxinucleótidos, de manera a) ma-nual, usando marcación radiactiva ó b) automática, utilizando ddNTPs que emiten color. Se representa ala hebra de ADN a secuenciar con el cebador unido por complementariedad. La reacción de síntesis delADN complementario por la enzima ADN polimerasa (PCR) se desarrolla: a) en cuatro tubos individuales,cada uno con los cuatro desoxinucleótidos (dNTPs) y un didesoxinuleótido particular (ddNTP). En general,el dNTP marcado radiactivamente es dATP; ó b) en un único tubo, con cada ddNTP unido a un marcadorfluorescente diferente. Luego, realiza la corrida electroforética en gel de poliacrilamida y la secuencia esleída desde la banda más corta (extremo 5’) hacia el de mayor longitud (extremo 3’) de manera: a) manualó b) digital, luego de la excitación con láser y emisión de fluorescencia, obteniéndose un cromatograma.ciado: la detección de las bandas de ADN y la completada los productos de las 4 reaccionestraducción de un patrón de bandas en uno de se mezclan y se corren en una sola calle de unsecuencia. Estos equipos utilizan nucleótidos gel, en un secuenciador automático. A medidamarcados con fluorocromos. Se utilizan 4 co- que los fragmentos pasan a través del láser,lorantes diferentes, que al ser exitados por lá- sus marcas fluorescentes se excitan y emitenser emiten luz de diferente longitud de onda. luz que se detecta mediante un fotomultiplica-Los colorantes pueden utilizarse para marcar dor. Después de ser procesada por una com-el primer universal de secuenciación de M13 putadora, la secuencia es mostrada como unao cada uno de los 4 terminadores de cadena serie de picos o cromatograma, donde cadadidesoxi. En este caso, cada mezcla de reac- uno de los 4 colores representa a un nucleótidoción con un terminador diferente se marca con diferente (rojo: timina, verde: adenina, negro:un colorante diferente. Cuando la reacción es guanina y azul: citosina) (Fig. 9).68 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 70. Lecturas RecomendadasMadigan M. T., Martinko J. M. and Parker J. 1999 Brock, Biología de los Microorganismos. Octa- va edición revisada. Prentice Hall Iberia. Madrid, España.Singleton P. 2004. Bacterias en Biología, Biotecno- logía y Medicina. 5ta Edición. Acribia.Sambrook J., Fmitsch E. F. and Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor.Southern E. M. 1975 Detection of specific sequen- ces among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol., 98, 503-517Fütterer J., Gisel A., Iglesias V., Kloti A., Kost B., Mittelsten Scheid O., Neuhaus G., Neuhaus-Url G., Schrott M., Shillito R., Spangenberg G. and Wang Z. Y. 1995. Standard Molecular Techni- ques for the Analysis of Transgenic Plants. En Gene Transfer to Plants. Potrykus Y, Spangen- berg G (eds.) Springer Lab Manual.Watson J. D., Baker T. A., Bell S. P., Gann A., Levi- ne M. and Losick Y. R. 2006. Biología Molecular del Gen. 5ª Edición, Ed. Médica Panamericana. Madrid. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 69
  • 71. I. Capítulo 5. identificación visual tales como forma de hoja, pubescencia, color de fruto, etc. En todos los casos debe tratarse de caracteres de heren- Marcadores Moleculares cia monogénica y predecible según las leyes de Mendel. Muchos de ellos se convierten enMaría Carolina Martínez, Marcelo Helguera, importantes descriptores a la hora de inscri-Alicia Carrera. bir nuevas variedades. Por ejemplo, alrede- dor de 50 caracteres de plántula, tallo, hoja, 5.1. Introducción espiga, espiguilla y cariopse se utilizan para Desde sus comienzos, el objetivo del mejo- inscribir e identificar variedades de trigo en laramiento vegetal ha sido seleccionar genoti- Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pescapos superiores a partir de la identificación de y Alimentación de la Argentina. Este tipo defenotipos superiores. El grado de éxito en este marcadores contribuyó significativamente alproceso depende de: i) el número de genes in- desarrollo teórico del concepto de ligamientovolucrados en el control genético del carácter genético y a la construcción de los primeros(herencia monogénica o poligénica) y las rela- mapas genéticos de plantas (como por ejem-ciones interalélicas (dominancia o aditividad), ii) plo, en tomate y maíz). En el mejoramiento dela influencia del ambiente, que se mide normal- girasol, los primeros híbridos se obtuvieronmente a través del parámetro heredabilidad. utilizando “color de hipocótile” como marcadorEl proceso de caracterización y/o selección se ligado al gen ms de androesterilidad; de estevuelve más eficiente a través del uso de mar- modo las plantas verdes que eran androesté-cadores genéticos, definidos como caracteres riles se utilizaban como líneas maternas y lasque presentan polimorfismo o variabilidad ex- plantas con antocianas que eran fértiles se eli-perimentalmente detectable en individuos de minaban del lote de producción al comienzo deuna población segregante y un tipo de herencia su desarrollo.predecible según las leyes de Mendel. Esta va- Las principales limitaciones de los marcado-riación puede considerarse a diferentes niveles res morfológicos son: i) se encuentran disponi-biológicos, desde cambios fenotípicos hereda- bles en un número restringido de especies ve-bles significativos (marcador morfológico) hasta getales, utilizadas como sistemas modelo parala variación de un solo nucleótido de ADN (mar- estudios genéticos, tales como el maíz, el to-cador molecular). El marcador ideal debería ser mate y la arveja, ii) bajo nivel de polimorfismo,altamente polimórfico (dentro y entre especies), iii) pueden producir alteraciones fenotípicasde herencia mendeliana no epistática, insensi- que dificultan el desarrollo de la planta (albinis-ble a los efectos ambientales, codominante (ca- mo), iv) generalmente de herencia dominantepaz de diferenciar individuos heterocigotas de y en algunos casos poligénica y, v) muchos dehomocigotas), de rápida identificación y simple ellos se expresan en estadio de planta adulta,análisis, y de detección en los estadios tempra- lo cual prolonga los tiempos de evaluación ennos del desarrollo de la planta. los programas de mejoramiento. En la actualidad existe una gran variedad Un enorme espectro de especies vegetalesde marcadores genéticos y a lo largo de este carece de información a este nivel. No obstan-capítulo desarrollaremos aquellos más frecuen- te, los marcadores morfológicos permanecentemente utilizados en plantas. Para una mejor como caracteres útiles en la identificación decomprensión se propone clasificar los marca- materiales dado que representan un conjuntodores en las siguientes categorías: i) marcado- de genes que pueden ser evaluados con méto-res morfológicos, ii) marcadores bioquímicos, dos sencillos y a bajo costo.iii) marcadores moleculares, iv) marcadoresfuncionales o de expresión, vi) marcadores ba- 5.3 Marcadores Bioquímicossados en SNPs. Son polimorfismos presentes en ciertas pro- teínas detectados a través de técnicas bioquí- 5.2 Marcadores Morfológicos micas. El desarrollo de los marcadores bioquí- Son características fenotípicas de sencilla70 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 72. micos produjo una revolución en los estudios no presentes en los homocigotas, que se ge-genéticos en plantas, que hasta el momento neran por la combinación de sub-unidades co-habían contado con un limitado número de dificadas por los distintos alelos o loci (Figuramarcadores morfológicos. La técnica permitía 1). Finalmente, iv) Compartimentalizaciónincluir potencialmente a todas las especies de subcelular: se encuentran formas enzimáticasplantas. En esta parte del capítulo nos referi- localizadas en citoplasma, cloroplasto o mito-remos a las Isoenzimas y a las Proteínas de condria, codificadas todas por genes nuclearesreserva. pero con diferentes velocidades de migración. 5.3.1 Isoenzimas Las isoenzimas se definen como diferentesformas moleculares de una enzima, que po-seen una actividad catalítica común, es deciractúan sobre el mismo sustrato. Ciertos cam-bios en el ADN que codifica estas enzimas(mutaciones) pueden resultar en cambios en lacomposición de aminoácidos, originando pro-teínas con la misma actividad biológica perocon diferente carga neta y por lo tanto con dife- Figura 1.rentes velocidades de migración en un campoeléctrico. Estas diferencias determinan patro-nes característicos de migración electroforética Las isoenzimas se extraen por homogenei-de las formas iso-enzimáticas. Varios factores zación del tejido (semilla, raíz, hoja) en condi-definen el patrón de bandas o zimograma: i) ciones no desnaturalizantes (que preservan laNúmero de genes que las codifican: la pre- actividad catalítica de la enzima) y se analizansencia de varios genes codificando para una mediante electroforesis en un soporte sólido,misma enzima ha sido atribuida a procesos de generalmente almidón. El gel puede ser corta-duplicación génica y subsecuente divergen- do en capas horizontales y cada una se desti-cia a través de mutaciones diferentes en cada na a una solución de revelado específica quecaso; ii) Estados alélicos: el proceso más sim- consta de un sustrato, un colorante y cofacto-ple de generación de nuevas formas enzimá- res, disueltos en un buffer apropiado. La reac-ticas es la mutación de un gen estructural, las ción que ocurre entre las enzimas presentesvariantes alélicas se denominan aloenzimas. en el gel y el correspondiente sustrato generanEstos marcadores muestran codominancia productos coloreados que conforman el patrón(en un individuo diploide ambos alelos de un de bandas. Las metodologías empleadas enlocus son expresados y visualizados). A modo la extracción y electroforesis son relativamen-de ejemplo, la enzima alcohol dehidrogenasa te sencillas y rápidas y el equipamiento es de(ADH), puede comprender varios loci y alelos bajo costo.con denominación Adh-1a, Adh-1b, Adh-2a, Las isoenzimas han tenido un rol prominenteAdh-2b, Adh-2c, etc.; iii) Estructura cuaterna- en estudios de poblaciones vegetales para de-ria de los productos proteicos: la enzima fun- terminar variabilidad y estructura genética, sis-cional puede estar compuesta por un número temática y biología evolutiva así como en des-variable de sub-unidades. En las formas más cripción de germoplasma e identificación desimples o monoméricas los individuos homoci- variedades. Su aplicación en la construccióngotas presentan una banda y los heterocigotas de mapas se ha visto limitada por el númerosimplemente la suma de ambas. Cuando la es- de marcadores isoenzimáticos disponibles (entructura cuaternaria se vuelve más compleja, general menor a 50), y por su reducido poli-encontramos enzimas activas compuestas por morfismo (2-4 alelos). Por otro lado, las formasdímeros, tetrámeros, etc. En este caso el indivi- enzimáticas extraídas de hoja o raíz (no así lasduo heterocigota presenta bandas adicionales de semilla) presentan variaciones en relación a Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 71
  • 73. las condiciones ambientales de crecimiento y nados conformando familias. Varios estudiosa la edad del tejido, lo cual afecta la reproduci- demuestran que durante la evolución de estosbilidad de los zimogramas. No obstante, estos genes se han detectado duplicaciones, trans-loci representan importantes marcas de refe- locaciones, inserciones de elementos móviles,rencia para relacionar mapas obtenidos a partir entre otros rearreglos cromosómicos, que se-de distintos marcadores de ADN. rían los responsables de generar un alto ni- vel de polimorfismo protéico entre y dentro de 5.3.2 Proteínas de reserva especies. Las proteínas de reserva son un grupo he- Por ejemplo, en el caso del trigo, las principa-terogéneo de proteínas presentes en la semi- les proteínas de reserva del grano se denomi-lla de planta que tienen por función proveer nan gluteninas y gliadinas, estas proteínas sonenergía al embrión en los primeros estadios de capaces de polimerizar durante el amasado decrecimiento. Estas proteínas han sido extensa- la harina formando una red denominada glutenmente estudiadas en cereales y oleaginosas y de importancia fundamental en la elaboraciónse relacionan directamente con la calidad del de pan. Desde un punto de vista genético, lasgrano. gluteninas se hayan codificadas en los loci Glu- Las proteínas de reserva se extraen me- 1 y Glu-3 y las gliadinas en Gli-1 y Gli-2 pu-diante procedimientos sencillos a partir de las diendo tener cada uno de estos loci 1, 2 o mássemillas y se separan mediante electrofore- genes; mutaciones en estos genes generansis en geles de poliacrilamida en condiciones nuevas variantes alélicas. Numerosos estudiosdesnaturalizantes (con detergentes). No se electroforéticos han revelado alto grado de po-requiere detectar actividad enzimática, las pro- limorfismo en el número y la movilidad electro-teínas se visualizan directamente por tinción forética de estas proteínas y muchos de estoscon Azul de Coomassie evidenciándose los polimorfismos son utilizados como marcadorespolimorfismos como diferencias en la movilidad genéticos para mejorar la calidad panadera delelectroforética. trigo, principalmente en el caso de las glute- En la mayoría de los cereales, estas proteí- ninas (Figura 2). Las gliadinas muestran pa-nas están codificadas por varios genes relacio- trones electroforéticos más complejos que las Figura 2.72 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 74. gluteninas y han sido utilizadas en la descrip- 5.4.1 Marcadores basados en la hibridaciónción de germoplasma e identificación de varie- del ADNdades. Como en el caso de las isoenzimas, laaplicación de proteínas de reserva en la cons- 5.4.1.1 RFLP (Restriction Fragment Lengthtrucción de mapas genéticos es limitada por el Polymorphism) o polimorfismo en la longitudnúmero de marcadores genéticos disponibles, de fragmentos de restricción (Botstein et al.,sin embargo estos loci representan importantes 1980)marcas de referencia, por ejemplo, para los cro- Son los marcadores moleculares más anti-mosomas 1 y 6 de trigo, donde están presentes guos y aún son usados para algunas aplica-los principales genes de gluteninas y gliadinas. ciones importantes como mapeo comparativo y Para más información sobre estructura, pro- estudios de sintenia entre especies (ver Partepiedades y rol de las proteínas de reserva en III, Capítulo 2 "Aplicaciones de los Marcadoresgrano se recomienda la lectura de la revisión de Moleculares").Branlard et al. (2001). Este marcador se basa en la comparación de La principal ventaja de los marcadores bio- perfiles de bandas generados a partir del ADNquímicos es su fácil implementación en el labo- de distintos individuos por digestión con enzi-ratorio ya que involucran metodologías senci- mas de restricción. Los fragmentos obtenidosllas, rápidas y de bajo costo. Como desventajas se separan por su tamaño mediante electrofore-se pueden citar: baja cobertura del genoma, di- sis y se transfieren a una membrana donde son desnaturalizados y luego hibridados con unaficultades en la interpretación de los resultados sonda. Esta sonda es un fragmento de ADN de(principalmente para las Isoenzimas) y, en el cadena simple (de secuencia conocida o no)caso de las proteínas de reserva, dado que mu- que está marcado radioactivamente. La sondachos de los genes codificantes suelen estar es- se unirá a aquellos fragmentos de restriccióntrechamente ligados (familias multigénicas), no con secuencia complementaria a la misma (verse puede asumir independencia entre los loci. enzimas de restricción y método de Southern Blot en Parte I, Capítulo 4 “Herramientas bási- 5.4 Marcadores moleculares cas de Ingenieria Genetica”). Un marcador molecular es simplemente un Para la visualización, la membrana se ex-segmento de ADN con una ubicación especí- pone a una placa radiográfica. En cuanto afica en un cromosoma (punto de referencia) la sonda empleada esta puede ser genómicacuya herencia puede seguirse en individuos de (con alta proporción de ADN no codificante, nouna población. La secuencia puede pertenecer perteneciente a ningún gen) o de ADNc (cuan-a regiones codificantes (genes) o sin función do proviene de un transcripto). También puedeconocida. obtenerse a partir de ADN de organelas (mi- Con el advenimiento de las técnicas moder- tocondrias o cloroplastos). Pueden emplearsenas de biología molecular (para más detalle ver sondas aisladas de especies relacionadas (porI.- 4), surgieron diversos métodos de detección ejemplo, sondas aisladas de tomate puedende polimorfismo genético directamente a nivel emplearse en papa y viceversa).de ADN. En la actualidad, se puede obtener un La variabilidad genética presente en el mar-número prácticamente ilimitado de marcado- cador molecular proviene de diferencias en lares en cualquier organismo vivo que permiten secuencia del ADN genómico debidas a mu-analizar la totalidad de la información genética taciones puntuales en los sitios de restricción,(genoma) de un organismo. a duplicaciones, deleciones, inserciones, etc., Para describir los distintos tipos de marca- que modifican la distancia entre pares de si-dores moleculares, se seguirá una clasificación tios de restricción generando fragmentos po-arbitraria en base a las metodologías que em- limórficos (de diferentes tamaños) (Figura 3).plean para su detección. Todas estas técnicas Un locus RFLP está definido por la combina-parten, como primer paso, de extraer ADN ge- ción de una enzima de restricción y una sonda.nómico de la planta bajo estudio. Individuos homocigotas poseen el mismo pa- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 73
  • 75. satélites, son repeticiones de secuencias de 9 a 100 pares de bases. El número de repeticiones es variable pero en general es menor a 1000. Existen dos formas de detectar los VNTR: por hibridación o por técnicas de PCR. En el pri- mer caso, el ADN genómico es digerido con enzimas de restricción que reconocen sitios adyacentes a la región repetida. Los fragmen- tos se separan por electroforesis, se inmovili- zan en una membrana y se detectan mediante sondas. La longitud de los fragmentos de res- tricción producidos en diferentes individuos va- ría de acuerdo al número de repeticiones del minisatélite. La diferencia básica entre RFLP y VNTR reside en el tipo de sonda utilizada. En la técnica de VNTR las sondas están constitui- das por secuencias homólogas a las secuen- cias repetidas de los minisatélites, por lo tanto todos los loci hipervariables del genoma son detectados simultáneamente, mientras que en RFLP, las sondas son homólogas a secuencias únicas del genoma, detectando así uno o po- cos loci cada vez. De esta manera, en el auto- rradiograma, al contrario del patrón simple de bandas obtenido por RFLP, para minisatélites se obtiene un perfil complejo de bandas múlti- Figura 3. ples. Los VNTR tienen la ventaja que además de explorar el polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción en cada locus hi- pervariable, utilizan también el polimorfismo entrón de restricción en ambos cromosomas ho- el número y distribución de estos loci a lo largomólogos y por lo tanto producen una sola ban- del genoma, posibilitando así la visualizaciónda. Ejemplos de nomenclatura utilizada para simultánea de diversas regiones del mismo.loci RFLP son XNpb136 de arroz o Xpsr912-2A Las limitaciones para esta técnica, son las mis-de trigo, que hacen referencia al laboratorio de mas descriptas oportunamente para RFLP.origen y a las sondas utilizadas. Los minisatélites también pueden ser detec- Las ventajas de los RFLPs radican en que tados mediante la amplificación por PCR de losson altamente reproducibles, codominantes segmentos conteniendo diferente número dey multialélicos. Por otro lado, cuentan con las repeticiones, utilizando iniciadores o "primers"desventajas de ser muy laboriosos, difíciles de que flanqueen los VNTR y luego su visualiza-automatizar, se necesita disponer de las son- ción mediante electroforesis y tinción con bro-das para la especie en estudio y requieren de muro de etidio. Esta opción se ha vuelto másinfraestructura adecuada para mantener las frecuente con el aumento de información desondas y trabajar con radiactivo, lo que los secuencias en bases de datos que permiten elhace relativamente costosos. diseño de iniciadores flanqueantes a determi- nados minisatélites. Sin embargo estos marca- 5.4.1.2 VNTR (Variable Number of Tandem dores han sido poco utilizados en plantas.Repeats) o repeticiones en tandem de númerovariable 5.4.2 Marcadores basados en la amplifica- Los VNTR, también conocidos como mini- ción arbitraria o semi arbitraria del ADN74 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 76. 5.4.2.1 RAPDs (Random Amplified tre distintos individuos consiste en la presenciaPolymorphic DNAs) o ADN polimórfico ampli- o ausencia de fragmentos de ADN amplificadoficado aleatoriamente (Williams et al. 1990, debido a mutaciones en el sitio de reconoci-Welsh y McClelland 1990) miento del iniciador, deleciones, inserciones. La metodología de RAPD fue desarrollada Este marcador no permite diferenciar indivi-de forma independiente por dos grupos de duos heterozigotas, por lo que es un marca-Estados Unidos. Un grupo la denominó RAPD y dor dominante. Los marcadores RAPD estánel otro AP-PCR (Arbitrarily Primed-Polymerase basados en una técnica sencilla, de bajo costoChain Reaction o reacción en cadena de la po- de implementación, automatizable y no radio-limerasa con iniciadores arbitrarios). activa. A diferencia de los marcadores basados La técnica de RAPD es una variante de PCR en PCR convencional no se requiere informa-que utiliza un solo oligonucleótido de 10 bp ción nucleotídica previa para su desarrollo, seque hibrida al azar con el ADN en estudio. Para dispone de un número ilimitado de marcadoresque se genere un fragmento RAPD es nece- y el nivel de loci polimórficos es alto. La princi-sario que el oligonucleótido iniciador hibride pal desventaja de esta técnica es su baja re-en las dos cadenas del ADN en orientaciones producibilidad entre laboratorios, en el sentidoopuestas suficientemente cercanas (menos de de que pequeñas modificaciones en la técnica3000 bp) como para permitir la amplificación. como por ejemplo, concentración de ADN ini-La secuencia del oligonucleótido es aleatoria cial, modelo de termociclador, origen de ADNal igual que los sitios de hibridación en el ADN, Polimerasa termoestable, etc., pueden alterarpor lo tanto la secuencia amplificada es desco- el patrón de fragmentos de ADN generados pornocida. El iniciador puede hibridar en distintos RAPD de una muestra.sitios del ADN sin necesidad de complementa- Relacionados con los RAPDs encontramosriedad exacta de bases, dado que la PCR se a los marcadores DAF (DNA Amplificationhace con temperaturas de unión del iniciador Fingerprinting) (Caetano Anollés et al. 1991)bajas, generando varios fragmentos que son y AP-PCR (Arbitrary Primed PCR) (Welsh yresueltos mediante electroforesis y posterior McClelland 1990). DAF y AP-PCR son técni-tinción (Figura 4). Cada banda del patrón de cas similares a RAPD. DAF involucra el usoamplificación es considerada un locus RAPD, de iniciadores arbitrarios de 5 pares de basesdefinido por la secuencia del iniciador y el peso de longitud. Esto incrementa la probabilidad demolecular. El polimorfismo que se observa en- apareamiento con el ADN molde respecto al Figura 4. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 75
  • 77. RAPD y, por lo tanto, resulta en un perfil más va empleando un nucleótido arbitrario (amplifi-complejo de bandas. La visualización se lleva cación +1 o preamplificación) y luego, este pro-a cabo por medio de geles de poliacrilamida ducto de amplificación obtenido es empleadoteñidos con plata. AP-PCR utiliza iniciadores como molde en una nueva amplificación em-ligeramente más largos que la técnica anterior pleando iniciadores que poseen 2 nucleótidos(aprox. 20 pares de bases). Los productos de selectivos adicionales al anterior (amplificaciónamplificación son marcados radiactivamente y +3 o amplificación final); iv) El análisis de lostambién pueden ser resueltos por electrofore- fragmentos así amplificados se realiza me-sis en geles de poliacrilamida. Las ventajas y diante electroforesis en geles de poliacrilami-limitaciones de estas técnicas son similares a da desnaturalizantes. Si uno de los iniciadoreslas descriptas para los RAPD. empleados está marcado radiactivamente, se visualizará mediante autorradiografía, si uno de 5.4.2.2 AFLPs (Amplified Fragment Length los iniciadores está marcado con un compues-Polymorphism) o polimorfismos en la longitud to fluorescente, puede ser resuelto empleandode fragmentos amplificados (Vos et al. 1995) un secuenciador automático. Alternativamente, Los marcadores AFLP constituyen una he- se puede visualizar mediante tinción con nitra-rramienta poderosa de análisis del genoma to de plata (Figura. 5).dado que poseen un alto poder de detecciónde la variabilidad genética. El ensayo de AFLPcombina la especificidad, resolución y poderde muestreo de la digestión con enzimas derestricción con la velocidad y practicidad de ladetección de polimorfismos mediante PCR, sinnecesidad de disponer de información previadel genoma a estudiar. Desde su desarrollo ydivulgación esta técnica se utiliza ampliamenteen el análisis de plantas. Consiste esencialmente en cuatro etapas: i)el ADN genómico es cortado con dos enzimasde restricción. Generalmente una es de corteraro (ej. EcoRI), que reconoce de 6 a 8 paresde bases y otra es de corte frecuente (ej. MseI)que reconoce 4 pares de bases; ii) fragmen-tos de ADN doble cadena de 20 a 30 pares debases llamados adaptadores se ligan en formaespecífica a los extremos de los fragmentosobtenidos en el paso anterior, generando así elmolde para la amplificación posterior del ADN;iii) se amplifican selectivamente fragmentospor PCR. En esta etapa, se utilizan iniciadoresde aproximadamente 20 nucleótidos que con-tienen una secuencia específica complementa-ria a la secuencia de los adaptadores y ade-más, 1 a 3 nucleótidos selectivos adicionalesde secuencia arbitraria en su extremo 3´. Dadoque sólo una subpoblación de los fragmentosoriginales es amplificada, se obtiene un patrónde bandas que permite un registro adecuado.La amplificación descripta en iii) se realiza endos etapas: una primera amplificación selecti- Figura 5.76 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 78. La base genética del polimorfismo de AFLP marcadores incluidos en la presente categoríaes la ausencia o presencia de fragmentos am- requieren del diseño de iniciadores específicosplificados de un tamaño determinado dado por para la amplificación de un locus en particular.mutaciones puntuales, inversiones, insercio-nes y deleciones que llevan a la pérdida o ga- 5.4.3.1 Microsatélites (Litt y Luty 1989)nancia de un sitio de restricción o la alteración Los microsatélites son regiones hipervaria-de la secuencia reconocida o amplificada por bles del genoma que contienen arreglos de se-los iniciadores. Al igual que en los RAPDs, no cuencias simples en tandem de mono, di, tri,es posible distinguir individuos heterocigotas tetra o pentanucleótidos que se repiten entrepor lo que se trata de un marcador dominante. 10 y 100 veces. Los marcadores microsatéli-Una banda AFLP se interpreta como un locus, tes, también denominados Simple Sequencedefinido por las dos enzimas de restricción, Length Polymorphism (SSLP), Simpleuna combinación de primers que incluyen las Sequence Repeat Polymorphism (SSRP),bases selectivas (Ej. EcoRI-ATC/MseI-AAG) y Simple Sequence Repeats (SSR) o Sequence-un peso molecular. Tagged Microsatellite Sites (STMS) se encuen- Su implementación en laboratorio requie- tran distribuidos por todo el genoma de la ma-re de una infraestructura considerable, son yoría de las especies eucariotas.relativamente laboriosos para su obtención Los microsatélites se detectan mediante suy el costo es medio a alto. Estos marcadores amplificación por PCR usando iniciadores es-presentan un alto poder de detección de la pecíficos de 20 a 30 pb de longitud que hibri-variabilidad genética, ya que se explora simul- dan en la región que flanquea al tandem detáneamente el polimorfismo de ausencia/pre- repeticiones (microsatélite). Estos marcadoressencia de sitios de restricción (como los RFLP) se resuelven por electroforesis en geles de po-y la ocurrencia o no de amplificación a partir liacrilamida en condiciones desnaturalizantes,de secuencias arbitrarias (como los RAPDs). mediante tinción con plata o por autoradiogra-Es un marcador mucho más robusto que los fía (en el caso de usar un iniciador marcadoRAPDs, ya que en la amplificación se utilizan radioactivamente). Si se dispone de un se-oligonucleótidos más largos, que aumentan cuenciador automático, se pueden resolver porsignificativamente la especificidad de la reac- tamaño en este equipo mediante el empleo deción sin perder las ventajas de la amplificación un iniciador marcado con un fluoróforo, posibi-de secuencias al azar (no requiere información litando un análisis automatizado.previa de secuencia de ADN). Asimismo, se La base genética del polimorfismo detecta-pueden emplear distintas enzimas de restric- do en microsatélites se basa en la variabilidadción e iniciadores selectivos, resultando en una del número de repeticiones en tandem y, con-ilimitada posibilidad de generar polimorfismos. secuentemente, en el tamaño del microsatéli-Otra ventaja de los AFLPs es el número de te amplificado en individuos de una especie.fragmentos (marcadores) obtenidos por reac- Estas diferencias son originadas durante la re-ción y resueltos por electroforesis (oscila entre plicación del ADN debido a fallas en la acción30 - 50 contra los 4 – 10 de RAPDs). de la ADN polimerasa durante el copiado de Una variante de esta técnica es la llama- una región repetida donde incorpora o eliminada cDNA-AFLP que, en vez de ADN genómi- repeticiones. Otro mecanismo responsable deco, parte de ARN mensajero que es copiado la variación es el entrecruzamiento desiguala ADNc. Esta metodología es empleada en entre cromosomas homólogos. En este casoanálisis de expresión diferencial de genes, es- se generan alelos con diferencias mayores entudios del transcriptoma y genómica funcional. el número de repeticiones. El desarrollo de marcadores microsatélites 5.4.3. Marcadores moleculares basados en requiere del conocimiento de las secuenciasla amplificación sitio-específica del ADN flanqueantes adecuadas para el diseño de En contraste con los marcadores basados en los iniciadores específicos. Los primeros SSRla amplificación de secuencias arbitrarias, los se desarrollaron a través de un proceso ex- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 77
  • 79. perimental complejo que implicó la obtención calizado entre ellas. Conceptualmente, seríade genotecas enriquecidas en microsatélites, similar a RAPD empleando un iniciador con lasecuenciación, diseño de iniciadores aptos secuencia repetida del microsatélite.para amplificar microsatélites por PCR y se- ISSR (Inter-SSR amplification): se basan enlección de loci con patrones de herencia sim- la amplificación por PCR empleando iniciado-ple. Actualmente, las secuencias flanqueantes res que contienen en su secuencia repeticionespueden obtenerse a partir de las secuencias de di o trinucleótidos junto con 4 bases nucleo-depositadas en las bases de datos (búsqueda tídicas determinadas en uno de sus extremos.in silico). El uso de programas informáticos es- Esto permite la amplificación parcial de todaspecializados en la búsqueda de microsatélites las regiones (potencialmente) amplificadas porha revelado que existen secuencias con estas el marcador MP-PCR, descripto anteriormente,características formando parte de secuencias aumentando la reproducibilidad, que es una deque se expresan (genes), denominándose SSR las limitaciones del uso de los MP-PCR. Al te-génicos o EST-SSRs. Aunque tendrían un nivel ner en el iniciador esas 4 bases extras, a estede polimorfismo menor, serían más fácilmente tipo de marcador se lo conoce también comotransferibles entre especies relacionadas. microsatélite anclado (AMP-PCR, Anchored Un locus SSR está definido por las secuen- Microsatellite-Primed PCR).cias de los iniciadores flanqueantes al micro- SAMPLE (Selective Amplification ofsatélite. Por el alto polimorfismo que suelen Microsatellite Polymorphic Loci) o amplificaciónpresentar por locus (multialelismo) se los con- selectiva de loci microsatélites polimórficos. Ensidera los marcadores ideales para el mejora- esta metodología se amplifican loci microsatéli-miento en especies autógamas como el trigo. tes a partir de un iniciador arbitrario empleandoEstos marcadores son codominantes (ambos dos técnicas: microsatélites y AFLP. Se reali-alelos de un individuo heterocigota pueden ser zan todas las etapas de AFLP, es decir, diges-visualizados), genoma-específicos y altamente tión con dos enzimas de restricción, ligación depolimórficos en comparación con los RFLPs y adaptadores, preamplificación y amplificaciónRAPDs. Su implementación en un laboratorio selectiva del ADN. Sólo que en la amplificaciónrequiere de mayor infraestructura y presupues- selectiva final, se emplea el iniciador de AFLPto que los RAPDs, siendo semejantes en este con sus tres nucleótidos selectivos en combi-aspecto a los AFLPs. nación con un iniciador SAMPLE. Este inicia- dor, posee en su secuencia bases complemen- 5.4.3.2 Otros marcadores basados en los tarias a un microsatélite. La banda polimórficamicrosatélites resultante de la amplificación del ADN con el Una de las limitaciones para la utilización de marcador SAMPLE puede ser convertida en unlos marcadores microsatélites es la necesidad marcador microsatélite convencional, a parirde conocer las regiones que flanquean a las del clonado y secuenciación de la misma.repeticiones para poder desarrollar los inicia-dores específicos. Así, se desarrollaron mar- 5.4.3.3. STS (Sequence-Tagged Sites) ocadores moleculares buscando explorar las sitios marcados por secuencias (Olson et al.repeticiones microsatélites sin necesidad de 1989)secuenciar el ADN. Entre esta clase de marca- STS es un término general dado a un locusdores podemos encontrar: en particular definido por las secuencias de sus MP-PCR (Microsatellite-Primed PCR): en el iniciadores específicos. Un STS puede ser ge-desarrollo de este marcador molecular, se uti- nerado para cualquier sitio del genoma siem-liza un iniciador que contiene las repeticiones pre y cuando ese sitio (locus) pueda ser clona-de un microsatélite específico para amplificar do y secuenciado. Un STS debe satisfacer dosel ADN. En las regiones del ADN que poseen condiciones: se debe conocer su secuencia,las dos secuencias inversamente orientadas que permite diseñar iniciadores específicosde este microsatélite específico hibridará el que permitirán su amplificación por PCR, y te-iniciador y amplificará el fragmento de ADN lo- ner una localización única en el cromosoma o78 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 80. genoma estudiado. Estos marcadores son su- Una segunda variante de los STS sonmamente usados en mapeo físico detallado de los marcadores CAPS (Cleavage Amplifiedgenomas grandes para ensamblar, por ejem- Polymorphic Sequence) o "secuencia poli-plo, clones de BAC entre sí. mórfica amplificada y clivada”, (Konieczny y Alternativamente, para una utilización más Ausubel 1993). En esta técnica, también cono-eficiente de marcadores moleculares en pro- cida como RFLP-PCR, un fragmento de ADNgramas de mejoramiento existe la posibilidad es amplificado por PCR, luego digerido conde convertir marcadores complejos y costosos enzimas de restricción y resuelto por electrofo-o inestables como RFLPs, AFLPs y RAPDs, en resis en agarosa o poliacrilamida. Este métodomarcadores PCR alelo-específicos, que son aprovecha la capacidad que posee la técnicaeconómicos, robustos y de sencilla implemen- de PCR de amplificar segmentos específicostación en cualquier laboratorio de biología mo- de ADN con la capacidad que poseen las en-lecular (los marcadores PCR alelo-específicos zimas de restricción de cortar el ADN en se-también serían STS en el sentido de que se tra- cuencias blanco de la enzima de restricción. Lata de una secuencia de ADN corta que identifi- base genética del polimorfismo detectado porca un locus específico del genoma y puede ser el marcador CAPS es la presencia/ausencia deamplificada por PCR). La estrategia consiste en sitios de restricción en la secuencia amplifica-aislar el fragmento de ADN polimórfico del gel, da por PCR. Este marcador permite identificarse clona, se secuencia y se diseñan iniciadores individuos heterocigotas, por lo que se compor-específicos de alrededor de 20 pb, para amplifi- ta como marcador codominante (Figura 6).car por PCR dicho fragmento. Cuando se parte Los marcadores STS y sus variantes SCARde un fragmento RAPD, el marcador derivado y CAPS, tienen la ventaja de requerir un ensa-mediante este proceso ha sido descripto como yo metodológico sencillo y altamente reprodu-SCAR (Sequence Characterized Amplified cible por los que son fácilmente transferibles aRegion, Paran y Michelmore 1993). otros laboratorios, permitiendo que sean muy El problema que enfrentan estas estrategias usados en selección asistida por marcadores.suele ser el bajo nivel de polimorfismo entre Asimismo, según las características de su dise-variedades de una misma especie (trigo, soja, ño, pueden ser codominantes y ser analizadosetc), lo que disminuye las posibilidades de en- en simultáneo varios loci STS en un mismo gel.contrar mutaciones útiles para desarrollar estos Actualmente, dada la disponibilidad de se-marcadores. De todos modos, existen antece- cuencias en base de datos es posible tambiéndentes exitosos de desarrollo de marcadores diseñar marcadores STS directamente a partirde PCR alelo-específicos en trigo para carac- de secuencias de interés (secuencias genómi-teres de interés agronómico como pueden ser cas, secuencias ESTs, etc) evitándose de estealelos de gluteninas, genes de resistencia a modo el trabajo previo de secuenciación delpatógenos, genes vinculados a adaptación, etc. STS. Figura 6. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 79
  • 81. 5.5 Marcadores Funcionales o de Los GTMs se basan en polimorfismos dentroExpresión de genes, independientemente de si se cono- cen o no sus funciones. Estos marcadores se En la actualidad, las tecnologías de marca- pueden desarrollar a partir de secuencias dis-dores moleculares en plantas superiores han ponibles en las bases de datos (cDNA/EST/se-sufrido un cambio. Así, la mayoría de los mar- cuencias genómicas que representan genes) ocadores descriptos anteriormente derivan del a partir de genotecas de ADN genómico enri-ADN genómico, y por lo tanto pueden perte- quecidas para secuencias de genes. Un ejem-necer a regiones transcriptas y no transcriptas plo de GTMs son los Análogos a Genes dedel genoma. Estos marcadores basados en Resistencia (Resistance Gene Analogs, RGAs)ADN derivado de cualquier región del geno- que son marcadores basados en secuenciasma, han sido descriptos como marcadores de derivadas de genes de resistencia a patóge-ADN al azar (RDMs: Random DNA Markers). nos. Las secuencias RGAs son útiles para laSin embargo, durante los últimos años se ha identificación de nuevos genes de resistencia aobservado una fuerte tendencia hacia el desa- patógenos en plantas.rrollo de marcadores moleculares derivados dela región transcripta del genoma (genes). Esto 5.5.3 Marcadores Funcionales propiamenteha sido posible gracias a la disponibilidad de dichos (FM: Functional Markers)un gran número de secuencias de clones de El desarrollo reciente de varios proyectos deADNc (ARNm transcripto a ADN empleando genómica estructural y funcional en especiestranscriptasa reversa, también conocidos como cultivadas, ha generado un enorme caudal deExpressed Sequence Tags o ESTs), en bases información a nivel de secuencias y esto ha po-de datos públicas (TIGR, NCBI; EBI, etc., ver sibilitado el desarrollo de un nuevo tipo de mar-Parte I, Capítulo 12, Análisis informático de se- cadores denominados marcadores funcionalescuencias moleculares). (FM). Estos marcadores derivan de motivos Los tipos de marcadores desarrollados a polimórficos (mutaciones) dentro de los genes,partir de la región expresada del genoma son y estos polimorfismos afectan directamente lanumerosos, complejos y variados. Sólo se des- expresión fenotípica del carácter asociado alcribirán en detalle aquellos marcadores más gen (Andersen y Lübberstedt 2003). Los FMrelevantes y que no fueron enunciados ante- reciben también el nombre de marcadoresriormente, recomendándose la lectura de la re- diagnósticos, marcadores de genes blanco ovisión de Gupta y Rustgi (2004) para informa- marcadores perfectos (perfect markers).ción adicional. El desarrollo de FM requiere de secuencias alélicas de genes caracterizados funcional- 5.5.1 Marcadores COS (Conserved mente, a partir de los cuales puedan identifi-Orthologue Set) carse motivos polimórficos funcionalmente res- Los marcadores COS representan genes ponsables de afectar el fenotipo de la planta.funcionales conservados en un amplio rango El primer paso en el desarrollo de FM es dis-de plantas dicotiledóneas. Inicialmente, estos poner de la secuencia de un gen con una fun-marcadores fueron desarrollados a partir de ción asignada. En Arabidopsis, menos del 10%la comparación de la secuencia genómica de de sus aproximadamente 25.000 genes hanArabidopsis con la base de datos de ESTs de sido caracterizados funcionalmente. En otrastomate. Se postula que estos marcadores po- especies, el número de secuencias caracteri-drán ser aplicados en el mapeo comparativo zadas funcionalmente es sustancialmente me-entre genomas emparentados y, por lo tanto, nor. Sin embargo, considerando la identidad deserán útiles para estudios taxonómicos y en la secuencias es posible asignar funciones putati-deducción de las relaciones filogenéticas. vas (probables) a un 30-50% de las secuencias expresadas (ESTs) en otras especies. Esta es- 5.5.2 Marcadores GTMs (Gene Targeted trategia de considerar genes candidatos y lasMarkers) relaciones sinténicas (similitud) entre genomas80 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 82. de plantas ha sido explotada exitosamente para de FM sobre caracteres de importancia agro-identificar genes agronómicamente importantes. nómica, por ejemplo, altura de planta en cerea- El segundo paso en el desarrollo de FM es la les; tiempo de floración en maíz, requerimien-búsqueda de secuencias polimórficas o alelos tos de vernalización en Brassica y trigo, tama-del gen en cuestión. Para ello se deben anali- ño de fruto en tomate, calidad de alimento enzar las secuencias del gen en más de un geno- arroz; resistencia a enfermedades y respuestatipo por especie. Las estrategias de desarrollo a stress en varias especies, etc. Sin embargo,de marcadores funcionales varían desde la de- aún en especies modelo, sólo el 10% de lostección de polimorfismos de un solo nucleótido genes han sido caracterizados funcionalmente(SNPs), el descubrimiento en regiones génicas mientras que para especies no modelo, estede secuencias tipo microsatelites (SSRs), la número es probablemente menor al 5%.identificación de sitios de restricción que dife- Los FM derivan de estudios de asociaciónrencien alelos (CAPs), la detección de inser- realizados en grandes colecciones de genoti-ciones y/o deleciones (InDels), las variaciones pos o de la comparación de líneas isogénicas,a nivel de secuencias que se pueden revelar las cuales tienen un costo alto para su desarro-empleando la metodología de conformación de llo, limitando el estudio inicial a uno o unos po-ADN simple cadena en electroforesis parcial- cos fondos genéticos. Luego estos FM debenmente desnaturalizantes (SSCP), etc. ser evaluados en otros fondos genéticos, con Posteriormente, se debe probar la existen- lo cual, para todo esto es necesario desarro-cia de variación fenotípica asociada al alelo en llar un marco experimental, estadístico y bio-cuestión. Esto puede realizarse indirectamente, informático para la acumulación de datos y laspor estudios de asociación en poblaciones se- evaluaciones a lo largo de diferentes estudios.gregantes, o directamente, mediante la compa- Teniendo en cuenta estos factores y el la-ración de genotipos isogénicos generados por borioso desarrollo de los FM, la generación demutagénesis específica en la secuencia del gen FM debería concentrarse en genes que confie-mediante TILLING, Targeting-Induced Local ran una variación fenotípica sustancial. Así, laLesions In Genomes (McCallum et al., 2003), selección de “genes claves” para caracteres deetc. interés agronómico será crucial y el paso limi- En varias aplicaciones, la gran ventaja que tante para el desarrollo de FM útiles.presentan los FM es su ligamiento completocon motivos (mutaciones) funcionales. En con- 5.5.4 Arreglos de ADN para estudios de ex-traste con los marcadores tradicionales (distri- presión de genesbuidos al azar en el genoma), los FM permiten: Los arreglos de ADN (arrays) permiten, en-i) la aplicación confiable de marcadores en po- tre otras cosas, analizar sistemáticamente elblaciones sin necesidad de mapeo previo; ii) el patrón de expresión génica de un organismouso de marcadores en poblaciones segregantes en escala genómica. De este modo, es posiblesin el riesgo de perder información debido a la examinar la expresión simultánea de cientos arecombinación; iii) una mejor representación de miles de genes en varios estadios del desarro-la variación genética en poblaciones naturales o llo, en respuesta a diferentes condiciones am-de mejoramiento. bientales y en tejidos específicos. En general, los FM son útiles para: i) la fija- Los arreglos de ADN son soportes sólidos,ción más eficiente de alelos en cualquier pobla- comúnmente vidrio o nylon, en los cuales es-ción segregante; ii) el análisis de alelos tanto en tán fijadas de forma ordenada gran cantidad depoblaciones naturales como de mejoramiento; secuencias de ADN de interés (marcadores) .iii) la combinación de alelos de FM que afectan Estas secuencias pueden ser genes comple-idénticos o diferentes caracteres en mejora- tos o parciales. El empleo de estos arreglosmiento de plantas; iv) la construcción de haplo- como herramienta para el estudio de expresióntipos de FM ligados. de genes a escala genómica sigue típicamen- En la actualidad se encuentran disponibles te los siguientes pasos: i) la construcción delvarios genes con potencial para el desarrollo arreglo de ADN; ii) la preparación de sondas Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 81
  • 83. (a partir de ARNm de las distintas situaciones de accesiones de germoplasma, desarrollo dea comparar); iii) la hibridización del arreglo; iv) plantas tolerantes a diferentes tipos de estrés,la detección de la señal y análisis de los datos etc. Asimismo, la identificación de genes ex-por herramientas computacionales apropiadas. presados diferencialmente, en especial aque- Existen diferentes sistemas de arreglos se llos cuya expresión no es abundante o estánADN, dependiendo de la fuente de ADN de involucrados en cascadas de transducción deinterés, naturaleza del soporte sólido y el sis- señales, ampliará enormemente los horizontestema de detección de la hibridización. El sis- una vez que esos genes puedan ser emplea-tema más simple es el que requiere menos dos como marcadores para selección asistidainversión, comúnmente se lo llama macroarre- (Galbraith, 2006).glo (macroarray) y emplea una membranade nylon como soporte en combinación con 5.6 Marcadores SNPs (Single Nucleotidesondas radiactivas. El sistema más sofistica- Polymorphisms)do utiliza láminas de vidrio y sondas fluores-centes y se lo llama microarreglo (microarray). Si bien, son una clase particular de marca-Asimismo, en los macroarreglos se depositan dores moleculares que podrían ser incluidos dentro del punto 5.4, se los decidió tratar apar-centenas de secuencias de ADN mientras que te dado que los SNPs pueden derivar tanto deen los microarreglos la densidad de secuencias secuencias genómicas codificantes (que se ex-es al menos un orden de magnitud mayor. Es presan) como no codificantes.importante destacar la existencia de distintos Recientemente, de la mano de los proyectostérminos empleados para describir estos arre- de secuenciación de genomas enteros de plan-glos, de modo que glass array, chips de ADN y tas, una nueva clase de marcadores molecu-biochips son denominaciones usadas para los lares denominados SNPs (polimorfismo de unmicroarreglos sobre placas de vidrio, en cuanto nucleótido), está siendo utilizada en distintosque nylon array y high density membranes son estudios genéticos. Estos marcadores se ba-para los macroarreglos sobre nylon. san en la detección de polimorfismos resultan- En el área vegetal, la utilización de arreglos tes de la alteración de una única base en unade ADN para el análisis de la expresión génica secuencia de ADN. En la figura 7 se muestranaumentó significativamente de la mano de los secuencias de ADN ejemplificando algunas va-proyectos de secuenciación completa del ge- riaciones de punto, las cuales se definen comonoma de Arabidopsis thaliana y Oryza sativa SNPs. Algunos autores consideran SNPs sólo(arroz) (para mas detalles ver Rensink y Buell, cuando ocurre una sustitución de base, otros2005). consideran también la inserción/deleción de Además de la contribución para el entendi- una base (InDel).miento de la expresión génica a gran escala, Los SNPs pasaron a tener mayor importan-se vislumbra la posibilidad de emplear la técni- cia a partir de la secuenciación del genomaca de arreglos de ADN en mejoramiento asis- humano, al descubrirse que el 90% de polimor-tido por marcadores, fingerprinting, selección fismo encontrado en el genoma eran SNPs. Figura 7.82 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 84. Recientemente en el área vegetal, la secuen- fragmentos genómicos equivalentes de regio-ciación a gran escala de genomas completos y nes génicas específicas del ADN de varios in-de secuencias expresadas (ESTs), ha permitido dividuos y comparar sus secuencias buscandoevidenciar la presencia de SNPs en especies SNPs. La adopción de esa estrategia involucracomo Arabidopsis thaliana, melón, soja, girasol, el diseño de iniciadores para amplificar seg-arroz, maíz, cebada, trigo, y caña de azúcar en- mentos de ADN de entre 400 a 700 pb, deri-tre otras. vados frecuentemente de genes de interés o Los marcadores genéticos SNP poseen na- provenientes de ESTs. Para la amplificaciónturaleza bialélica y son muy abundantes en el se emplean ADNs de varios individuos, prefe-genoma, siendo la frecuencia de SNPs de 1 rencialmente representativos de la diversidadcada 100-300 pb para los genomas de plantas. de la población de interés. Estos productosLos SNPs pueden localizarse en regiones codi- de amplificación resultantes se secuencianficantes, regulatorias y no codificantes. Cuando directamente y las secuencias resultantes seestán presentes en regiones codificantes, alinean, empleando programas bioinformáticosmuestran 100% de asociación con el carácter apropiados para la identificación de polimorfis-de interés, por lo que son muy útiles en MAS mos (SNPs).(marker assisted selection o selección asistida Actualmente, la secuenciación a gran esca-por marcadores) y en el aislamiento de genes. la del genoma de varios organismos permite la Debido a su frecuencia de distribución, los identificación de SNPs mediante la compara-SNPs surgen como importantes marcadores ción de millares de secuencias depositadas enpara la obtención de mapas genéticos de alta las bases de datos, incluyendo clones genómi-resolución. Estudios llevados a cabo utilizando cos y, principalmente, secuencias de ADNc y/oArabidopsis como organismo modelo, han de- ESTs.mostrado que estos marcadores posibilitan la Independientemente del método utilizadoobtención de mapas de una resolución cerca de para identificar los SNPs es indiscutible la con-100 veces superior a la obtenida con los marca- tribución de la bioinformática en dicho proceso.dores convencionales. Por otra parte, la necesidad de la validación Los SNPs son estables desde el punto de experimental de los datos es indispensable.vista evolutivo, lo que facilita su empleo en es- Actualmente, están disponibles distintos mé-tudios de poblaciones. Otra característica im- todos de validación y genotipado (detección),portante es que la genotipificación de los SNPs uno de ellos son los chips de ADN o microarre-no está basada en la medida del tamaño de los glos de ADN. Como se dijo anteriormente, es-alelos como ocurre con los otros marcadores tos chips consisten en arreglos de oligonucleó-moleculares, y la distinción de los alelos puede tidos de secuencia conocida depositados sobreser automatizada. Por lo tanto, los SNPs, por un soporte sólido. Para el caso de la deteccióntener una tasa de mutación relativamente baja, de SNPs, los oligonucleótidos difieren entre síser mucho más frecuentes en el genoma y ser en sitios específicos en nucleótidos individua-detectables en forma automatizada, surgen les (en el sitio del SNP). La técnica es apro-como importantes marcadores genotípicos. piada para analizar varios SNPs en paralelo En tiempos recientes se han desarrollado a partir de cada muestra (en forma multiplex).varias metodologías para detectar SNPs que En una columna del arreglo cuatro oligonucleó-utilizan diferentes estrategias para comparar tidos diferirán solamente en el sitio del SNPregiones específicas del ADN obtenidas de va- (tendrá cada uno, una de las cuatro bases enrios individuos. La elección de uno de los mé- la posición del SNP). Cuando este arreglo estodos dependerá de muchos factores: costos, hibridado con productos de PCR o fragmentospotencial para el procesamiento de los datos de ADN genómico obtenidos por nebulizacióngenerados, los equipamientos necesarios y la (romper el ADN en fragmentos de un tamañodificultad de los ensayos. determinado y al azar), estos se unirán solo Inicialmente, los abordajes para la detección a los oligonucleótidos perfectamente comple-de SNPs consistían en amplificar y secuenciar mentarios y los productos no perfectamente Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 83
  • 85. complementarios (con mismatch) serán lava- hipótesis. Se considera que muchos de estosdos. La unión perfecta de cada caso podrá ser SNPs están localizados en el interior de se-tomada por un sistema de detección. Así, en cuencias génicas, esto puede significar unaun único microarreglo (chip) es posible analizar importante reducción en el tiempo y costosmiles de SNPs, correspondientes a distintos para el descubrimiento de genes de interés,loci en simultáneo. comparado con los marcadores actualmente Otros métodos de análisis de SNPs incluyen: disponibles. Asimismo, el desarrollo constantecromatografía liquida de alta resolución desna- de tecnologías para su aplicación permitirá au-turalizante (DHPLC), espectrometría de masa, tomatizar el mapeo de alta densidad y, conse-ensayos con extensión de iniciadores, PCR cuentemente, reducir los costos de su empleoen tiempo real, minisecuenciación, secuen- en estudios moleculares a gran escala.ciación de una única base, digestión por enzi-mas de restricción (RFLP), CAPS, entre otros. 5.7 Lecturas recomendadasPuede encontrarse una revisión detallada deestos métodos en Kwok (2001), Tsuchihashi y Andersen J.P & Lübberstedt T. 2003. FunctionalDracopoli (2002). markers in plants. Trends Pl. Sc. 8: 554-560. Botstein D., White R.L., Skolnick M. & Davis R. W. En cuanto a las aplicaciones y perspectivas Construction of a genetic linkage map in mande los marcadores SNPs cabe destacar que using restriction fragment length polymorphisms.han sido fundamentales para el análisis de Am. J. Hum. Genet. 32: 314-331. 1980.genes y el descubrimiento de la base genéti- Branlard G., Dardevet M., Saccomano R., Lagout-ca molecular de importantes características te F. & Gourdon J. 2001. Genetic diversity ofagronómico-industriales. Como por ejemplo en wheat storage proteins and bread wheat quality.arroz, el descubrimiento de SNPs involucrados Euphytica 119: 59-67.en la calidad de cocción, procesamiento y aro- Caetano-Anollés, G., Bassam, B.J. & Gresshoff,ma del grano (Larkin y Park, 2003). P.M. 1991. DNA amplification fingerprinting using La comparación directa de SNPs también very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/ Technology 9: 553-557. Se puede borrarha sido empleada en estudios de genética de Galbraith D.W. 2006. DNA Microarray Analysis inpoblaciones y filogenia, identificación de va- Higher Plants. OMICS: A Journal of Integrativeriedades, construcción de mapas genéticos y Biology. 10(4): 455-473.físicos, análisis funcionales, análisis de asocia- Gupta P.K. & Rustgi S. 2004. Molecular markersción en mejoramiento genético vegetal etc. from the transcribed/expressed region of the ge- El uso de métodos masivos de análisis, nome in higher plants. Funct Integr Genomicscomo los arreglos de alta densidad de oligonu- 4:139-162.cleótidos, se están empleando en la actualidad Konieczny A., & F. Ausubel. 1993. A procedure forpara identificar Single Feature Polymorphisms mapping Arabidopsis mutations using co-domi- nant ecotype-specific PCR based markers. Plant(SFPs, Polimorfismos de Característica Única) J. 4:403–410.como una alternativa atractiva para detectar Kwok P-Y. 2001. Methods for genotyping Single Nu-SNPs y otro tipo de mutaciones entre genoti- cleotide Polymorphisms. Annu. Rev. Genomicspos. Los SFPs son detectados sobre arreglos Hum. Genet. 2: 235-258.de alta densidad de oligonucleótidos (chips) Larkin P.D. & Park W.D. 2003. Association of waxyy representan polimorfismos de secuencia de gene single nucleotide polymorphsim with starchADN entre dos genotipos dentro de un oligonu- characteristics in rice (Oryza sativa L.). Molcleótido individual, el cual se detecta por dife- Breed 12:335-339.rencia en la afinidad de hibridación. El término Litt M. & Luty J.A. 1989. A hypervariable microsate- llite revealed by in vitro amplification of a dinu-“característica (feature)” refiere a la señal de cleotide repeat within the cardiac muscle actinhibridación dada por una sonda (oligonucleóti- gene. Am. J. Hum. Genet. 44:398-401. 1989.do) en el arreglo (Zhu y Salmeron, 2007). McCallum C.M., Comai L., Greene E.A. & Henikoffet El descubrimiento de los SNPs, asociado a S. 2003. Targeting induced local lesions in ge-la posibilidad de utilizarlos como marcadores, nomes (TILLING) for plant functional genomics.permite a los investigadores explorar nuevas Plant Physiol. 123:439-442.84 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 86. Olson M., Hood L., Cantor C. & Dotstein D. 1989. A common language for physical mapping of the human genome. Science 245:1434-1435.Paran I. & Michelmore R.W. 1993. Development of reliable PCR based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Genet. 85:985-993.Rensink W.A. & Buell C.R. 2005. Microarray ex- pression profiling resources for plant genomics. Trends Pl. Sc. 10(12): 603-609.Steinmetz L.M. 2000. Combining genome sequen- ces and new technologies for dissecting the ge- netics of complex genotypes. Trends Pl. Sc. 5(9): 397-401.Tsuchihashi Z. & Dracopoli N.C. 2002. Progress in high throughput SNP genotyping methods. Phar- macogenomics 2: 103-110.Vos P., Hogers M., Bleeker M., Rijans M., Van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M. & Zabeau M. 1995. AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23:4407-4414.Welsh J. & McClelland M. 1990. Fingerprinting ge- nomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18:7213-7218.Williams J.G., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski L.A. & Tingey S.D. 1990. DNA polymorphism ampli- fied by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18:6531-6535.Zhu T. & Salmeron J. 2007. High-definition genome profiling for genetic marker discovery. Trends Pl. Sc. 12(5): 196-202. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 85
  • 87. I CAPITULO 6 llo de mapas genéticos altamente saturados permite el clonado posicional de genes.Construcción de mapas de 2. Introducción a la construcción de ma-ligamiento genético, localización pas genéticos en vegetalesde genes y regiones Para comprender mejor las bases teóricascromosómicas asociadas a y metodológicas empleadas en el mapeo ge-caracteres de interés en plantas nético es necesario recordar algunos concep- tos básicos de genética Mendeliana. GregorGerardo D L Cervigni, Mendel realizó sus experimentos en Pisum sativum (arveja cultivada) efectuando cruza-Juan Pablo A Ortiz, Sergio E Feingold mientos controlados entre individuos que se 1. Introducción diferenciaban en determinadas características La posibilidad de construir mapas de liga- (como por ejemplo el color de la flor, tipo demiento genético en especies vegetales o ani- tegumento de las semillas y largo de los tallos),males es una de las contribuciones de mayor y estudió la forma en que estos caracteres seimpacto de las técnicas de marcadores mole- transmitían a la descendencia. A partir de datosculares en las ciencias biológicas. Los marca- experimentales formuló una hipótesis simpledores moleculares utilizados pueden corres- para explicarlos y posteriormente diseñó expe-ponder a regiones intergénicas no codificantes rimentos para contrastarla. Sus trabajos permi-o a segmentos génicos, en cuyo caso son de- tieron inferir la existencia de “factores” heredi-nominados funcionales y constituyen marca- tarios y sus mecanismos de transmisión antesdores “ideales” a los efectos de selección de de conocer la existencia del ADN como mate-genotipos. Un mapa genético establece de ma- rial de transmisión genético. En base a sus da-nera probabilística el arreglo lineal de un grupo tos experimentales Mendel formuló su prime-marcadores (o genes) sobre el genoma de una ra ley, o ley de la segregación. Ella estableceespecie. Si bien el concepto data de principios que los miembros de un par génico (alelos) sede siglo XX, a partir de los trabajos de Morgan segregan (se separan) uno de otro durante lay Bridges con mutantes de Drosophila, recién formación de las gametas. Como consecuen-a partir del advenimiento de los marcadores cia, la mitad de las mismas portan un alelo ymoleculares fue técnicamente posible construir la otra mitad el otro. La progenie es luego for-mapas genéticos saturados en la mayoría de mada por la combinación al azar de las game-las especies vegetales de interés agronómico. tas de ambos progenitores. La segunda ley deUsando este tipo de mapas es posible iden- Mendel, o ley de la segregación independiente,tificar la posición y el efecto de genes sobre indica que la segregación de los alelos de uncaracteres de importancia mediante asocia- gen es independiente de la segregación de losciones estadísticas entre los valores fenotípi- alelos de otro gen. Estas dos leyes fueron loscos y las variantes alélicas de los marcadores. puntos de partida sobre los cuales se elaboróLa disponibilidad de mapas genéticos permite toda la teoría de herencia que hoy conocemos.también la selección indirecta de genotipos de- Incluso aún en el presente, los análisis de lasseables, comúnmente denominada MAS (del frecuencias en que aparecen los caracteresinglés Marker Assisted Selection), mediante el en las progenies de cruzamientos controladosseguimiento de marcadores localizados en re- son una parte fundamental de los análisis ge-giones genómicas determinadas. La utilización néticos. Los caracteres genéticos pueden estarde marcadores comunes permite comparar la controlados por uno o pocos genes, o poseerestructura del genoma de diferentes especies un control complejo que involucra muchos ge-(comparative mapping) e identificar rearreglos nes, denominados loci de caracteres cuantitati-cromosómicos a pequeña y gran escala (micro vos o QTLs (del inglés Quantitative Traits Loci),y macro sintenia) para estudios de filogenia y a menudo afectados por el ambiente. La dis-evolución molecular. Por otro lado, el desarro- ponibilidad de un gran número de marcadores86 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 88. (loci) polimórficos, no afectados por el medio mitan la construcción del mapa genético. Enambiente, neutros, sin efectos deletéreos y ausencia de polimorfismos genéticos los aná-cuya herencia pude determinarse con relativa lisis de segregación y ligamiento son imprac-facilidad, simplificó enormemente los análisis ticables. En general los cruzamientos entregenéticos en especies vegetales y animales. especies alógamas presentan mayor grado deLa construcción de un mapa de ligamiento ge- polimorfismo que entre autógamas. La falta denético es esencialmente una representación polimorfismos es común en poblaciones deri-gráfica lineal del orden más probable de mar- vadas de cruzamientos entre progenitores decadores moleculares o genes a partir de los va- base genética estrecha, como los realizadoslores de recombinación observados entre ellos. entre distintos cultivares de la misma especieCada arreglo lineal es denominado “grupo de o entre individuos de especies silvestres deri-ligamiento”. En teoría un mapa saturado debe vados de la misma población natural. En teoríacontener el mismo número de grupos de liga- es posible desarrollar varios tipos de poblacio-miento que número básico de cromosomas. nes segregantes y la decisión de cual utilizar En este Capítulo se desarrollarán los con- depende de la resolución que se desee alcan-ceptos básicos del mapeo genético en vegeta- zar con el mapa y la posibilidad y/o facilidadles y algunas de sus aplicaciones. De ninguna de desarrollarla. En la Figura 1 se muestra unmanera se pretende abordar el tema en toda esquema del desarrollo de 5 poblaciones bási-su extensión debido a que la misma supera cas de mapeo. Las poblaciones de tipo retro-largamente los objetivos de este libro. Aquellos cruza (backcross o BC1) y F2 son generalmentelectores que deseen ampliar y profundizar los adecuadas y fáciles de generar en la mayoríatemas que aquí se desarrollan pueden consul- de las especies cultivadas como: trigo, maíztar los textos que se citan en la lista de referen- y soja. Las poblaciones F2 proveen mayor in-cias bibliográficas al final del Capítulo. formación genética que las retrocruzas para el Los pasos fundamentales a seguir en la mismo número de individuos debido a que pue-construcción de un mapa genético de una de- den evaluarse dos cromosomas recombinan-terminada especie o el mapeo específico de un tes por planta. En especies autoincompatiblesgen (locus) de interés pueden resumirse en: 1) y altamente heterocigotas las poblaciones F1selección de progenitores y desarrollo de una también son segregantes y pueden emplear-población segregante (población de mapeo), 2) se para mapeo. Estos 3 tipos de familias songeneración de un número suficiente de marca- efímeras, es decir, que cada individuo segre-dores y registro de los mismos en cada uno delos individuos de la población (genotipado), 3)determinación de las frecuencias de recombi-nación entre marcadores y determinación degrupos de ligamiento y 4) determinación del or-den de los marcadores y conversión de la fre-cuencia de recombinación (r) en unidades demapeo o centiMorgan (cM). 2.1. Poblaciones de mapeo El primer paso en todo proyecto de mapeoes el desarrollo de una población segregan-te para una o más características de interés.La selección de los progenitores es un puntoimportante debido a que no sólo deben sercontrastante para la característica en estudio,sino que además deben presentar diferenciasa nivel de secuencias del ADN y así obtenersuficientes marcadores polimórficos que per- Figura 1. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 87
  • 89. gará las combinaciones génicas que porta en de la F1. La desventaja de este método es quela siguiente generación. Si no es posible man- es necesario disponer de un protocolo eficientetenerlas clonalmente como por ejemplo a partir para la regeneración de plantas in vitro a partirde órganos vegetativos o por cultivo in vitro, la del cultivo de anteras y la posterior duplicacióninformación obtenida en ellas debe ser transfe- cromosómica.rida a una nueva población utilizando algunos Una vez establecido el tipo de población ade los marcadores que fueron previamente lo- utilizar, el número de individuos es también uncalizados (mapeados) de manera de conservar punto importante debido a que la resolución delpuntos de referencia entre ambas. mapa y el ordenamiento de los marcadores en En el caso de requerirse múltiples ensa- los grupos de ligamiento dependen de éste. Enyos, (repeticiones intra experimento, ensayos general, poblaciones de 60 a 100 individuosen distintas localidades o en varios años), son adecuadas para trabajos de tipo acadé-es necesario desarrollar poblaciones de ma- mico, como la localización de un determinadopeo inmortales como las Líneas Endocriadas locus en el genoma o el mapeo de un carác-Recombinantes (RILs por Recombinant Inbred ter cualitativo. Sin embargo, para proyectos deLines) o poblaciones de Haploides Duplicados mapeo de QTLs o la construcción de mapas de(DHs). Ambas poblaciones se componen de un alta resolución son necesarias poblaciones deconjunto de líneas homocigotas que pueden 500 a 1000 individuos.ser replicadas por semillas varias veces y porvarios ciclos de cultivo. Estas características 2.2. Registro de marcadores moleculareslas hacen especialmente adecuadas para ma- y clasificación de la poblaciónpear QTLs. Las RILs son generadas a partir de Los marcadores moleculares útiles para ma-una población F2 por descendencia de semilla peo deben existir en 2 o más formas alélicasúnica de un número determinado de individuos distinguibles, de manera que los genotipos dedurante cinco o más generaciones. Finalmente, cada individuo puedan ser claramente identifi-cada línea representará los diferentes bloques cados. Los mismo pueden ser de tipo dominan-de ligamiento presentes en un individuo F2 de te (presencia o ausencia de una banda comola población original, pero en estado homoci- en RAPD y AFLP) por lo cual no es posiblegota. Una vez estabilizadas, las RILs pueden distinguir entre el genotipo homocigota (AA)ser mantenidas y multiplicadas por semillas del heterocigota (Aa) o co-dominantes (todosaño tras año. Una de las desventajas de este los alelos pueden identificarse, por ej., usan-método es que algunas regiones del geno- do SSR y RFLP), donde los 3 genotipos de unma pueden seguir en el estado heterocigota mismo locus dialélico pueden ser discriminadosa pesar de las múltiples autofecundaciones. (AA, Aa y aa). Como criterio general una vezPor otro lado, no es posible desarrollarlas en que se dispone de entre 100-200 marcadoresespecies autoincompatibles. Las poblaciones en una determinada población es posible identi-DH se generan a partir del cultivo de tejidos de ficar grupos de ligamiento, regiones genómicasanteras de individuos F1. En algunas especies específicas y mapear genes o QTLs. Asimismo,es posible regenerar plantas enteras a partir prácticamente cualquier nuevo marcador quede microgametofitos haploides (grano de polen se agregue pude integrarse a los preexistentes.en el estado uninucleado). Si la planta dado- El genotipo de cada individuo de la población,ra es una F1, sus granos de polen portarán las para cada uno de los marcadores debe ser de-gametas derivadas de la meiosis con diferen- terminado (genotipado). En general se tomantes combinaciones alélicas. Posteriormente, como marcadores informativos aquellos quepor tratamientos de duplicación cromosómica muestran relaciones de segregación, por pre-con colchicina, las plantas haploides obtenidas sencia/ausencia, que se ajusten a las frecuen-pueden diploidizarse llevando todos los loci al cias esperadas considerando el tipo de pobla-estado homocigota. Como resultado se obtiene ción y marcador molecular utilizado (por ej.: 1una serie de líneas que representan las com- Aa: 1 aa en una retrocruza o 3 A_: 1aa en unabinaciones génicas presentes en las gametas F2), por medio de la prueba del ji-cuadrado (Χ2).88 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 90. 2.3. Estimación de las frecuencias de para que el número de plantas recombinantesrecombinación y detección de grupos de sea igual al de no recombinantes, se dice queligamiento los mismos segregan independientemente. Por otro lado, si el número de plantas recombinan- 2.3.1. Concepto de ligamiento tes es menor al esperado (50%) se considera Dos loci que se encuentran muy cercanos que ambos loci están ligados genéticamente.en el mismo cromosoma no segregan indepen- De esta manera, determinando la frecuenciadientemente durante la meiosis. Esta relación de aparición de individuos con combinacionesse denomina ligamiento genético y explica la alélicas recombinantes es posible realizar unaaparición de una proporción mayor de indivi- medida relativa de la distancia entre ellos. 2.3.2duos portando combinaciones alélicas paren-tales que lo esperado según la Segunda Ley Detección del ligamientode Mendel. Los genes ligados pueden ser se- El primer paso en el estudio del ligamientoparados por un intercambio físico de partes de entre 2 loci (por ej., A y B) consiste en deter-cromosomas (cromátidas hermanas) durante minar si los mismos segregan individualmen-la meiosis por el proceso de entrecruzamiento te de acuerdo al modelo esperado (1:1, 3:1,o “crossing-over” (CO), el cual genera game- 1:2:1, etc.), y posteriormente, si lo hacen entas recombinantes, distintas de las parentales forma independientemente o no. En ambos(Figura 2). casos la prueba estadística adecuada es el Χ2 Figura 2. Existe una relación entre la distancia física considerando un nivel de significancia prede-a la que se encuentran 2 loci y la probabilidad terminado (p ≥ 0,05 o 0,01), aunque tambiénde que se produzca un CO entre ellos. Cuanto es posible utilizar el LOD score (ver punto 2.4).más alejados estén uno del otro mayor será Si la probabilidad asociada al Χ2 obtenido parala probabilidad de que ocurra un entrecruza- cada locus en forma individual es superior a lamiento y se generen gametas recombinantes. predeterminada, se considera que ambos mar-Consecuentemente, si dos loci están lo sufi- cadores segregan de acuerdo a lo esperado.cientemente separados en el cromosoma como En el segundo paso, el número de progenies Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 89
  • 91. observadas en cada clase genotípica se con- 1 producto de cada 100 meiosis es del tipo re-trasta con los valores esperados para una se- combinante. Un ejemplo de los pasos a seguirgregación independiente (Tabla 1). en la estimación del ligamiento entre dos ge- nes se muestra en la Figura 3.Tabla 1: Segregaciones esperadas para 2 loci inde-pendientes en distintas poblaciones de mapeo. (i) F1 P2 Tipo de Marcador Marcador A B a b x población dominante co-dominante a b a b BC 1 1:1:1:1 1:1:1:1 (ii) Datos derivados del cruzamiento prueba Gametas Fenotipos Genotipos No. F2 9:3:3:1 1:2:1:2:4:2:1:2:1 AB AB AaBb 60 Parentales ab ab aabb 59 RILs 1:1:1:1 1:1:1:1 Gametas F1 Ab Ab Aabb 4 Recombinantes DH 1:1:1:1 1:1:1:1 aB aB aaBb 3 Total 126BC­ : población de retrocruzamiento; F2: población tipo F2 1 (iii) Prueba de segregaci n de factores simples A/a y B/b óderivada del cruzamiento entre 2 progenitores heteroci-gotas; RIL: población de líneas endocriadas recombinan- Número de individuos con fenotipo A = 60 + 4 = 64tes (RILs por Recombinant Inbred Lines) y DH: población Número de individuos con fenotipo a = 59 + 3 = 62de haploides duplicados. X2 1 g.l .= 0.03 n.s Número de individuos con fenotipo B = 60 + 3 = 63 Número de individuos con fenotipo b = 59 + 4 = 63 X2 1 g.l = 0.00 La hipótesis nula (Ho) es que ambos loci se-gregan independientemente y la hipótesis al- (iv) Prueba de segregaci n independiente de locus A y B óternativa (HA) es que ambos loci están ligados. Fenotipos Frecuencia No. No.Si los desvíos obtenidos entre los valores ob- (genotipos) AB (AaBb) esperada ¼xn esperado 31,5 observado 60servados y esperados tienen una probabilidad Ab (Aabb) ¼xn 31, 5 4de ocurrencia menores que 1/20 o 1/100 (p < aB (aaBb) ¼xn 31, 5 30,05-0,01), se considera que los loci A y B no ab (aabb) ¼xn 31, 5 59segregan independientemente y por lo tanto se Total 126acepta HA que indica la existencia de ligamien- X =å2( E - O )2 E = 99, 56*to entre ellos (ver ejemplo Figura 3). *(P < 0.001) (v) Cálculo del porcentaje derecobminación (% r) 2.3.3. Estimación de la frecuencia de número de gametas recombinantes (4 + 3)recombinación %r= número total de gametas = 126 = 0,0555 o 5,55 % Una vez verificada la existencia de ligamien-to entre 2 loci es posible estimar la frecuencia Figura 3.de recombinación (r) entre ellos. En el casomás simple de una retrocruza, todas las clasesfenotípicas (o genotípicas) pueden ser identi-ficadas (Figura 3). El valor de r expresado en En este caso la frecuencia de recombinaciónporcentaje se calcula: entre A y B es de 5,55 %. Como la frecuen- cia de recombinación es una proporción, su variancia (derivada de la distribución binomial) número de gametas recombinantes está dada por la expresión: R (1-R)/N, donder(%)= x100 R es la frecuencia de recombinación y N es el número total de gametas número total de los individuos de la población. Una estimación de r = 0,01 (1 %) es definida Por lo tanto, un valor de r = 5,55 % (como elcomo una unidad de mapeo (u.m), y corres- de nuestro ejemplo), posee el siguiente errorponde a la distancia entre dos loci en la cual estándar:90 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 92. B nunca hubiéramos detectado estos dobles [0,055x(1-0,055)/126]=0,020 . entrecruzamientos. Extendiendo este razona- miento, en realidad tampoco sabemos si entre A-B hubo entrecruzamientos dobles y, por lo De esta manera es posible establecer el gra- tanto, haber subestimado la proporción de re-do de ligamiento entre 2 loci. Sin embargo, en combinantes entre ellos. Cuanto más grande esalgunos tipos de poblaciones como las F2, no la distancia entre 2 marcadores, más inexactatodas las clases genotípicas pueden ser iden- será la medida de la distancia. Asimismo, otrotificadas fácilmente, especialmente cuando se hecho que debe considerarse es el fenómenotrabaja con marcadores co-dominantes. Esto de interferencia (I). La interferencia se relacio-es debido a que no es posible diferenciar si los na con la imposibilidad física de que adyacentedobles heterocigotas derivan de 1 o 2 game- a un punto de entrecruzamiento se produzcatas recombinantes. Para estos casos se han otro en la misma meiosis debido a un impedi-desarrollado procedimientos alternativos para mento físico entre ellos (se "interfieren"). Estasestimar las distancias genéticas. El método características hacen que las frecuencias dede máxima probabilidad (maximum likelihood recombinación no sean magnitudes aditivasmethod) es el más utilizado. Debido a que se para grandes segmentos cromosómicos. Paratrata de un método estadístico de estimación solucionar esto, los valores de r se conviertende probabilidades las fórmulas empleadas en unidades de mapeo (centMorgan – cM) me-en los cálculos son generalmente complejas. diante la aplicación de las funciones de mapeo.Allard (1956) desarrolló el método de los sco- Las ecuaciones para convertir r en cM derivanres para derivar las fórmulas, estimar las dis- de funciones de distribución y son fundamen-tancias genéticas y calcular las desviaciones talmente dos, la función de Haldane (1919) y laestándares para varios tipos de poblaciones. de Kosambi (1944). La diferencia básica entreAfortunadamente en el presente se dispone de ellas es el supuesto que asumen con respec-programas de computación que utilizan estas to a la interferencia en la ocurrencia de doblesfórmulas y permiten trabajar con grandes ar- CO. La función de Haldane considera interfe-chivos de datos derivados de poblaciones de rencia nula (I=0) mientras que la función deun gran número de individuos. Entre los más Kosambi estima el valor de I. Estos valores ge-populares se encuentran el Mapmaker (Lander neralmente se encuentran entre 0 y 1 (interfe-1987) y el JoinMap (Stam et al. 1993). rencia completa). El valor real de interferencia se ubicará entonces en algún lugar en medio 2.3.4. Ordenamiento de los marca- de ambos valores. Los valores de cM estima-dores y conversión de frecuencias a dos con ambas funciones son equivalentesunidades de mapeo cuando se consideran valores de r de hasta 10 Cuando se estudia el ligamiento simultáneo %, para valores mayores la transformación deentre 3 o más marcadores (por ej. A, B y C), Kosambi es más exacta.se puede establecer un orden en base a lasdistancias relativas entre ellos (mapeo de 3puntos). Suponiendo que el orden sea ABC, la 2.4. Programas de mapeo La utilización de programas de mapeodistancia estimada en la prueba de 2 puntos como el Mapmaker 3.0 (Lander et al. 1987;entre A y C será aproximadamente igual a lasuma de la distancia entre A-B + B-C. Sin em- http://www.nslij-genetics.org/soft/mapmaker)bargo, frecuentemente la distancia entre A y C o JoinMap 1.4 - 4.0 (Stamp 1993; http://www.(medida como prueba de dos puntos) suele ser kyazma.nl), permiten el análisis simultáneo demenor a la de A-B + B-C. Esto se debe a la muchos marcadores en poblaciones de granpresencia de entrecruzamientos dobles entre número de individuos, mediante la utilizaciónA y C cuyo resultado final es la formación de de métodos de estimación de parámetrosgametos parentales AC y ac que se computan como el de máxima probabilidad o mínimoscomo "no recombinantes", cuando en realidad cuadrados. Estos programas poseen diferen-sí lo son. Si no hubiéramos mapeado el gen tes procedimientos, o rutinas, que permiten la Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 91
  • 93. estimación de r entre pares de marcadores, 3. Mapeo de QTLla identificación de los grupos de ligamiento y Muchas de las características de importan-la determinación del orden de los marcadores cia agronómica presentan una distribucióndentro de cada grupo. El programa Mapmaker continua de valores, esto es, dentro de unautiliza el test estadístico LOD score para eva- población determinada no existe una clara dis-luar el valor de r estimado y la posición más tinción en clases fenotípicas. La base genéticaprobable de un marcador en el grupo de liga- de estas características fue esclarecida pocomiento. El LOD score (logaritmo de los odds) después del redescubrimiento de las leyes dees el logaritmo en base 10 del cociente entre la Mendel, cuando Yule en 1902 propuso queprobabilidad de obtener los datos observados esa variación era la consecuencia de la acciónen caso de que los loci considerados estuvieran aditiva de muchos genes. Entre éstos se sue-ligados, sobre la probabilidad de obtener los da- le identificar a genes de efectos pronunciados,tos en ausencia de ligamiento. Un LOD = 3 para denominados genes mayores y genes con pe-un par de marcadores indica que es mil veces queños efectos que fueron inicialmente deno-más probable que los loci estén ligados respec- minados poligenes. Sin embargo, la distinciónto a que no lo estén. El programa Mapmaker entre poligenes y genes mayores (también lla-también utiliza LOD score para comparar dife- mados oligogenes) no resultó satisfactoria yarentes órdenes posibles entre varios genes. Al que el efecto de un gene depende del entornoorden más probable le asigna un 0 y a los res- genético, el ambiente y del alelo presente en el locus del gen. Geldermann (1975) propusotantes le asigna valores negativos. Por su par- denominar a estos loci controladores de carac-te, el programa JoinMap (Stam, 1993) permite terísticas cuantitativas como QTLs (del ingléstrabajar con distintos tipos de poblaciones e in- Quanitative Traits Loci). Esta nomenclatura re-clusive con distintos tipos de segregación den- sultó más adecuada ya que no asocia al gentro de la misma población. Este programa fue con la magnitud de su efecto.especialmente diseñado para estimar datos de Si bien la genética cuantitativa ha propues-ligamiento genético en poblaciones derivadas to y utilizados modelos biométricos con grande especies altamente heterocigotas y/o donde éxito a lo largo de la historia del mejoramientono es posible obtener líneas puras. Otra de sus de plantas y animales, estos modelos se ba-principales ventajes es que permite “combinar” san en la estimación de los efectos génicos ymapas derivados de distintas poblaciones (o no tanto en el número de genes involucrados.datos bibliográficos) si disponen marcadores en Utilizando marcadores moleculares ligados acomún (Stam 1993). Debido a que las unidades los QTLs, es posible estimar el genotipo, losde mapeo genético están basadas en frecuen- efectos genéticos y tener una aproximacióncia de recombinación su significado en cuanto menos sesgada del número de o genes/QTLsa distancia física (número de nucleótidos) entre determinantes del carácter. Es indispensabledos loci varía según la especie considerada, el que el lector no considere la metodología decromosoma y la localización dentro del mismo. marcadores moleculares sustituta de de losEs conocido que existen regiones de alta fre- modelos genéticos-estadísticos utilizados porcuencia de recombinación localizadas sobre los la genética cuantitativa, por el contrario, ellosbrazos cromosomales (comúnmente llamados son la base de los estudios de mapeo de ge-hotspots) y regiones donde la recombinación nes/QTL utilizando marcadores moleculares.está fuertemente restringida como por ejemplocerca de los centrómeros o telómeros. Aunque Una de las técnicas de identificación dese corre el riesgo de cometer un error grosero QTLs es la denominada asociación con mar-puede considerarse que en promedio 1 cM equi- cas simples o marcadores individuales. En estevale aproximadamente a 1 Mpb (un millón de caso, la utilización de un mapa genético no espares de bases) en humanos y entre 500 y 750 necesaria, aunque un mapa genético ayuda akpb (mil pares de bases) en plantas superiores la interpretación de los resultados. Las posibi-(como el arroz y tomate, respectivamente). lidad de identificar un QTL usando marcadores92 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 94. moleculares depende de la distancia genética Efecto aditivoexistente entre el marcador y el QTL, y de la m MM - m mmmagnitud de los efectos genéticos, aditivo (a) y a=de dominancia (d) (ver más abajo), del propio : 2(1 - 2r )QTL. La estimación de estos efectos es indi-recta pues se realiza con base en el marcador Efecto de dominancia:ligado al QTL. Además, la estimación de estos m MM + m mmefectos será más o menos exacta dependien- m Mm -do de la técnica de mapeo utilizada, siendo la d= 2más adecuada aquellas técnicas derivadas del (1 - 2r ) 2mapeo por intervalo. Consideremos M/m el locus del marcador Razón d/a (grado medio de dominancia):molecular y Q/q el locus del QTL. Para sabersi M y Q están ligados, son necesarias las si- d 2m Mm - m MM + m mm d =guientes etapas: a (1 - 2r )( m MM - m mm)• obtener una población segregante para ambos loci M y Q(población de mapeo), Si el QTL no estuviera ligado al marcador,• medir la característica fenotípica (Y) con- (r = 0,5) las diferencias entre las tres medias trolada por el QTL (Q), no serán estadísticamente significativas. De la• obtener el fenotipo del marcador (M) en misma forma, si a y d fuesen iguales a cero (au- cada planta de esta población, y registrarlo sencia de efecto), no se detectarían diferencias en una matriz de datos. estadísticas entre las medias. De esta manera, sólo si r < 0,5 es posible detectar asociaciones Considerando el caso de un único locus entre M y Q, dependiendo esta detección del(Q/q), en que el alelo Q aumenta el valor de grado de ligamiento o magnitud de r (pequeñosla característica, y haciendo µQQ, µQq y µqq valores de r facilitan la detección) y del efectolas medias de los individuos con genotipos QQ, del alelo Q sobre el carácter.Qq y qq, respectivamente, y µ = (µQQ + µqq)/2la media entre los genotipos homocigotos, los Formalmente tenemos: Ho: µMM=µMm=µmm;siguientes efectos genéticos pueden ser obte- HA1: µMM ≠ µMm; HAa2: µMM ≠ µmm; HA3:µMm ≠ µmm.nidos una población F2: Medias de los genotipos µqq µ µQq µQQ d Valores genotípicos -a a a) efecto aditivo (a) y (d) efecto de la domi- La asociación Marcador-QTL se confirmanancia donde: si las diferencias entre las medias fenotípicas mQQ - mqq mQQ + mqq de grupos de marcadores son estadísticamen- a= d = mQq - te diferentes de cero (se rechaza de Ho). Las 2 2 diferencias pueden ser evaluadas por medio án una generación F2 cuyos genotipos mar- del análisis de la varianza (ANOVA) o pruebacadores MM, Mm y mm estarán presente en la t, eligiendo un nivel de significancia de P ≤ 0,05frecuencia de 1/4, 1/2 y 1/4, respectivamente. como se ejemplifica en la Tabla 2.En este caso los efectos a, d y d/a son estima- En una población F2, la asociación entre eldos con base en el marcador ligado al QTL, marcador y el QTL puede ser valorada a travéscomo sigue: de la regresión entre los genotipos y su corres- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 93
  • 95. Tabla 2: ANOVA entre los tratamientos MM, Mm y mmobtenidos de una población F2 Observe que:FV GL SC CM F P a = g1 - g2Tratamiento 2 202791,97 101395,98 54,94 0,0000 y d = g2 + g1Residuo 142 262030,95 1845,28Total 144 464822,93 por lo que para estimar los efec- tos a y d en una población de retro-FV: fuente de variación, GL: grados de libertad, SC: suma de cuadra- cruzamiento debe retrocruzarse lados, CM: cuadrados medios, F: valor del estadístico F (CM Tratamiento/ F1 con cada uno de los progenito-CM Residuo) y P: probabilidad de rechazar una Ho verdadera. Cuando res. Un problema adicional es queP < 0,05 indica asociación entre el marcador (M) y el QTL (Q).v a y d pueden anularse. Si existiera dominancia completa de Q sobre qpondiente fenotipo. En este caso, es necesario (d = a), g1 = 0 y si existiera dominancia comple-codificar los tres genotipos (MM, Mm y mm) ta de q sobre Q (d = -a), g2 = 0.como 1, 0 y -1 para el modelo aditivo, y 0, 1 y 0para el modelo dominante. El análisis de ANOVA y la regresión son téc- nicas que permiten la identificación de mar- El modelo de regresión adoptado es: cadores ligados a QTLs, pero poseen ciertas limitaciones: Yi = β0 + β1X1j +β2X2j + εj. 1) no indican si hay uno o más QTLs asocia- dos al marcador, donde: 2) no estiman la posición del QTL y Yi= valor de la característica; X1j= código del 3) el efecto del QTL puede ser subestimadomarcador para efecto aditivo (MM = 1, Mm = 0, debido a que es confundido con la frecuenciamm = -1); X2j= código del marcador para efec- de recombinación.to dominante (MM = 1, Mm = 0, mm = -1); β0= intercepto de la regresión (media de la ca- 3.2. Mapeo por intervalosracterística); β1 = inclinación de la recta para el El mapeo por intervalo (interval mapping) fuemodelo aditivo; β2 = inclinación de la recta para propuesto originalmente por Lander y Botsteinel modelo dominante y εj = error aleatorio para (1989) y es la base de todos los métodos dej-ésimo individuo. mapeo de QTL utilizados actualmente. Para conceptualizar esta metodología podemos Una vez evaluado y confirmado el modelo considerar el cruzamiento entre dos progenito-completo (modelo aditivo + dominante), debe res homocigotos cuya F1 posee la constituciónanalizarse la importancia relativa de cada uno genética que se ejemplifica en la Figura 4.de los modelos, por ejemplo mediante la me- A diferencia del mapeo por marcas simples,todología de regresión múltiple de eliminación en el mapeo por intervalo es indispensablepor paso (stepwise). poseer un mapa genético ya que la unidad de En poblaciones de retrocruzamiento, sólo el análisis es el intervalo genético y no un marca-genotipo heterocigoto (Qq) y uno de los homo- dor individual. De manera resumida el mapeocigotos (QQ o qq) están presentes por lo que por intervalo utiliza la siguiente estrategia: 1)el efecto aditivo y dominante quedan confun- como la distancia entre cada par de marcado-didos, en este apartado denominados g1 y g2, res es conocida, el método estima los paráme-respectivamente, y estimados como sigue: tros del modelo a incrementos de distancias genéticas predefinidos, 2) los parámetros del modelo pueden ser estimados mediante la fun-g1=mMM-mMm = (a-d)(1-2r) ción de verosimilitud o regresión, 3) la hipótesis H0: ausencia de QTL/ HA: QTL en un intervalo Yg2=mMm-mmm = (a+d)(1-2r) entre marcadores, son contrastadas a través94 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 96. entre los marcadores, el genotipo de QTL más probable dentro del intervalo sería QQ. Así, la única variable indicadora que asume valor es x* y ese valor es 1 (p = 1), pues no exis- ten desvíos debido a la dominancia y el alelo Q incrementa el valor del carácter. El intervalo M1M1M2m2 fue generado por una gameta pa- rental y otra recombinante. Ahora es probable que dentro del intervalo genético el genotipo del QTL sea QQ o Qq con probabilidades 1-p y p, respectivamente. El valor 1-p será máximo cuando estemos cerca del genotipo marcador M1M1 y mínimo cuando estemos próximos de Figura 4. M2m2. Lo contrario sucederá con el valor de p. Las variables x* y z* asumirán valores 1-pde la razón de dos verosimilitudes, LR (LR por y p, respectivamente, cuyos valores variaranLikelihood Ratio) o LOD score y 4) la presencia conforme nos desplacemos en el intervalo ade un QTL es inferida cuando el máximo valor distancias ra. Con el mismo razonamiento sede LR o de LOD obtenido es mayor a un um- pueden encontrar las probabilidades condicio-bral previamente establecido (punto 3.4). nales de los genotipos QQ, Qq y qq para los Haley y Knott (1992), presentaron un modelo intervalos M1M1m2m2 y M1m1M2m2.de mapeo por intervalos basados en regresión.El modelo adoptado para poblaciones F2 es: Según el modelo de Según Haley y Knott (1992) una regresión es realizada para cada Yj = µ + ax* + dz* + εj. valor de ra entre los marcadores M1 y M2. El valor de ra que produzca el mayor valor de R2 donde: Yj = valor de la característica Y en el (coeficiente de determinación), LR o de LODindividuo j; µ = media de la característica en la indica la localización del QTL. El test de sig-población; a = efecto aditivo del locus que está nificancia de hipótesis, LR, según puede sersiendo estudiado, sobre la característica Y; d = expresado como:efecto de dominancia del locus que está siendo SCR (reducido)estudiado, sobre a característica Y; x* y z* son LR = 2 ln SCRlas variables indicadoras (utilizadas para esti- (completo)mar los efectos a y d del QTL) y dependen delos genotipos de los marcadores flanqueantes educido) = Suma de cuadrados del residuo deldel QTL, en el individuo j y εj = error aleatorio modelo reducido: Yj = µ + ej; SCR(completo) = Sumapara j-ésimo individuo. de cuadrados del residuo del modelo completo: Yj = µ + ax* + dy* + εj ( para F2), Yj = µ + g1x* Expliquemos como se obtienen los valores + εj (para Retrocruzamientos) y Yj = µ + ax* +de las variables indicadoras x* y z* presenta- εj (para RIL y DH). Los valores de LOD se en-dos en la Tabla 3. Para adjudicar estos valores cuentran dividiendo el valor LR por 4,61 (LODdebemos respondernos la pregunta: Dado un = LR / 4,61).intervalo genético de marcadores moleculares,cuyo fenotipos son conocidos, ¿cuál es la pro- 3.3. Mapeo por intervalo compuestobabilidad que dentro del intervalo el genotipo En el mapeo por intervalo, los tests de hi-del QTL sea QQ, Qq o qq?. Consideremos el pótesis no son independientes de otros QTLsintervalo genético M1M1M2M2. El genotipo de ligados al intervalo siendo analizado. Paralos marcadores indica que fue generado por QTLs no ligados al intervalo el efecto no es tanel encuentro al azar de las gametas parenta- dramático, pero deben hacerse las siguientesles M1M2. Dado que no existió recombinación consideraciones: 1) la segregación del QTL no Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 95
  • 97. Tabla 3: Esperanza de los efectos genotípicos medios para un QTL para todos los po- sibles genotipos de los marcadores flanqueantes, en una población F2, cuando no se considera la ocurrencia de recombinaciones dobles en el intervalo. Genotipo Probabilidad c ondicional Variables indicadoras Marcador QQ Qq qq (a)x* (d)z* M1 M1 M2 M2 1 0 0 1 0 M1 M1 M2m 2 1-p p 0 1-p p M1 M1 m2m2 (1-p)2 2p(1-p) p 2 1-2p 2p(1-p) M1m1 M2 M2 p 1-p 0 p 1-p M1m1 M2m 2 cp(1-p) 1-2cp(1-p) Cp(1-p) 0 1-2cp(1-p) M1m1 m2m2 0 1-p p -p 1-p M1m1 M2 M2 p2 2p(1-p) (1-p)2 -(1-2p) 2p(1-p) m1 m1M2m 2 0 p 1-p -(1-p) p m1 m1m2m2 0 0 1 -1 0 p=ra/r ; (1-p)= rb/r; c=r2/[r2+(1-r)2] (Tomado de Schuster & Cruz, 2004).ligado contribuye a la variación fenotípica; blación F2 pueden ser estimados los efectos2) interfiere en la estimación del efecto del QTL aditivo y de dominancia, en un RC el efecto g1y 3) removiendo el efecto de la segregación o g2 y sólo el efecto aditivo en poblaciones dedel otro QTL se reduce la varianza residual RILs y DH. Para determinar si el valor de cadadel intervalo en consideración, aumentando el efecto estimado es diferente de cero se usanpoder de detección y precisión. El mapeo por las estadísticas LR o LOD. En muchos trabajosintervalo compuesto (Jansen 1993, 1994; Zeng de mapeo un valor de LOD superior a 2 – 31993, 1994), combina el mapeo por intervalo es utilizado como criterio para declarar la pre-con la regresión múltiple. Esta última, permite sencia de un QTL. Esta forma de determinar elincluir en el mapeo marcadores ubicados por valor umbral o crítico es arbitrario y la mayoríafuera del intervalo como cofactores, incremen- de los autores no lo consideran el más adecua-tando el poder de detección y precisión en la do, pues la probabilidad e detectar al menos unestimativa de la posición del QTL. La pregunta falso positivo (declarar la real la presencia dede cuántos cofactores deben utilizarse no es un QTL inexistente) en alguna región del ge-de fácil respuesta. En principio los dos marca- noma es prácticamente 1 (100 %). Se propusodores que flanqueen el intervalo deben ser in- disminuir este sesgo determinando un nivel decluidos, al igual que aquellos que resulten sig- significancia para cada cromosoma. En estenificativos en una regresión múltiple. Definidos caso, el nivel de corte para cada cromosomalos marcadores que se utilizarán como cofac- correspondería al del genoma completo dividi-tores, la metodología de mapeo por intervalo do el número de cromosoma o grupos de liga-compuesto se aplica exactamente igual a la de mientos obtenidos. También es posible definirmapeo por intervalo simple. un nivel de significancia para cada intervalo, di- vidiendo la significancia del cromosoma por el 3.4. Test de hipótesis y nivel de número de intervalos en el grupo de ligamientosignificancia (número de marcadores menos uno). La formulación de hipótesis adecuadas y Finalmente, el valor crítico de corte puedeutilización de estadísticos apropiados, para la establecerse empíricamente mediante el testevaluación de las mismas, es esencial para de permutaciones que es actualmente el másdeclarar la presencia de un QTL. En una po- usado. Para realizar este test deben numerar-96 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 98. se los individuos de 1 a n. Los valores fenotípi- establecer el número, posición y efecto indivi-cos de las características son tomados al azar dual de cada uno de los loci involucrados. Siny atribuidos a los individuos conforme vayan embargo, la identificación de QTLs en diversossiendo retirados. El primer valor fenotípico reti- cultivos no ha concluido con la identificación derado es asignado al individuo 1, el segundo va- los genes responsables del fenotipo, cuya exis-lor fenotípico al individuo 2, así sucesivamente, tencia se presume en el intervalo comprendidose asignan todos los valores fenotípicos a cada entre marcadores flanqueantes de los mismos.uno de los individuos. Los datos permutados Como consecuencia, la función biológica (o elson analizados para detectar la presencia de modo de acción) de los genes responsables deQTL, almacenando el mayor valor de LOD ob- los efectos de los QTLs es aún desconocida entenido. El proceso se repite de forma completa la mayoría de los casos reportados. Asimismo,N veces, finalmente, los valores de LOD rete- la posibilidad de realizar un “caminado cromo-nidos, son ordenados por orden de magnitud sómico” (cromosome walking) desde el marca-permitiendo estimar el valor critico de cada dor flanqueante al QTL hacia la región físicatest. El valor crítico de cada intervalo tendrá la donde reside el gen responsable con el fin demagnitud N(1- α), o sea, si se realizaron 1000 aislarlo, depende de la distancia de recom-permutaciones, la significancia de 5% será el binación entre el marcador y el gen, y de la950 º valor ordenado. Se procede de la mis- relación de esa distancia con la distancia físi-ma forma para obtener el valor de corte para ca real, que puede estar afectada por variosun determinado grupo de ligamiento o para el otros factores, como fuera mencionado antesgenoma completo (conjunto de grupos de li- en este capítulo.gamientos) considerando uno u otro en el test La creciente disponibilidad pública de infor-de permutación. Cuanto mayor el número de mación de secuencias de transcriptos de ADNpermutaciones, mayor la precisión en el valor mensajero (Expressed Sequence Tags, ESTs),crítico. junto con el grado de homología evidenciado entre especies, ha permitido la generación de 4. Mapas y marcadores funcionales los llamados marcadores génicos o funciona- En la historia del desarrollo de los marcado- les, cuya característica relevante es la de es-res moleculares se ha priorizado la detección tar localizados en regiones codificantes delde polimorfismos en regiones no codificantes genoma.del genoma. Esto ha sido en función de asegu- ticipan en las llamadas mutaciones silencio-rar la neutralidad fenotípica de los marcadores sas. Esto es, cuando el cambio nucleotídico sey posibilidad de maximizar la variación entre produce en la tercera base del codón sin alte-diferentes genotipos. Esta última caracterís- rar el aminoácido para el cual codifica. La iden-tica está sustentada en que las regiones no tificación de SNPs puede inferirse directamen-génicas del genoma no han sufrido presión de te a partir de datos de secuencias públicas, siselección sobre las mutaciones que pudieran estas corresponden a distintos genotipos, o porhaber ocurrido en el transcurso de la evolución secuenciación de fragmentos de genes amplifi-y por consiguiente ser más variables. La aso- cados por PCR de individuos diversos.ciación de los marcadores con caracteres de Aunque históricamente se ha asumido queinterés, como se ha visto anteriormente, está las secuencias tipo microsatélites son propiasdeterminada por la distancia de recombinación del ADN no codificante, hoy sabemos que las(o física) del marcador con el gen responsa- mismas pueden encontrarse también en regio-ble del fenotipo. De esta manera, los mapas nes génicas. Si bien la frecuencia relativa degenéticos basados en marcadores molecula- estos motivos es baja (< 5 %) la gran abun-res han posibilitado la localización de regiones dancia de secuencias de ESTs en diversos cul-cromosómicas estadísticamente asociadas a tivos, ha ocasionado que varios estudios ha-caracteres de tipo cualitativos (monogénicos) yan usado esta estrategia para el desarrollo deo cuantitativos (poligénicos o QTLs). Como ya marcadores moleculares. La selección de mo-se ha visto, la determinación de QTLs permite tivos de trinucleótidos, aumenta la posibilidad Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 97
  • 99. de encontrar SSRs polimórficos en regiones (RGAs) o genes pertenecientes a rutas meta-codificantes, minimizando los posibles cam- bólicas particulares (por ejemplo: síntesis debios en el marco de lectura ocasionados por carbohidratos), o a integrantes de una familiauna variación en el número de repeticiones de génica (por ejemplo: genes de la familia P450).motivos de di, tetra o pentanucleótidos. Estos Los mapas genéticos funcionales posibilitanmarcadores, denominados SSRs génicos o establecer una estrategia de genes candidatosEST-SSRs, presentan las mismas ventajas en la identificación de factores responsables deque los SSRs neutros que han sido enunciadas QTLs a nivel molecular, a través de la coinci-en el Capítulo 5. dencia en la localización de QTLs y marcadores Los marcadores CAPs requieren la existen- génicos. Un marcador funcional se convierte encia de un sitio de restricción polimórfico en la gen candidato cuando está asociado al carác-secuencia génica, y si bien se han reportado ter fenotípico a través de un análisis de marcascasos, los mismos son de baja ocurrencia. simple, o cuando en un mapa su localización La aproximación más sencilla para el desa- coincide con un QTL. En el primer caso, tanto elrrollo de un marcador funcional es a través de marcador como el carácter fenotípico deben es-una amplificación por PCR de un fragmento de tar evaluados en la misma población, mientrasun gen y estableciendo la existencia de polimor- que en el segundo caso esto no es necesario, yfismo entre genotipos a través de la resolución es factible comparar la posición de un marcadordel producto en geles de SSCP. Los polimorfis- funcional con QTLs de mapas de otras poblacio-mos detectados mediante esta técnica se basa nes de la misma u otra especie. Por ejemplo, seen que hebras simples de ADN con secuencias ha encontrado que el locus del gen Lin5 del cro-distintas, migrarán diferencialmente en un cam- mosoma IX del tomate correspondiente a unapo eléctrico, en función de un diferente plega- invertasa vacuolar (responsable de la degra-miento intra-cadena dado por la complementa- dación de sacarosa en glucosa y fructosa) co-riedad de bases. Patrones de bandas distintos localizada con el QTL Brix9-2-5 de rendimientoentre genotipos estarían indicando una varia- de azúcar de fruto, mientras que en papa el gención de secuencia en el fragmento amplificado. ortólogo invGE está asociado a variaciones enSin embargo, no puede asegurarse identidad el nivel de azúcares reductores en tubérculos dede secuencia de dos fragmentos amplificados, una población segregante, y su posición coinci-por no observarse diferencias en los patro- de con el QTL Sug9a, responsable del endulza-nes de electroforesis, ya que la detección de miento por frío en tubérculos de otra poblaciónlas mismas es un balance entre el número de de papa. Análogamente se ha encontrado queSNPs presentes y el tamaño del fragmento am- marcadores funcionales, basados en análogosplificado. Los polimorfismos presentados por a genes de resistencia (RGAs) se asocian enlos marcadores funcionales pueden entender- diferentes especies a resistencias a distintasse como variantes alélicas, que pueden o no enfermedades fúngicas y virales.estar asociados a una variación a nivel protei- Asimismo, en caracteres complejos donde seco, ya sea en estructura o expresión. De todos hayan establecido múltiples QTLs, los marcado-modos, estos marcadores, análogamente a lo res funcionales permiten establecer la interac-enunciado antes en este capítulo, pueden uti- ción entre éstos a la luz de las rutas metabólicaslizarse para generar mapas genéticos, que al involucradas, pudiéndose identificar enzimasestar formados por marcadores funcionales se claves para la manifestación del carácter. Estadenominan mapas funcionales. información genera un marco adecuado para Los mapas funcionales en general están ba- estudios de ingeniería metabólica.sados en mapas pre-existentes de marcadores El mejoramiento genético asistido por marca-neutros con el agregado de marcadores fun- dores moleculares (MAS) encuentra en los mar-cionales. Estos marcadores funcionales pue- cadores funcionales una situación ideal en laden corresponder a genes sin relación entre sí, que la recombinación entre el gen responsablecomo por ejemplo en mapas de ESTs-SSRs, y el marcador es nula, ya que ambos guardano incluir análogos de genes de resistencia identidad.98 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 100. Al estar diseñados sobre genes, la transfe- recombination frequency. En: The genetic analy-rencia de estos marcadores a través de espe- sis of quantitative traits. (First edition). Chapmancies está beneficiada, dada la mayor conserva- & Hall. London. pp. 120-132ción de las secuencias codificantes. Asimismo, LANDER, E. S.; GREEN, P.; ABRAHAMSON, J.; BARLOW, A.; DALY, M. J.; LINCOLN, S. E. yla comparación de mapas funcionales aporta NEWBURG, L. 1987. MAPMAKER: an interac-información en estudios de sintenía (conserva- tive computer package for constructing primaryción del tipo y orden de marcadores entre es- genetic linkage maps of experimental and natu-pecies relacionadas), evolución y especiación ral populations. Genomics 1:174–181.entre diferentes organismos. LANDER, E.S. y BOTSTEIN, D. 1989. Mapping Del mismo modo, la utilización de marcadores mendelian factors underlying quantitative traitsfuncionales en la conservación de los recursos using RFLP linkage maps. Genetics 121: 185-genéticos permite ponderar la diversidad gené- 199.tica existente en base a las variantes alélicas ORTIZ, J. P. A.; PESSINO, S. C.; BATH, V.; HAY-intra e inter-específicas. Concordantemente, WARD, M. D. y QUARÍN, C. L. 2001. A genetic linkage map of diploid Paspalum notautm. Crop.los estudios de genética de asociación (o ma- Science 41: 823-830.peo de asociación), basados en el desequilibrio RUSSELL, P.J. 1996. Mendelian Genetics. En: Ge-de ligamiento entre un marcador y un carácter netics, Chapter 2 (4th Edition). Harper Collinsfenotípico en una población de individuos no College Publishers, New York. pp. 17- 46relacionados (como es el caso de los bancos SAX, K. (1923) The association of size differencesde germoplasma) se presenta robustecido por with seed coat pattern and pigmentation in Pha-el uso de marcadores génicos. seolus vulgaris. Genetics 8:552-560 Finalmente, la correlación de los marcadores SCHUSTER, I. y CRUZ, C. D. 2004. Estatística ge-funcionales con datos fenotípicos o con QTLs nômica aplicada a populações derivadas de cru-sólo sugiere la función putativa de un gen y zamentos controlados. Primera Edición. Viçosa, Brasil. Ed. UFV. pp 568.sus variantes alélicas. Es por esto que la con- STAM, P. 1993. Construction of integrated geneticfirmación definitiva de la función génica debe linkage maps by means of a new computer pack-realizarse mediante estrategias más directas age: JoinMap. Plant J. 3:739–744.como ensayos de complementación y/o silen- WEISING, K.; NYBON, H.; WOLFF, K. y KAHL, G.ciamiento génico. 2005. Linkage analysis and genetic maps. En: DNA Fingerprinting in plants. Principles, Me- thods, and Applications (2nd Edition). CRC Press,5. Bibliografía y lecturas recomendadas: Taylor & Francis Group, Boca Raton, Florida. pp. 277-289 YOUNG, N.D. 1994 Constructing a plant geneticALLARD, R. W. 1956. Formulas and tables to faci- linkage map with DNA markers. En: DNA-based litate the calculation of recombination values in markers in plants. Advances in cellular and mo- heredity. Hilgardia 24: 235–278. lecular biology of plants. Vol. 1. (PHILLIPS, R. L.FEINGOLD, S. E.; LLOYD, J.; NORERO, N.; BO- y VASIL, I. K. Editors). (1st edition). Kluwer Aca- NIERBALE, M. y LORENZEN, J. 2005. Map lo- demic Publishers. Dordrecht, The Netherlands. cation and diversity values for new potato SSRs pp. 39-57 developed from EST databases. Theor. Appl. YULE, G.U. 1902. Mendel´s laws and their probable Genet. 111: 456-466. relation to intra-racial heredity. New Phytol. 1:GELDERMANN, H. 1975. Investigations on inheri- 193-207. tance of quantitative characters in animals by gene markers. I. Methods. Theor. Appl. Genet. 46: 319-330.HALEY, C. S. y KNOTT, S.A. 1992. A simple regres- sion method for mapping quantitative trait loci in line crosses using flanking markers. Heredity 69: 315-324.JANSEN, R. C. 1993. Interval mapping of multiple quantitative trait loci. Genetics 135: 205-211.KEARSEY, M. J. y POONI, H.S. 1996. Estimation of Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 99
  • 101. I CAPÍTULO 7. se encuentran disponibles las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de miles de genes y productos génicos codificados por los ge-Genómica nomas de varios organismos complejos. Esta información se utiliza para el estudio de en-Viviana Echenique; Juan P. Selva; Mauro Meier; fermedades humanas complejas y para com-Pablo Roncallo; Gustavo Schrauf prender fenómenos tales como la fisiología celular, el desarrollo, la conducta, la evolución, etc. También aportan información acerca de to- 1 Introducción dos los aspectos del crecimiento y desarrollo La «genómica» se desarrolló en las ulti- vegetal, diferenciación y respuesta a estresesmas dos décadas como consecuencia de los bióticos y abióticos. Gracias al potencial de re-avances realizados en biología molecular e lacionar fenotipos biológica y económicamenteInformática, dos áreas de la ciencia que han importantes con los genes responsables de lostenido un desarrollo tecnológico enorme, gene- mismos actualmente es posible identificar ge-rando una revolución en el conocimiento y en nes de interés para ser transferidos a otros or-la comprensión de los procesos biológicos. ganismos por medio de tecnología génica. Por El término fue acuñado en 1986 por Thomas otro lado, el conocimiento de la secuencia deRoderick para referirse a la subdisciplina de la los genes posibilita el desarrollo de marcadoresgenética que se ocupa del mapeo, secuen- perfectos, basados en la secuencia del mismociación y análisis de las funciones de geno- gen, lo cual facilita la selección y la transferen-mas completos y sirvió de nombre para una cia de los mismos a variedades de interés. Larevista especializada en la publicación de los conjunción entre tecnología génica, marcado-mencionados temas, “Genomics”. Consiste res moleculares, genómica y bioinformática haen la caracterización molecular de genomas revolucionado el mejoramiento genético vege-enteros y aporta información acerca de la se- tal, dando origen a lo que se denomina mejo-cuencia y de la función de cada sector del ge- ramiento molecular y se están desarrollandonoma en diferentes situaciones de desarrollo nuevos y promisorios cultivares (Fig. 1).y bajo diferentes condiciones ambientales, así La genómica puede dividirse en:como de los mecanismos implicados en la re-gulación de la expresión e interacción génica. - Genómica estructural, que se ocupa de Para ello, las herramientas que se utilizan la caracterización física de los genomas.para el análisis individual de genes o peque-ñas regiones cromosómicas, se aplican al aná- - Genómica funcional, que caracteriza ellisis global de genomas completos, estudian- transcriptoma, que está constituido por eldo en conjunto los miles de genes, proteínas conjunto completo de transcriptos producidosy metabolitos que constituyen un organismo, por un organismo, el proteoma o conjunto deasí como las complicadas redes de interac- proteínas codificadas por un genoma, y el me-ciones que operan entre ellos. La información taboloma o conjunto total de metabolitos degenerada es enorme y es clave para la identi- una célula, consecuencia de la función de losficación y el aislamiento de genes de interés y ARN y proteínas.permitirá interpretar, en términos moleculares,los procesos biológicos. Para ayudar en este El objetivo de la genómica es la dilucidaciónproceso han surgido poderosas herramientas completa y exacta de la secuencia de ADN debioinformáticas que permiten almacenar e in- un genoma haploide representativo de una es-terpretar esta información. pecie. Cuando esta secuencia se conoce, abre Las aplicaciones de la genómica alcanzan a la puerta a numerosas posibilidades.todos los ámbitos de la actividad humana re- Por análisis computacional de la misma ylacionados con la biología, como la salud, la utilizando principios conocidos de genética esalimentación y el medio ambiente. Actualmente posible:100 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 102. Figura 1: La conjunción entre tecnología génica, marcadores moleculares, genómica y bioinformática re-volucionaron el mejoramiento vegetal, conduciendo al desarrollo de nuevos cultivares. Los nuevos geneshallados son introducidos en plantas por tecnología génica. Esto a su vez permite establecer la funciona-lidad de los mismos. El conocimiento de la secuencia permite la obtención de mapas, marcadores perfec-tos y realizar selección asistida por marcadores moleculares (MAS), así como el fenotipeado molecular.Gentileza de G. Spangenberg. • Comparar secuencias similares presen- nes codificantes y no codificantes del genoma. tes en diferentes entidades biológicas y Catalogar las variaciones genéticas entre indivi- comprender la función de las mismas. duos ayudará a identificar aquellos cambios que • Realizar predicciones acerca de to- conducen a enfermedades genéticas, investi- das las proteínas codificadas por una gar nuevas terapias y establecer la resistencia especie. o susceptibilidad a diferentes factores. Para la • Establecer las variaciones genéticas comparación de secuencias se utiliza el algorit- entre distintas poblaciones de una mis- mo BLAST (basic local alignement search tool: ma especie. herramienta de búsqueda de alineación local Comparar secuencias de diferentes espe- básica), para lo cual existen distintos programascies y entender procesos evolutivos. que permiten hallar regiones similares entre di- ferentes genes (Parte I, Cap. 12). Esto ha dado origen a la genómica compa- En Febrero de 2001, coincidiendo con el cin-rativa y ha demostrado que existe considerable cuenta aniversario de la publicación del modelosintenia, es decir, una localización conservada estructural del DNA por Watson y Crick, la revis-de genes en posiciones equivalentes en espe- ta Nature publicó el primer borrador del genomacies relacionadas (Fig. 2). También ha sido una humano, que ha sido secuenciado completa-excelente herramienta para identificar motivos mente. También se han secuenciado otros ge-de secuencia altamente conservados y, por lo nomas como maíz, colza, soja, trébol, raigrás,tanto, funcionalmente importantes en regio- etc. (Tabla 1). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 101
  • 103. Tabla 1. Ejemplos de genomas secuenciados en los últimos años. Especie Tamaño del genoma Haemophilus influenzae 1.830.137 pb Mycoplasma genitalium 580.070 pb Methanococcus jannaschii 1.660.000 pb Bacterias Helicobacter pylori 1.667.867 pb Escherichia coli 4.639.221 pb Bacillus subtilis 4.214.810 pb Treponema pallidum 1.138.006 pb Levadura (Saccharomyces cerevisiae ) 12.052.000 pb Trichomonas vaginalis 160 Mpb Nematodo (Caenorhabditis elegans) 97 Mpb Organismos Mosca del vinagre ( Drosophila melanogaster ) 120 Mpb Eucariotas Mosquito de la malaria ( Anopheles gambiae ) 278 Mpb Mosquito del dengue y fiebre amarilla (Aedes aegypti ) 1.380 Mpb Abeja (Apis mellifera) 236 Mpb Protozoo malaria ( Plasmodium falciparum ) 22 Mpb Sorgo (Sorghum bicolor ) 700 Mbp Plantas Arroz (Oryza sativa ssp. japonica e indica) 420 - 466 Mpb Pez globo (Tetraodon nigroviridis ) 300 Mpb Gallo rojo de la jungla ( Gallus gallus) 1.000 Mpb Zarigüeya (Marsupial, Monodelphis domestica) 3.475 Mpb Ratón (Mus musculus ) 2.500 Mpb Vertebrados Rata (Rattus norvegicus ) 2.750 Mpb Perro (Canis familiaris ) 2.411 Mpb Chimpancé (Pan troglodytes ) 2.843 Mpb Macaco rhesus (Macaca mulatta) 2.870 Mpb Humano (Homo sapiens ) 3.000 MpbFigura 2: Sintenia entre los genomas de varias gramíneas. El genoma de arroz contiene grupos de mar-cadores que se hallan altamente conservados en muchos cereales, por lo cual dichos genomas puedensintetizarse básicamente como compuestos por «bloques de ligamiento de arroz». En la figura se muestrael alineamiento de los cromosomas y segmentos de cromosomas (identificados con letras mayúsculas)de varias gramíneas con los del arroz (centro). El genoma del maíz tiene dos copias semejantes de cadabloque de genes por lo que está representado por dos anillos del círculo. Las líneas externas punteadasconectan sectores adyacentes de los cromosomas de trigo. Modificado de Gale y Devos (1998).102 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 104. También es posible estudiar todos los genomas 2 Genómica estructuralbacterianos asociados a genomas más complejos, Como su nombre lo indica, el objetivo de la mismasin necesidad de aislar y de cultivar especies micro- es caracterizar la estructura del genoma. Conocerbianas particulares. Esto se denomina metagenó- la estructura de un genoma individual puede ser demica (Parte I, Cap. 11). Para este estudio se extrae utilidad para manipular genes y segmentos de ADNtodo el ADN de una comunidad microbiana de un en una especie particular. El análisis comparativoambiente particular (suelo, agua de mar, intestino de diferentes genomas posibilitará deducir reglashumano, etc.), se determina que genes se encuen- generales que gobiernan la estructura de todos lostran presentes, cuales son sus funciones y las dife- genomas.rencias que existen entre distintas comunidades a La genómica estructural procede a través de ni-este nivel. veles incrementales de resolución analítica, comen- Más recientemente ha surgido la denominada zando con la asignación de genes y marcadores a“Genómica Sintética”, que pretende crear formas cromosomas individuales, mapeando estos genes ysintéticas de vida recreando genomas artificiales, marcadores dentro de los cromosomas, finalizandocélulas con vías metabólicas predeterminadas y pro- con la preparación de un mapa físico a través depiedades catalíticas especificas. Involucra el redise- la secuenciación. Es decir, que se procede desdeño y la fabricación de sistemas biológicos. Como un mapeo genético de baja resolución, basado enejemplo podemos citar el transplante de un genoma el análisis de recombinación meiótica, hacia uno dede una célula bacteriana a otra. alta resolución, basado en marcadores moleculares, A continuación se brinda un panorama global llegando a la realización de un mapa físico, basa-acerca de la forma en que se articulan los proyec- do en la secuencia de fragmentos clonados parcial-tos de genómica, algunos resultados relevantes, las mente solapantes (Fig. 3).aplicaciones en agricultura y el estado de la investi-gación en Sudamérica. Los pasos a seguir son: 1) -Asignación de genes a los cromosomas 2) -Mapeo Cromosómico marcador 2 marcador 1 gen marcador 3 3) -Mapeo de Restricción gen marcador 2 3) -Mapeo Físico gen fragmentos clonadosFigura 3: Niveles de complejidad de la genómica estructural. La genómica estructural procede desde unmapeo genético de baja resolución, basado en el análisis de recombinación meiótica, a uno de alta reso-lución, basado en marcadores moleculares hasta la realización de un mapa físico, basado en la secuenciade fragmentos clonados solapantes. Modificada de Griffths et al. (2004). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 103
  • 105. - Mapeo cromosómico de baja resolución físico determinando qué fragmentos poseen marca-(ubicación de genes que producen fenotipos mutan- dores en común. Las distancias físicas se miden entes conocidos y algunos marcadores). Las distan- kilobases (kb) o megabases (Mb).cias genéticas se basan en frecuencias de entrecru- - Anclado del mapa genético en el mapa físi-zamientos («crossing overs») y son medidas como co.porcentaje de recombinación en centimorgans (cM). - Secuenciación de ADN a gran escala, que - Mapeo genético de alta resolución de cada brinda un mapa completo de cada cromosoma.cromosoma (con marcadores moleculares ubicados - Anclado del mapa genético y del mapa físi-muy próximos entre sí). co en el de secuencia. Las distancias físicas ge- - Mapeo físico, basado en distancias molecula- neralmente no se correlacionan directamente conres, resultantes de mapas de fragmentos de restric- las distancias genéticas porque las frecuencias deción parcialmente superpuestos. La distancia entre recombinación no son siempre proporcionales a lasdos marcadores puede ser medida determinando el distancias moleculares. Sin embargo, a menudo lastamaño de los fragmentos de restricción que los con- dos correlacionan razonablemente bien en regionestienen, siendo el fragmento más pequeño que lleva eucromáticas de los cromosomas (aquellas menosambos marcadores una estimación de la distancia condensadas, que se colorean de manera más difu-entre ellos. Utilizando combinaciones de sondas y sa). En humanos, un cM es equivalente, en prome-enzimas de restricción puede construirse un mapa dio, a aproximadamente 1 Mb de ADN. 1) -Asignación de genes a los cromosomas 2) -Mapeo Cromosómico marcador 2 marcador 1 gen marcador 3 3) -Mapeo de Restricción gen marcador 2 3) -Mapeo Físico gen fragmentos clonadosFigura 3: Niveles de complejidad de la genómica estructural. La genómica estructural procede desde unmapeo genético de baja resolución, basado en el análisis de recombinación meiótica, a uno de alta reso-lución, basado en marcadores moleculares hasta la realización de un mapa físico, basado en la secuenciade fragmentos clonados solapantes. Modificada de Griffths et al. (2004).104 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 106. 2.1 Asignación de loci a crosomas intervalos recombinacionales entre genes co- específicos. nocidos contienen cantidades muy grandes de ADN. Estos intervalos o «gaps» no pueden ser Se utilizan los siguientes métodos: completados utilizando análisis de ligamiento - Ligamiento a loci conocidos: análisis debido a la ausencia de marcadores en esastradicional basado en cruzamientos, en espe- regiones. Para llenarlos y construir mapas decies en las que es factible hacerlo. alta resolución surgieron los marcadores mole- - Electroforesis de campo pulsátil: se usa culares, entre los que se encuentran los RFLPen el caso de especies que poseen cromoso- y los SSLP (mini y microsatélites)(Parte I, Cap.mas pequeños, separables por esta técnica, 5). Estos marcadores permiten la construccióncomo sucede con los de levaduras. Las ban- de mapas genéticos con una densidad de undas en el gel corresponderían a cromosomas marcador/centimorgan (cM). Aunque tal reso-individuales y pueden utilizarse para locali- lución es un logro muy importante, un centi-zar nuevos genes por hibridación. Prime- morgan representa, en humanos, una mega-ro, utilizando sondas de localización conocida base, lo que equivale a un millón de pares dese establece que banda corresponde a cada bases o 1000 kb. Para lograr mayor resolucióncromosoma. Luego, un nuevo gen clonado de actualmente existen los SNP, que son marca-ubicación desconocida se utiliza como sonda dores basados en el polimorfismo de un solopara asignarle una posición en un cromosoma nucleótido.determinado. - Hibridación in situ: cuando se dispone de - Híbridos celulares interespecíficos, un gen clonado éste puede ser utilizado comopor ejemplo humano-ratón. Se utiliza exclusi- para hibridar con los cromosomas in situ, paravamente en mapeo del genoma humano o de lo cual se lo marca radiactivamente o por fluo-especies animales. Se establecen bancos de rescencia. Puede, de ese modo, identificarselíneas celulares que contengan todos los cro- a los cromosomas portadores de la secuencia,mosomas del roedor y un cromosoma huma- determinar si son secuencias específicas de unno particular. Siempre incluye un cromosoma cromosoma y determinar la posición del gen enhumano que lleva un alelo salvaje defectivo el mismo. En el caso de fluorescencia, la téc-para una función bioquímica determinada en el nica se denomina FISH («fluorescence in situgenoma del ratón. Si sobreviven en un cultivo hybridization»). La localización del fragmentodeficiente para el factor que no sintetizan es en el cromosoma se visualiza como un puntoporque llevan el alelo humano equivalente, que brillante (Parte I, Cap. 3).complementa la función faltante. - Mapeo físico de los cromosomas: apor- ta un nivel de resolución mayor. Se trata de 2.2 Ubicación de los genes a lo largo del identificar un conjunto de fragmentos de ADNcromosoma clonados superpuestos que, juntos represen- El próximo nivel de resolución consiste en ten un cromosoma o un genoma completo. Losdeterminar la posición de un gen o marcador mapas así obtenidos se llaman mapas físicos,molecular sobre el cromosoma. Este paso es porque el ADN es el material físico del genoma.importante porque los mapas genéticos pue-den alinearse con los mapas físicos y utilizarse 2.3 Secuenciación a gran escala delpara validar los mismos. genoma - Generación de bancos de EST (etique- - Mapeo por recombinación: en los casos tas de secuencias expresadas)en que ha sido factible hacerlo (organismos La complejidad de los genomas eucariotasexperimentales como levaduras, mosca de la hace aconsejable, como primera aproxima-fruta, ratón, Arabidopsis, etc.) ha posibilitado la ción, no abordar el estudio del genoma comple-construcción de mapas que a lo largo de los to. Es preferible estudiar sólo una fracción delaños aparecen repletos de genes con efectos mismo, es decir, aquellos genes que se estánfenotípicos determinados. Sin embargo, los expresando en un momento determinado de la Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 105
  • 107. ADN Genómico Genoteca de BACS Clones organizados en Contigs BAC a ser secuenciado Subclones (‘shotgun clones’) Secuenciado EnsambladoFigura 4: Estrategia de secuenciado jerárquico («hierarchical shotgun sequencing strategy»). El primerpaso consiste en construir una genoteca por fragmentación del ADN e introducción del mismo en vectoresque aceptan grandes insertos, en este caso de BACs. Los fragmentos de ADN representados en la mismason organizados en un mapa físico y los clones individuales son seleccionados y secuenciados para lo cualse hace una nueva genoteca de trozos más pequeños («shotgun library»). La secuencia de los clones seensambla finalmente para reconstruir la secuencia del genoma. Modificada de la publicación del Interna-tional Human Genome Sequencing Consortium, 2001vida del organismo. Para ello se obtienen po- genoma completo. Para ello, el ADN genómi-blaciones de ADNc (que reflejan sólo secuen- co total se digiere con enzimas de restriccióncias expresadas) que se secuencian de forma apropiadas o se fragmenta mecánicamente enmasiva para generar miles de secuencias par- fragmentos de gran tamaño (100-300 kb.), queciales conocidas como ESTs (Parte I, Cap. 8). se clonan en vectores apropiados, para cons-Estas secuencias de entre 300-500 pb. suelen truir genotecas que contienen, al menos, unaser suficientes para la identificación de los ge- representación completa del genoma, que pue-nes mediante comparación con las secuencias de estudiarse en detalle y secuenciarse (Parteexistentes en las bases de datos públicas (ej. I, Cap. 4). A fin de distinguir las regiones codi-Genbank, EMBL), utilizando para ello progra- ficantes de las no codificantes, las secuenciasmas de análisis informático (Parte I, Cap.12). se comparan con las de ESTs y ADNc previa-Si la información contenida en la secuencia mente estudiados.parcial no es suficiente, habría que determinarla estructura del ADNc completo para estudiar Para reconstruir la secuencia del genomasu función por otros métodos. original a partir de los fragmentos clonados se utilizan las siguientes estrategias: - Secuenciación genómica La aproximación anterior no permite iden- a) Secuenciación de los clones ytificar genes que se expresan a bajo nivel o ensamblado de los fragmentosen situaciones fisiológicas no consideradas o El clonado comienza obteniendo un númeroregiones no representadas en el ARNm. Para elevado de fragmentos al azar que se clonanobtener esta información debe secuenciarse el en un vector apropiado. En la preparación de106 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 108. mapas físicos de genomas se utilizan vectores genomas completos (whole genome shotguncomo los cósmidos, YACs, BACs y PACs, que sequencing) (Fig. 5). Todos los estadios delaceptan insertos de gran tamaño (Parte I, Cap análisis genómico como la preparación de clo-4). El contenido de estos clones se caracteriza nes, el aislamiento de ADN, la electroforesis yy se ordenan, buscando los puntos de solapa- la secuenciación han sido bien adaptados a di-miento o superposición. Un conjunto de clones ferentes máquinas o robots, automatizando elsolapantes se llama contiguo. Para establecer trabajo.el solapamiento de clones se secuencian re-giones cortas del inserto proximas al sitio de b) Ordenamiento de los clonesclonado utilizando primers posicionados en el Se utilizan varias técnicas para ordenar losvector. Los intervalos sin secuencias (gaps) se clones en contiguos. Entre ellas:completan utilizando el final de un fragmento - FISH: para localizar las posiciones aproxi-clonado para llegar al siguiente (primer wal- madas de insertos grandes.king). A medida que se van caracterizando los - Fenotipificación (fingerprinting): se cor-clones, los contiguos se alargan y van con- ta el clon con enzimas de restricción que ge-vergiendo unos con otros. El proyecto termina neran un grupo de bandas que representancuando se tiene un conjunto de contiguos que un «fingerprint» o «huella digital» del clon. Lasequivale al número de cromosomas de la es- bandas generadas por varios clones puedenpecie en estudio. En la Figura 4 se resume una alinearse visualmente o por un programa deestrategia de secuenciación jerárquica (hierar- computación para determinar si se superponenchical shotgun sequencing). Esta se usa para o solapan.genomas grandes. Para genomas más peque- - STS («sequence tag sites» o sitios deños se utiliza otra, llamada secuenciación de secuencia marcada): son secuencias cortasFigura 5: Montaje de un genoma complejo mediante la secuenciación completa del genoma por tiros deescopeta («whole genome shotgun sequencing»). En primer lugar, se construyen los contiguos con lassecuencias que se superponen. Finalmente se utilizan los extremos apareados para cubrir los intervalossin secuencia y así orientar y ordenar los contiguos en unidades llamadas andamios (scaffolds) Modificadode Griffths et al. (2004). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 107
  • 109. de insertos grandes clonados. Se reúne un mismo. El mismo actúa como punto de partidaconjunto de clones al azar y se cortan en frag- para el caminado cromosómico (chromosomementos más pequeños que se clonan en λ y se walking), donde los fragmentos finales del mar-secuencian pequeñas regiones de cada uno. cador ligado son utilizados como sondas paraPara ello se diseñan primers que amplifican seleccionar otros clones de la genoteca. Deluna secuencia corta de ADN (STS). segundo grupo de clones (los que solapan con el inicial) se hacen mapas de restricción y los Actualmente existe una tecnología más fragmentos obtenidos son utilizados para rea-moderna para el secuenciado de genomas, lizar una nueva ronda de selección de clonesla pirosecuenciación. Esta técnica utiliza es- superpuestos. Así el proceso de «caminado»feras atrapadas en una placa que contiene se mueve hacia ambos lados a partir del sitio1.600.000 microceldas. Cada esfera (una por inicial, que culmina cuando se llega al gen demicrocelda) permite realizar una reacción de interés. Existe otra técnica relacionada llamadasecuenciación individual, basada en la síntesis salto cromosómico, que permite saltar a travéscomplementaria de un ADN de cadena sencilla, de áreas distantes y potencialmente no clona-previamente multiplicado por PCR y alineado a bles del ADN y genera «marcas», ampliamen-cada esfera. La incorporación de cada nucleó- te espaciadas a lo largo de la secuencia, quetido durante la síntesis de ADN libera una mo- pueden utilizarse como puntos de inicio paralécula de pirofosfato (PPi), que al interactuar múltiples caminatas cromosómicas bidireccio-con enzimas presentes en el medio (luciferasa, nales. Esta técnica consiste en crear fragmen-entre otras) produce una señal quimioluminis- tos grandes (entre 80-150 kb) por restriccióncente captada por una cámara de detección del ADN en la región que se cree contiene alde fotones, la traducida en una computadora gen de interés. Cada fragmento de ADN escomo la adición de un nucleótido determinado, luego circularizado, poniendo en contacto losgenerando una secuencia individual por cada extremos libres. Este procedimiento acercacelda. Esta tecnología, desarrollada por la em- puntos relativamente distantes de la regiónpresa 454 Life Sciences, dio lugar a la creación de genoma en estudio. Se trata de generar endel primer equipo de secuenciación masiva esa unión un sitio que no sea cortado en una(Secuenciador GS 20™) diseñado para se- posterior restricción, de manera que esas doscuenciar genomas bacterianos, con una capa- regiones que estaban distantes en el genomacidad para descifrar 20 millones de bases por ahora estén unidas en un fragmento. El círculocorrida (4hrs) en secuencias individuales de se corta con una nueva enzima de restricción±100 bases. En el proyecto del género Bacillus, y los fragmentos obtenidos, entre los que seque tiene un genoma de aproximadamente 4 encuentran los sitios de unión, se clonan enMb, con seis corridas se descifraron 129.6 Mb, fagos.con una cobertura mayor a 20x de su genoma. Esto es lo que se llama una «genoteca deEn comparación, por el método de Sanger, se saltos». Una sonda del sector de comienzo delogró una cobertura de 3x (12,5Mb). la región que contiene al gen de interés puede utilizarse como punta de partida para comenzar3 Utilización de mapas genómicos para el a «saltar» por el genoma. Un salto puede, poranálisis genético ejemplo, avanzar unos 50 kb hacia el locus de Los mapas genéticos y los físicos son un im- interés. Una vez allí, el otro extremo de la uniónportante punto de partida para varios tipos de del fragmento inicial se corta y se usa paraanálisis genético, incluyendo el aislamiento de buscar el siguiente punto de salto en la geno-genes y genómica funcional. teca. O sea que a través de las uniones se va Por ejemplo: avanzando hacia el punto donde se encuentra - Aislamiento de genes por clonado po- el locus. Cada posición de salto es un punto desicional: para ubicar un gen cuya secuencia partida para una caminata cromosómica. Estasse desconoce se puede partir de un marcador regiones se van secuenciando. Allí comienzaconocido que esté estrechamente ligado al la búsqueda de genes utilizando programas108 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 110. de predicción y se seleccionan las secuencias 4 Análisis funcional de los genescandidatas. Esta estrategia de saltos se utilizó Una vez secuenciado el genoma completopara clonar el gen de la fibrosis quística, que pueden identificarse la mayoría de los geneses una enfermedad humana que resulta fatal y de una especie. Restaría entonces determinares causada por mutaciones en un gen de gran cuál es la función de cada uno de ellos y cómotamaño localizado en el cromosoma 7. interaccionan para definir un fenotipo determi- - Estrategia del gen candidato: la caracte- nado. La genómica funcional intenta resolverrización de una región cromosómica hace que esta cuestión a través del estudio de:aparezcan varios genes de función descono-cida. Si un gen de interés es mapeado en esa - El transcriptoma: se refiere al estudio deregión, estas secuencias pasan a ser «candi- los perfiles de expresión de todos los genesdatas». Para cada una de ellas, o para la más presentes en el genoma. Para ello se extraenprobable, de acuerdo al análisis de secuencia, todos los ARNm contenidos en una célula, te-se diseñan experimentos tendientes a determi- jido u órgano en un determinado momento denar en cuales tejidos se expresa, en qué condi- desarrollo o situación fisiológica. El métodociones, etc., utilizando Northern blot o RT-PCR. más utilizado es el de micromatrices de ADN,Si el patrón de expresión encontrado coincide que permite analizar simultáneamente la ex-con el patrón esperado es altamente probable presión de miles de genes, pudiéndose dis-que hayamos encontrado el gen de interés. El poner entre 5000-50.000 genes (ESTs, ADNc,experimento ideal para confirmar esto, sería la oligonucleótidos) sobre un portaobjetos utili-transformación de un individuo mutante para zando un sistema robotizado. Sobre este chipesta función con el gen normal. Si se produ- de ADN se realizan experimentos de hibrida-ce la reversión del fenotipo mutante (comple- ción con muestras marcadas radiactivamentementación), tendremos la prueba irrefutable o con fluoróforos apropiados, y los resultadosde que estamos frente al gen buscado. se cuantifican mediante análisis con phospho- - Genes con patrones complejos de he- rimager o microscopía confocal. De esta mane-rencia: no todos los genes muestran patrones ra se pueden identificar, de forma simultánea,simples de herencia. Puede suceder que: los patrones de expresión de miles de genes - La variación fenotípica sea cuantitativa, en un momento del desarrollo o en respuestacomo peso o altura. Este tipo de variación se a diferentes estímulos ambientales. El análisisdebe a la interacción acumulativa entre alelos bioinformático de estos datos permite asociar+ y – de varios genes y el ambiente. grupos de genes que se expresan de forma co- La disponibilidad de miles de marcadores ordinada y proporciona información importantemoleculares como los SSLP, dispuestos a lo sobre la función de los mismos (Parte I, Cap. 8).largo del cromosoma, ha posibilitado el mapeo - El proteoma: comprende el conjunto to-de algunos de estos genes que contribuyen a tal de proteínas expresadas por un genomala variación cuantitativa cuyos loci son llama- completo, incluyendo las modificadas des-dos QTL (quantitative trait loci) (Parte I, Cap. pués de la traducción. El estudio del transcrip-5 y 6). Para abordar este problema, se buscan toma debe ser complementado con el análisisdos tipos de líneas que muestren fenotipos de las proteínas codificadas por los transcrip-contrastantes para un carácter cuantitativo y se tos, puesto que estas macromoléculas están alcruzan para generar descendencia homocigota final de la ruta de expresión génica. El métodoque contenga solo un segmento o un peque- más utilizado para estudiar la abundancia re-ño número de segmentos de una de las líneas. lativa de cientos de proteínas es la electrofo-Estos individuos pueden caracterizarse por su resis bidimensional en geles de poliacrilamidafenotipo y puede estimarse la contribución de (2DPAGE), que permite separar con gran reso-los segmentos específicos a la variación obser- lución la mayoría de los polipéptidos celularesvada. Los SNP (polimorfismos de un nucleó- combinando de forma secuencial diferenciastido simple) aceleran el mapeo de caracteres en carga y en masa molecular. Utilizando sis-complejos. temas computarizados de análisis de imagen Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 109
  • 111. se seleccionan las proteínas cuya abundan- en cuenta la envergadura de un proyecto decia relativa cambia durante el desarrollo o en secuenciado, los emprendimientos genómicosrespuesta a diferentes estímulos ambientales tomaron especies modelo, representativas de(Parte I, Cap.9). un genoma vegetal. El primer modelo vegetal - El metaboloma: comprende el conjunto fue una dicotiledónea, Arabidopsis thaliana.total de metabolitos de una célula. En plan- Le siguió una monocotiledónea, el arroz, cuyotas, el metabolismo secundario (reacciones genoma es seis veces menor que el del maízque no son vitales para el individuo y que con- y 37 veces menor que el del trigo. El estudioducen a la producción de compuestos que a de estas dos especies permitirá arribar a cono-veces ayudan a su supervivencia, como por cimientos clave para el mejoramiento vegetal.ejemplo antraquinonas, alcaloides, digoxina, Arabidopsis thaliana es una dicotiledóneataumatina, vainillina, menta, etc.) produce una que posee uno de los genomas vegetalesenorme variedad de compuestos diferentes. más pequeños. Carece de importanciaSe han identificado más de 40.000 y se esti- económica pero resulta ser un excelente or-ma que aún quedan por descubrir alrededor de ganismo para la investigación puesto que es100.000. Los investigadores que trabajan en fácil de transformar y su ciclo de vida tarda sóloeste nuevo campo de la química aplicada a la 7 semanas, de semilla a semilla. Alrededor debiología (metabolómica) consideran que sólo 12.000 científicos trabajan coordinadamentede esta forma se podría definir, en términos en esta pequeña planta, conformando el másmoleculares, un fenotipo concreto. En meta- avanzado sistema de experimentos en biologíabolómica se emplean herramientas analíticas vegetal del mundo. Su secuencia genética esmuy sensibles (tales como espectrometría de de libre acceso en el sitio http://www.arabi-masa, cromatografía líquida o gaseosa y re- dopsis.org. En un artículo publicado en Naturesonancia magnética nuclear) para analizar los (2000) se analiza el genoma de Arabidopsis acambios metabólicos provocados por mutacio- partir de las 115.4 megabases secuenciadasnes génicas o por la expresión de transgenes. (de un total de 125). Su evolución involucróLa metabolómica puede ser aplicada al monito- una duplicación completa del genoma, seguidareo de estreses inducidos, para identificar pa- por una subsecuente pérdida y duplicación desos metabólicos limitantes, para el análisis de genes, lo cual dio origen a un genoma dinámi-mutantes y hasta para realizar la evaluación de co, enriquecido por una transferencia lateralmanejos agronómicos, tales como el efecto de de genes de cianobacterias. Contiene 25.498fertilizantes sobre el metabolismo, etc. (Parte I, genes que codifican para 11.000 familias deCap. 10). proteínas, con una diversidad funcional similar - La bioinformática intenta dar sentido a la a la encontrada en Drosophila y Caenorhabditisinformación derivada de las técnicas anterior- elegans. Arabidopsis posee varias familiasmente descriptas. La importancia de esta cien- de proteínas nuevas pero carece de otras co-cia resulta obvia cuando se considera que los munes, indicando que los grupos proteicos engenomas poseen miles de millones de pares común han experimentado una expansión yde bases (Parte I, cap. 12). contracción en estos tres grupos eucariotas. El genoma de arroz está compuesto por 19 5 Modelos bloques génicos que, reordenados como “blo- El mapeo comparativo ha demostrado que ques de Lego”, permiten reconstruir el genomala organización de los genes dentro de los de las Tritíceas, maíz, Setaria, caña de azúcargenomas ha permanecido muy conservada y sorgo (Fig. 6). Considerados como una uni-a través de la evolución, existiendo estrechas dad genética representarían el genoma ances-relaciones de colinearidad entre los geno- tral de las gramíneas, el cual tendría un únicomas de casi todas las gramíneas cultivadas, par de cromosomas.entre las solanáceas, entre las brasicaceas La familia de las gramíneas es probable-cultivadas y Arabidopsis, entre los pinos, rosá- mente la mejor caracterizada en este aspecto,ceas y varias leguminosas. Por ello, teniendo contando con una buena cantidad de mapas110 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 112. Figura 6: El genoma de arroz está compuesto por 19 bloques génicos que, reordenados como «bloquesde Lego», permiten reconstruir el genoma de las Tritíceas, maíz, Setaria, caña de azúcar y sorgo. Estosbloques, considerados como una unidad genética, representarían el genoma ancestral de las gramíneas,el cual tendría un único par de cromosomas.genéticos comparativos que demuestran las muy diferente entre estas especies, ¿cuál es larelaciones interespecíficas (Fig. 7). En térmi- base de la mayor complejidad en los humanos?nos genéticos, las gramíneas representan una La explicación estaría en el proteoma, másfamilia muy diversa. Se estima que el genoma que en el genoma. Las proteínas codificadasde las mismas divergió hace alrededor de 65 por los genes pueden agruparse en familias enmillones de años desde un antecesor común. base a su similitud y muchas de estas familiasEl nivel de ploidía y el número básico de cro- proteicas son compartidas por todos los gruposmosomas son muy variables, así como el ta- mencionados, aunque el número de miembrosmaño del genoma. por familia es mayor en humanos. Esto es particularmente evidente en aque- 6 Algunas generalizaciones acerca de los llos genes involucrados en el desarrollo. Losgenomas humanos tenemos 30 genes para factores Los estudios en especies modelo han per- de crecimiento del fribroblasto, mientras quemitido arribar a varias generalizaciones. Una Drosophila y Caenorhabitis elegans tienen 2.de ellas es que el número de genes no es Las nuevas proteínas surgen a través de cor-la base de la complejidad. La mosca de la tes y empalmes alternativos de un mismo ARNfruta tiene unos 13.000 genes, Caenorhabitis mensajero (alternative splicing), lo que permi-elegans 18.000, Arabidopsis 26.000 y los hu- te aumentar considerablemente la diversidadmanos 30.000. Si el número de genes no es proteica a partir de los mismos mensajes. Las Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 111
  • 113. Figura 7: Alineamiento de cromosomas de arroz (3, 6) y maíz (9).predicciones indican que el 60% de los genes los exones (secuencias del mensajero que sehumanos tiene dos o más alternativas de em- encuentran representadas en la proteína, laspalme. En Caenorhabitis el 22%. secuencias correspondientes a los intrones no Un elevado número de factores de trans- lo están) comprenden un porcentaje bajo delcripción y modificaciones postraduccionales genoma, mientras que los intrones compren-también conducen a una mayor complejidad. den el 24%. Los genes no están distribuidos enEn el caso de Arabidopsis, cerca del 9% de forma pareja. Algunos se encuentran agrupa-los genes son factores de transcripción (FT). dos en ciertas regiones del genoma mientrasSi se compara la proporción con los genomas que otros se encuentran aislados. En la mosca,de otras especies, se observa que Arabidopsis el nematodo y Arabidopsis la disposición de losno sólo tiene más genes que algunos anima- genes es mucho más regular.les pequeños, sino que la proporción de FT es Aproximadamente la mitad del genoma hu-más alta que en cualquier clase de organismo mano consiste de secuencias repetitivas,estudiado. Esto parece reflejar el hecho de siendo la mayoría elementos transponiblesque las plantas deben adaptarse a una amplia que se propagan replicándose e insertandovariedad de condiciones medioambientales, a una copia de sí mismos en otras regiones deldiferencia de los animales, que pueden movili- genoma. En la actualidad solo dos tipos de ele-zarse y cambiar de lugar si este no les resulta mentos son activos, Alu y LINE1. La mayoríapropicio. de los mismos se encuentran en regiones ricas En humanos, los genes ocupan una cuarta en A y T, mientras que los genes se encuen-parte del genoma, y sólo el 1,5% codifica para tran en áreas con elevado contenido de G yproteínas. Las secuencias correspondientes a C. Fragmentos de estos elementos también112 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 114. se encontraron en las secuencias regulatorias 7 Genómica y Agriculturaque controlan la expresión de varios genes, por Especialistas en varias disciplinas han lle-lo que se ha sugerido que, de alguna manera, gado a la conclusión de que el alcance de lapodrían afectar positivamente su expresión y genómica será mayor en lo que se refiere a laevolución. economía y la calidad de vida que en el ám- Los genomas vegetales también están pla- bito de la salud humana. Gracias al aporte degados de secuencias repetitivas (transposo- grupos de investigación de todo el mundo senes y retrotransposones), que constituyen un dispone de bases de datos públicas con infor-porcentaje muy importante del ADN nuclear y mación genómica de utilidad para los mejora-han contribuido, a lo largo de la evolución, a dores. El conocimiento de cómo actúan los ge-la expansión de los genomas. En maíz repre- nes en una especie puede ayudar a los mejo-sentan del 50 al 80% del genoma y en trigo el radores a perfeccionar su función en otra. Las80% (Fig. 8). De esta manera los genomas de secuencias de los genomas de Arabidopsis ylos cereales pueden considerarse como islas de arroz proporcionan información relevantede genes que se hallan dispersas en un mar de acerca de otros cultivos, como el maíz y el tri-secuencias repetitivas. go. Dado que estos tres cereales representanFigura 8: a) Elementos repetitivos en un fragmento cromosómico de maíz. b) Diagrama que muestra comolos elementos transponibles en gramíneas son responsables del incremento en el tamaño del genoma.El arroz, sorgo, cebada y maíz derivaron de un ancestro común hace aproximadamente 70 millones deaños. Desde entonces, los transposones y retrotransposones se han ido acumulando a diferentes nivelesen las especies. Los cromosomas son más largos en maíz y cebada, cuyos genomas contienen grandescantidades de retros con LTR (long terminal repeats). En verde se señalan los elementos transponibles yen naranja los genes. Modificada de Griffths et al. (2000). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 113
  • 115. más de la mitad de la producción alimentaria La genómica comparativa, basada en elmundial y que el arroz es el alimento básico de análisis de ESTs de diferentes plantas tole-más de la mitad de la población del planeta, la rantes a estreses abióticos, ha permitido latrascendencia de la genómica en la agricultura identificación de redes de genes comunes aso-es indiscutible. ciados con estreses ambientales, tales como La similitud entre las especies de cereales salinidad, sequía, bajas y altas temperaturas.también implica que cuando se trasladan ge- El análisis de especies tolerantes a situacionesnes de una especie a otra, tenderán a funcio- extremas ha identificado genes involucradosnar bien y en la misma forma con una mínima en los mecanismos que las hacen tolerantes.manipulación genética. Dichos genes podrán entonces ser transferidos A través de esfuerzos públicos y privados se a especies de cultivo.trabaja en la identificación de genes asociados Como ejemplos pueden citarse Agrostiscon caracteres como rendimiento, resistencia a adamsonii y Agrostis robusta, tolerantes a sali-la sequía, calidad de los alimentos, resistencia nidad, Microlaena stipoides, tolerante a alumi-a insectos y tolerancia a herbicidas. nio y Deschampsia antarctica, tolerante a bajas De esta manera se ha acelerado significa- temperaturas (la única gramínea que crece entivamente el aporte de nuevas variedades al la Antártida) (Fig. 9).mercado, ya sea por modificación genética o También se ha mencionado que los factorespor selección con marcadores moleculares o de transcripción serían las “llaves” para des-utilizando criterios de selección a partir de la bloquear funciones génicas que aprovechen lainformación molecular. diversidad de la naturaleza para producir mejo-Figura 9: Categorización funcional de ESTs de Deschampsia antarctica. El objetivo de este proyecto esencontrar genes involucrados en la resistencia a bajas temperaturas para ser transferidos, por tecnologíagénica, a especies de cultivo. Gentileza de G. Spangenberg.114 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 116. res cultivos. Estos son genes que virtualmente bacteria fijadora y la planta sino también entrecontrolan todo carácter importante, desde el la planta y otro simbionte, las micorrizas (aso-punto de vista agrícola, en las plantas, inclu- ciación de un hongo con la raíz de una plantayendo rendimiento, resistencia a las enferme- superior. Esta asociación no es específica dedades, protección contra las heladas y sequía, especie como el caso de Rhizobium y las legu-producción de químicos, proteínas usadas en minosas. El hongo puede ser de varios géner-farmacéutica, etc. La mayoría de los caracte- os y aporta fósforo a la planta). Recientementeres vegetales a los que interesa aplicar la inge- se logró la identificación, en alfalfa, de un re-niería genética son multigénicos (ej. tolerancia ceptor requerido para el reconocimiento de se-al estrés hídrico) y los genes involucrados se ñales bacterianas de nodulación, los llamadosexpresan en cascadas de forma tal que genes factores NOD.primarios activan a genes secundarios que a Las plantas medicinales aportan el 25% desu vez activan a genes terciarios. Los factores los compuestos activos utilizados actualmentede transcripción serían los responsables de ha- por la industria farmacéutica. Entre estos com-cer funcionar a los genes primarios, obtenién- puestos se encuentran los citocromos P450,dose largas cascadas de expresión de genes que participan en la biosíntesis de muchospor la manipulación de un solo gen. compuestos anticancerígenos, alcaloides, fitoesteroides, antioxidantes y antimicrobia- Durante los últimos años se ha obtenido una nos. También tienen un rol muy importante engran colección de FT de plantas, funcional- la detoxificación de xenobióticos (herbicidas ymente caracterizados, no sólo en Arabidopsis, pesticidas). Se han identificado 1052 citocro-sino también en especies como tomate, maíz mos P450 y el objetivo actual es, utilizandoy soja. En total hay cerca de 1900 FT en herramientas de metabolómica, determinar suArabidopsis pero en el contexto de la genómi- función bioquímica precisa.ca funcional el interés recae en unas 60 famil- Otro de los objetivos de la metabolómica esias que tienen funciones reconocidas. La her- el estudio de la síntesis de las esencias queramienta primaria que se utiliza para conocer confieren perfume a las flores y el mejoramien-la función de los FT consiste en sobreexpre- to del sabor de algunas plantas utilizadas ensarlos y/o detener la expresión de algunos de alimentación humana, como por ejemplo man-ellos. Se puede, por ejemplo, medir el efecto dioca, donde el objetivo sería la eliminación dede cada FT en la composición de los lípidos en los glucósidos cianogénicos que le confierenlas semillas aceiteras y la composición de lípi- sabor amargo.dos en las hojas, la composición de azúcares, La devastación de los bosques es motivo su-de esteroides, etc., estudiar procesos básicos, ficiente para invertir en proyectos de genómicaa través de la dilucidación de sus efectos en el tendientes a la identificación de genes involu-desarrollo vegetal y la resistencia a las enfer- crados en perennidad, desarrollo, interacciónmedades, o tratar de identificar el FT que regu- con herbívoros, respuesta a estrés y síntesisla el consumo de nitrógeno (N). El N es uno de de metabolitos secundarios como lignina ylos insumos más costosos para la agricultura, celulosa. Se han generado ESTs de álamo,por lo que identificar los genes que controlan y abedul, abeto, pino y eucaliptos. El álamo semodifican la respuesta al N sería de gran valor. utiliza como sistema modelo para el análisis También existen proyectos genómicos rela- de los genes involucrados en la formación decionados con leguminosas y con sus simbiontes madera. Otro objetivo en este campo es lafijadores de nitrógeno. Recientemente se han búsqueda de estrategias para inducir floraciónsecuenciado los genomas de las especies de temprana, que es un factor crítico en el mejora-Mesorhizobium y Sinorhizobium y se han pro- miento de forestales.ducido cientos de miles de EST de Medicago La secuenciación de los genes y la diluci-truncatula, Lotus corniculatus y soja. En el dación de las vías que controlan la floración encaso de M. truncatula no sólo se han disectado los cereales, que difiere en varios aspectos conlos pasos que controlan las señales entre la los correspondientes en Arabidopsis, ha sido Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 115
  • 117. otro de los logros de la genómica. También se maíz, sorgo, arroz, trigo y cebada conservan lalocalizaron y caracterizaron, en trigo y cebada, presencia y el orden de marcadores y genes,los genes VRN1 y VRN2, que son los genes aunque en algunos casos la correspondenciacentrales en la vía de vernalización en trigo, cromosómica fue modificada por duplicacio-cebada y otros cereales invernales. Este cono- nes, inversiones o translocaciones. De estacimiento es clave en agricultura, ya que per- manera se logró consensuar un mapa unifica-mitiría, potencialmente, controlar la floración do de gramíneas en el que se detallan secuen-en cultivos de gran importancia económica, cias y genes conservados en diferentes geno-como los cereales y los forrajes. mas (Fig. 2). Utilizando estas herramientas fue posible transferir información proveniente de 8 Aportes de la genómica al mejoramien- plantas de genomas pequeños (arroz, sorgo)to de cereales a plantas de genomas más complejos como el El trigo pan (Triticum aestivum L 2n= 6x= 42; trigo. Esto ha facilitado la localización más pre-AABBDD) es uno de los principales cultivos cisa de genes para tolerancia a estrés biótico yalimenticios ya que provee cerca del 55% de abiótico (prebrotado, dormición, vernalización,los carbohidratos consumidos por el hombre. frío y otros) y el desarrollo de marcadores útilesLa genética de este cultivo resulta compleja, para el mejoramiento. También ha conducido aes de naturaleza hexaploide, con tres geno- la obtención de mapas consenso específicosmas homeólogos denominados A, B y D que para trigo pan, candeal, maíz y cebada.aportan 7 pares de cromosomas cada uno. Losgenes redundantes son una norma, con sets Las nuevas técnicas de genómica funcional,homoalélicos triplicados en la mayoría de ellos. epigenética, mapeo por asociación, “TILLING”El genoma del trigo hexaploide es el de may- y los ARN interferentes (ARNi), entre otras,or tamaño (17000 Mbp trigo, 2800 Mbp maíz, contribuirán a un mayor conocimiento del800 Mbp sorgo, 450 Mbp arroz). Más del 80% funcionamiento del genoma de este cereal.del mismo está constituido por secuencias de Existen genotecas de BACs/BIBACs para to-ADN altamente repetitivo. El restante 20% está dos los genomas de trigo. Estas representancompuesto por secuencias de bajo número de un importante complemento para saturar loscopias o copia única, donde se encuentran la mapas.mayoría de los genes. Si bien las secuencias En los últimos años fueron confeccionadoaltamente repetitivas varían de especie en es- numerosos mapas genéticos de trigo pan, can-pecie, las secuencias génicas, en general, son deal y cebada a partir de poblaciones de RILsconservadas. Esta característica permite el uso (líneas recombinantes endocriadas) o haploi-de sondas heterólogas (de otros genomas) des duplicados, que resultan útiles en estudiosen experimentos de hibridación de tipo RFLP de identificación de QTL asociados a calidad(Parte I, Cap. 5) para identificar secuencias y estreses bióticos (enfermedades) y abióticosconservadas en especies diferentes dentro de (sequía, salinidad). Para ello se utilizaron yuna misma familia taxonómica (Devos y Gale, desarrollaron miles de marcadores molecula-2000). res, incluyendo RFLPs, SSRs, AFLPs, SNPs, En 1989 se publicó el primer mapa genético y marcadores DArT (Diversity array techno-molecular de trigo, correspondiente a los cro- logy), (estos últimos basados en matrices demosomas homeólogos del grupo 7, observán- diversidad). La información generada posibilitódose que el orden de los genes y marcadores el desarrollo de marcadores perfectos, a partirse conserva en gran parte de los tres geno- de la secuencia del gen a seleccionar, en lugarmas de trigo hexaploide. Esta fue la primera de marcadores genéticamente ligados. Comoprueba de colinearidad en gramíneas y posibil- ejemplo pueden citarse los genes de las enzi-itó el desarrollo de la genética comparativa en mas polifenol oxidasas, lipoxigenasas y fitoenocereales. sintasa, entre otros. También posibilitó la con- En trabajos posteriores se comprobó que fección de mapas consenso para trigo pan,largos segmentos de los cromosomas de candeal y cebada.116 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 118. El acceso a los principales genes que afectan Traits Loci de expresión) y han sido utilizadosla calidad ha abierto nuevas vías para el desa- para identificar funciones de genes individuales.rrollo comercial de diferentes productos deriva- Toda esta información permite inferir que lados del trigo. Es posible obtener variedades con biotecnología puede cambiar el escenario de losdiferente calidad de almidón, diferente textura cereales en dos áreas principales: (1) protegien-de grano, diferente composición de gluteninas, do al cultivo de estreses bióticos y abióticos ygliadinas y secalinas en función del uso indus- (2) modificando el concepto de producción detrial. El descubrimiento de genes valiosos de «commodities» por el de producción de «spe-otros genomas y la posibilidad de incorporarlos cialities», por ejemplo para derivados de trigoal trigo por transgénesis permitirán resolver pro- con mayor valor agregado, como noodles (claseblemas del cultivo, como pueden ser limitantes de fideo muy utilizado en Asia), galletitas dulces,debido a estreses bióticos y abióticos o desa- crackers (un tipo de galletita que se rompe fácil-rrollar nuevas generaciones de transgénicos en mente), masa congelada, pan de molde, pasta,función de las necesidades del consumidor, con almidones, plásticos biodegradables, etc.mayor contenido de aminoácidos esenciales Se han identificado cinco áreas de investiga-como la lisina, vitaminas, etc. ción a desarrollar en los próximos años para el La complejidad del genoma del trigo ha he- mejoramiento de trigo, que pueden aplicarse acho aconsejable abordar los estudios genómi- los cereales en general: (i) mapeo genético, (ii)cos a través del transcriptoma. Para ello se han análisis de QTL, (iii) mejoramiento molecular,establecido consorcios internacionales como (iv) mapeo por asociación, y (v) desarrollo deel International Wheat Genome Sequencing software.Consortium (IWGSC) o el International TriticeaeMapping Initiative (ITMI), el cual coordina gru- 9 Genomas trabajadorespos de investigación de distintos países en la La genómica aplicada a dilucidar los meca-construcción de mapas moleculares del geno- nismos por los cuales funcionan los microorga-ma de trigo. Existe colaboración internacio- nismos puede conducir al aislamiento de susnal para otros cultivos como el arroz, donde el componentes para desarrollar nanoestructurasInternacional Rice Genome Sequencing Project que lleven a cabo funciones complejas. Como(IRGSP) coordina esfuerzos de 10 países y como ejemplos pueden citarse:resultado de esto, en 2002, fueron colocadas enbases de datos públicas secuencias de alta cali- Methanococcus jannaschii: es una bacteriadad que representaban 366 Mbp del genoma de que produce metano, una importante fuente dearroz. En el 2005 se llegó a 371 Mbp, que repre- energía. Contiene enzimas que soportan tem-sentan el 95% del mismo. Las bases de datos peraturas y presiones elevadas por lo que sonde EST han crecido exponencialmente en la úl- potencialmente útiles para fines industriales.tima década, de manera que en Septiembre de Deinococcus radiodurans: soporta niveles2008 había 55 millones de ESTs depositadas en de radiación extremadamente elevados por loel National Center for Biotechnology Information cual tiene un alto potencial para limpiar dese-dbEST database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ chos radiactivos.dbEST). Esto incluye cerca de 1.607.934 de Thalassiosira pseudonana: se trata de unaESTs de trigo hexaploide y sus parientes más diatomea marina que es la principal participan-cercanos de la tribu Triticeae, que son Hordeum te en el bombeado biológico de carbono haciavulgare L.; especies diploides y tetraploides de las profundidades de los océanos, por lo queTriticum, Secale cereale L. y Aegilops speltoides posee un elevado potencial para mitigar losTausch. Estas ESTs se utilizan para el desarro- cambios climáticos del planeta.llo de marcadores funcionales, la preparaciónde mapas de transcriptos y la construcción de 10 Proyectos de Genómica en Sudaméricamatrices de ADNc. Actualmente el estudio de En Sudamérica se han desarrollado y seARN interferentes, TILLING y la “genética de ex- encuentran en ejecución algunos proyectospresión” lideran el mapeo de eQTL (Quantitative genómicos. Frente al estado del desarrollo de Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 117
  • 119. estas áreas en el mundo, existen en la región interés agrícola. Otro proyecto de genómica,serias carencias, tanto de recursos humanos en este mismo país, apunta a desarrollar plata-entrenados como de infraestructura y equi- formas tecnológicas en genómica forestal conpamiento. En Brasil se estableció una red de el objeto de mejorar la posición competitiva delcooperación que secuenció completamente el sector forestal chileno.genoma de Xylella fastidiosa, bacteria que ata- En el marco del Programa Cooperativo paraca a los cítricos causando importantes pérdidas el Desarrollo Tecnológico Agroalimentario yeconómicas. También incursionó en el estudio Agroindustrial del Cono Sur (PROCISUR),de genómica funcional de células cancerosas los Institutos Nacionales de Investigacióny de secuenciación del genoma de caña de Agropecuaria de Argentina, Bolivia, Brasil,azúcar, Saccharum oficinalis. En Argentina se Chile, Paraguay y Uruguay han conformadoha trabajado en la secuenciación de Brucella una plataforma regional para enfrentar los de-abortus, agente causal de la brucelosis bovina. safíos que impone la secuenciación del geno- Investigadores argentinos participan tam- ma de la papa. Esta iniciativa es desarrollada abién en proyectos de genómica en coopera- nivel mundial por el Consorcio Internacional deciones internacionales, como el consorcio in- Secuenciación del Genoma de la Papa, que li-volucrado en la secuenciación del genoma de dera la Universidad de Wageningen de HolandaTrypanosoma cruzzi, el proyecto que llevó a la y en la que están comprometidos China,clonación y caracterización de los genes de ver- Estados Unidos, Holanda, India, Inglaterra,nalización en trigo o el proyecto de búsqueda Irlanda, Nueva Zelanda, Polonia, Rusia y losde genes de tolerancia a frío en Deschampsia sudamericanos Chile, Perú, Argentina y Brasil.antarctica. En Chile se ha completado recien- Estos últimos, en conjunto, secuenciarán eltemente la secuenciación de Piscirickettsia sal- cromosoma 3 del genoma de la papa y en totalmonis, patógeno intracelular de salmones que se deberán secuenciar los 12 cromosomas decausa importantes pérdidas en esta industria. la especie.También se trabaja activamente en especies En varios países se han secuenciadohortícolas, principalmente frutales. fragmentos de genomas de virus y viroides Otros ejemplos son el desarrollo de marca- (Argentina, Chile, Uruguay). En Argentina sedores microsatélites (Parte I, Cap. 5) de di- esta realizando la caracterización biológicaversas especies, como girasol (colaboración y molecular del virus del mal de Río Cuartode INTA-Argentina con empresas semilleras (MRCV) con el fin de estimar la diversidad ge-locales), vides (INIA-Chile como parte de un nética de las poblaciones del virus, detectar laconsorcio internacional), alpacas y otros camé- existencia de razas y limitar la propagación delidos sudamericanos (INIA-Chile), pasto llorón esta enfermedad de importancia para el maíz.(CERZOS, UNR, INTA Castelar), entre otros. El En el año 2003 la Agencia Nacional degirasol es una especie de importancia económi- Promoción Científica y Tecnológica deca en la Argentina y es el eje de varios proyec- Argentina (ANPCyT) lanzó una convocatoriatos genómicos. Algunos de los objetivos son la para Proyectos de Área de Vacancia (PAV),caracterización de la diversidad funcional del donde la genómica era una de las prioridades.girasol y la identificación de SNPs asociados a En respuesta a esta convocatoria se formó unacaracteres agronómicos de importancia como Red de laboratorios dedicados al análisis ge-la resistencia a estreses bióticos y abióticos. nómico funcional y comparativo en especiesPor otro lado, el desarrollo de marcadores mi- de interés agropecuario, forestal o ambientalcrosatélites, ESTs y el mapeo genético de las (PAV137). Los objetivos fueron generar una in-mismas es utilizado para asistir al mejoramien- fraestructura operativa y comunicacional ade-to y realizar identificación varietal. cuada y formar recursos humanos necesarios En Chile se ha desarrollado un programa de para apoyar el desarrollo de iniciativas e inves-genómica funcional coordinado por diversos tigaciones en áreas de genómica funcional yministerios, destinado a enfrentar problemas bioinformática críticas para la biología agrope-de postcosecha y enfermedades en plantas de cuaria, forestal y ambiental. La red pudo capa-118 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 120. citar recursos humanos orientados a la bús- liza el estudio de genes y sus productos, in-queda, prospección y/o análisis funcional de volucrados en los mecanismos moleculares degenes con interés básico o aplicado. Se abor- susceptibilidad y resistencia a estreses bióti-daron cinco áreas de desarrollo e integración: cos, a través de estudios de genómica funcio-a) transcriptómica, b) proteómica, interactómi- nal, utilizando ESTs y unigenes y micromatri-ca y metabolómica, c) genómica comparativa, ces de ADNc.d) genómica evolutiva para la caracterización Los objetivos para programas de genómicade la diversidad genética y e) ecogenómica sudamericanos deberían enfocarse hacia el(aplicada a la evaluación de impacto ambien- aumento de la productividad y la mejora de latal) y epidemiología molecular. En los dos pri- calidad de los productos, desarrollando capaci-meros subproyectos se encararon trabajos de dades para identificar genes del germoplasmaprospección y caracterización funcional de re- regional, de manera de disminuir la dependen-giones genómicas de interés en plantas supe- cia de variedades y genes desarrollados y ais-riores y bacterias zoonóticas mediante el aná- lados por países del primer mundo y buscar so-lisis de perfiles de transcripción, interacción de luciones para problemas propios de la región,proteínas y perfiles metabólicos (girasol, citrus, que difícilmente pueden ser enfrentados porsoja, solanáceas, Mycobacterium y otros). En programas de mejoramiento genético ajenos ael c) se caracterizaron molecularmente regio- la misma.nes genómicas involucradas en característicasreproductivas (apomixis) de especies forra- 11 Lecturas / sitios recomendados jeras, de resistencia a estreses en especiescultivadas, así como de características pro- Cenci A., Chantret N., Xy K., Gu Y., Anderson O.D.,ductivas en girasol y caprinos. El área d) sirvió Fahima T., Distelfeld A. Y Dubcovsky J. 2003.para evaluar la diversidad genética de recursos Construction and characterization of a half mil-biológicos naturales o cultivados, en particular lion clones Bacterial Artificial Chromosomeen especies leguminosas y en forestales. La (BAC) library of durum wheat. Theor Appl Genet 107: 931-939.e) permitió estudiar la dinámica poblacional de Cervigni G., Paniego N., Díaz M., Selva J.P., Zap-variantes alélicas en ecosistemas (impacto del pacosta D., Zanazzi D., Landerreche I., Felitticultivo de maíces transgénicos en potenciales S., Pessino S., Spangenberg G. And Echeniquegenes de resistencia en insectos plaga, cuanti- V. 2008. Expressed sequence tag analysis andficación de diversidad genética de especies en development of gene associated markers in apeligro de extinción en ecosistemas naturales near-isogenic plant system of Eragrostis curvula.explotados por el hombre) y encarar la epide- Plant Molecular Biology. 67: 1-10.miología molecular de la fiebre aftosa y de la Devos K.M Y Gale M.D. 2000. Genome relationship:peste porcina clásica. the grass model in current research. Plant Cell Este proyecto acaba de finalizar (septiembre 12: 637-646 Echenique V., Stamova B., Wolters P., Lazo G.,de 2008) y, si bien aún no se ha realizado la Carollo V. Y Dubcovsky J. 2002. Frequencies ofevaluación final del mismo, varios de los ob- Ty1-copia and Ty3-gypsy retroelements withinjetivos fueron cumplidos exitosamente, ya que the Triticeae EST databases. Theor. Appl. Genet.se formaron varios doctores en el área en dis- 104: 840-844.tintas Universidades del país, entrenados para Gale M. Y Devos K. 1998. Plant comparative genet-trabajar en equipos multidisciplinarios, además ics after 10 years. Science, 282: 656-658.de lograr avances en el conocimiento en las Gibson D.G., Benders G.A., Andrews-Pfannkochmencionadas áreas. C., Denisova E.A., Baden-Tillson H., Zaveri J., El INIA (Uruguay) cuenta con proyectos de Stockwell T.B., Brownley A., Thomas D.W., Al-desarrollo y validación de herramientas bioin- gire M.A., Merryman C., Young L., Noskov V.N., Glass J.I., Venter J.C., Hutchison Iii C.A. Y Smithformáticas para integrar información genómica H.O. 2008. Complete chemical synthesis, as-en programas de fitomejoramiento y selección sembly, and cloning of a Mycoplasma genitaliumde germoplasma. Dentro de los proyectos de genome. Science, 319: 1215-1220.genómica de arroz, el EMBRAPA (Brasil), rea- Glass J.I., Assad-Garcia N., Alperovich N., Yooseph Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 119
  • 121. S., Lewis M.R., Maruf M., Hutchison Iii C.A., Smi- Moore G. 2000. Cereal chromosome structure, evo- th H.O. Y Venter J.C. 2005. Essential genes of lution and pairing. Ann. Rev. Plant Mol. Biol. 51: a minimal bacterium. Proc. Nat. Acad. Sci. 103: 195-222 425-430. Sanmiguel P., Ramakrishna W., Bennetzen J.L.,Goff S.A., Ricke D., Lan T.H., Presting G., Wang Busso C. Y Dubcovsky J. 2002. Transposable R., Dunn M., Glazebrook J., Sessions A., Oeller elements, genes and recombination in a 215 kb. P., Varma H. et al. 2002. A draft sequence of the contig from wheat chromosome 5A. Functional rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Sci- and Integrative Genomics. 2: 70-80. ence, 296: 92-100. Wade C.M., Kulbokas E.J. Iii., Kirby A.W., ZodyGriffiths A., Miller J., Suzuki D., Lewontin R. Y M.C., Mullikin J.C., Lander E.S., Lindblad-Toh K. Gelbart W. 2004. An introduction to genetic anal- Y Daly M.J. 2002. The mosaic structure of vari- ysis. Octava Edición. W.H. Freeman, N.York. ation in the laboratory mouse genome. Nature, 860 pp. 420: 574-578.Gupta P.K., Mir R.R., Mohan A. And Kumar J. Warren R.L., Varabei D., Platt D., Huang X., Messi- 2008. Wheat genomics: Present status and na D., Yang S., Kronstad J.W., Krzywinski M., future prospects. International Journal of Warren W.C., Wallis J.W., Hillier L.W., Chinwalla Plant Genomics. Article ID 896451, 36 pages. A.T., Schein, J.E. Siddiqui A.S., Marra M.A., Wil- doi:10.1155/2008/896451 son R.K., Y Jones S.J.M.. 2006. Physical map-Kumar A. Y Bennetzen J.L. 1999. Plant retrotrans- assisted whole-genome shotgun sequence as- poson. Annu Rev Genet 33: 479-532. semblies. Genome Res. 16: 768-775.Lacadena J.R. 2000. Seréis como dioses. Crítica Yu J., Hu S., Wang J., Wong G.K., Li S., Liu B., (Madrid), 874: 12-16. Deng Y., Dai L., Zhou Y., Zhang X. Et Al. 2002. ALartigue C., Glass J.I., Alperovich N., Pieper R., Par- draft sequence of the rice genome (Oryza sativa mar P.P., Hutchison Iii C.A., Smith H.O. Y Venter L. ssp. indica). Science, 296: 79-92. J.C. 2007. Genome transplantation in bacteria: The Arabidopsis Genome Initiative: Analysis of the changing one species to another. Science 317: genome sequence of the flowering plant Arabi- 632-638. dopsis thaliana. Nature 2000. 408: 796-815.120 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 122. I CAPÍTULO 8 tos de posición (originados en el mapeo gené- tico) con los datos de expresión (originados en el análisis del transcriptoma) posibilita la selec-Transcriptómica ción de candidatos responsables de disparar un determinado carácter de interés.Silvina Felitti y Silvina Pessino Este capítulo tiene como objetivo presentar en forma abreviada una serie de metodologías que son utilizadas habitualmente para el análi- El análisis de los niveles de representación sis del transcriptoma de plantas. Debido al muyde ARN mensajeros proporciona información rápido cambio y perfeccionamiento en las téc-importante sobre la actividad de un gen, evi- nicas empleadas para abordar el estudio de ladenciando si está siendo copiado para poste- representación de mensajeros tanto a nivel deriormente dirigir la síntesis de la proteína a la mesada como bioinformático, algunas de lascual codifica. En los últimos años los proce- metodologías mencionadas aquí ya han sidodimientos para la detección de los niveles de reemplazadas y se usan actualmente en formaARN mensajeros han progresado velozmente poco frecuente. Sin embargo hemos decididodesde el análisis de genes únicos específicos incluirlas, dada su gran importancia histórica(como el Northern, slot, y dot blotting, la RT- en relación al cambio de abordaje conceptualPCR semicuantitativa y cuantitativa y los en- que va desde el análisis de la actividad de ge-sayos de protección de nucleasas) hacia otros nes únicos al estudio integral de la expresiónenfocados en la identificación de múltiplestranscriptos que difieren en su representación génica. Comenzaremos describiendo las técni-entre las diversas muestras experimentales cas en orden cronológico de desarrollo.(como la hibridización substractiva, el displaydiferencial, el ADNc-AFLPs, la secuenciación Hibridización substractivade etiquetas expresadas o ESTs, el análisis se- Los métodos de hibridización substractivarial de la expresión de genes o SAGE y la hi- fueron creados a principios de los años 80 conbridización de microarreglos). La organización el propósito de construir bibliotecas de ADNcposterior de las secuencias dentro de grupos para obtener sondas de genes expresadosfuncionales basada en los datos de homología diferencialmente. Fueron los primeros que seproporciona un marco básico para conducir utilizaron de manera amplia con el propósitonuevos estudios dirigidos a definir el rol bioló- de identificar genes regulados positiva o nega-gico de cada producto génico. Por otra parte, la tivamente en una escala global. Sus ventajasaplicación de técnicas de PCR en tiempo real y incluyen la habilidad de aislar genes de funciónde hibridización in situ de tejidos permiten una relacionada sin tener conocimientos previosvalidación más precisa de los datos de expre- de su secuencia o identidad y el uso de téc-sión diferencial obtenidos por métodos ante- nicas comunes de biología molecular que noriormente citados. requieren equipos especializados de detección La capacidad tecnológica creciente permi- y análisis. El procedimiento general consistete ahora capturar sectores de tejidos o inclu- en la hibridización de un ADNc provenienteso células aisladas y analizar su contenido de de una muestra prueba (tester) con un excesoARNm, lo que provee información específica de ARNm proveniente de una muestra controlsobre la representación del transcriptoma para (driver). Los transcriptos expresados en ambastipos celulares únicos. La asociación de los da- muestras (tester y driver) forman moléculas detos provenientes de la secuenciación genómica ARNm/ADNc híbridas, mientras que las se-con aquellos originados en la transcriptómica y cuencia de ADNc que están presentes única-la proteómica facilita la predicción de la exis- mente en la muestra tester permanecen comotencia de fragmentos codificantes en sectores hebras simples. Las moléculas de hebras sim-acotados del genoma, y da información sobre ples y dobles se separan usando cromatogra-la posible función de los candidatos en tejidos fía en hidroxilapatita. Los ADNcs expresadosparticulares. Además, la asociación de los da- diferencialmente pueden entonces ser recu- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 121
  • 123. perados y clonados o usados directamente el display diferencial esto se logra utilizandocomo sondas para analizar una biblioteca. Dos como cebador de la transcripción reversa a unlimitaciones importantes del protocolo original poliT anclado con una o más bases adicionalesson: i) el requerimiento de grandes cantidades al extremo 3´ del ARN mensajero (por ejemplode ARNm y ii) una tendencia a una menor efi- (T)12AC). Estos oligonucleótidos se fijan al ARNciencia en la identificación de transcriptos poco mensajero a través de la unión de las basesabundantes. adicionales, impidiendo que el poliT “resbale” La hibridización substractiva es aplicable sobre distintas zonas del poli A. El único gruposólo a comparaciones de pares de muestras y de ARNms que es transcripto en forma reversadebe ser realizada por duplicado con el tester y es el integrado por las moléculas que llevan lasel driver invertidos para detectar tanto aumen- bases complementarias a las bases adiciona-tos como disminuciones en los niveles de ex- les del poliT en el extremo del mensajero adya-presión. Además no genera una medida cuanti- cente al poliA. En contraste, la RAP-PCR utilizatativa y aunque es eficiente en la identificación oligonucleótidos de secuencia arbitraria para lade genes que están completamente ausentes transcripción reversa. Estos cebadores tienenen el driver no revela fácilmente a aquellos que normalmente 10 bases de largo y se unen aestán presentes en ambas muestras en distinta sus secuencias complementarias permitiendoproporción. Se realizaron modificaciones para formar una hebra de ADNc desde este sitio.mejorar el protocolo original que incluyen la En este caso el subgrupo de ARNms que su-producción de ADNc con marcas de biotina o fre transcripción reversa estará integrado poroligo(dT)30-látex de manera de refinar la se- aquellas moléculas que presenten la secuen-paración de las moléculas de cadena simple cia complementaria a la del cebador orientaday doble. También se incorporó la amplificación en el sentido adecuado.de ADNcs selectos por PCR para disminuir la Luego de haberse realizado la síntesis de lacantidad inicial de ARNm requerido y aumen- primer hebra del ADNc, se amplifican segmen-tar la eficiencia de clonado de los transcriptos tos de los transcriptos usando pares múltiplesseleccionados. También se ha utilizado un pro- de cebadores de PCR. Tanto para el displaytocolo ingenioso conocido como hibridización diferencial como para el RAP-PCR, el cebadorsubstractiva de supresión (SSH) que fue dise- superior es un oligonucleótido arbitrario de 10ñado para favorecer la detección de transcrip- pares de bases. El cebador inferior es el mis-tos raros expresados diferencialmente. Este mo oligonucleótido poliT anclado (para el casoincluye una normalización en la representación del display diferencial) o el decámero arbitrariode los transcriptos diferenciales basada en la (para el caso de RAP-PCR) que se usaron alter-inhibición de la amplificación de aquellos que nativamente para hacer la transcripción rever-son más abundantes, eliminando también la sa. Se ha estimado que los productos de PCRnecesidad de separar moléculas de cadena de 240 combinaciones particulares de pares dedoble y simple (ver Figura 1). cebadores de display diferencial (por ejemplo todas las combinaciones de 20 oligonucleó- Display diferencial y RAP-PCR tidos arbitrarios y 12 oligonucleótidos ancla- Las técnicas conocidas en general como dos) representan estadísticamente a todos los“huellas digitales de ARN” (ARN fingerprinting) ARNm originalmente presentes en la muestra.incluyen al display diferencial (DD) y la PCR Los productos de PCR pueden ser marcadosde ARN cebada arbitrariamente (RAP-PCR). por incorporación de un nucleótido radiactivoAmbos métodos están basados en una am- o de una molécula que pueda ser detectada aplificación por PCR de subgrupos al azar de través de su interacción con un anticuerpo con-transcriptos a partir de dos o más muestras. jugado a un sistema de detección (por ejemploLa primera etapa de ambos procedimientos es digoxigenina). También puede usarse un ce-común y consiste en generar ADNcs haciendo bador unido a un fluoróforo u optarse por nouna transcripción reversa de una fracción de marcar los fragmentos amplificados y usar lue-las moléculas de ARNm de una muestra. En go una tinción con nitrato de plata para revelar122 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 124. cDNA “driver” (en exceso) cDNA “tester” con el adaptador 1 cDNA “tester” con el adaptador 2 Primera hibridización a b c d Segunda hibridización: mezcado de muestras, agregado de “driver” desnaturalizado y anillado a, b, c, d + e Rellenado de los extremos a b c d e Agregado de los cebadores + Amplificación por PCR a , d no hay amplificación b´ b® b´ no hay amplificación c amplificación lineal e amplificación exponencial Figura 1.los geles. La visualización de los productos de la otra, o aquellos que están presentes con di-PCR se logra luego de la electroforesis en ge- ferentes intensidades relativas en los distintosles de poliacrilamida seguida de la apropiada tratamientos experimentales, representan po-generación y detección de imágenes, que son tenciales transcriptos de ARNm de expresiónevaluadas comparando la intensidad relativa diferencial. Típicamente, las bandas son eva-de las bandas producidas a partir de diferentes luadas sólo si amplifican en forma consistentemuestras experimentales. Los fragmentos que en reacciones de PCR duplicadas para cadaestán presentes en una muestra y ausentes en muestra (ver la Figura 2). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 123
  • 125. Muestra de RNA 1 Muestra de RNA 2 )A n (A)A )A (A A)A A) A) n (n A A(n A A)A A A ( AA AA AA AA A( (n A A n AA AA A n A AA A)A(n AA A)A( nAA A A AAA(A)nA AAA(A)nA A)A( AA AAA A n A AA (A) A A)A( nAA ( nAA AAA n A)AAA A( AAA(A AA (A) A A n) )n A ( nA n AA A)A AA AA A(A (A (A )n A AA )A )A n n A A A(A An ) Transcripción reversa usando cebador ancla del tipo 5’T(T)nTXY3’ Muestra de cDNA 1 Muestra de cDNA 2 PCR usando el cebador ancla 5’T(T)nTXY3’ y un decámero al azar Muestra 1 Muestra 2 Figura 2. La fase final del display diferencial consiste casos debe realizarse un alineamiento de lasen la identificación de la secuencia del trans- imágenes de los fragmentos de amplificacióncripto representado por el producto de PCR y con el gel de poliacrilamida seco. En los casosla confirmación de que éste realmente se ex- en que se utiliza tinción con nitrato de plata nopresa en forma contrastante. Estas etapas se es necesario realizar este paso, por lo cual lalogran localizando físicamente y escindiendo la recuperación de la banda es mucho más efi-sección del gel de poliacrilamida que contiene ciente. Los productos de PCR son purificadosal producto de interés. En la mayoría de los del gel y reamplificados. Para ello el fragmento124 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 126. de poliacrilamida se procesa en fragmentos pe- de la secuencia. Sin embargo, es probable quequeños con un bísturí que se transfieren a una distintos alelos o incluso diferentes miembrossolución tampón adecuada para la elución de de una familia génica hibridicen en conjunto enlos fragmentos. Luego de una centrifugación, el experimento de Northern, o que los diseñosel sobrenadante se purifica con fenol/clorofor- de cebadores para real time PCR no permitanmo y el ADN se precipita con etanol, se diluye diferenciarlos. También puede ocurrir que enen agua y se reamplifica por PCR. los experimentos de DD se detecte una he- Se han utilizado varias estrategias para bra antisentido sobreexpresada en una de lasconfirmar la expresión diferencial de los trans- muestras. Si la hebra sentido está expresadacriptos, que incluyen el uso de los fragmentos en la otra, los experimentos de real time nocomo sondas de Northern, la siembra de los permitirán la detección de la expresión diferen-fragmentos en membranas para someterlos a cial. Estos son sólo algunos de los muchos ca-análisis de Northern inverso y el clonado y se- sos posibles en los cuales el northern y la PCRcuenciación de los productos para diseñar ce- en tiempo real no reproducirán los datos debadores específicos que permitan realizar PCR DD, pero no precisamente porque el DD hayasemicuantitativas, así como también la hibridi- generado un falso positivo, sino simplementezación in situ de tejidos. porque estas técnicas están basadas en prin- Dos ventajas importantes de los métodos cipios de detección diferentes. Muchos de losde fingerprinting de ARN con respecto a los de supuestos “falsos positivos” detectados por DDhibridización substractiva son la capacidad de en el pasado (cuando no se tenía concienciacomparar muestras experimentales múltiples sobre la frecuencia de la expresión antisenti-en forma simultánea y la de identificar genes do) pueden englobarse seguramente en estasque están regulados tanto positiva como ne- categorías.gativamente en una muestra respecto de las Otro problema es que estas técnicas debenotras. Sin embargo, los métodos de fingerprin- aplicarse en general a muestras provenien-ting de ARN comparten con el SSH la limitación tes del mismo individuo sometido a distintasde que no son cuantitativos. condiciones o sobre individuos genéticamen- Uno de los problemas que suelen atribuirse te idénticos (por ejemplo isolíneas). Cuandoa display diferencial es la amplificación de fal- se comparan los perfiles de ARNm de indivi-sos positivos o sea fragmentos de genes que duos diferentes genéticamente, pueden apare-parecen estar diferencialmente expresados cer falsos positivos que son resultado de unapero son luego cosiderados artefactos de PCR amplificación diferencial debida a una varia-porque no pueden validarse por Northern blot ción en la secuencia de los transcriptos máso PCR en tiempo real. Es necesario dar una que a diferencias en su representación. Esemirada más detallada a este punto. Es cierto problema puede ser evitado utilizando estra-que es imprescindible realizar las amplificacio- tegias de análisis de segregantes en grupones de DD PCR por duplicado o triplicado para (BSA) aplicadas al estudio de perfiles de ARN.asegurarse que la amplificación es reproduci- Finalmente, la investigación de todos los ge-ble y no se trata de una banda espuria. Pero nes que potencialmente se expresan en formauna vez superado este punto de la reproduci- diferencial requiere el uso de equipamiento debilidad de la amplificación, hay que considerar última generación y una inversión extensiva deque no siempre las diferencias detectadas con tiempo y trabajo para detectar y confirmar laesta técnica pueden ser validadas por Northern expresión diferencial de cada uno de los geneso por PCR en tiempo real. Por ejemplo, cuando individuales.existe expresión alélica diferencial entre mues-tras, o cuando diferentes miembros de una Polimorfismos en el largo de los fragmen-misma familia génica son expresados diferen- tos de ADNc amplificados (ADNc-AFLP)cialmente, es posible que se detecten polimor- La tecnología de AFLP, generalmente utili-fismos en los geles de DD, como consecuencia zada para producir huellas genéticas de DNAde que los primers se unan a sitios variables genómico, puede ser aplicada también a pre- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 125
  • 127. paraciones de ADNc de doble hebra para ob- de adaptadores de cadena doble a los extre-tener un perfil del transcriptoma. Los patrones mos de los fragmentos de restricción, iv) ampli-obtenidos por esta técnica son una herramien- ficación de un subgrupo de los fragmentos deta confiable y eficiente para la identificación de restricción usando dos cebadores complemen-ARNms expresados diferencialmente. La téc- tarios al adaptador que llevan bases selectivasnica de ADNc-AFLP detecta fragmentos de adicionales en el extremo 3´ v) electroforesisrestricción de DNA por medio de amplificación de los fragmentos de restricción amplificadospor PCR. Comprende las siguientes etapas: i)generación de ADNc, ii) restricción del ADNc en geles de poliacrilamida, vi) visualización decon dos endonucleasas específicas, preferible- las huellas digitales genéticas mediante el usomente una que reconoce sitios de 6 bases y de autoradiografías, fosfoimágenes y otros mé-otra que reconoce sitios de 4 bases, iii) ligación todos (ver Figura 3). mRNA AAAAAAAAAAAAAn(A)A TTTTTTTTTTTTTT Cebador Oligo dT AAAAAAAAAAAAAn(A)A TTTTTTTTTTTTTT Síntesis de cDNA cDNA Digestión con las endonucleasas de restricción Ligación de los adaptadores Preamplificación con los cebadores Amplificación selectiva de fragmentos XY YX XY YX Huella digital (Fingerprint) Figura 3.126 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 128. Las mayores ventaja del uso de la tecno- normalizadas para ecualizar la abundancialogía de ADNc-AFLP son: i) no se requiere de clones que corresponden a los diferentesinformación previa de secuencia; ii) se puede transcriptos. Los EST secuenciados a partirestudiar una fracción muy grande de todos los de estas últimas pueden ser comparados paragenes expresados, iii) es una técnica muy sen- identificar transcriptos que se expresan en unasible que permite la detección de transcriptos biblioteca y están completamente ausentes ende baja abundancia, iv) los fragmentos son ex- otra, pero si se pretende obtener datos cuanti-traídos fácilmente de los geles y las secuen- tativos exactos que describan abundancia re-cias correspondientes pueden determinarse lativa se debe recurrir indefectiblemente a bi-sin necesidad de clonados previos. bliotecas de ADNcs no normalizadas. También existen productos comerciales que permiten la Etiquetas de secuencia expresadas construccion de bibliotecas donde los transcrip-(Expressed sequence tags, ESTs) tos han sido amplificados pero manteniendo la La secuenciación exhaustiva de ESTs proporción relativa de unos respecto a otros,(Expressed Sequence Tags) es considerado lo que facilita la comparación cuantitativa entreprincipalmente un método para la caracteriza- muestras.ción de la expresión génica, a pesar de que la Las ESTs requieren de varias etapas de pro-generación de ESTs resulta también importan- cesamiento, ensamblado en grupos (contigs)te para deducir la presencia de genes no pre- y anotación para que se pueda extraer infor-dichos en ausencia de datos genómicos. Las mación biológica a partir de las mismas. ParaESTs son obtenidas a gran escala por secuen- esto, resulta muy importante el almacenamien-ciación de una sola hebra de clones de ADNc to, la organización y la anotación de estas se-(aproximadamente 500 pb) provenientes de cuencias utilizando distintas herramientas in-bibliotecas que representan distintos tejidos o formáticas (revisadas por Nagaraj et al., 2007).condiciones experimentales. Las ESTs repre-sentan descripciones parciales de las regiones Análisis serial de la expresión de genesque se transcriben de un genoma. Una canti- (SAGE)dad creciente de centros de investigación han El análisis serial de la expresión de genesconstruído y secuenciado bibliotecas de ADNc (SAGE) consiste esencialmente en una versiónen los últimos años. Esta tendencia se ve refle- acelerada de la secuenciación de ESTs. Estájada en el número de ESTs depositadas en la basada en el concepto de que una etiquetabase de datos del NCBI (ESTdb), el que al 6 de corta de unas pocas bases es suficiente paraJunio de 2008 es de 2994249 provenientes de identificar inequívocamente a un transcripto,261 especies de plantas. siempre y cuando esté ubicada en una posición En teoría, la abundancia de una EST es di- definida dentro de la secuencia del mensajero.rectamente proporcional a la representación en Una etiqueta SAGE consiste típicamente ennúmero de copias de un transcripto en un teji- 9-14 bases de secuencia ubicadas por debajodo determinado. El proceso de generación de del último sitio de reconocimiento de una en-ESTs es relativamente lento y costoso, lo que donucleasa específica en el transcripto blanco.hace difícil que se logre la saturación de una Múltiples etiquetas SAGE se ligan juntas en unbiblioteca. Teóricamente, si se secuencia el nú- vector de clonado de manera que una reacciónmero suficiente de ESTs, este método permite de secuenciación de 300 a 500 pb genera lasanalizar incluso aquellos genes que presentan secuencias de 20 a 30 etiquetas al mismo tiem-niveles de expresión bajos, pero si el número po (ver Figura 4). Como cada etiqueta SAGEde secuencias obtenidas es limitado conviene representa un único transcripto de ARNm, esrecurrir a técnicas de amplificación comple- posible obtener una visión general de todosmentarias (ADNc-AFLP o DD) para detectar los genes expresados en la muestra original.transcriptos poco abundantes. Las diferencias en la expresión de genes en- Las secuencias ESTs a menudo se generan tre muestras experimentales pueden entoncesa partir de bibliotecas de ADNc que han sido ser identificadas comparando la abundancia Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 127
  • 129. AAA(A)nA TTT(T)n T AAA(A)nA TTT(T)n T AAA(A)nA TTT(T)n T Corte con la “enzima ancla” (EA) Unión a esferas de estreptavidina AAA(A)nA TTT(T)n T AAA(A)nA TTT(T)n T AAA(A)nA TTT(T)n T División a la mitad y añadido de los adaptadores A y B CATG AAA(A)nA CATG AAA(A)nAA GTAC TTT(T)n T B GTAC TTT(T)n T CATG AAA(A)nA CATG AAA(A)nA A GTAC TTT(T)n T B GTAC TTT(T)n T CATG AAA(A)nA CATG AAA(A)nA A GTAC TTT(T)n T B GTAC TTT(T)n T Corte con la “enzima de etiquetado” (ET) GGATGCATGXXXXXXXXX GGATGCATGOOOOOOOOO Cebador A CCTACGTACXXXXXXXXX Cebador B CCTACGTACOOOOOOOOO TE AE Etiqueta (tag) TE AE Etiqueta (tag) Ligación y amplificación con los cebadores A y B Cebador A GGATGCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGCATCC Cebador B CCTACGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACGTAGG Etiqueta doble (ditag) Corte con la “enzima ancla” (ET), purificación de las “ditags”, concatenado y clonado CATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATG GTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTAC AE Tag 1 Tag 2 AE Tag 3 Tag 4 AE Ditag Ditag Figura 4.relativa de etiquetas SAGE específicas en dife- ca su abundancia en la muestra en estudio. Arentes bibliotecas. Los genes o las secuencias diferencia de los microarreglos, la técnica deESTs representados por las etiquetas SAGE SAGE permite detectar transcriptos de los cua-son localizados en las bases de datos detec- les no se conoce su secuencia previamente atando aquellos transcriptos que tengan la eti- la realización del experimento, es decir es unaqueta SAGE en la posición adecuada. técnica conocida como “abierta” (pueden reco- Esta técnica se utiliza para identificar y cuan- nocerse genes nuevos).tificar transcriptos. Fue descripta por primera A partir de un experimento de SAGE se pue-vez por Velculescu y colaboradores en 1995 den obtener unos 50.000 a 100.000 fragmen-(ver bibliografía recomendada). Brevemente, tos, los que representan de 20.000 a 40.000se utiliza una enzima de restricción tipo II (en- genes únicos. Estos fragmentos brindan infor-zima de etiquetado) que libera fragmentos de mación cualitativa de los transcriptos detecta-entre 9 y 14 pb a partir de los ADNc previa- dos, mientras que el número de copias de cadamente digeridos con otra enzima de restricción uno de ellos brinda información cuantitativa y(la más comúnmente utilizada es NlaIII). Estos refleja la abundancia de los transcriptos en lafragmentos son luego ligados entre si para muestra. Generalmente se observa que algu-formar un concatémero que es clonado y se- nos de los fragmentos detectados por SAGEcuenciado. Los fragmentos detectados en una presentan más de 100 copias, otros entre 2 ymuestra representan a los transcriptos que los 100 copias y la mayoría de ellos (70-80%) seoriginaron y su frecuencia de detección indi- encuentran en copia única. En la mayoría de128 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 130. los casos se observa que entre el 50-70% de del transcripto tales como las resultantes delos fragmentos presentan similitud con genes splicing alternativo o SNPs presentes en la eti-o transcriptos de función conocida, mientras queta pueden resultar en distintos fragmentosque entre 30-50% no son similares a ninguna que en realidad se correspondan con un mis-secuencia conocida. Es esperable que estos mo gen), experimentales (artefactos introduci-porcentajes que son usuales actualmente se dos en las secuencias como consecuencia demodifiquen en el futuro a medida que aumente la técnica utilizada) y por redundancia de trans-el número de genes caracterizados y la canti- criptos. Las bases de datos de referencia sedad de etiquetas promedio secuenciadas por construyen con secuencias que son altamenteproyecto. redundantes. Las mismas son agrupadas en Se ha observado una especificidad relativa- función de la homología de secuencias, lo quemente alta de un fragmento de entre 9 y 14 pb puede originar que se encuentren transcriptospara su asociación con transcriptos conocidos que corresponden a un mismo gen en gruposen el caso de genomas relativamente simples. distintos (como en el caso de que hubiera spli-Sin embargo, la especificidad disminuye cuan- cing alternativo) o que se agrupen transcriptosdo se estudian genomas más complejos. Se correspondientes a genes distintos porque pre-han hecho intentos para mejorar la especifi- sentan un alto grado de homología de secuen-cidad aumentando el largo de los fragmentos. cia. Es importante mencionar que las bases deLongSAGE aumenta el largo de los fragmentos datos de referencia pueden ser incompletas,a 21 pb y SuperSAGE a 26 pb, utilizando dife- debido a que comúnmente se incluyen en lasrentes enzimas de etiquetado. Esta estrategia mismas secuencias de alta calidad y anotadasmejoró la especificidad de un dado fragmento para aumentar la especificidad. Sin embargo,para representar a un transcripto único (aun- esta estrategia disminuye en gran medida elque no completamente) y también la probabi- número de transcriptos representados en lalidad de que dicho fragmento se localice una base de datos. Esto origina que muchos deúnica vez en el genoma. Sin embargo, el hecho los fragmentos obtenidos por SAGE sean cla-de trabajar con fragmentos más largos aumen- sificados como desconocidos incluso cuandota los costos de secuenciación de la técnica. sus transcriptos correspondientes hayan sidoPor estos motivos, el usuario debe considerar previamente identificados. Además, un mismocuidadosamente cuál es la longitud de los frag- fragmento puede presentar homología con másmentos a utilizar para cada caso particular. de un gen, lo que presenta un desafío adicional Los fragmentos obtenidos mediante SAGE para la clasificación de los mismos. Por todosno se pueden utilizar directamente en bús- estos motivos, es necesario verificar la asigna-quedas de homología con secuencias conteni- ción de un fragmento mediante otras técnicas.das en bases de datos debido a que son muy Entre las más utilizadas se pueden mencionarcortos. Para poder asignar un gen a un dado el RACE (Rapid Amplification of ADNc Ends)fragmento es necesario contar con una base y GLGI (Generation of Long ADNc from SAGEde datos de referencia construida previamen- tags for Gene Identification).te. Esta base de datos contiene información de Los fragmentos obtenidos por SAGE puedenfragmentos obtenidas in silico a partir de se- organizarse en tres grupos: de alta, intermediacuencias conocidas de transcriptos o de genes y baja abundancia. Sin embargo, no se ha ana-de la especie en estudio. Si un fragmento aisla- lizado exhaustivamente aún si el número dedo experimentalmente presenta homología con copias de un fragmento obtenido por SAGEuna secuencia presente en la base de datos refleja exactamente en todos los casos la can-SAGE de referencia, entonces se considera tidad de ARNmensajero real contenida en laque el transcripto que lo originó proviene del muestra. Dado que el SAGE involucra numero-gen que había sido asignado a esa secuencia. sas amplificaciones por PCR, pueden originar-La confiabilidad de la asignación de genes uti- se errores específicos para un dado fragmento.lizando estas bases de datos está influenciada Además se ha observado que las secuenciaspor factores biológicos (por ejemplo, isoformas obtenidas por esta técnica presentan un ma- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 129
  • 131. yor contenido de G+C, lo que sugiere una pre- dad de la técnica se ve reflejada en su ampliaferencia de amplificación que compromete la variedad de aplicaciones que abarca desdeexactitud de la cuantificación. el análisis de expresión génica hasta estu- Dos ventajas importantes del SAGE sobre dios de ADN genómico (como Comparativela hibridización substractiva y el display dife- Genomic Hybridization - CGH- y Chromatinrencial es que los datos obtenidos son cuan- Immunopurification microarrays - conocidostitativos y acumulativos. Si se genera la sufi- como ChIP-chips). Sin embargo, en este ca-ciente cantidad de información de secuencia pítulo sólo describiremos los microarreglos dese obtienen perfiles exactos de la expresión de ADNc y de oligonucleótidos, ya que son los máslos transcriptos, que describen la abundancia utilizados para el análisis del transcriptoma.de todos los genes expresados en una célula Los microarreglos de ADN pueden ser crea-o tejido. Existe una base de datos pública de dos de dos maneras: fijando las moléculas deexpresión génica que ha sido creada para el ácidos nucleicos sobre una superficie sólida oalmacenamiento y análisis de secuencias de por síntesis in situ de oligonucleótidos. En elSAGE cuyo poder continuará creciendo a me- primer caso las moléculas de ADN pueden serdida que se contribuya con más información. ADNcs amplificados por PCR, oligonucleótidosOtra característica de los datos de SAGE es o fragmentos de ADN genómicos clonados enque pueden complementar otros de ESTs ge- BACs (Bacterial Artificial Chromosomes).nerados a partir de bibliotecas de ADNc nor- La utilización de clones de ADNc amplifica-malizadas o substraídas. Los ESTs brindan in- dos por PCR como sondas es el método deformación de secuencia mientras que el SAGE elección cuando se interrogan muestras de or-provee datos cuantitativos describiendo la ganismos cuyo genoma no está secuenciado.abundancia de los transcriptos. Finalmente, a Estos microarreglos son generalmente fabrica-pesar de que el SAGE requiere capacidad de dos utilizando robots. Los mismos contienensecuenciación de última generación, la canti- un cabezal de puntas que es sumergido endad de datos que aporta puede ser 20 veces soluciones de sondas de ADN disueltas en elmayor que el que posibilita la misma cantidad buffer correspondiente y que luego son depo-de secuenciación EST. sitadas sobre un sustrato de vidrio modificado químicamente. Las puntas se cargan de sonda Hibridización de microarreglos por capilaridad y la tensión superficial entre el Los microarreglos han revolucionado la bio- buffer y el vidrio actúa para descargar las son-logía molecular. Esta técnica utiliza cientos a das. Las perturbaciones en la estructura de lasmiles de sondas altamente organizadas sobre descargas son frecuentes y son una fuente sig-una superficie sólida para interrogar de mane- nificativa de variación de la señal. Si bien exis-ra simultánea a todas las moléculas de ARN ten otras alternativas, la utilización de robots(definidas como blancos) contenidas en una es la más popular debido a su disponibilidad,muestra biológica. Las muestras a ser analiza- alta flexibilidad y bajos costos. Los sustratosdas se marcan fluorescentemente o radiactiva- inertes sobre los cuales se depositan las son-mente y se aplican al microarreglo. Los ácidos das son variados. Los portaobjetos de vidrionucleicos marcados hibridan con las moléculas cubiertos con poli-L-lisina fueron gradualmentede ADN complementarias que se encuentran reemplazados por sustratos con aminosilanoinmovilizadas en el microarreglo. La fuerza de comerciales debido a su mayor consistenciala señal fluorescente o radiactiva capturada por en cuanto a la morfología de las descargas.las sondas de ADN en el arreglo es detectada y Para este tipo de químicas, las sondas sondigitalizada para su cuantificación. inicialmente unidas por atracción electrostáti- Los microarreglos fueron originalmente dise- ca y luego fijadas por ligación cruzada (cross-ñados para identificar diferencias de expresión linking) al sustrato mediante radiación UV ogénica en dos muestras distintas basadas en calor. Posteriormente se introdujeron sustratoslas cantidades relativas de blancos unidos a reactivos y sondas modificadas que permitenuna sonda determinada en el arreglo. La utili- una mayor discriminación de secuencia debido130 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 132. Muestra prueba Muestra de referencia Transcripción reversa y marcaje con fluoróforos Clones de DNA Impresión robótica Hibridización al microarreglo Laser 2 Excitación Laser 1 Emisión Análisis computacional Figura 5.a que hay un único punto de unión y una mayor Originalmente, las sondas de ADN eran di-retención de la sonda al sustrato. También se sueltas en soluciones con alto contenido dehan desarrollado otros sustratos para producir sales. Luego se introdujo la utilización de de-señales más intensas y que demanden me- tergentes para mejorar la morfología de lasnores cantidades de sondas. Para lograrlo se descargas. Sin embargo, algunos investigado-aumentó la cantidad de grupos reactivos sobre res informaron que la presencia de detergen-la superficie. Esto se puede lograr cubriendo tes resulta en un mayor arrastre de la sondalos portaobjetos con dendrímeros, mezclas de y una mayor variabilidad entre una deposiciónepoxisilano y aminosilano o con polímeros que y la siguiente. La utilización de soluciones dese auto-absorben. descarga conteniendo agentes higroscópicos Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 131
  • 133. permitió mejorar la estructura de los puntos y dos al desarrollo de nuevas tecnologías, van aaumentar las intensidades de señal obtenidas. permitir reducir los niveles de variabilidad sis-La desventaja de la utilización de aditivos hi- temáticos resultantes de la fabricación de losgroscópicos es que producen aumentos en el microarreglos.área ocupada por la sonda, sin embargo, este La mayoría de los laboratorios ensayan laefecto se puede reducir disminuyendo la velo- calidad de sus microarreglos antes de reali-cidad del robot o aplicando micro-vibraciones zar los experimentos de hibridación con lasde las puntas. Disminuir la temperatura de la muestras biológicas de interés. Generalmentecámara del robot donde se generan los mi- se controla la bondad de la impresión y se de-croarreglos y utilizar soluciones hidrofóbicas tectan errores tales como puntos que no estáncontribuye también a reducir el tamaño prome- bien formados, aquellos de tamaños mayoresdio de las descargas. La variedad de solucio- a los deseados o faltantes. Los puntos puedennes de descarga que existe sugiere que no ser visualizados utilizando tinturas fluorescen-hay un tipo de solución que resulte ideal para tes de unión a ADN. También se pueden em-todas las aplicaciones y que la elección de la plear métodos más precisos como son la hi-misma depende en gran medida del tipo de mi- bridación con mezclas de oligonucleótidos alcroarreglo que se quiere construir. Las puntas azar de 9-mer marcados fluorescentemente ode los cabezales que se utilizan son normal- con oligonucleótidos marcados que hibridizanmente de acero inoxidable o de titanio y contie- con secuencias marcadoras cortas que estánnen un capilar generado mediante descargas presentes en todas las sondas de ADN deleléctricas o la utilización de un láser. Se ob- microarreglo. Para controlar la calidad de laserva una variación sistemática en la extensión producción de microarreglos es recomendablede la descarga, porque ésta es una función del desarrollar, documentar y emplear protocolosformato de la punta, y existe variabilidad du- estándar (Standard Operating Procedures-rante la fabricación de las mismas. Se han de- SOPs). Se pueden encontrar ejemplos de lossarrollado nuevas tecnologías para solucionar mismos en la página http://www.flychip.org.uk.este problema como por ejemplo la generación Esta práctica no solamente aumenta la con-de puntas de cerámica más uniformes. sistencia entre experimentos dentro de un la- La evaporación durante el proceso de impre- boratorio, sino que facilita la transferencia desión de los microarreglos es la principal causa información entre laboratorios.de variabilidad. La evaporación reduce el vo- El segundo método posible para la construc-lumen de solvente en las microplacas de 384 ción de microarreglos es la síntesis de oligo-pocillos y dentro del reservorio capilar de las nucleótidos in situ, inicialmente desarrolladapuntas, lo que produce un aumento de concen- por Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, EEUU).tración de las sondas y altera las caracterís- Este método usa una conjunción de fotolitogra-ticas de la solución de descarga. Como con- fía y de química combinatoria que resulta ensecuencia de esto, las propiedades del punto la síntesis de chips de ADN de alta densidad.sembrado y la distribución de la sonda de ADN También NimbleGen (NimbleGen, Madison,dentro del área del mismo se modifican. Este EEUU), Xeotron (Xeotron, Houston, EEUU) yproblema se puede solucionar en parte regu- Febit (Febit, Mannheim, Alemania) han desa-lando las condiciones de humedad y tempera- rrollado otros procesos para lograr la síntesistura dentro de la cámara del robot donde se de oligonucleótidos in situ. Todos estos pro-realiza la impresión de los microarreglos. Dado cesos se basan en la utilización de radiaciónque existen numerosas interacciones entre UV. En cambio Combimatrix (Combimatrix,los distintos componentes del proceso, no es Mukilteo, EEUU) usa electroquímica localiza-sencillo predecir en forma exacta cómo va a da. En el caso de Affymetrix se logra la síntesisresultar la combinación entre una solución de in situ mediante fotoactivación y desprotecciónsiembra y un sustrato determinados. Sin em- de ácidos nucleicos. Se utilizan fotomáscarasbargo, se están realizando constantemente es- para dirigir la radiación UV a sectores espe-tudios para examinar este proceso que, suma- cíficos del microarreglo, de modo de lograr132 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 134. la síntesis en forma selectiva. En el caso de secuencia. Por lo tanto, los estudios de expre-NimbleGen, Xeotron y Febit, todos ellos usan sión usando arreglos de tipo “tejado” permitenmétodos que no requieren la utilización de fo- obtener una visión mucho más completa deltomáscaras. En este caso, la radiación UV es transcriptoma y de su relación con el genoma.dirigida mediante miles de espejos regulables La necesidad de descripciones precisas dey el ADN es sintetizado utilizando nucleótidos experimentos de microarreglos para permitir elmodificados con fosfoamidita. En el caso de almacenamiento de los datos experimentalesCombiMatrix, numerosos microelectrodos son y su análisis posterior ha originado la creaciónutilizados para sintetizar distintas moléculas de del “Minimum Information About a MicroarrayADN en paralelo. La reacción química para la Experiment (MIAME) Standard” (MIAMEsíntesis de oligonucleótidos ocurre en el área Standard). Al igual que con las secuencias deque rodea a cada microelectrodo a la que se ADN o con las estructuras de proteínas, essuele denominar “vaso virtual” (virtual flask). cada vez más común el requerimiento de en- Una estrategia para estudiar la expresión gé- viar los resultados a bases de datos de estenica de todo un genoma es la detección de la tipo antes de su publicación. Estos estándaresactividad transcripcional completa de los cro- son necesarios para permitir que la informaciónmosomas usando “arreglos solapados o en te- esté públicamente disponible en un formatojado” (tiling arrays). En este caso, en lugar de único, y también para uniformar la nomenclatu-utilizar sondas específicas para cada gen, el ra empleada lo que hace posible la integracióngenoma completo incluyendo regiones intergé- y comparación de resultados obtenidos de dis-nicas está representado en el arreglo. Además tintas fuentes. MIAME administra descripcio-de detectar transcriptos estos chips permiten nes técnicas detalladas (plataforma utilizada, métodos de marcación e hibridación, mediciónrealizar hibridaciones comparativas de geno- de datos y diseño del arreglo), pero no proveemas para detectar deleciones y polimorfismos, información relevante específica del organismoestudiar los perfiles de metilación y analizar en estudio que es necesaria para comprendermuestras de inmunoprecipitación de cromati- el experimento planteado. Por este motivo, sena. Affymetrix desarrolló los primeros arreglos diseñó la base MIAME/Plant, la que incluye de-de este tipo para Arabidopsis. Los estudios talles biológicos para describir experimentosrealizados utilizando arreglos de tipo “tejado” de microarreglos realizados en plantas.permiten la identificación de numerosos sitios El análisis de los datos originados en un mi-transcripcionalmente activos que no habían croarreglo resulta mucho más laborioso que susido detectados mediante algoritmos predicti- generación. En el mismo se consideran la hipó-vos y/o en colecciones de ADNc. Muchos de tesis de trabajo y los objetivos experimentalesestos nuevos transcriptos son expresados a para lograr identificar a los genes candidatospartir de la hebra complementaria y en antisen- en las condiciones de estudio. El análisis puedetido con respecto a transcriptos anotados pre- dividirse en dos fases: 1) el procesamiento deviamente. O sea, mientras que en determina- datos y 2) la identificación de genes de interésdos tejidos y/o condiciones se expresa la hebra y la interpretación biológica de los resultados.sentido, en otros se transcribe la antisentido. El procesamiento de los datos incluye la de-Sumado a esto, también se demostró que las terminación del nivel de ruido, la cuantificaciónregiones centroméricas presentan actividad de las señales fluorescentes, el examen de latranscripcional en ambos sentidos resultando calidad de los datos, la eliminación de los erro-esta observación sorprendente, ya que hasta res técnicos y la normalización de los datos. Lahace muy poco tiempo atrás se suponía que identificación de los genes candidatos incluyeen estas regiones no había transcripción ac- la reducción del volumen de la información ativa. Esta metodología permite asimismo el un nivel manejable y más fácil de visualizar, elestudio del metiloma, de las regiones de ADN reconocimiento de patrones de expresión es-regulatorias, del procesamiento alternativo de pecíficos y la interpretación del significado bio-ARN y del descubrimiento de polimorfismos de lógico de los mismos. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 133
  • 135. Conclusiones sión. Las colecciones de ESTs presentan alta Los métodos descriptos en este capítulo son especificidad para los transcriptos en estudiotecnologías eficaces que expanden los estu- pero baja sensibilidad para aquellos de esca-dios de expresión desde los genes únicos has- sa abundancia. La técnica de SAGE disminuyeta el nivel del transcriptoma completo. Ninguno el largo secuenciado por transcripto lo que au-de estos procedimientos per se es óptimo para menta la velocidad de relevamiento, pero estatodas las aplicaciones y la mejor estrategia simplicidad resulta en una alta sensibilidadpara situaciones específicas puede ser crear pero a costa de una menor especificidad. Unacombinaciones de varios de ellos. El continuo comparación de las características de cadarefinamiento de las técnicas de transcriptómica técnica se presenta en la Tabla 1.y de la bioinformática relacionada proporciona- La combinación de la información genera-rá a los investigadores nuevas herramientas da por la transcriptómica (nivel y localizaciónpara estudiar la expresión de la información he- espacio/temporal de la expresión génica) y lareditaria y lograr un mejor entendimiento sobre de los proyectos de secuenciación de geno-el control genético de los procesos fisiológicos. mas (secuencias completas de los genes y sus Cada plataforma empleada actualmente para promotores) permite realizar asociaciones deestudiar el transcriptoma tiene sus ventajas y expresión y homología estructural que en mu-desventajas. Por ejemplo, los microarreglos chos casos facilitan la inferencia de la posibleson una técnica de alto rendimiento pero sólo función de los genes identificados. Por supues-se pueden aplicar a transcriptos de secuencia to esto constituye una instancia inicial en laconocida. Los métodos de ADNc- AFLP y DD definición de la función de cada gen. Para de-son abiertos, es decir permiten detectar ge- terminar su rol preciso deben hacerse estudiosnes noveles y son especialmente útiles cuan- particulares en general dirigidos a bloquear odo se trabaja fuera de los modelos, pero son aumentar su expresión por ingeniería genéticacualitativos o semicuantitativos y requieren de y a modificar estructuralmente la molécula deun complemento de PCR en tiempo real para manera de alterar la actividad de los diferentesvalidar y cuantificar las diferencias de expre- dominios de la proteína que codifica.Tabla 1: Comparación de los principales métodos de relevamiento del transcriptoma. Características SAGE/ESTs Microarreglos DD/cDNA- Hibridización AFLP sustractiva Detecta transcriptos conocidos Sí Sí Sí Sí Detecta transcriptos desconocidos Sí No Sí Sí Detecta transcriptos con splicing Sí Sí o no Sí No alternativo Detecta transcriptos antisentido Sí Sí o no Sí Sí Cuantificación Absoluta Relativa Relativa Relativa Sensibilidad Alta Moderada Alta Alta Especificidad Moderada Alta Moderada Moderada Reproducibilidad Buena para Buena para datos Requiere Buena para transcriptos obtenidos con la realización de transcriptos abundantes misma plataforma duplicados o abundantes triplicados Comparable entre si Buena para Buena para Buena para Buena para transcriptos transcriptos transcriptos transcriptos abundantes abundantes abundantes abundantes Costo Más alto que el de 5-10 veces menor Muy bajo Muy bajo microarreglos que el de SAGE Adaptado de Wang 2006 understanding SAGE data, Trends in Genetics.134 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 136. Para maximizar el potencial de la transcrip- transcripts induced by phytohem-aglutinin andtómica es necesario un cambio de paradigma phorbol 12-myristate 13-acetate. Anal. Biochem.respecto a la interpretación de los resultados 240:90–97.obtenidos en este tipo de experimentos. Este Liang, P., A. B. Pardee. 1992. Differential display of eukaryotic messenger ARN by means of thecambio de paradigma implica comprender que polymerase chain reaction. Science (Wash DC)los datos de expresión no están libres de erro- 257:967–971.res y aceptar que la variabilidad biológica es- Meyers B.C., Galbraith, D.W., Nelson T. and Agraw-pacio-temporal es una parte inherente y cuan- al, V. 2004. Methods for transcriptional profilingtificable de este tipo de experimentos. A pesar in plants. Be fruitful and replicate. Plant Physiol.,de que los continuos cambios en la expresión 135, 637-652.de genes en tiempo y espacio colocan al inves- MIAME Standard: http://www.mged.org/Work-tigador en un escenario de arenas movedizas, groups/MIAME/miame.htmles mucha y muy relevante la información que Moody D. E. 2001. Genomics techniques: an over-puede obtenerse de este tipo de estudios. Esta view of methods for the study of gene expres- sion. J. Anim. Sci. 79 (E. Suppl.): E128-E135.transición en la interpretación de los resultados Nagaraj S.H., Gasser R.B. and Ranganathan S.será más fácil si se delinea claramente la dife- 2007. A hitchhiker’s guide to expressed se-rencia entre proponer una función biológica a quence tag (EST) analysis. Brief Bioinform., 8,partir de simples datos de expresión y postu- 6-21.lar una hipótesis que debe luego validarse en NimbleGen: http://www.nimblegen.combase a datos experimentales concretos. Okubo, K., N. Hori, R. Matoba, T. Niyama, A. Fu- kushima, Y. Kojima, K. Matsubara. 1992. Large Biblografía Recomendada scale ADNc sequencing for analysis of quantita- tive and qualitative aspects of gene expression.Adams, M. D., J. M. Kelley, J. D. Gocayne, M. Dub- Nat. Genet. 2:173–179. nick, M. H. Poly-meropoulos, H. Xiao, C. R. Me- Rensink W.A. and Buell C.R. 2005. Microarray ex- rril, A. Wu, B. Olde, R. F. Moreno. 1991. Comple- pression profiling resources for plant genomics. mentary DNA sequencing: expressed se-quence Trends in Plant Science, 10, 603-609. tags and human genome project. Science (Wash Sargent T. D., I. B. Dawid. 1983. Differential Gene DC) 252:1651–1666. expression in the gastrula of Xenopus laevis.Affymetrix: http://www.affymetrix.com Science (Wash DC) 222: 135-139.Combimatrix: http://www.combimatrix.com Schena M., D. Shalon, R. W. Davis, P. O. Brown.Davis, M. M., D. I. Cohen, E. A. Nielsen, M. Stein- 1995. Quantitative monitoring of gene expres- metz, W. E. Paul, L. Hood. 1984. Cell-type-spe- sion patterns with a complementary DNA micro- cific ADNc probes and the murine 1 region: the array. Science (Wash DC) 270:467–470. localization and orientation of Ad. Proc. Natl. Velculescu, V. E., L. Zhang, B. Vogelstein, K. W. Acad. Sci. USA 81:2194–2198. Kinzler. 1995. Serial analysis of gene expres-Diatchenko, L., Y.-F. C. Lau, A. P. Campbell, A. sion. Science (Wash DC)270:484–487. Chenchik, F. Moqa-dam, B. Huang, S. Lukyanov, Venkatasubbarao S. 2004. Microarrays – status and K. Pukyanov, N. Gurskaya, E. D. Sverdlov, P. D. prospects. Trends in Biotechnology, 22, 630-637. Siebert. 1996. Suppression subtractive hybridi- Welsh, J., K. Chada, S. S. Dalal, R. Cheng, D. zation: A method for generating differentially reg- Ralph, M. McClelland. 1992. Arbitrarily primed ulated or tissue-specific ADNc probes and librar- PCR fingerprinting of ARN. Nucl. Acids Res. ies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:6025–6030. 20:4965–4970.Febit: http://www.febit.com Xeotron: http://www.xeotron.comGregory B.D., Yazaki J. and Ecker J.R. 2008. Utiliz- Zimmermann P., Schildknecht B., Craigon D., ing tiling microarrays for whole-genome analysis Garcia-Hernandez M., Gruissem W., May S., in plants. The Plant Journal, 53, 636-644. Mukherjee G., Parkinson H., Rhee S., WagnerGurskaya, N. G., L. Diatchenko, A. Chenchik, P. U. and Hennig L. 2006. MIAME/Plant – adding D. Siebert, G. L. Khaspekov, K. A. Lukyanov, value to plant microarray experiments. Plant L. L. Vagner, O. D. Ermolaeva, S. A. Lukya- methods, 2:1. nov, E. D. Sverdlov. 1996. Equalizing ADNc subtraction based on selective suppression of polymerase chain reaction: cloning of Jurkat cell Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 135
  • 137. I Capítulo 9 Luego de la separación electroforética, se lleva a cabo la tinción de los geles y el aná-Proteómica lisis de las imágenes para visualizar y cuan- tificar cada proteína. Los métodos de tinciónPaula Casati y María F. Drincovich utilizados van desde los más convencionales, como la tinción con azul de Coomassie o ni- trato de plata, hasta métodos más sensibles 1. Introducción como la tinción fluorescente. Por otro lado han La proteómica, entendida como el estudio sido desarrollados recientemente varios com-del patrón proteico de una célula u órgano, puestos fluorescentes que permiten múltiplesse encuentra ya en su segunda década como tinciones de un mismo gel, técnica que permitecampo de estudio. Durante la primera década, la tinción y visualización de diferentes gruposla mayor parte de los estudios se realizaron de proteínas o diferentes subproteomas (porprincipalmente mediante el uso de geles en dos ejemplo, el fosfoproteoma o el glicoproteoma)dimensiones seguidos de técnicas de tinción de manera secuencial en un mismo gel. La se-convencionales. Si bien estos métodos conti- paración en geles bidimensionales puede darnúan siendo utilizados de manera importante, lugar a un mapa proteico complejo, y algunasdurante esta segunda década otros métodos veces la reproducibilidad de estos geles puedemás sensibles y que además presentan mayor ser problemática debido a la naturaleza diversareproducibilidad han comenzado a ser utiliza- de las distintas proteínas, sumado a la tarea dedos. Estas técnicas han sido clasificadas como identificar el mismo punto proteico en distintos“proteómica cualitativa”. Muchos de estos mé- geles. Esto se debe a que cuando se realizantodos están siendo aplicados en experimentos estudios comparativos es necesario analizarde biología vegetal. Por ejemplo, la electrofore- múltiples geles que pueden contener 1000sis bidimensional DIGE (del inglés, differential puntos proteicos cada uno. Así, a pesar del usogel electrophoresis) y el marcado isotópico de de programas avanzados para el análisis deproteínas y péptidos, son técnicas utilizadas en geles 2D, se requiere una validación manual fi-la actualidad para el estudio de diversos pro- nal. Existen distintos paquetes de computaciónteomas. En el presente capítulo se describen para el análisis de las imágenes que permitenprimero los métodos utilizados en proteómica asistir con la substracción del ruido de base,en la actualidad, seguido de una descripción la detección de los puntos proteicos, el ajustede las aplicaciones de estas técnicas en la bio- de las imágenes, la detección e identificaciónlogía de plantas. de puntos entre geles, y la cuantificación me- diante un análisis estadístico. Los geles bidi- 2. Electroforesis en dos dimensiones mensionales son una herramienta para la reso- El procedimiento más utilizado para los es- lución y visualización de isoformas proteicas,tudios de proteómica es la separación elec- productos de degradación y modificacionestroforética por isoelectroenfoque (IEF) de las postraduccionales; además de permitir el cál-proteínas seguido de una segunda separación culo empírico de la masa molecular, punto iso-en gel de poliacrilamida en presencia de SDS eléctrico y niveles de expresión. Las limitacio-(SDS-PAGE). Esta técnica se denomina co- nes de la técnica son la no automatización, lamúnmente electroforesis bidimensional (2D), dificultad para resolver proteínas de membranadonde las proteínas se separan en base a su y proteínas muy básicas o ácidas.carga y masa molecular. Los avances recien- Una técnica que aumenta la sensibilidad ytes en la resolución del IEF gracias al uso de disminuye la variabilidad que existe entre dis-geles comerciales en tiras han aumentado la tintos geles es la llamada electroforesis diferen-reproducibilidad y la resolución de los geles 2D cial en gel o DIGE. En esta técnica, las mues-en proteómica. En particular, la disponibilidad tras proteicas se preincuban con compuestosde tiras comerciales de diferentes tamaños y