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Biotecnologìa y mejoramiento vegetal ii   levitus, echenique, hopp
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Biotecnologìa y mejoramiento vegetal ii levitus, echenique, hopp

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  • 1. AuspiciosArgenBio es el Consejo Argentino para la Información y Desarrollo de laBiotecnología. Es una organización sin fines de lucro que tiene como misión divulgar Biotecnologíainformación sobre la biotecnología, contribuyendo a su comprensión a través de laeducación y estimulando su desarrollo. y Mejoramiento Vegetal IIConsideramos prioritario el apoyo a iniciativas relacionadas con la biotecnología ydirigidas a la comunidad educativa de todos los niveles. En este sentido, este libro Editores:cubre una necesidad importante ya que aporta información completa y actualizada Gabriela Levitus, Viviana Echenique,sobre las tecnologías de laboratorio que se aplican al mejoramiento vegetal, escrita Clara Rubinstein, Esteban Hopp y Luis Mroginskipor especialistas y en idioma español.Confiamos en que tanto estudiantes con profesionales encontrarán en este libro unaexcelente fuente de información. Consejo Argentino para la InformaciónPara conocer más sobre ArgenBio, visitar www.argenbio.org y el Desarrollo de la Biotecnología Ediciones Instituto Nacional de INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA ARGENBIO - Consejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología Tecnología Agropecuaria
  • 2. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II Editores: Dra. Gabriela Levitus, Dra. Viviana Echenique, Dra. Clara Rubinstein, Dr. Esteban Hopp Ing. Agr. Luis Mroginski. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 1
  • 3. 2 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 4. ÍndicePrefacio ............................................................................................................................... 6Agradecimientos ................................................................................................................ 7Lista de Autores .................................................................................................................. 7Prólogo a la Primera Edición. Dr. Francisco García Olmedo ............................................. 11Prólogo a la Segunda Edición. Dr. Francisco García Olmedo ........................................... 11Parte I: Herramientas Básicas ........................................................................................... 15Capítulo 1: Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. Luis Mroginski, Pedro Sansberroy Eduardo Flaschland ………………………………………………………………………………………. 17Capítulo 2: Morfogénesis. Silvia Radice .………………………………………………….………………. 26Capítulo 3: La citogenética molecular e inmunocitogenética en el estudio de los genomas ve-getales. Guillermo Seijo, Graciela I. Lavia, Germán Robledo, Aveliano Fernández y Viviana G. SolísNeffa. .................................................................................................................................................. 34Capítulo 4: Herramientas básicas de ingeniería genética. Ingrid Garbus, Marisa Gómez y Vi-viana Echenique. ................................................................................................................................ 47Capítulo 5: Marcadores moleculares. María Carolina Martínez, Marcelo Helguera y Alicia Carrera. 70Capítulo 6: Construcción de mapas de ligamiento genético, localización de genes y regionescromosómicas asociadas a caracteres de interés en plantas. Gerardo D. L. Cervigni, Juan Pa-blo A. Ortiz y Sergio E. Feingold. ......................................................................................................... 86Capítulo 7: Genómica. Viviana Echenique, Juan P. Selva, Mauro Meier, Pablo Roncallo y GustavoSchrauf. .............................................................................................................................................. 100Capítulo 8: Transcriptómica. Silvina Pessino y Silvina Felitti. .......................................................... 121Capítulo 9: Proteómica. Paula Casati y María F. Drincovich ............................................................. 136Capítulo 10: Metabolómica. Fernando Carrari, Telma E. Scarpeci, Luciano A. Abriata, Alejandro J.Vila y Estela M. Valle. ......................................................................................................................... 146Capítulo 11: Metagenómica. O. Mario Aguilar y Daniel H. Grasso. ................................................... 157Capítulo 12: Bioinformática aplicada a la biotecnología vegetal. Norma Paniego, Ruth Heinz,Paula Fernández, Verónica Lia, Corina Fusari. ................................................................................... 170Parte II: Métodos para generar y analizar diversidad 183Capítulo 1: Polinización y fertilización in vitro. Susana Cardone, Gladys Pérez Camargo y AuroraPicca. .................................................................................................................................................. 185Capítulo 2: Hibridación somática. Pablo Polci y Pablo Friedrich. .................................................... 197 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 3
  • 5. Capítulo 3: Epigenética y evolución. Ricardo W. Masuelli y Carlos F. Marfil .................................. 211Capítulo 4. Mutagénesis, TILLING y EcoTILLING. Alberto Prina, Alejandra Landau, María GabrielaPacheco y Esteban Hopp ................................................................................................................... 217Capítulo 5: Variación somaclonal. Susana Cardone, Sofía Olmos y Viviana Echenique. ............... 229Capítulo 6: Aplicación de la transformación genética al mejoramiento vegetal. Marina L. Díaz,Diego C. Zappacosta, Pascual M. Franzone y Raúl D. Ríos ............................................................... 243Capítulo 7: Usos del silenciamiento génico para el análisis funcional de genes candidatos.Cecilia Vázquez Rovere, Ariel Bazzini, Cecilia Rodríguez, Natalia Almasia y Sebastián Asurmendi .. 259Capítulo 8: Análisis de experimentos biológicos. Sofía Olmos, Miguel DiRenzo, Mercedes Ibá-ñez, Nélida Winzer .............................................................................................................................. 271Capítulo 9: Métodos multivariados para estimar variabilidad genética. Nélida Winzer, MiguelDiRenzo, Sofía Olmos y Mercedes Ibáñez. ......................................................................................... 283Parte III: Métodos para acelerar programas de mejoramiento e identificación varietal 295Capítulo 1: Obtención de plantas doblehaploides. Pablo Polci, Verónica Conti y Rubén Miranday Nicolás Gear. .................................................................................................................................... 297Capítulo 2: Aplicaciones de los marcadores moleculares. Alicia Carrera, Gabriela Tranquilli, An-tonio Garayalde y Marcelo Helguera. .................................................................................................. 311Capítulo 3: Marcadores moleculares y mejoramiento genético de cultivos. Carlos Sala, Maria-no Bulos, Analía Fresco y Emiliano Altieri. .......................................................................................... 325Capítulo 4: Identificación y registro de variedades. Ana Laura Vicario, Marcelo Labarta y MaríaAlicia Loray ......................................................................................................................................... 339Parte IV: Métodos de propagación y conservación de germoplasma 351Capítulo 1: Micropropagación. Sofía Olmos, Gabriela Luciani y Ernestina Galdeano .................... 353Capítulo 2: Semilla sintética. Hebe Rey y Luis Mroginski ................................................................. 363Capítulo 3: Conservación de germoplasma in vitro. Adriana Scocchi y Hebe Rey. ....................... 369Parte V: Ejemplos de aplicaciones de la biotecnología vegetal 377 Capítulo 1: Aportes de la citogenética al estudio de genomas vegetales. Lidia Poggio, Gra-ciela González, María Rosa Ferrari, Ana María García, Arturo Wulff, Eduardo Greizerstein, PabloTomas y Gustavo Schrauf. .................................................................................................................. 379Capítulo 2: Mejoramiento de plantas forrajeras en la era genómica. Germán Spangenberg,Mauro Meier y Viviana Echenique ....................................................................................................... 389 Capítulo 3: Caracterización molecular de la apomixis y su aplicación en la agricultura. Silvi-na C. Pessino y Juan Pablo A. Ortiz .................................................................................................... 403Capítulo 4: Avances de la biotecnología en cultivos ornamentales. Alejandro S. Escandón, Pa-blo A. Marinangeli y Mariana Pérez de la Torre. .................................................................................. 4214 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 6. Capítulo 5: Aplicación de la biotecnología en la mejora y conservación de especies forestales.Susana Marcucci Poltri, Leonardo Gallo, Noga Zelener, Susana Torales, Sandra Sharry .................... 435Capítulo 6: Técnicas de ingeniería genética para conferir resistencia a virus en plantas. Maria-na del Vas, Ana Julia Distéfano, Cecilia Vázquez-Rovere, Esteban H. Hopp. ..................................... 447Capítulo 7: Obtención de plantas resistentes a enfermedades bacterianas. Adrián Vojnov, Mer-cedes Rivero y Diego Zappacosta ....................................................................................................... 457Capítulo 8: Aproximaciones biotecnológicas para un manejo sustentable del estrés fúngicoen la agricultura. Juan Carlos Díaz Ricci; Ursula Tonello; Gustavo Martínez-Zamora; Sergio Sala-zar; Nadia Chalfoun; Gabriel Vellicce; Carlos Grellet; Paula Filippone; Alicia Mamani; Marta Ontiveroy Atilio Pedro Castagnaro. ................................................................................................................... 467Capítulo 9: Utilización de cultivos de tejidos para la obtención y conservación de plantas li-bres de enfermedades. Vilma Conci. ................................................................................................ 481Capítulo 10: Obtención de plantas resistentes a insectos. Dalia Lewi y Clara Rubinstein ............... 495Capítulo 11: Aplicaciones biotecnológicas al manejo de malezas. Germán Ferrari y Julio E. De-lucchi. .................................................................................................................................................. 507Capítulo 12: Obtención de plantas tolerantes a distintos tipos de estreses abióticos. Florenciadel Viso, Andrea F. Puebla, Néstor Carrillo y Raquel L. Chan ............................................................. 519Capítulo 13: Manipulación genética del metabolismo secundario en plantas. Alicia Zelada, Ma-ría Binaghi ........................................................................................................................................... 529Capítulo 14: Mejoras de calidad en alimentos. Clara Rubinstein, Gabriela Levitus ............................. 539Capítulo 15: Fitorremediación. María Eugenia Segretín, Paula Bey y Alejandro Mentaberry ............. 545Capítulo 16: Plantas como biorreactores. Fernando Bravo Almonacid, Sonia Wirth, María EugeniaSegretin, Mauro Morgenfeld, Ezequiel Matías Lentz. ......................................................................... 559Parte VI: Manejo responsable de la tecnología 569Capítulo 1: Criterios científicos para la evaluación de la bioseguridad de Organismos Genéti-camente Modificados. Clara Rubinstein ........................................................................................... 571Capítulo 2: Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados - Marcos Regulatorios.Moisés Burachik .................................................................................................................................. 583Capítulo 3: Flujo génico y su posible impacto ambiental. Mónica Poverene, Soledad Ureta yAgustina Gutiérrez. ............................................................................................................................. 595Capítulo 4: Detección de OGM en la cadena agroalimentaria. Florencia Longo y Ana Vicario. ....... 603Capítulo 5: Manejo integrado de plagas – Programa de Refugios. Viviana Confalonieri y CeciliaRoca. ................................................................................................................................................... 613Capítulo 6: Resistencia de malezas a herbicidas: evolución y estrategias de manejo. DanielTuesca, Luisa Nisensohn, Mario R. Sabbatini, Guillermo Chantre. ..................................................... 621Parte VII: Biotecnología y sociedad 631Capítulo 1: La transformación tecnológica y los nuevos desafíos. Carmen Vicién. .......................... 633 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 5
  • 7. Capítulo 2: Adopción de los cultivos genéticamente modificados en Argentina y en el mun-do. Gabriela Levitus ......................................................................................................................... 639Capítulo 3: Biotecnología en la mira: el problema de la percepción. Valeria Durand ............... 6436 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 8. PREFACIO En oportunidad de la Primera Edición de “Biotecnología y Mejoramiento Vegetal”, nos habíamospropuesto responder a la necesidad de un texto en idioma español, dirigido a docentes y estudian-tes de los cursos de Agronomía y de otras formaciones relacionadas con las tecnologías aplicadasal mejoramiento vegetal, así como brindar un recurso de información general y consulta para noespecialistas. Esta Segunda Edición, intenta actualizar, profundizar y extender estas temáticas,atendiendo a la rápida evolución en este campo del conocimiento. En el contexto de los principios básicos del mejoramiento, es decir, generar variabilidad genéti-ca y seleccionar características deseables, las tecnologías evolucionan rápidamente y, del mismomodo, se acelera la transferencia del conocimiento básico a las aplicaciones. Esta edición intentareflejar este proceso dinámico y aportar información actualizada con ejemplos de aplicaciones almejoramiento de diferentes especies vegetales. En este trabajo se han reunido las contribuciones de investigadores y especialistas en diferentescampos relacionados con el mejoramiento. En las secciones dedicadas a las herramientas básicas,se ha hecho foco en las técnicas de cultivo de tejidos y micropropagación que se utilizan en sí mis-mas para generar variabilidad, conservar germoplasma, producir clones libres de enfermedades ocomo paso obligado en la construcción de plantas transgénicas. En la sección que se ocupa de lasaplicaciones de estas técnicas a casos específicos, se brindan ejemplos de mejoramiento logradoen diferentes especies. La tecnologías “omicas” (genómica, transcriptómica, metabolómica) constituyen una de las herra-mientas más importantes en el mejoramiento, por la potencialidad que presentan, tanto en el campode la investigación básica, en el mapeo de genes y la identificación de marcadores moleculares,como en la identificación de funciones y redes regulatorias que influyen en las características que sedesean mejorar: resistencia a enfermedades y plagas, rendimiento, calidad nutricional y respuestasa diferentes tipos de estrés ambiental, entre otras. Es claro que dentro de las tecnologías de mejoramiento, la transgénesis o transformación ge-nética es una de las herramientas más versátiles y poderosas, ya que permite resolver problemasque por vía del mejoramiento convencional no sería posible enfrentar. En esta edición se presentannumerosos ejemplos de transgénesis para la obtención de cultivos tolerantes a estrés biótico yabiótico, a plagas y enfermedades o con mejoras en su calidad nutricional. Desde 1996, cuando se cultivaron por primera vez, la superficie mundial de cultivos transgénicosaumentó 80 veces, alcanzando las 134 millones de hectáreas en 2009. Según el último informe delISAAA (Servicio Internacional para las Adquisiciones Agrobiotecnológicas) estas hectáreas fueroncultivadas por 14 millones de agricultores de 25 países, siendo Argentina uno de los líderes enadopción, con el 16% del área global. Por otro lado, es importante notar que se han establecido sistemas de control a nivel internacionalpara regular el desarrollo y la aplicación de la ingeniería genética al mejoramiento de organismosvivos (conocidos como organismos genéticamente modificados u OGMs). Si bien éstos no se limitana plantas, en este trabajo se presentan sólo los aspectos regulatorios y de bioseguridad relaciona-dos con los cultivos transgénicos. Esperamos que esta nueva edición constituya una herramienta útil y accesible para docentes,estudiantes y profesionales que se dedican y se dedicarán a la noble tarea de mejorar la agricultura. Los Editores Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 7
  • 9. AGRADECIMIENTOSA todos y cada uno de los 141 autores, en su mayoría investigadores y profesionales de institu-ciones argentinas, que han contribuido con sus aportes.Al Dr. Francisco García Olmedo, reconocido investigador y catedrático español, por regalarnostambién el prólogo de esta segunda edición.Al Consejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología (ArgenBio), por aus-piciar la publicación del libro.A los revisores, colegas y personal de apoyo, por sus valiosas contribuciones para concretar esteproyecto. Los EditoresEl uso de fuentes y nombres comerciales en este documento es sólo para fines de identificacióny no implica ningún aval ni recomendación. Además, los contenidos u opiniones expresadas enesta publicación son de exclusiva responsabilidad de los autores.LISTAS DE AUTORES (por orden alfabético)Abriata Luciano A. Instituto de Biotecnología, INTA CastelarAguilar O. Mario IBBM, Facultad de Ciencias Exactas, UNLPAlmasia Natalia Instituto de Biotecnología, INTA CastelarAltieri Emiliano Nidera SemillasAsurmendi Sebastián Instituto de Biotecnología, INTA CastelarBazzini Ariel Instituto de Biotecnología, INTA CastelarBey Paula INGEBI, CONICETBinaghi María Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBABravo Almonacid Fernando INGEBI, CONICETBulos Mariano Nidera SemillasBurachik Moisés Dir. de Biotecnología, Min. de Agricultura, Ganadería y PescaCardone Susana Facultad de Agronomía, UBACarrari Fernando Instituto de Biotecnología, INTA CastelarCarrera Alicia Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurCarrillo Néstor IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNRCasati Paula CEFOBI, Universidad Nacional de RosarioCastagnaro Atilio Pedro EEAOC, TucumánCervigni Gerardo D. CEFOBI, Universidad Nacional de RosarioChalfoun Nadia INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánChan Raquel L. Universidad Nacional del LitoralChantre Guillermo CERZOS, CONICET, Universidad del SurConci Vilma INTA – IFFIVEConfalonieri Viviana Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA)Conti Verónica INTA-EEA Bordenavedel Vas Mariana Instituto de Biotecnología, INTA Castelardel Viso Florencia Instituto de Biotecnología, INTA CastelarDelucchi Julio E. Monsanto Argentina8 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 10. Díaz Marina L. CERZOS, CONICET, Universidad del SurDíaz Ricci Juan Carlos INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánDiRienzo Miguel Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de CórdobaDistéfano Ana Julia Instituto de Biotecnología, INTA CastelarDrincovich María F. CEFOBI, Universidad Nacional de RosarioDurand Valeria Ketchum Argentina - ArgenBioEchenique Viviana Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurEscandón Alejandro S. Instituto de Floricultura, INTA CastelarFeingold Sergio E. INTA - EEA BalcarceFelitti Silvina Universidad Nacional de RosarioFernández Aveliano Fac. Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE IBONEFernández Paula Instituto de Biotecnología, INTA CastelarFerrari Germán Monsanto ArgentinaFerrari María Rosa Universidad Nacional de Buenos AiresFilippone Paula EEAOC, TucumánFlaschland Eduardo Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) – IBONEFranzone Pascual M. IGEAF INTA CastelarFresco Analía Nidera SemillasFriedrich Pablo Universidad Nacional del SurFusari Corina Instituto de Biotecnología, INTA CastelarGaldeano Ernestina Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) – IBONEGallo Leonardo INTA - EEA BarilocheGarayalde Antonio CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurGarbus Ingrid CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurGarcía Ana María Facultad de Agronomía, UBAGarcía Olmedo Francisco Universidad Politécnica de MadridGear Nicolás SyngentaGómez Marisa CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurGonzález Graciela Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAGrasso Daniel H. Instituto de Suelos, INTA CastelarGreizerstein Eduardo Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBAGrellet Carlos INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánGutiérrez Agustina Universidad Nacional del SurHeinz Ruth Instituto de Biotecnología, INTA CastelarHelguera Marcelo INTA EEA Marcos JuárezHopp Esteban Instituto de Biotecnología, INTA CastelarIbáñez Mercedes Universidad Nacional de Río CuartoLabarta Marcelo Instituto Nacional de Semillas – INASELandau Alejandra Instituto de Biotecnología, INTA CastelarLavia Graciela I. Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONELentz Ezequiel M. INGEBI, CONICETLevitus Gabriela ArgenBioLewi Dalia IGEAF INTA CastelarLia Verónica Instituto de Biotecnología, INTA CastelarLongo Florencia Instituto de Biotecnología, INTA CastelarLoray María Alicia Dirección de Calidad - INASELuciani Gabriela CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurMamani Alicia INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánMarcucci Poltri Susana Instituto de Biotecnología, INTA CastelarMarfil Carlos F. INTA - EEA MendozaMarinangeli Pablo A. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurMartínez Ma. Carolina Instituto de Biotecnología, INTA Castelar Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 9
  • 11. Martínez-Zamora Gustavo INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánMasuelli Ricardo W. INTA - EEA MendozaMeier Mauro CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurMentaberry Alejandro Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAMiranda Rubén Asociación Cooperativas Argentinas (ACA), Univ. del SurMorgenfeld Mauro INGEBI, CONICETMroginski Luis Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) – IBONENisensohn Luisa Universidad Nacional de RosarioOlmos Sofía Laboratorio de Biotecnología, INTA PergaminoOntivero Marta INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánOrtiz Juan Pablo Facultad de Ciencias Agrarias, UNRPacheco Ma. Gabriela IGEAF INTA CastelarPaniego Norma Instituto de Biotecnología, INTA CastelarPérez Camargo Gladys Facultad de Agronomía, UBAPérez de la Torre Mariana Instituto de Floricultura, INTA CastelarPessino Silvina C. Facultad de Ciencias Agrarias, UNRPicca Aurora Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurPoggio Lidia Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAPolci Pablo Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurPoverene Mónica Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurPrina Alberto IGEAF INTA CastelarPuebla Andrea F. Instituto de Biotecnología, INTA Castelar Radice Silvia INTA CastelarRey Hebe Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONERíos Raúl D. IGEAF INTA CastelarRivero Mercedes Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBARobledo Germán Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONERoca Cecilia Dow AgrosciencesRodríguez Cecilia Instituto de Biotecnología, INTA CastelarRoncallo Pablo CERZOS, CONICETRubinstein Clara Monsanto Argentina – ILSISabbatini Mario R. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurSala Carlos Nidera SemillasSalazar Sergio INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánSansberro Pedro Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONEScarpeci Telma E. IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNRSchrauf Gustavo Facultad de Agronomía, UBAScocchi Adriana Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONESegretin Ma. Eugenia INGEBI, CONICETSeijo Guillermo Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONESelva Juan P. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurSharry Sandra Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de La PlataSolís Neffa Viviana G. Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) – IBONESpangenberg Germán Victorian Department of Primary Industries (DPI)Tomas Pablo FCA, Universidad Nacional del LitoralTonello Ursula INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumánTorales Susana IRB, INTA CastelarTranquilli Gabriela IRB, INTA CastelarTuesca Daniel Facultad de Ciencias Agrarias, UNRUreta Soledad CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurValle Estela M. IBR - Facultad de Cs Bioquímicas y Farmaceuticas, UNRVázquez Rovere Cecilia Instituto de Biotecnología, INTA Castelar10 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 12. Vellicce Gabriel EEAOC, TucumánVicario Ana Laura Dirección de Calidad – INASEVicién Carmen Facultad de Agronomía, UBAVila Alejandro J. IBR - Facultad de Cs Bioquímicas y Farmaceuticas, UNRVojnov Adrián Fundación Pablo CassaráWinzer Nélida Universidad Nacional del SurWirth Sonia INGEBI, CONICETWulff Arturo Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAZappacosta Diego C. Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del SurZelada Alicia Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAZelener Noga IRB, INTA CastelarPRÓLOGOSPrólogo a la primera edición Recientemente, un periodista, que compartía una ensalada con un biólogo, exclamó: ¡Si yosólo aspiro a que la lechuga que yo tenga que consumir no tenga genes! Cuando el biólogo leexplicó que al comer ésta no había más opción que engullir unos 25.000 genes del genoma deLactuca sativa y varios miles de genes adicionales correspondientes a los genomas de los mi-croorganismos que habitual y cómodamente habitan en la superficie de las turgentes hojas, elperiodista quedó atónito. Según un eurobarómetro de hace unos meses, más de dos tercios de los europeos estaban encontra de los alimentos transgénicos. Sin embargo, en la misma encuesta se incluía una aseve-ración - los tomates normales no tienen genes, los transgénicos sí - frente a la que también másde dos tercios de los encuestados se mostraban de acuerdo o confesaban su ignorancia. Es unalástima que dicho eurobarómetro no registrara la proporción correspondiente al encabezamiento“no saben, pero sí contestan”, aunque es fácil colegir que dicha fracción era alta y en extremovergonzante. Los avances del conocimiento biológico y de la biotecnología destacan en el panorama cien-tífico-técnico de este fin de siglo y han impregnado las más diversas vertientes de nuestra vidacotidiana sin que se haya aceptado que un mínimo de estos conocimientos debería formar parteintegral de la cultura general. La ignorancia de los hechos básicos relativos a nuestra herenciagenética o a nuestra alimentación se considera incluso de buen tono. Esto se refleja de entradaen el caos semántico que se ha creado en torno a la biotecnología, del que hay que culpar nosólo a la ignorancia del ciudadano sino también a la torpeza de los científicos y a la dictadura delos medios de comunicación. Es preciso despejar este caos si queremos entendernos a partir dela ciencia, y no a sus espaldas. Términos tales como organismos genéticamente modificados (OGMs), alimentos transgéni-cos, ingeniería genética, ADN recombinante, transferencia génica, clonación, alimentos natura-les, mejora genética e, incluso, biotecnología, han invadido nuestro lenguaje cotidiano sin ordenni concierto. A estas alturas empieza a ser difícil normalizar la situación, pero tratemos de con-tribuir a ello. La definición de biotecnología abarca a todas las tecnologías mediadas por un ser vivo o porpartes de él, sean éstas células o enzimas aisladas. Bajo esta definición se incluyen desde lapropia agricultura, inventada hace diez milenios, y la fabricación de las veinticuatro clases decerveza mesopotámica, que tanto gustaban a Nabucodonosor, hasta la última forma de producir Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 11
  • 13. insulina humana. No es apropiado, por tanto, usar el término de forma restringida para referirseexclusivamente a los últimos avances basados en la biología molecular. Para esto último resultamás adecuado el uso de la expresión “biotecnología molecular”. Prácticamente la totalidad de lo que ponemos en nuestra mesa ha sido genéticamente modifi-cado. La domesticación de plantas y animales supuso una alteración muy drástica de sus geno-mas y la mejora genética subsiguiente ha ido añadiendo modificaciones extensas y sustanciales.Lo importante es la naturaleza de los cambios introducidos y no los métodos empleados paraello. De hecho, la ingeniería genética es sólo uno de esos métodos - una modalidad más de me-jora genética - y sólo sirve para modificar uno o pocos genes de forma muy selectiva. No serviríapara obtener razas de perro tan distintas - en su tamaño, morfología y temperamento - como elChihuahua y el Pit Bull Terrier, que en cambio han surgido de la mano del hombre gracias a losmétodos genéticos más tradicionales. En consecuencia, resulta absurdo denominar OGMs sóloa los productos de la ingeniería genética para contraponerlos a los supuestamente “naturales”. Casi nada de lo que ponemos en nuestra mesa es natural, hasta el punto que la mayoría delos organismos de los que derivamos nuestro alimento han perdido su capacidad de sobrevivirpor sí mismos en la naturaleza. Es más, para llegar a nuestra mesa han debido sufrir alteracionesgenéticas que les priven de infinidad de sustancias naturales que son tóxicas o inhibitorias parael ser humano. Una variedad moderna, modificada por ingeniería genética, está tan lejos de sernatural como las que la precedieron. ¡Por fortuna! Ya que es obvio que natural no es sinónimode inocuo. Se consideran organismos transgénicos aquellos cuyo genoma ha sido alterado por ingenieríagenética o, si se prefiere, por sastrería genética, ya que las operaciones fundamentales de estavía experimental consisten en cortar y coser (unir) piezas de ADN. Un gen es un tramo de ADN(una secuencia construida con las bases A, T, G, C) que, en general, determina una proteína (unasecuencia de aminoácidos), de acuerdo con las equivalencias plasmadas en la clave genética.Mediante la nueva tecnología se puede alterar un genoma por la adición de uno o varios (pocos)genes que previamente no formaban parte de él o por la inutilización de uno o varios genes entrelos ya existentes. Estas operaciones se hacen para conferir caracteres deseables y para eliminarcaracteres indeseables del organismo, respectivamente, objetivos que no difieren de los de lamejora genética tradicional. En lo que difieren la vieja y la nueva tecnología es en el repertorio génico que se puede mane-jar - genes de la misma especie, en el caso de la vieja, y de cualquier especie, en el de la nue-va - y en el modo de introducir y transferir la modificación genética, por vía sexual o por adiciónexógena (transformación), respectivamente. Los organismos modificados por transformación sesuelen denominar transgénicos. Llamar transgénicos a los alimentos derivados de dichos orga-nismos resulta menos apropiado porque, como dice el refrán, “degradado es todo gen que entrapor boca de cristiano”. Es absurdo llamar transgénico al azúcar procedente de una remolachatransgénica, ya que es un producto químico puro, esencialmente indistinguible del aislado de laremolacha normal o de la caña de azúcar. Con acertado criterio, los editores de esta obra han adoptado un tratamiento integral de todoslos métodos, objetivos y logros de la alteración genética de las plantas con fines prácticos. Faltanen nuestro idioma obras que acerquen con rigor a una parte tan importante de nuestra culturageneral. Las adaptaciones a los nuevos avances de textos preexistentes, hechas a menudo porun único autor, suelen adolecer de falta de familiaridad con la nueva tecnología. De aquí que laaproximación adoptada en esta obra, según la cual cada capítulo está a cargo de verdaderosespecialistas, sea la más apropiada en la actualidad. Dr. Francisco García Olmedo, 200412 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 14. Prólogo a la segunda edición La buena fortuna de un libro lleva aparejada la esclavitud de su autor o autores, que quedanencadenados a la necesidad de mantenerlo vivo en sucesivas ediciones. Estamos ante la segundaedición de “Biotecnología y Mejoramiento Vegetal”, un texto que, hace seis años, supuso una es-pléndida y afortunada aportación a la recensión de un área tecno-científica en vigorosa ebullición yde gran relevancia práctica. La necesidad de esta edición surge de múltiples circunstancias, entrelas que cabe resaltar el enorme avance del conocimiento que ha tenido lugar, la redefinición delos retos entonces planteados y la aparición de otros nuevos que han diversificado los objetivosprácticos de la disciplina. Además, entre la aparición de la primera edición y la de esta segunda, haocurrido una crisis alimentaria significativa que no es separable de otras, tales como la económica,la climática o la energética. Según todos los indicios, la crisis alimentaria va a ser duradera y obedece a factores múltiples: lasubida del precio del petróleo, el bajo nivel de reservas, la especulación, el incremento de la pobla-ción y del consumo per capita, el desvío de una parte sustancial de la producción agraria hacia lafabricación de biocombustibles, la disminución de los rendimientos por el estrés debido al cambioclimático y la falta de inversión en innovación agropecuaria. Parece como si el éxito relativo de lasúltimas décadas hubiera hecho bajar la guardia. En particular, la tasa de crecimiento de la producción de alimentos ha ido por detrás de la delcrecimiento de la población durante la última década, justo el tipo de comportamiento relativo quepropuso Malthus hace más de dos siglos. En el último medio siglo, ha sido la mejora genética laque ha tenido el protagonismo técnico en la derrota de la amenaza maltusiana, ya que la superfi-cie de suelo laborable apenas ha crecido. En la actualidad, se ha adquirido de pronto concienciade que no se sabe bien cómo se va a conseguir el aumento de la producción de alimentos en un70-100 % para el año 2050, necesidad que se considera mínima para alimentar una población pro-yectada de unos 9.000 millones de seres humanos que, además, tendrán una demanda per cápitasignificativamente superior a la actual. Si se quiere lograr dicho objetivo, habremos de ser aún máseficaces en las próximas décadas de lo que lo hemos sido en las precedentes. Por supuesto, las respuestas a los retos planteados ni han sido ni serán exclusivamente técni-cas, pero todas las estrategias posibles han tenido y tendrán un importante componente técnico yes sobre este componente sobre el que se centra el libro que ahora se reedita. El cambio climático está alterando los estreses bióticos y abióticos a que deben hacer frente lascosechas, lo que hace prioritaria la investigación básica y aplicada tanto en el esclarecimiento delos mecanismos involucrados como en la adaptación de las cosechas tradicionales a las nuevascondiciones, así como el desarrollo de nuevas cosechas que sean más apropiadas para condicio-nes extremas. La crisis energética ha impulsado un nuevo interés por los biocombustibles, en los que se hancentrado algunas esperanzas infundadas que han dado lugar a la formulación de objetivos políticosque pueden tener consecuencias perjudiciales para la alimentación mundial. Así por ejemplo, losobjetivos declarados para fechas próximas, tanto por lo EEUU como por la UE, están determinandouna competencia por el suelo agrícola de la generación de biocombustibles con la producción dealimentos que no puede sino encarecer significativamente los alimentos y aumentar el número dehambrientos en el mundo, así como contribuir a la destrucción de bosque tropical. Por otra parte,La búsqueda de especies y variedades aptas para la producción de biocombustibles plantea retosformidables a la investigación de su agronomía y a su mejora convencional y biotecnológica. Es en el escenario que a grandes rasgos acabamos de esbozar, donde la presente edición de“Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II” manifiesta su pleno potencial y debe alcanzar su máxi-ma funcionalidad. Dr. Francisco García Olmedo, 2010 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 13
  • 15. 14 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 16. Parte IHerramientas básicas Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 15
  • 17. 16 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 18. I - CAPÍTULO 1 1. Objetivo del cultivo: si bien es difícil tratar de clasificar las aplicaciones que se persiguen con el cultivo de tejidos, se podría esquemati-Establecimiento de cultivos de zarlas en aplicaciones para:tejidos vegetales • Estudios básicos. En este caso, los explan- tes cultivados pueden ser diversos. Si lo únicoLuis Mroginski, Pedro Sansberro y que se quiere lograr es un sistema de callosEduardo Flaschland para estudiar algún proceso fisiológico, se puede cultivar cualquier órgano, tejido o célula 1 Introducción viva. En este caso –en que lo único que se bus- ca es la inducción de callos– lo ideal es cultivar El cultivo de tejidos –en su acepción amplia– explantes jóvenes, derivados de semillas enpuede ser definido como un conjunto muy hete- germinación, donde se obtienen respuestas rá-rogéneo de técnicas que presentan en común pidas y, en general, hay menores problemas deel hecho de que un explante (una parte sepa- contaminación con microorganismos. A vecesrada del vegetal que pueden ser protoplastos – se hace uso del cultivo de tejidos porque repre-células desprovistas de pared celular– células, senta un sistema experimental que simplificatejidos u órganos) se cultiva asépticamente en la complejidad generada por los fenómenosun medio artificial de composición química de- de correlación entre las distintas partes quefinida y se incuba en condiciones ambientales normalmente están presentes en una plantacontroladas. La imprecisión de esta definición entera. El explante que se usará estará condi-puede generar muchas polémicas, pero es ac- cionado por lo que se quiere estudiar. Un buentualmente aceptada. Generalmente es común ejemplo lo constituye el cultivo de ovarios fe-dividir las técnicas del cultivo de tejidos en dos cundados del tomate para estudiar los reque-grandes grupos: a) cultivos en medios semisó- rimientos nutricionales durante el crecimientolidos y b) cultivos en medios líquidos, los que de los frutos. Asimismo, el cultivo de óvulos haa su vez pueden ser agitados (mediante el em- sido muy útil para estudiar aspectos relaciona-pleo de agitadores de uso continuo) o estacio- dos con la formación de las fibras en algodón.narios. También es frecuente dividir al cultivo El cultivo de discos de tallos brindó una valiosade tejidos atendiendo a los niveles de comple- ayuda para estudiar la rizogénesis in vitro.jidad en cultivo de órganos, cultivos celulares y • Obtención de plantas con sanidad contro-cultivo de protoplastos. Para el establecimien- lada. Es muy común la utilización del cultivo deto de los cultivos utilizando cualquiera de los tejidos para la obtención de plantas libres desistemas es necesario tener en cuenta algunos virus (ver VIII.-9). El explante ideal para ello esaspectos generales comunes relacionados con el meristema (dependiendo de la especie, deel explante, la asepsia, el medio de cultivo y 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo ylas condiciones de incubación. La discusión de de un par de primordios foliares.estos aspectos constituye el objetivo de este • Micropropagación. En este caso depende-capítulo. Adicionalmente se incluye el tema de rá del sistema que se quiere utilizar. Si lo quela aclimatación de las plantas regeneradas in se quiere explotar es la brotación de meris-vitro, que es de gran importancia en la mayoría temas, los ápices terminales y los segmentosde las aplicaciones del cultivo de tejidos en la uninodales de ramas jóvenes constituyen ex-agricultura. celentes explantes. En este caso el cultiva- dor de tejidos debe conocer perfectamente la biología de la reproducción de la planta para 2 Explante aprovechar aquellos explantes que en formaVarios factores deben ser tenidos en cuenta natural son propágulos. En cambio, si se pre-en la elección del explante apropiado para el tende micropropagar mediante el empleo deestablecimiento de los cultivos in vitro, entre semillas sintéticas (ver Parte IV, capítulo 2) elellos: explante original deberá posibilitar la inducción Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 17
  • 19. de la embriogénesis somática. En este caso, la • Establecimiento de suspensiones celula-utilización de embriones zigóticos inmaduros u res. En este caso se recomienda iniciar los cul-hojas, suelen ser frecuentes como explantes. tivos a partir de explantes extraídos de semillas • Obtención de híbridos interespecíficos. en germinación (hipocótilo, epicótilo, cotiledo-Una de las primeras aplicaciones del cultivo de nes, raíces).tejidos en la agricultura lo constituyó su empleocomo ayuda para la obtención de híbridos deri- 2. Posibilidad de contaminación con mi- croorganismos. De ser posible, se deben cul-vados de cruzamientos interespecíficos, donde tivar explantes de plantas donantes que crecense produce el aborto temprano de embriones. en condiciones de invernadero, con ello seEn estos casos, el explante cultivado es el reduce sustancialmente las tasas de contami-embrión cigótico en estadios tempranos de su nación. Por otra parte, es recomendable evitardesarrollo. Con la misma finalidad también se el uso de «explantes sucios» (raíces, rizomas)utilizan ovarios u óvulos fecundados. que provienen de plantas crecidas en macetas • Obtención de plantas de semillas con em- o en el campo, dado que en la mayoría de losbriones rudimentarios. Para esta finalidad los casos no es posible conseguir una buena des-explantes pueden ser semillas (por ej. orquí- infección de los mismos.deas) o bien, se aíslan los embriones en un es-tado temprano de desarrollo («corazón») como 3. Edad fisiológica. Este es un aspecto deen el caso de yerba mate o de algunas varieda- gran influencia en la morfogénesis. Como reglades de duraznero. general se puede decir que cuando más joven • Obtención de plantas haploides (consi- e indiferenciado se encuentre el explante a cul- tivar, mejor será su respuesta in vitro. Es porderando como haploide a un esporofito que ello que los meristemas apicales y axilares soncontiene el complemento gamético de cromo- ampliamente usados en numerosas especies.somas). En este caso, los explantes más uti- En el caso de la micropropagación de plan-lizados son las anteras, aunque también pue- tas leñosas, la edad del explante es un factorden emplearse microsporas aisladas, óvulos y crítico. Si los tejidos son jóvenes, la micropro-ovarios no fertilizados. pagación tiene mayores posibilidades de ser • Inducción de variación somaclonal. En este exitosa que con tejidos maduros. Este hechocaso se pueden utilizar varios explantes, pero genera la necesidad de realizar tratamientossi la finalidad de su utilización es la aplicación de rejuvenecimiento de las plantas donantesen planes de mejoramiento genético de plan- de explantes.tas, los explantes utilizados deben posibilitar laregeneración de plantas enteras. 4. Tamaño. En general, cuanto más grande • Producción y/o conversión de sustancias sea el explante mayores serán las posibilida-útiles. Se puede utilizar una gran variedad des de inducir la proliferación de callos o la re-de explantes. Los de raíces suelen ser muy generación directa de órganos. Sin embargo, a mayor tamaño de explante también son ma-utilizados. yores las probabilidades de que los cultivos se • Obtención de híbridos somáticos. Para esta contaminen con microorganismos. También esfinalidad se recurre a la fusión de protoplastos. necesario tener en cuenta que existe un ta-En la mayoría de los casos se aíslan los proto- maño mínimo del explante, que depende de laplastos de mesófilos de hojas y de suspensio- especie y del material vegetal, por debajo delnes celulares. cual no es fácil lograr el establecimiento de los • Conservación e intercambio de germo- cultivos. Los explantes muy pequeños suelenplasma. Los meristemas son los explantes requerir del empleo de medios más complejospreferidos para el desarrollo de sistemas de o de los denominados medios acondicionados.conservación a mediano y largo plazo (crío- 5. Epoca del año. Es un factor que suelenconservación con nitrógeno líquido) y para el tener mucha importancia en la micropropaintercambio de material genético. gación y que generalmente está asociado al18 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 20. grado de dormición que presentan ciertos ex- te –con la ayuda de un microscopio estereos-plantes (yemas, por ejemplo) y también con la cópico– los cultivos en forma periódica (por loposibilidad de mayor o menor proliferación de menos semanalmente). También se puedenmicroorganismos. realizar pruebas con medios de cultivo dife- renciales y «test» bioquímicos específicos. 3 Asepsia Para evitar y/o minimizar las contaminacio- nes de los cultivos con microorganismos es Uno de los principales problemas que se necesario:presentan cuando se tratan de establecer loscultivos es el de la contaminación de los mis- 1) Conocer el material vegetal con que se tra-mos con diversos tipos de microorganismos baja y los posibles contaminantes específicos.(hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, vi-rus). El ambiente generado por explante-medio 2) Realizar una adecuada preparación de lade cultivo-condiciones físicas de incubación planta dadora de explantes, cultivándola pre-es altamente propicio para la proliferación de ferentemente en invernaderos tratadas conmuchos de estos microorganismos que pue- productos químicos que eliminen patógenos yden provocar la destrucción de los cultivos. Es eventuales microorganismos endófitos.difícil cuantificar el impacto de estas pérdidas,pero en promedio, en laboratorios dedicados a 3) Proceder a la desinfección superficial dela micropropagación se lo puede estimar en al- los explantes mediante el uso de compuestosrededor del 10%. En el mejor de los casos, es- químicos con el objeto de eliminar los micro-tos microorganismos no destruyen los cultivos organismos con el menor daño posible parapero compiten con el explante por los nutrien- el explante. Si bien no es posible recomendartes del medio de cultivo o bien lo modifican. un procedimiento general, se puede señalarEs muy difícil conseguir cultivos estrictamen- que el procedimiento más popularizado con-te asépticos dado que en la mayoría de los siste en una doble desinfección mediante lacasos es altamente probable que los mismos inmersión de los explantes en etanol (70%v/v)contengan virus y fitoplasmas, por lo que en durante 20-60 segundos seguido de hipoclo-la práctica, cuando se refiere a cultivos asép- rito de sodio 1 -3%, contenido en el agua deticos, en general se quiere significar que son lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos,cultivos donde no se produce la proliferación dependiendo de la naturaleza del explante.de hongos y bacterias. Algunos procedimientos se basan en el em- Dos son las fuentes de contaminaciones: a) pleo de únicamente etanol o de hipoclorito demicroorganismos presentes en el interior o en sodio. Finalmente, es necesario eliminar losla superficie de los explantes y b) fallas en los restos de estos productos mediante varios la-procedimientos de cultivo en el laboratorio. La vados con agua destilada estéril.correcta detección de estas fuentes y del tipo En este último punto hay que aconsejar quede microorganismo son aspectos importantes se utilice agua destilada estéril de recientepara el éxito de los cultivos, pues por un lado preparación, dado que está demostrado que elayuda a determinar la fuente de contaminación almacenaje prolongado del agua estéril puedey por otro lado, ayuda a la planificación de los ser la causa de contaminaciones con bacte-procedimientos para controlarlos. Varios géne- rias. Es aconsejable realizar estas operacio-ros de bacterias (Pseudomonas, Xanthomonas, nes de desinfección superficial en una cámaraErwinia, Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus, de transferencia con aire estéril. En lugar delMicrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, hipoclorito de sodio se puede utilizar hipoclori-Mycobacterium, Corynebacterium) y de hon- to de calcio (6 -12 %) o el cloruro de mercuriogos filamentosos (Aspergillus, Penicilium, (0,1%- 1,5%). Es preciso recomendar extremaFusarium, Alternaria, Cladosporium y cautela con el empleo de este último compues-Neurospora) están frecuentemente en los cul- to, dado que es altamente tóxico y además notivos. Es conveniente inspeccionar visualmen- es removido con facilidad del explante. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 19
  • 21. En los casos en que no se utilice etanol, la croondas. El agua caliente también puede seradición de agentes tensoactivos junto con el usada. En el caso de sustancias termolábiles,desinfectante es una práctica recomendada. la esterilización se puede hacer mediante fil-Entre los más usados figuran Tween-20 (0,01 tración a través de filtros bacteriológicos.– 0.1%) o unas gotas de Triton. El lavado pre- No es posible recomendar ningún sistemavio de los explantes con agua corriente y de- de esterilización dado que la exitosa destruc-tergentes, ayuda a una mejor desinfección. La ción de los microorganismos depende de múl-inmersión de los explantes en soluciones con- tiples factores entre los que interesan el tama-teniendo sustancias antibióticas y /o antimicó- ño del recipiente, el tiempo de esterilización yticas (gentamicina, sulfato de estreptomicina, la naturaleza de la sustancia a esterilizar. Sinampicilina, tetraciclina, carbenicilina, sulfato de embargo, se pueden dar algunas sugerencias:gentamicina, pentacloronitrobenceno, rifam- • La esterilización en estufas mediante calorpicina, anfotericina B, benomil, carbendazim) seco (aire caliente) es recomendable para es-puede ser de utilidad, pero deben ser utilizados terilizar recipientes de vidrios secos (pipetas,en casos excepcionales. Estos productos tienen cápsulas de Petri, tubos). En estos casos, 2-4el inconveniente de que alteran la composición horas en estufas a 180-200 ºC brindan exce-de los medios de cultivo y además pueden ser lentes resultados.metabolizados por los explantes. • La esterilización con calor húmedo con va- Últimamente han aparecido soluciones bio- por bajo presión (en autoclave o en una «olla acidas que matan bacterias y hongos, previenen presión»). Es el procedimiento más empleadola germinación de esporas y a altas concen- para la esterilización de los medios de cultivotraciones pueden eliminar contaminaciones (salvo, como se indicó más arriba, para aque-de microorganismos endófitos. Uno de estos llos que posean componentes termolábiles).compuestos es el PPM (Plant Preaservative En este caso, lo más común es usar una pre-Mixture). Otro ejemplo es el denominado G-1, sión de 1.46 kg.cm-2 durante 20 minutos, conun compuesto derivado de los furfurales de la lo que prácticamente se destruyen todas lascaña de azúcar. Este compuesto, químicamen- formas de vida. Es importante que en todoste: 1-(5-bromofur-2-il)-2- bromo-2-nitroeteno los puntos del autoclave se alcance dicha tem-fue desarrollado en la Universidad Central de peratura, para lo cual hay disponibles cintaslas Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y detectoras colorimétricas.fungicida de amplio espectro. En los casos en que se utilicen plántulas cre- 5) Cultivar los explantes en una cámara decidas in vitro como plantas donantes de explan- transferencia con aire estéril («gabinete de flu-tes, es necesario desinfectar las semillas para jo laminar»), localizada en un ambiente limpiosu cultivo y germinación y luego es aconsejable y no expuesta a corrientes de aire. De no dis-desinfectar también las plántulas resultantes. poner este equipamiento, se pueden sustituir En algunos materiales vegetales se utiliza con cuartos esterilizados previamente con luzla preincubación de los explantes mediante lo ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV encual éstos son desinfectados suavemente y forma directa). La mesada de trabajo y las pa-precultivados durante 24 horas en un medio redes del gabinete deben ser desinfectadasconteniendo sacarosa, y finalmente son desin- previamente con etanol al 70%. De la mismafectados nuevamente y cultivados. manera deben ser desinfectados exteriormen- 4) Emplear medios e instrumentos de cultivo te todos los recipientes (conteniendo mediosesterilizados, es decir, liberados completamen- de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el áreate de cualquier microorganismo vivo o espo- del aire estéril.ras. Para la esterilización, en la mayoría de los Los operarios constituyen frecuentementecasos se hace uso del calor en sus diversas una importante fuente primaria de contamina-formas: llama directa, calor húmedo (en forma ción, porque es recomendable que, antes dede vapor abierto o bajo presión), calor seco comenzar a trabajar laven sus manos y ante-(aire caliente). Se pueden usar hornos a mi- brazos con abundante agua y jabón y se des-20 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 22. infecten con etanol al 70 %. La utilización de Tabla 1: Composición de tres medios básicosguardapolvos, guantes y máscaras protectoras usados en el cultivo in vitro de tejidos.de la boca y de la nariz, así como los gorros 1 Compuestos Medio básicoprotectores de los cabellos, ayudan a reducir MS N6 B5sensiblemente los niveles de contaminación. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, NH 4NO3 1.650 ----- -----tijeras, agujas, cápsulas de Petri) deben ser KNO 3 1.900 2.830 2.500 KH 2PO4 170 400 -----esterilizados antes de su uso. Muchos de es- CaCl 2.2H 2O 440 166 150tos instrumentos pueden ser colocados en eta- (NH4) 2SO 4 ----- 463 134nol al 95% y, antes de ser usados, se deben MgSO4.7H 2O 370 185 250 NaH 2PO 4.4H 2O ----- ----- 150flamear cuidadosamente en la llama de un me- KI 0,83 0,80 0,75chero. También es necesario flamear la boca MnSO 4.H2O ----- ----- 10,00de los recipientes que contienen los medios de H 3BO 3 6,20 1,60 3,00 MnSO 4.4H 2O 22,30 4,40 -----cultivo antes y después de cultivar el explante. ZnSO 4.7H 2O 8,60 1,50 2,00 6) Incubar los cultivos en cámaras o cuar- Na2MoO 4.2H 2O 0,25 ----- 0,25 CuSO 4.5H 2O 0,025 ----- 0,025tos de cultivo, cerrados, libres de corrientes FeSO 4.7H 2O 27,80 27,85 27,80de aire y bien higienizados. En lo posible se Na2EDTA 37,30 37,25 37,30debe restringir la circulación de personas, y los CoCl 2.6H 2O 0,025 ----- 0,025 Glicina 2,00 2,00 -----recipientes con cultivos contaminados deben Tiamina -HCl 0,10 1,00 10,00ser rápidamente eliminados de este sector. Es Piridoxina -HCl 0,50 0,50 1,00conveniente que antes del lavado, estos culti- Ácido Nicotínico 0,50 0,50 1,00vos sean esterilizados. Mioinositol 100,00 ----- 100,00 Sacarosa 30.000,00 50.000,00 20.000,00 4 Medios de cultivo PH 5,7 5,8 5,5 -1- 1. Un medio de cultivo puede ser definido 1) Composición en mg·Lcomo una formulación de sales inorgánicas y MS = Medio de Murashige y Skoog (Physiol. Plant. 15: 473 - 97. 1962)compuestos orgánicos requeridos para la nu- N6 = Medio de Chu,C.C., Wang,C:C., Sun,C.S., Hsu, C., Yin, K,C.,trición y manipulación de los cultivos. Existen y Chu, C. (Sci. Sinica 18: 6 59- 668. 1975) B5 = Medio de Gamborg, O.L., Miller,R.A. y Ojima, K. (Exp.Cellnumerosas formulaciones, cada una de las Res. 50: 151 - 158. 1968)cuales comprende entre 6 y 40 compuestos.Para dar una idea de la cantidad de formu-laciones disponibles, George y col., luego de • Otros compuestos.revisar más de 3.000 trabajos científicos des-criben en dos tomos (casi 1.000 páginas en to- Fuente de carbono: Prácticamente todos lostal) más de 2.000 medios de cultivo. También cultivos son heterótrofos (comparativamentedos empresas multinacionales ofrecen para la unos pocos son autótrofos) y por ende necesi-venta más de 60 medios cada una, listos para tan del suministro de una fuente de carbono.su utilización especialmente en la micropropa- La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%,gación comercial de plantas. En la Tabla 1 se es el azúcar más utilizado. En algunos mediospresentan tres medios que son muy usados en se la reemplaza por glucosa. En casos particu-la actualidad. lares se cita el empleo de maltosa o galacto- Básicamente, los medios de cultivo se com- sa. También myo-inositol (100 mg/L) suele serponen de compuestos que suministran: incorporado a los medios resultando un mejor • Una fuente de carbono crecimiento de los cultivos. • Nutrientes minerales Nutrientes minerales: Los medios de cultivo • ·Sustancias vitamínicas deben suministrar los mismos macro y micro- • Sustancias reguladoras del crecimiento nutrientes que son esenciales para el creci- • Agente gelificante (en el caso de medios miento de las plantas enteras. En general sesemisólidos) destacan las concentraciones relativamente Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 21
  • 23. altas de nitrógeno y potasio. El nitrógeno es agua de coco (5 a 15%), jugo de tomate y purésuministrado en forma de amonio y/o nitrato. de banana. También en ocasiones es necesa-También se pueden utilizar urea, glutamina y ria la incorporación de agentes antioxidantescaseína hidrolizada. Es fundamental que el hie- (L-cisteína, ácido ascórbico, polivinilpirrolido-rro sea incorporado juntamente con un agente na) para prevenir el ennegrecimiento tisularquelante (Na2EDTA), lo que lo hace disponible causado por la oxidación de polifenoles pre-es un amplio rango de pH. sentes en los explantes. Este ennegrecimiento puede causar la muerte de los mismos. Sustancias vitamínicas: De todas las que La preparación de los medios de cultivo pue-comúnmente se incorporan a los medios, pa- de llevarse a cabo de diferentes maneras, enreciera que la tiamina es la única realmente «lecturas recomendadas» se citan manualesimprescindible para el buen crecimiento de los de laboratorio donde se describen detallada-cultivos. mente este punto. Sustancias reguladoras del crecimiento: En 5. Condiciones ambientales para lala mayoría de los casos los medios utilizados incubación.para el establecimiento de los cultivos con-tienen auxinas (ANA, 2,4-D, AIA, AIB, NOA, La incubación de los cultivos se debe llevarDicamba, Picloram) y/o citocininas (BA, KIN, a cabo en condiciones controladas. Por lo me-ZEA, 2iP, Thidiazurón). Las giberelinas (es- nos en lo que se refiere a temperatura, calidadpecialmente GA3) son requeridas en algunas e intensidad de luz, fotoperíodo, humedad at-ocasiones para el cultivo de meristemas o para mosférica e higiene. Estas condiciones se lo-la elongación de brotes. El ABA, es usado en gran con el empleo de cámaras climatizadasalgunos casos. o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor) y una buena y uni- Agente gelificante (en el caso de medios se- forme circulación de aire en el interior y dota-misólidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el com- dos de un buen sistema de alarma para cortarpuesto más utilizado. También pueden em- la iluminación en caso de no funcionar el aireplearse «Agargel» (0,40-0,60%), «Transfergel» acondicionado. En general, los cultivos son in-(2,0-2,60%), «Phytagel» (0,25- 0,40%), agaro- cubados a temperatura constante de 25-28 ºC,sa (0,80-0.90%) y «Gelrite» (0,10-0,20%). con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lámparas fluo- Otros compuestos: Muchas sustancias, de rescentes del tipo «luz día» con una irradianciavariada composición química, suelen ser adi- de entre 50 y 200μmol m-2s-1. La humedad at-cionadas a los medios básicos. Además de la mosférica debe ser elevada (80- 90%).glicina, otros aminoácidos se pueden agregara los medios. Es el caso de L-tirosina, aspara- 6 Aclimatación de las plantas regenera-gina y cisteína, aunque hay que tener presente das in vitro.que en dosis altas pueden inhibir el crecimien-to de los cultivos. El carbón activado (0,1 a Durante el período de incubación, los cultivos5%) suele ser incorporado al medio, dado que son expuestos a condiciones ambientales disí-es probable que absorba metabolitos tóxicos miles al ambiente externo. La atmósfera internapara los cultivos. se caracteriza por presentar una considerable variación diurna en la concentración de CO2, En algunos medios se incorporan ácidos humedad relativa elevada, temperatura cons-orgánicos como el málico, el cítrico, el pirúvi- tante e intensidad lumínica baja. A su vez, elco y el succínico y es frecuente el empleo de medio de cultivo compuesto por concentracio-L-glutamina y de caseína hidrolizada. Aún hoy nes elevadas de azúcares (en aquellos siste-se siguen utilizando ciertos componentes de mas heterótrofos y semiautótrofos de micropro-composición química no bien definida como el pagación), sales y reguladores del crecimiento,22 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 24. sumado a la ausencia de microorganismos, del substrato, para mantener la temperaturageneran anormalidades morfológicas, anató- por encima de los 18-20 ºC.micas y fisiológicas que las plantas deberán Sin lugar a dudas, la opción más económicacorregir cuando son transferidas al ambiente es el empleo de la luz natural, disminuyendo suexterno. Este período de adaptación al nuevo irradiancia (20-50%) mediante el agregado dehábitat es llamado fase o etapa de aclimata- mallas de sombreado («saram»). No obstante,ción. La estrategia a implementarse durante el en aquellas latitudes donde el nivel medio demencionado ciclo deberá contemplar el control luz natural es bajo y los días son cortos du-minucioso de los parámetros ambientales (hu- rante una parte considerable del año, la luz ar-medad, temperatura y luz) de tal manera que tificial puede ser aplicada como complementopermita disminuir la deshidratación y, al mismo de la luz natural. Las lámparas tubulares fluo-tiempo, estimular la fotosíntesis con el objeto de rescentes del tipo «luz día» son empleadasgenerar un rápido crecimiento de los plantines. en horticultura para prolongar el fotoperíodo. El retraso en el desarrollo de la cutícula y la Asimismo, las lámparas tubulares de sodio altaescasa funcionalidad del aparato estomático presión presentan una distribución espectralque presentan las hojas de la mayoría de las de la energía adecuada para estimular fotosín-especies cultivadas in vitro, determinan una tesis y se emplean para tal fin en una ampliaalta tasa de transpiración que puede ocasionar variedad de cultivos.la muerte por deshidratación. El control de este Otro aspecto importante a tener en cuentaproceso fisiológico es de vital importancia du- lo constituye la elección del substrato, siendorante la aclimatación, teniendo en cuenta que la el adecuado aquel que permita el normal creci-disminución de la transpiración será gradual y miento y desarrollo de las raíces. Se puede em-dependerá de la rehabilitación de los estomas, plear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mez-así como también del desarrollo de la cutícu- clas de ellos, teniendo la precaución de rea-la. El equipamiento necesario estará sujeto a la lizar una esterilización previa. Es convenienteespecie, pudiendo utilizarse desde túneles de el agregado de fertilizantes, sea a través delpolietileno para plantas que posean un elevado substrato (fertilizantes de liberación controla-control de la transpiración (por ej. Malus pumila da) o bien mediante el sistema de riego (fer-o Agave tequilana) o bien, a través del empleo tilizantes solubles); empleándose proporcio-de cámaras climatizadas (Fig.1) equipadas con nes ricas en fósforo (N-P-K: 9-45-15) y potasiosensores que permiten un descenso paulatino (N-P-K: 4-25-35) que favorecerán el desarrollode la humedad relativa. En algunos casos pue- radicular y la rustificación de las plantas.de resultar necesaria la aplicación exógena de En todo momento deberá realizarse un rigu-ABA (hormona involucrada en el control del cie- roso control fitosanitario empleándose antibióti-rre de los estomas) o bien, el empleo de sus- cos, fungicidas e insecticidas de uso universal.tancias antitranspirantes que forman una capa En la Figura 1, se detalla un modelo de cá-semipermeable en la superficie de la hoja. En mara de aclimatación diseñada por los autoreseste último caso deberán tomarse algunas pre- y empleada por el Laboratorio de Cultivo decauciones debido a que pueden observarse re- Tejidos del Instituto de Botánica del Nordeste.acciones de fitotoxicidad. Básicamente, está compuesta por una fase Resulta imprescindible evitar la exposición a aérea construida en aluminio y policarbonatotemperaturas extremas tanto en la fase aérea alveolar (9) y un recipiente o batea (11) quecomo en el substrato. Mediante el empleo de contiene gránulos de arcilla expandida a fin deextractores y/o acondicionadores de aire com- facilitar el drenaje. Mediante el agregado debinados con un sistema de niebla, es posible arena u otro substrato adecuado, esta cámaraestablecer la temperatura de la fase gaseosa puede ser utilizada tanto para el enraizamientoentre los 25 y 30 ºC durante la estación estival, ex vitro de los brotes obtenidos en la etapa demientras que en la época invernal es necesa- multiplicación, así como también, para el en-rio, a veces, el empleo de mantas térmicas o raizamiento convencional (a «raíz desnuda»)serpentinas, sea de agua o aire caliente a nivel de estacas de tallos u hojas. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 23
  • 25. La humedad relativa de la fase aérea es con- Debido a la latitud geográfica en que se en-trolada por un sensor (6) ubicado por encima cuentra, la cámara está equipada con un acon-de la tubería de riego (4). El sistema humidifi- dicionador de aire (3000 frigorías) para evitarcador está compuesto por picos tipo «fog» y situaciones de estrés térmico en época estival.es alimentado por una bomba de bajo caudal A su vez, y dado que la mayoría de las espe-y alta presión (13). Con el propósito de evitar cies estudiadas son originarias de climas tro-el goteo que pudiese ocasionar el agua rema- picales y subtropicales, el sistema cuenta connente en las cañerías, el sistema consta de mantas térmicas que son colocadas por deba-una válvula solenoide de descarga y desagüe jo de los tubetes, manteniendo la temperatura(7). La fase gaseosa es renovada en forma in- del substrato durante el invierno. En este últi-termitente mediante el empleo de extractoresubicados en ambos extremos de la cámara (3) mo caso se agrega un material aislante entre lalos que, conjuntamente, introducen o extraen leca (10) y la malla de hierro (16) de tal maneraaire, generando un movimiento masal. de dirigir el calor hacia la fase aérea.24 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 26. 7. Agradecimientos.Los autores agradecen al Ing. Pablo A. Lunapor la planificación digital de la cámara de acli-matación. A la Secretaría General de Cienciay Técnica (UNNE) y al Establecimiento La Ca-chuera por el aporte financiero recibido paraconstruir la misma. 8. Lecturas RecomendadasGEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEOR- GE. 1987. Plant Culture Media . Vol. 1 (Formu- lations and Uses). Exegetics Limited. England. 567 pág.GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEORGE. 1988. Plant Culture Media . Vol. 2 (Commentary and analysis). Exegetics Limited. England. 420 pág.HURTADO, D.V. y MERINO, M.E. 1991. Cultivo de Tejidos Vegetales. Ed.Trillas. México. 232 pág.PÉREZ PONCE, J.N. 1998. Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. Instituto de Biología de Plantas.Santa Clara. Cuba. 390 pág.POSPOSILOVA, J.; I. TICHA, P. KADLECEK, D. HAISEL, S. PLZAKOVA. 1999. Acclimatization of micropropagated plants to ex vitro conditions. Biologia Plantarum 42: 481-497.ROCA, W.M. y L.A. MROGINSKI. 1993 (segunda edición). Cultivo de tejidos en la Agricultura: Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Cali, Colom- bia, 970 pág.TORRES, A.C.; L.A. CALDAS y J.A. BUSO. 1998. Cultura de Tecidos e Transformacao Genética de Plantas. (Vol.1) Embrapa. Brasil.509 pág.TORRES, A.C.; L.A. CALDAS, y J.A. BUSO. 1999 Cultura de Tecidos e Transformacao Genética de Plantas. (Vol.2) Embrapa. Brasil.355 pág. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 25
  • 27. I - CAPÍTULO 2 2.- Tipos de morfogénesis. Definiciones En condiciones de cultivo in vitro, las célulasMorfogénesis somáticas pueden regenerar embriones (FigSilvia Radice 1) o brotes, raíces y/o flores (Fig 2) como res- puesta a un determinado estímulo. La regene- 1.- Introducción ración es un proceso que comprende diferen- tes fases que se suceden de manera similarLa embriogénesis somática y la organogénesis para los tres tipos de morfogénesis citadas. Deson dos procesos morfogénicos muy frecuen- Klerk y colaboradores, en 1997, denominarontes en el cultivo in vitro de especies vegetales. a estas diferentes fases como adquisición deLa embriogénesis somática es el proceso por la competencia; fase de inducción y fase deel cual se obtiene una estructura similar a un realización.embrión cigótico sin que medie la fertilización En la primera fase, las células no respon-de las gametas, mientras que por organogé- den al estímulo organogénico pero adquierennesis pueden obtenerse tallos, raíces o flores. esa competencia durante una fase de desdi-Estos órganos son inducidos a partir de una ferenciación. En la segunda fase o fase de in-célula o de un grupo de células que, según las ducción, las células son receptivas al estímulocondiciones de cultivo, tienen la propiedad de morfogénico y hay una relación directa con elmantenerse en activa división. tipo, concentración y combinación de regula-Esta totipotencialidad celular fue enunciada dores del crecimiento agregados al medio depor Haberlandt en 1902, quien propuso la teo- cultivo y el órgano a desarrollar. En la fase dería de que todas las células vegetales tienen realización, la célula sufre las sucesivas divi-la capacidad de regenerar plantas completas. siones para formar el órgano determinado.Haberlandt no llegó a demostrar su hipótesis A partir de la siembra in vitro de diferentes ex-debido a que no pudo lograr la división celu- plantes relativamente grandes y en condicio-lar. Los medios de cultivo que empleaba no nes de cultivo adecuadas, puede inducirse laincluían reguladores del crecimiento debido a formación de nuevos órganos de manera direc-que esos compuestos eran aún desconocidos. ta, sin la formación de callo. Si la formación esLos avances en el cultivo de tejidos vegetales de brotes, raíces o flores se denomina organo-fueron muy lentos en sus inicios. En 1934, Whi- génesis directa. Si en cambio se induce la for-te pudo mantener, en forma ilimitada, el creci- mación de embriones somáticos, este procesomiento de raíces en medios líquidos a partir de se denominará embriogénesis directa (Figs. 1 yápices de tomate. Al mismo tiempo se identi- 3). Si por el contrario, a partir de la siembra deficó el ácido indol acético (AIA), que posibilitó un explante in vitro se observa la proliferaciónel mantenimiento indefinido de callos de za- de células en forma desordenada y sin ningunanahoria y tabaco in vitro. Posteriormente se función predeterminada, se iniciará la produc-descubrió el efecto de la leche de coco como ción de callos o suspensiones celulares (Figs.estimulante de la formación de callo sobre el 2 A y 3). La diferenciación de órganos a partircultivo de embriones de Datura stramonium. de callos, denominada morfogénesis indirecta,En 1948 Skoog y Tsui, trabajando con cultivos estará condicionada a la previa formación dede callo de tabaco, demostraron la existencia los meristemoides. Morfogénesis directa o in-de una regulación química en la parte aérea y directa fueron términos propuestos por Hicksen la raíz. Trabajos posteriores en callos de la en1980.misma especie, con el agregado de cinetina,la primera citocinina descubierta, permitieron 3.- Histología de la morfogénesisdemostrar que la diferenciación de brotes, raí-ces o de ambos, era regulada por el balance de Después de 48 horas de realizada la siembraauxinas/citocininas. del explante en el medio de cultivo adecuado,26 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 28. Figura 1: A-F embriogénesis somática obtenida por cultivo in vitro. A-C-E, embriogénesis somática en di-ferentes fases de crecimiento observada en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivado en MS + 1 mg l-1 deBAP. B-D-F, embriogénesis somática obtenida en diversos cultivares de Prunus sp a partir de embrioneszigóticos inmaduros cultivados en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 de Kin con una previa inducción en MS+ 2 mg l-1 de 2,4-D. Las reglillas representan 5 mm.a partir de una célula epidérmica o del mesófilo renciación de los nuevos órganos. Este tipo defoliar, como ocurre en las coníferas, se suce- meristema puede iniciarse en forma directa, aden una serie de divisiones mitóticas. Así se partir de células diferenciadas pertenecientes apueden observar, a través del estudio histológi- un explante cultivado in vitro, o indirectamente,co, pequeñas masas de células que contienen a partir de una célula o grupo de células dife-citoplasma denso y grandes nucleolos. Este renciadas que promueven la proliferación celu-conjunto de células, agrupadas a modo de es- lar (Fig 4 A). Su evolución determinará el cre-feras, fueron denominadas meristemoides por cimiento de un órgano, por ejemplo una yemaTorrey en 1966, y son responsables de la dife- adventicia (Fig 4 B). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 27
  • 29. Figura 2: A-E Organogénesis somática obtenida por cultivo in vitro. A, callo organogénico obtenido enAbelia sp. (André) Rehder cultivada en MS + 1 mg l-1 de picloran. B, Inicio de brotes (flechas) en hojascrecidas in vitro de “Crimson Gold” (Prunus persica L.) cultivadas en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 deKin. C, Brotes de Gerbera jamesonii Bolus obtenidos a partir del cultivo de capítulos florales en MS 0,05mg l-1 de IBA + 0.75 mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de GA3. D, brotes florecidos in vitro de Abelia sp. (André)Rehder cultivados en MS + 1 mg l-1 de BAP. E, raíces (flechas) crecidas de callo de Abelia sp. (André) Re-hder cultivadas en inducidas en MS + 1 mg l-1 de 2iP, previamente inducidas con 1 mg l-1 de picloran. Lasreglillas representan 5 mmLas células embriogénicas son similares a las po de células embriogénicas, el desarrollo decélulas meristemáticas debido a que no son las mismas no está sincronizado. Estas célulasdemasiado voluminosas, tienen gran cantidad son capaces de dividirse o de transformarsede ribosomas, citoplasma denso, un nucleolo en embriones según las condiciones del medioagrandado y pequeños granos de almidón. Es- de cultivo. Aquellas células que no desarrollantas células, que en general se agrupan, pueden proembriones comienzan el proceso de dife-variar en tamaño y número. Dentro de un gru- renciación, es decir se vacuolizan, disminuye28 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 30. el volumen de núcleo y nucleolo y desaparecen noso, sufre divisiones polarizadas formando unlos gránulos de almidón. embrión globular. Previo a esta polarización seLas experiencias demuestran que las células deposita almidón, luego se forma la epidermisembriogénicas se desarrollan sólo cuando se y adquiere simetría bilateral. Sucesivamente semodifican las condiciones de cultivo. En gene- observa el crecimiento de uno o más cotiledo-ral, cuando se reducen las cantidades de auxi- nes, el desarrollo de los tejidos provasculares,na y citocinina o se elimina la auxina. la iniciación de los ápices radicales y de tallo yLas células embriogénicas desarrollan como una progresiva acumulación de almidón, lípidosembriones cuando las condiciones experimen- y proteínas.tales permiten que estas expresen su poten- En el caso de un origen multicelular de los em-cial. Pueden ocurrir dos condiciones ontogé- briones somáticos pueden observarse diversosnicas diferentes, es decir que el origen de los patrones. Los embriones somáticos se formanembriones sea unicelular o pluricelular. a partir de grupos de células epidérmicas yEn el caso de iniciarse a partir de una célula, la subepidérmicas (Fig 4 C). Este tipo de ontoge-misma se aísla de las demás por una importan- nia de origen multicelular se llama comúnmentete modificación en su pared celular, en particu- budding o embriogénesis adventicia. Estas cé-lar por la gelificación de la laminilla media. Esta lulas pequeñas tienen una alta relación núcleo/célula, rodeada por un polisacárido mucilagi- citoplasma, citoplasma denso y un nucleolo vo- luminoso que se tiñe fuerte- mente. Se diferencian de las células embriogénicas por la falta de sustancias de reser- va, por su delgada pared ce- lular y su frecuente división celular. Estas estructuras se denominan proembriones globulares (Fig 1 A, B). En una etapa posterior desarro- llan una epidermis, un tejido provascular, acumulan mate- rial de reserva y se polarizan. Estas estructuras globulares desarrollan cotiledones y se transforman en embriones somáticos que presentan ápices caulinar y radicular. Para una misma especie puede ocurrir uno u otro tipo de inicio según las condicio- nes de cultivo. El desarrollo de un embrión somático de origen unicelular es compa- rable a la de un embrión ci- gótico. En dicotiledóneas, la etapa globular es seguidaFig. 3: Esquema de los diferentes procesos morfogénicos obtenidos por una etapa corazón quea partir de la siembra in vitro de diferentes explantes. Las líneas con- se corresponde con la adqui-tinuas expresan organogénesis o embriogénesis directa mientras que sición de la simetría bilateral:las líneas quebradas indican que la morfogénesis se obtiene por vía desarrollo de la epidermis,indirecta. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 29
  • 31. Figura 4: A-E Cortes histológicos de diferentes explantes cultivados in vitro. A, meristemoides (flechas)observados en cultivo de Silybum marianum L. en MS + 1 mg l-1 de AIA + 5 mg l-1 de BAP 10 x. B, yemasadventicias (flechas) en ápices de Fragaria x ananassa Duch. cultivados en Boxus + 0,1 mg l-1 de IBA + 0.5mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de GA3 4 x. C, grupo de células embriogénicas (flechas) en Codiaeum variegatum(L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón. 20 x. D, embriones somáticos en Codiaeum variegatum (L)Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón 10 x. E, embriogénesis secundaria en Codiaeum variegatum (L)Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón 10 x.de los estratos procambiales y de manera su- la raíz y al procambium en respuesta a la elon-cesiva el desarrollo del ápice radical. El ápice gación axial del embrión somático debido alde tallo se desarrolla más tarde, durante la eta- transporte de auxinas (Fig 1 C).pa cotiledonar. En los embriones somáticos de Los embriones de origen multicelular obtenidosalgunas especies hay una etapa intermedia en- por budding muestran la misma ontogenia quetre la globular y corazón llamada oblonga, que los cigóticos, como así también la produccióncorresponde a la individualización del ápice de de sustancias de reserva.30 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 32. Sin el seguimiento histológico detallado, la for- nos. Por esta causa, no es posible generalizarmación del embrión somático sólo puede ser metodologías o protocolos de trabajo debido aconfirmada por la germinación (Fig 1 F). Sin que los medios de cultivo, así como las condi-embargo, debido al bajo porcentaje de embrio- ciones de cultivo seleccionados, deben ser es-nes que llegan a esta etapa, esta tarea es casi pecíficos para cada situación en particular. Unimprescindible para una correcta evaluación de ejemplo de ello es el protocolo empleado porlas respuestas encontradas con los diversos Stamp and Meredith en diferentes cultivares demedios de cultivo empleados. Vitis vinifera. En cuatro de ellos fue posible laComparados con los embriones cigóticos de la obtención de embriones somáticos a partir demisma especie, los embriones somáticos fre- embriones cigóticos, pero estos resultados nocuentemente desarrollan de manera anormal se repitieron con el cultivar "Pinot Noir".o son inmaduros. La anomalía más frecuente-mente encontrada es la formación doble o tri- 4.2.- Varios son los compuestos químicos queple del sistema vascular, causada por la pobre influyen en los patrones morfogénicos in vitropolarización del transporte de auxinas. También dentro de los cuales podemos considerar:se puede encontrar un contenido excesivamen- 4.2.1.- la composición salina del medio de culti-te alto, reducido o ausente de las reservas de vo. La composición salina más empleada paraalmidón y/o proteicas, que el meristema apical o inducir la formación de callo, la organogénesisradical no estén desarrollados o que la embrio- directa o indirecta en la mayoría de las espe-génesis sea repetitiva o secundaria (Fig 4 E). cies vegetales, es la de Murashige & SkoogLa falta del meristema apical o una escasa (1962) (MS). Sin embargo, existen otras formu-deposición de sustancias lipoproteicas en los laciones diseñadas para inducir determinadosembriones somáticos de algunas especies no patrones morfogénicos. Existe además una es-debe ser tomada como una anormalía. Esto trecha relación entre la composición hormonalpuede ser un síntoma de inmadurez debido del explante y la concentración de reguladoresa la rápida formación de los mismos. En este del crecimiento agregada al medio de cultivo.caso una etapa intermedia que permita la ma- 4.2.2.- reguladores del crecimiento. Estosduración de las estructuras formadas permitirá compuestos pueden promover la morfogénesisincrementar el porcentaje de embriones somá- aún cuando la concentración salina no sea laticos capaces de germinar. adecuada. En condiciones óptimas de cultivo pueden aumentar significativamente la dife- 4.- Factores que afectan los procesos renciación de órganos. Para la inducción demorfogénicos embriones somáticos en muchas especies ve- getales es necesario el agregado de auxinas,Los cuatro principales factores que condicio- como ocurre en Tilia spp. Sin embargo paranan la obtención y el crecimiento de nuevos otras, como es el caso del crotón (Codiaeumórganos in vitro son: variegatum), es suficiente con el agregado de thidiazurón. El genotipo y el tipo y concentra-4.1.- el genotipo ción de reguladores del crecimiento empleados4.2.- las condiciones químicas seleccionadas están estrechamente relacionados.para realizar el cultivo. 4.2.3.- antibióticos. En procesos de transfor-4.3.- las condiciones físicas seleccionadas mación con Agrobacterium tumefaciens espara realizar el cultivo. muy común el agregado de antibióticos del tipo4.4.- el explante. cefotaxime; kanamicina y carbenicilina para la eliminación de la bacteria. En explantes de4.1.- El genotipo es un factor determinante en hoja de diferentes cultivares de Malus domes-todos los procesos morfogénicos, desde la ca- tica se encontró que 250 mg L–1 de cefotaximepacidad del explante para su establecimiento en aumentan significativamente la regeneracióncondiciones in vitro a la proliferación de callo, o de brotes mientras que 500 mg L–1 de carbe-la diferenciación y crecimiento de nuevos órga- nicilina promueven la formación de callo y la Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 31
  • 33. kanamicina inhibe los procesos morfogénicos. dicionada por el tipo y tamaño del envase selec-4.2.4.- carbón activado. En general se usa para cionado para el cultivo, así como también por eladsorber compuestos tóxicos de la micro atmós- sistema de cobertura del mismo. Las tapas usa-fera gaseosa o el exceso de reguladores del cre- das en cultivo in vitro varían desde el tapón decimiento presentes en el medio de cultivo pero algodón; papel de aluminio; película de resiniteE.K. Pettersson y su equipo de colaboradores de transparente o tapas rígidas de polipropileno. Ella Swedish University of Agriculture, demostraron intercambio gaseoso es diferente para cada tipoque puede promover la embriogénesis somática de tapa, en consecuencia la atmósfera internadebido a la incorporación de ciertos compuestos también sufrirá variaciones.al medio de cultivo por difusión. En condiciones in vivo la atmósfera contiene 784.2.5.- agar. Otro aspecto importante a tener en % de nitrógeno; 21 % de oxígeno y 0,035 % decuenta es la consistencia del medio de cultivo. dióxido de carbono. En cultivos in vitro se hanPuede emplearse como semi-sólido o líquido. El registrado además, etileno y otros compuestosagente gelificante más utilizado en el cultivo in hidrocarbonados.vitro es el agar, extraído de diversas algas ma- El nivel de oxígeno disponible para el explanterinas. Las diferentes calidades existentes en el condiciona el crecimiento y los procesos morfo-mercado modifican la expresión morfogénica génicos. En general se necesita una buena airea-debido a que pueden contener sustancias inhi- ción para obtener cualquier tipo de proceso mor-bitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el fogénico. En alfalfa se puede obtener un buencaso del cultivo de hojas de Actinidia chilensis incremento de material a partir de suspensiones(en medio de MS con el agregado de 0,1 mg/L de celulares embriogénicas cuando la solución seAIA + 1 mg/L de BAP) cuya respuesta morfogéni- satura con 70% de oxígeno. Por el contrario, unaca varió según el tipo de agar utilizado. Cuando tensión de oxígeno del 5 % estimula la produc-el gelificante empleado fue Chubut-agar, de pro- ción de plantas a partir de anteras de tabaco.ducción nacional, se observó una gran diferen- La concentración de dióxido de carbono (CO2) enciación de yemas adventicias, mientras que con la atmósfera gaseosa in vitro varía según la res-el agregado de agar SIGMA R sólo se indujo la piración y la actividad fotosintética de las plantas.proliferación de callo. En condiciones de oscuridad, el CO2 incrementa En caso de seleccionar medios de cultivo líqui- mientras que en condiciones de luz, disminuye.dos, la respuesta morfogénica observada varía En trabajos realizados con Ficus lyrata se hande manera considerable. El cultivo líquido es im- encontrado concentraciones variables, entre 0,5prescindible cuando se busca promover la mor- % y 8,5 %, según el tipo de sello o tapa emplea-fogénesis indirecta a través de suspensiones ce- dos. Concentraciones superiores al 1 %, que sonlulares. Para ello es necesario cultivar los callos generalmente tóxicas en condiciones in vivo, pro-en medio líquido con agitación para permitir que bablemente no fueron limitantes para la actividadlas células se disgreguen y puedan diferenciar fotosintética.raíces, brotes o embriones somáticos en forma La presencia de etileno en condiciones in vitroaislada. promueve diversas respuestas. Su acumulación La elección de un medio de cultivo líquido o tiene efectos inhibitorios sobre el cultivo de cé-sólido depende, además, de la especie con la lulas, callos y anteras, La cantidad de etilenoque se trabaja. En Cymbidium, por ejemplo, se producida in vitro varía con la especie, el tipo deha observado que el empleo de medio líquido explante, la concentración de citocininas en elpromueve una mayor diferenciación de proto- medio de cultivo, el tipo de agar utilizado y con lacormos respecto del mismo gelificado. A su vez, luz. Una forma de incorporar etileno al envase deeste proceso puede mantenerse durante varios cultivo es a través de la esterilización del materialsubcultivos, mientras que en medio de cultivo ge- de disección realizada con el material embebidolificado se observó que los protocormos tienden en alcohol y flameado con mechero Bunsen. Ena formar tallos. muchos casos el etileno actúa como promotor de4.2.6.- atmósfera gaseosa. Es un factor determi- la morfogénesis pero luego es inhibitorio del cre-nante en los procesos morfogénicos y esta con- cimiento de los órganos diferenciados32 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 34. 4.3.- Entre las condiciones físicas podemos men- cultivadas en un mismo medio de cultivo, segúncionar los efectos de la temperatura, la humedad la porción de la lámina utilizada (Pedroso y Pais,relativa y la luz. 1993). Estos investigadores cultivaron estas ho-4.3.1.- La temperatura de incubación de los cul- jas in vitro durante seis semanas previa inmersióntivos es un factor importante a tener en cuenta. del explante en una solución de IBA (1 mg l–1) du-Si bien en condiciones naturales las plantas ex- rante 20 minutos (Fig 5).perimentan diferencias térmicas durante el día yla noche, las temperaturas in vitro se mantienencasi estables. Es importante señalar que cuantomás se asemejen las condiciones in vitro a lasóptimas de crecimiento de la especie estudiada,mayor será la respuesta obtenida. En cultivos dehojas de Streptocarpus x hybridus sometidos adiferentes temperaturas se observó que la rege-neración mayor de brotes se producía a 12 ºCmientras que por encima de los 30 ºC, práctica-mente no se observó diferenciación.4.3.2.- La humedad relativa (HR), como medidade la cantidad de vapor de agua contenida enla atmósfera gaseosa, es otro de los parámetrosfísicos a tener en cuenta. La HR dependerá del Figura. 5: Esquema de las diferentes respuestassello o cobertura del envase empleado. Si este morfogénicas obtenidas después de seis semanascierre es hermético, la humedad interior será del de cultivo in vitro de hojas de Camellia japonica L. según la porción de la lámina. 1, callo organogéni-100 %. Si en cambio existe la posibilidad de un co. 2 embriogénesis somática directa. 3, regenera-intercambio gaseoso la humedad interna pue- ción directa de raíces. 4, callo organogénico.de descender a niveles cercanos al 50 %. Esteimportante descenso de la HR puede promoveruna pérdida veloz de agua del medio de cultivovariando la concentración de sus compuestos Lecturas recomendadashasta llegar a niveles tóxicos (Debergh, comuni-cación personal). Buddendorf-Joosten J.M.C. and Woltering E.J.4.3.3.- La luz suministrada a los cultivos debe 1994. Components of the gaseous environmentser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad and their effects on plant growth and develop-y período de suministro. La respuesta morfogé- ment in vitro. Plant Growth Regulation 15: 1-16.nica de un explante puede variar según si se le De Klerk G.J., Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. and Neumann K.H. 1997. Regeneration of roots,proporciona luz o no. Para estimular la formación shoots and embryos: physiological, biochemicalde callo, es común que se prefiera la oscuridad. and molecular aspects. Biologia Plantarum 39El suministro de luz favorece la diferenciación de (1): 53-66.órganos. George E. 1993. Plant propagation by tissue culture Part 1 The technology. Butler and Tanner Ltd4.4.- Tal como ya se señaló anteriormente, los (ed). Gran Bretaña. 1361pp.proceso morfogénicos dependen del genotipo, Hicks G.S. 1980. Patterns of organ development inpero a esto debe sumarse el efecto del explante plant tissue culture and the problem of organ de-seleccionado. El tratamiento de la planta madre, termination. Bot. Rev. 46: 1-23.las condiciones físicas y fisiológicas en las que Williams E.G. and Maheswaran G. 1986. Somatic embryogenic factors influencing coordinated be-ésta se encuentre y el sector del cual se tome havior of cells as an embryogenic group. Ann.el explante determinarán a su vez la respuesta Bot. 57: 443-597.morfogénica en condiciones in vitro. Un ejemplomuy interesante es la diferente respuesta morfo-génica observada en hojas de Camellia japonica Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 33
  • 35. I - CAPÍTULO 3 mosómico). Esta caracterización se realiza en metafase mitótica debido a que, en esta fase, los cromosomas han alcanzado su máxi-La citogenética molecular e inmu- mo grado de condensación y sus límites estánnocitogenética en el estudio de perfectamente definidos. Para este análisis ge-los genomas vegetales neralmente se emplean tejidos meristemáticos porque presentan un alto índice mitótico (i.e.Guillermo Seijo; Graciela I. Lavia; la razón entre el número de células en divisiónGermán Robledo; Aveliano Fernández; y el número total de células observadas). LosViviana G. Solís Neffa órganos (ápices radicales o caulinares, óvulos, etc.) son pre-tratados con diversas sustancias 1 Introducción que inhiben la formación del huso mitótico (col- chicina, 8-hidroxiquinoleína, paclosol, etc.) a La comprensión de la organización de los los efectos de acumular metafases, dispersargenomas lograda a través del análisis citoge- los cromosomas en el citoplasma y producirnético ha tenido un gran impacto en la evalua- una mayor condensación de los mismos. Losción y utilización de la biodiversidad, así como materiales se fijan y luego se tiñen con colo-en el mejoramiento genético y la ingeniería ge- rantes nucleares (fucsina básica, orceína, car-nética, en particular, desde el desarrollo de las mín, giemsa, etc.). Finalmente, se confeccio-técnicas de citogenética molecular. El empleo nan los preparados por macerado y aplastadosondas de ADN y de anticuerpos conjugados (“squash”) del material sobre un portaobjetos.con fluorocromos en un número creciente de Con estos métodos de tinción, los cromoso-especies vegetales ha permitido, entre otros lo- mas metafásicos observados con un micros-gros, la localización de secuencias específicas, copio óptico aparecen uniformemente teñidos,la identificación de cromosomas particulares, el excepto en el centrómero (constricción pri-estudio del origen y la estructura de los geno- maria) y en algunas constricciones menoresmas de híbridos y poliploides, la comparación (secundarias).de regiones genómicas homólogas, el estudio Mediante la observación microscópica sedel comportamiento cromosómico y el análisis determina el número cromosómico somáti-de la expresión génica. Por ello, las técnicas de co (2n) y, a través del análisis de microfotogra-hibridación in situ (ISH) e inmunocitogenética fías o dibujos de metafases con cromosomasconstituyen actualmente herramientas indis- bien definidos y separados (Fig. 1A), se esta-pensables para la comprensión de la organiza- blecen los cariotipos. Para ello, se analiza lación y la expresión del genoma de las plantas. morfología de los cromosomas determinando En este capítulo se describen, en primera la posición del centrómero y la longitud deinstancia, algunos de los criterios empleados los brazos corto (bc) y largo (bl), así comotradicionalmente para la caracterización cario- la longitud total (lt) de cada cromosoma. Atípica y, posteriormente, se presentan los prin- partir de estas medidas, se calcula el índicecipios y las aplicaciones de diferentes técnicas centromérico [IC = (bc / lt) × 100], según elde hibridación in situ de ácidos nucleicos y de cual los cromosomas se clasifican en cuatro ti-inmunodetección de modificaciones epigenéti- pos morfológicos: metacéntricos (m, IC = 50 -cas de nucleótidos e histonas. 37,5), submetacéntricos (sm, IC = 37,5 - 25), subtelocéntricos (st, IC = 25-12,5), acrocén- 2 Citogenética clásica tricos (t, IC = 12,5 - 0) y telocéntricos (T, IC = 0). Otro aspecto a considerar para caracte- La caracterización cromosómica de espe- rizar morfológicamente a los cromosomas escies o variedades de plantas se inicia con la la presencia y la posición de las constriccionesdescripción del cariotipo a través del análisis secundarias, así como la presencia y el tipodel número, el tamaño y la forma de los cro- de satélites. En general, las primeras corres-mosomas que presentan (complemento cro- ponden a regiones organizadoras de los nu-34 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 36. cleolos (NORs) y los últimos a las porciones tricos) y, dentro de cada tipo, según su tamañocromosómicas distales delimitadas por la cons- (de mayor a menor) ubicando los centrómerostricción secundaria y el telómero de los brazos alineados a una misma altura y los brazos cor-que los portan. Los cromosomas que presen- tos hacia arriba. En las plantas diploides (Fig.tan satélites se denominan cromosomas SAT 1C y E) y alopoliploides, el cariotipo se com-(Fig. 1A, E y F). pone de pares de cromosomas homólogos; Para la confección del cariotipo los cromo- mientras que en las autopoliploides (Fig. 1D ysomas del complemento se ordenan según su F) se compone de grupos de tres o más cro-morfología (de metacéntricos a submetacéntri- mosomas de acuerdo con el nivel de ploidía.cos, subtelocéntricos, acrocéntricos y telocén- El orden que ocupa en el cariotipo cada par oFIGURA 1. A-D: Metafases mitóticas teñidas con coloración de Feulgen. A: Lathyrus macropus, 2n = 2x =14, las flechas señalan los satélites de los cromosomas SAT. B: Oziroe argentinensis [citada en Fernándezy Daviña (1991) como Fortunatia biflora], 2n = 2x = 30, con un cariotipo asimétrico. C y D: Turnera sidoidessubsp. pinnatifida, C: citotipo diploide, 2n = 2x = 14 y D: citotipo tetraploide, 2n = 4x = 28. E-F: Idiogramasde los citotipos diploide y tetraploide de Turnera sidoides subsp. pinnatifia ilustrados en C y D, respectiva-mente. En gris se representan los satélites de los cromosomas SAT. La barra representa 10 micras en A yB, 5 micras en C y D y 2,5 micras en E y F. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 35
  • 37. grupo de cromosomas se indica mediante un (Fig. 2A). Además, pueden utilizarse diversosnúmero y, mediante una letra, el tipo cromosó- fluorocromos que tienen la capacidad de inter-mico al que pertenece de acuerdo a su morfo- calarse preferentemente en regiones del ADNlogía. La representación gráfica del cariotipo se con una composición de bases particular. Pordenomina idiograma (Fig. 1E y F). La compo- ejemplo, las regiones ricas en adenina y timinasición de un complemento cromosómico tam- son reveladas con DAPI (4,6-diamidino-2-feni-bién se puede expresar mediante una fórmula lindol diclorhidrato) o quinacrina, mientras quecariotípica, en la que se indica el número de las ricas en guanina y citosina lo son con CMA3cada tipo morfológico de cromosomas que pre- (cromomicina A3). Las bandas pueden ser desenta el material analizado (ej. 16 m + 10 sm tamaño e intensidad diferentes y presentar una+ 2 st + 2 t). Entre los parámetros cuantitativos distribución particular sobre los cromosomasmás utilizados para caracterizar los cariotipos de un complemento generando un patrón dese encuentra el grado de asimetría que pre- bandeo característico (Fig. 2B). Estas técnicassentan los mismos. Para ello, se emplean ca- de bandeo cromosómico han permitido, entegorías o índices de asimetría cromosómi- muchos casos, la identificación inequívoca deca que consideran las diferencias de tamaño cromosomas homólogos, la caracterización deentre los cromosomas del cariotipo (asimetría genomas así como el seguimiento de cromo-intercromosómica), y las diferencias morfoló- somas o bloques cromosómicos en híbridos ygicas de los cromosomas derivadas de la pro- líneas de introgresión.porción entre sus brazos (asimetría intracro- La diferenciación lineal de los cromosomasmosómica). Un cariotipo simétrico es aquel por técnicas de bandeo no siempre es eviden-cuyos cromosomas son aproximadamente del te en todos los grupos de plantas y, aún enmismo tamaño y en su mayoría metacéntricos, aquellas especies que presentan buenos pa-mientras que uno asimétrico es aquel que trones de bandas, a menudo no se cuenta conpresenta cromosomas de diferentes tamaños un número significativo de marcadores comoy predominantemente submetacéntricos, acro- para integrar los mapas de ligamiento con loscéntricos o telocéntricos (Fig. 1B). La informa- mapas físicos. La posibilidad de posicionar se-ción obtenida a partir del análisis de los cario- cuencias particulares sobre los cromosomas y,tipos permite identificar cromosomas, clasificar de esta forma, generar un gran número de mar-los cariotipos, realizar análisis comparativos cadores cromosómicos ha sido posible graciasentre grupos de especies más o menos rela- al desarrollo de las técnicas de hibridación incionadas e inferir sus tendencias evolutivas. situ, cuyo uso se ha generalizado a partir delAsimismo, permite detectar las anomalías nu- desarrollo de sistemas de marcado y de detec-méricas y estructurales en los complementos ción de sondas no radiactivas.cromosómicos de células o individuos. En numerosos grupos de plantas, la identi- 3 Hibridación in situ fluorescente (FISH)ficación de los diferentes pares de homólogosdel cariotipo puede resultar engorrosa debido Esta técnica se basa en reacciones de re-a que presentan cromosomas con morfología conocimiento y asociación de bases entre unmuy similar. En estos casos, la aplicación de segmento del ADN cromosómico (secuen-determinados tratamientos en combinación cia blanco) y una secuencia complementariacon diferentes tipos de tinción, puede revelar marcada (sonda). La misma se aplica a pre-regiones cromosómicas con condensación o paraciones de células somáticas o germinales,composición cromatínica diferencial (bandas), previamente incubadas con enzimas (celulasa,generando marcadores cromosómicos adicio- pectinasa y citohelicasa) que remueven lasnales. Así, el tratamiento de los cromosomas paredes celulares. Las preparaciones son tra-con un álcali y la posterior tinción con Giemsa tadas con ARNasa A para evitar hibridacionesrevela regiones de heterocromatina consti- inespecíficas de la sonda con ARNs y, poste-tutiva, mientras que la impregnación argénti- riormente, son permeabilizadas mediante laca (bandeo Ag-NOR) revela las NORs activas incubación con proteasas. Las sondas pueden36 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 38. ser marcadas con nucleótidos unidos a hapte- Desde el desarrollo inicial de la técnica denos (digoxigenina, biotina, etc.) o a fluorocro- FISH, se han mejorado sustancialmente tantomos (Cy3, Cy5, etc.) por la reacción en cadena la sensibilidad (i.e. el tamaño mínimo de unade la polimerasa (PCR), por una transferasa secuencia que puede ser detectada bajo el mi-terminal o por medio de la actividad exonu- croscopio) como el poder de resolución es-cleotídica y de la subsiguiente polimerización pacial (i.e. la distancia física mínima a la querealizadas por la ADN pol I a partir de escisio- dos secuencias pueden ser identificadas comones simples causadas por una ADNasa (nick independientes). Bajo condiciones óptimas detranslation). La sonda marcada, componiendo hibridación y de detección, la sensibilidad deuna mezcla de hibridación que contiene forma- esta técnica depende de la accesibilidad demida y ADN bloqueante (entre otros compo- la sonda a la región complementaria sobre elnentes) es colocada sobre las preparaciones ADN. La misma, a su vez, está determinadacromosómicas, para luego realizar una desna- por el grado de condensación de la cromati-turalización conjunta del ADN de los cromoso- na. El éxito de FISH se debe a las indudablesmas y de la sonda, a temperaturas que varían ventajas que ofrece frente a las técnicas clási-entre 70 ºC y 90 ºC durante unos 10 minutos. cas para identificar homologías y, sobre todo, aPosteriormente, los preparados son incubados la posibilidad de contar con una amplia bateríaa 37 ºC durante al menos 1 hora (normalmente de sondas disponibles de acuerdo con la na-toda la noche) a fin de inducir la hibridación. turaleza de la secuencia blanco que se quieraEn este paso, la sonda y la secuencia cromo- detectar.sómica complementaria al blanco compiten en- En general, se pueden utilizar sondas detre sí, pero debido a la alta concentración de ADN de copia única, moderadamente repe-la primera y a su menor tamaño, bajo condi- titivo o altamente repetitivo. Las secuenciasciones óptimas, la sonda hibrida en todos los repetitivas pueden ser conservadas o varia-sitios complementarios a lo largo de los cro- bles y estar dispuestas en tándem (i.e. una co-mosomas. En el caso de las sondas marcadas pia está seguida de otra en arreglos de decenascon haptenos, la detección de los sitios de hi- a miles de copias formando un locus definido)bridación se realiza mediante una o dos rondas o dispersas (i.e. las repeticiones pueden estarde anticuerpos conjugados con fluorocromos. dispuestas a lo largo de una región cromosómi-Los preparados se analizan con microscopios ca, de algunos cromosomas o de todo el com-de epifluorecencia utilizando filtros específicos plemento). Entre las secuencias repetitivas, laspara cada fluorocromo, registrando la presen- sondas de los genes ribosomales (ADNr) 45Scia, el tamaño y el número de señales fluo- y 5S son las empleadas con mayor frecuenciarescentes por complemento. Normalmente, para la generación de marcadores cromosómi-se obtiene una microfotografía monocromática cos por FISH. Esto es debido a que son se-por cada sonda utilizada y una del complemen- cuencias altamente conservadas y a que pre-to cromosómico teñido con DAPI o ioduro de sentan una disposición en tándem que facilita lapropidio. Estas microfotografías son super- detección de los loci. Los mismos pueden estarpuestas e integradas en una sola imagen. El presentes en más de un sitio por complemen-posicionamiento relativo de las señales con to cromosómico, proporcionando marcadoresrespecto al centrómero, los telómeros u otros útiles para la identificación de cromosomas ymarcadores cromosómicos permite mapear para realizar comparaciones cariotípicas (Fig.con precisión cada sonda sobre el complemen- 2C). Otra de las sondas de secuencias conser-to cromosómico y representarlas en un idiogra- vadas y repetidas en tándem que se empleanma. A diferencia de la citogenética clásica, la habitualmente en experimentos de FISH sonidentificación de cromosomas o de segmentos las teloméricas (Fig. 2D). Las mismas soncromosómicos particulares usando sondas de utilizadas tanto para establecer con precisiónFISH es independiente de la morfología cromo- los límites cromosómicos como para revelar in-sómica y, por lo tanto, es posible reconocerlos versiones que comprenden los segmentos cro-en diferentes estados del ciclo celular. mosómicos distales y la ocurrencia de fusiones Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 37
  • 39. cromosómicas. Las sondas de secuencias no mosómicos; mientras que las de secuenciasconservadas repetidas en tándem son muy repetidas dispersas lo son para definir regio-útiles para el desarrollo de marcadores especí- nes cromosómicas o genomios, en particular,ficos de cromosomas y de complementos cro- para identificar los genomas parentales en losFIGURA 2. A: Bandeo Ag-NOR en una metafase de Arachis hypogaea donde se identifican las regionesorganizadoras del nucleolo en marrón oscuro (flechas). B: bandeo con quinacrina que distingue las regio-nes heterocromáticas ricas en AT (en amarillo intenso) de las regiones eucromaticas (amarillo pálido) enlos cromosomas prometafásicos de Oziroe argentinensis. C: FISH doble en una metafase de A. batizocoien donde se localizan los genes ribosomales 5S (en verde) y 45S (en rojo), la contratinción realizada conDAPI diferencia bandas heterocromáticas centroméricas ricas en AT (en blanco) de las porciones cromo-sómicas eucromáticas (en azul). D: FISH que revela las regiones teloméricas (verde) de A. hypogaea. E:FISH que revela la distribución preferencial de un retroelemento en el genoma A de A. hypogaea. F: GISHdoble sobre una metafase de A. hypogaea utilizando como sondas ADN genómico de A. ipaensis (rojo) yde A. duranensis (verde) que demuestra la constitución alopoliploide del cultígeno y las especies diploidesprogenitoras más probables. G y H: ARN-FISH en antera y ovario de Paspalum notatum utilizando comosonda un ARN marcado de expresión diferencial y tejido-específica en plantas apomícticas pero no sexua-les. La intensidad del color violeta indica cantidades relativas del ARN analizado presente en los diferentestejidos de plantas apomícticas. La barra representa 5 micras en A, C-F, 10 micras en B, 200 micras en Gy 100 micras en H.38 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 40. híbridos interespecíficos y en los alopoliploi- genómico total y no por un fragmento de ADNdes (Fig. 2E). Ambos tipos de secuencias re- de secuencia conocida. El ADN utilizado parapetidas pueden mostrar diferencias notorias en construir estas sondas es extraído mediantelos motivos que las componen, así como en su protocolos estándares y luego es marcado porabundancia y distribución, aún entre especies nick translation o por amplificaciones al azarestrechamente emparentadas. El análisis del usando cebadores cortos (random priming).conjunto de las secuencias repetitivas consti- El éxito de GISH depende del grado de dife-tuye una herramienta excelente, en sí misma o renciación que presenten los genomios que secomo complemento de otras técnicas, para la pretende analizar. Por lo general, las secuen-identificación de cromosomas y genomios, el cias codificantes de los genomas de dos es-estudio de la arquitectura nuclear y los análisis pecies más o menos relacionadas no varíanfilogenéticos. También nos permiten realizar substancialmente entre sí, por lo tanto, la hi-estudios detallados de aberraciones cromosó- bridación diferencial de las sondas en GISHmicas estructurales y numéricas, hacer infe- está determinada principalmente por el gradorencias sobre los mecanismos involucrados en de divergencia del componente repetitivo dela evolución cromosómica y realizar el segui- los genomas en cuestión. En la medida en quemiento de cromosomas o regiones particulares los dos genomas presenten más secuenciasen las sucesivas generaciones de los progra- en común, mayor será la dificultad para distin-mas de mejoramiento. Las sondas de secuen- guirlos. Una estrategia para mejorar la capaci-cias únicas hibridan con el ADN cromosómico dad discriminante de esta técnica consiste encorrespondiente a un locus específico. A dife- realizar un GISH simple utilizando ADN de unrencia de las secuencias repetidas que pueden genoma marcado (sonda) junto con una deter-ser localizadas fácilmente por FISH, la detec- minada proporción de ADN sin marcar del ge-ción de las secuencias únicas es más laboriosa noma que no se va a detectar (sonda fría). Endebido a que, por lo general, las regiones codi- cambio, cuando la diferencia entre las secuen-ficantes de los genes presentan longitudes me- cias de los genomas considerados es alta senores que las detectables por FISH convencio- puede utilizar GISH doble o triple, colocandonal (10 kb). El empleo de grandes bloques de sobre el preparado mezclas equimolares de lasADN genómico clonado en vectores, como los sondas marcadas diferencialmente para cadacromosomas artificiales de bacterias (BACs), uno de los genomas que se quiere distinguir enen combinación con FISH (BAC-FISH), cons- una metafase. Las regiones cromosómicas quetituye un método efectivo para el mapeo físico hibridan con una sola sonda se visualizan conde secuencias únicas de ADN. Sin embargo, el el color original del fluorocromo, mientras queADN repetitivo presente en las regiones no co- las que presentan complementariedad con dosdificantes de los insertos muchas veces genera o más sondas presentan colores intermedios.patrones de señales dispersas o inespecíficas Entre las diferentes aplicaciones de GISH,(background). A pesar de esta dificultad, hasta se destaca el estudio de la composición ge-el momento, BAC-FISH constituye una de las nómica de los alopoliploides y de los híbri-mejores técnicas para correlacionar los mapas dos naturales o artificiales. En estos casos,genéticos con los físicos, ya que se pueden de- la técnica se basa en la hibridación del ADNsarrollar sondas específicas para cada cromo- genómico marcado de los probables ancestrossoma o locus en particular. o progenitores sobre las preparaciones cromo- sómicas del material en estudio. La hibridación 4 Hibridación in situ genómica (GISH) diferencial de las sondas con sólo un subgrupo de cromosomas en una metafase constituye Esta técnica se utiliza para identificar los di- una clara evidencia de que el material estudia-ferentes genomios presentes en un organismo do está compuesto por diferentes genomios.híbrido o alopoliploide. Aunque aplica todos los Mediante el empleo de GISH se han deter-principios de FISH, difiere de ésta porque las minado los progenitores probables de algunassondas que utiliza están constituidas por ADN especies alopoliploides cultivadas como el ta- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 39
  • 41. baco, la avena, el trigo y el maní (Fig. 2F). Otra 5 Mapeo por amplificación directa de se-de las ventajas de analizar los híbridos y los cuencias de interés por PCR in situ (PRINS)alopoliploides con GISH doble o múltiple, con-siste en la capacidad que ofrece esta técnica La técnica de PRINS (“primed in situ”) espara detectar translocaciones intergenó- considerada como una alternativa a ISH paramicas, las que pueden pasar inadvertidas la detección de ciertos tipos de secuenciascon los métodos convencionales de aná- de ácidos nucleicos. Esta técnica involucra lalisis genómico. Aplicado a células meióti- extensión de cebadores diseñados para lascas, GISH proporciona un método preciso secuencias blanco por medio de la Taq poli-para el análisis de los apareamientos cro- merasa. Durante la extensión, se incorporanmosómicos que ocurren en los genomas nucleótidos marcados con fluorocromos ohíbridos. El estudio de la capacidad de los haptenos a fin de permitir la localización físicacromosomas de aparearse en meiosis es el de las secuencias en forma directa o indirectaprocedimiento utilizado tradicionalmente mediante protocolos adicionales de detección.para establecer las relaciones genómicas Comparada con FISH convencional, PRINSentre diferentes especies. Sin embargo, ofrece algunas ventajas tales como: 1) el em-en muchas configuraciones metafásicas pleo de cebadores diseñados a partir de un mí-resulta difícil distinguir los apareamientos nimo de información de la secuencia blanco, 2)ocurridos entre cromosomas homólogos dichos cebadores pueden hibridar con secuen-de aquellos ocurridos entre cromosomas cias de ADN más fácil y rápidamente que lashomeólogos (i.e. parcialmente homólogos). sondas (de mayor tamaño) usadas en FISH,Mediante GISH es posible “pintar” los cro- aún en cromatina compacta, 3) no requiere elmosomas y, de este modo, determinar el marcado de sondas y 4) los cebadores puedenorigen genómico de los cromosomas apa- ser extendidos aún dentro de las secuenciasreados y no apareados, tanto en profase adyacentes (a diferencia de FISH que dependecomo en metafase de la meiosis I. La técnica de una secuencia específica), reforzando la in-de GISH también constituye una herramienta tensidad de la señal para una secuencia corta.irreemplazable para el desarrollo de progra- Mediante PRINS se han localizado secuenciasmas de mejoramiento vegetal que involucran repetitivas en tándem (secuencias teloméricas,hibridaciones interespecíficas o intergenéricas elementos móviles y ADNr) en cromosomas deya que permite: 1) confirmar el origen híbrido leguminosas (Vicia faba y Pisum sativum) y dede la progenie, 2) determinar el origen de los gramíneas (Hordeum vulgare, Avena sativa ycromosomas en las distintas generaciones, Lolium multiflorum). Todos los loci encontradosen particular, cuando los híbridos F1 muestran fueron coincidentes con los hallados por FISH.inestabilidad cromosómica tal como la elimi- Los resultados demuestran que la técnica denación cromosómica uniparental, 3) identificar PRINS es apropiada para la localización rá-bivalentes interparentales en la meiosis de los pida de repeticiones en tándem sobre cromo-híbridos F1 sexuales y 4) comprobar si los cro- somas vegetales cuando la distancia entre losmosomas recombinantes son transmitidos a lassiguientes generaciones. Esta técnica también cebadores es pequeña (1 kb) y los blancos sonha sido utilizada para detectar regiones croma- largos (100 – 500 kb). Sin embargo, no se ob-tínicas introgresantes, especialmente aquellas tienen buenas señales cuando las secuenciasque portan caracteres agronómicos de interés. repetidas están muy separadas entre sí, comoUn ejemplo de ello es el análisis de una línea ocurre con el gen de la vicilina. Este gen estáélite de cebada introgresada con Hordeum bul- repetido muchas veces en el genoma de Viciabosum resistente a roya. Mediante una combi- faba, pero cada copia está separada por unanación de GISH y FISH se pudo determinar la distancia mayor de 12 kb. En estos casos, ellocalización de los fragmentos cromosómicos empleo de FISH resulta más adecuado dadode H. bulbosum introgresados en el comple- que se obtienen mejores señales. Por otra par-mento cromosómico de cebada que le confe- te, PRINS no ha presentado ventajas con res-rían dicha resistencia. pecto a FISH convencional para la detección40 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 42. de secuencias simples en la mayoría de los características hacen que los cromosomas pa-casos, aún utilizando PRINS cíclico que invo- quiténicos constituyan el material de elecciónlucra de 5 a 10 ciclos de amplificación. Una de para los estudios de FISH de alta resolución,las mayores desventajas de PRINS es el alto en particular, para identificar secuencias blan-grado de aparición de señales inespecíficas, co de alrededor de 10 kb y resolver dos lociprobablemente debido a la incorporación de separados por menos de 100 kb.nucleótidos marcados en los extremos 3´OH Por otra parte, la técnica de FISH sobrelibres que resultan de roturas espontáneas de cromosomas mitóticos extendidos utilizalos cromosomas durante el procesamiento del cromosomas metafásicos seleccionados pormaterial. Estas incorporaciones indeseables citometría de flujo a partir de meristemas ra-pueden disminuirse mediante el tratamiento dicales sincronizados. El estiramiento de loscon ligasa o incorporando 2´, 3´ - didesoxinu- cromosomas se realiza mediante una digestióncleótidos (ddNTP) antes de PRINS. moderada con proteinasa K, antes de la fija- En síntesis, esta técnica es útil para la de- ción con etanol-ácido acético (3:1). Mediantetección rápida de repeticiones en tándem gran- este procedimiento, se pueden obtener cromo-des, pero no constituye una alternativa a FISH somas con una longitud de 10 a 100 veces ma-para la detección de genes de copia simple o yor que la original. Esto permite aumentar la re-para el pintado de los cromosomas en plantas solución de los arreglos de secuencias génicasmediante el uso de un cóctel de cebadores y repetidas sobre los cromosomas, sin perdercromosoma-específicos. la información sobre la orientación relativa con respecto al centrómero y los telómeros. Esta 6 FISH de alta resolución técnica posee una resolución similar a la que utiliza cromosomas paquiténicos y es muy útil Bajo este concepto se agrupan una serie de en aquellas especies en las que la obtencióntécnicas que, utilizando los mismos principios de buenos preparados meióticos es dificultosade FISH convencional, permiten hacer hibri- o en aquellas que poseen cromosomas paqui-daciones sobre cromosomas profásicos o aún ténicos difíciles de resolver.sobre núcleos interfásicos. Estas estrategias - FISH en núcleos interfásicos: esta técni-permiten aumentar tanto la resolución como la ca se aplica a núcleos en cortes de tejidos asísensibilidad de la detección. como a núcleos aislados, y permite incremen- tar tanto la sensibilidad como la resolución de - FISH sobre cromosomas poco conden- FISH.sados: consiste en el análisis de cromosomas Para el análisis de los núcleos en tejidos,meióticos en paquitene o de cromosomas mi- los órganos de la planta se fijan con formalde-tóticos extendidos. hído o glutaraldehído (este último en baja pro- La técnica de cromosomas paquiténicos porción ya que puede inducir autofluorescen-se aplica a células madres del polen fijadas en cia), luego se cortan con micrótomo y los cortesetanol : ácido acético (3:1) y tratadas con una se montan directamente sobre un portaobjetos.mezcla de enzimas (celulasa, pectiolasa y cito- Debido a que la sonda necesita penetrar en elhelicasa) que digieren la calosa de las paredes tejido para alcanzar el interior del núcleo, secelulares. En general, los cromosomas paqui- realizan diversos pre-tratamientos tendientesténicos vegetales son de 7 a 40 veces más a incrementar la permeabilidad de los tejidoslargos que aquellos de metafases mitóticas, y, además, se emplean como sondas frag-están compuestos por cuatro hebras de ADN mentos marcados cuyo tamaño no supera los(iguales en los homocigotos), son más acce- 100-500 pb. El análisis de las hibridaciones sesibles a las sondas (debido a que tienen una realiza con un microscopio confocal, debido aestructura cromatínica menos condensada) y que este tipo de microscopio permite visuali-presentan marcadores cromosómicos particu- zar las estructuras mediante la reconstrucciónlares (bloques heterocromáticos y knobs) que tridimensional de las secciones ópticas de lapermiten individualizarlos con facilidad. Estas muestra. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 41
  • 43. Para el análisis de núcleos aislados, los rondas de amplificación con anticuerpos paratejidos se disgregan en un buffer de estabiliza- obtener una buena intensidad de las señales.ción apropiado y la fracción de interés se ob- La principal ventaja de fiber-FISH frente a FISHtiene por centrifugación y tamizado en mallas en núcleos interfásicos es que se logra unacon diferentes diámetros de poro. Los núcleos mayor sensibilidad (200 pb) y una resoluciónaislados se colocan directamente sobre un por- a nivel genómico de 1 kb. Esta técnica es detaobjetos y se secan al aire y deshidratan en gran utilidad para analizar clones solapantes,serie alcohólica. Este procedimiento, que tam- detectar rearreglos cromosómicos pequeños,bién puede ser aplicado a suspensiones celu- determinar distancias físicas entre genes y sulares, no presenta mayores problemas de per- orientación, medir tamaños de loci y acelerarmeabilidad para las sondas. Las regiones de el clonado posicional. Sin embargo, su utilidadhibridación de las sondas sobre las secuencias para el mapeo de secuencias es limitada de-de copia simple se observan como señales in- bido a que sólo permite establecer posicionesdividuales dentro del núcleo (dos señales en relativas, perdiendo la orientación real de laslos núcleos diploides), cada una de ellas co- sondas con respecto al centrómero y a los teló-rrespondiente a cada uno de los cromosomas meros. Una variante de esta técnica es el em-homólogos. pleo de cromatina estirada, un procedimiento Mediante estas técnicas también se ha es- que involucra la extensión de las fibras croma-tudiado la organización y la disposición de los tínicas sin remover las proteínas, la que resultacentrómeros, de los telómeros y de los cro- muy útil para examinar las interacciones ADN-mosomas en núcleos interfásicos de diferen- proteínas.tes órganos y tejidos de trigo, arroz, tabaco yArabidopsis thaliana. En particular, las mismas 7 Mapas cromosómicosresultan muy útiles para el análisis de los cam-bios que se producen durante el ciclo celular Estos mapas constituyen una herramientaen las diferentes estructuras cromosómicas fundamental para integrar los mapas físicosdependientes de secuencias. También se em- (basados en el ordenamiento de secuencias yplean para el mapeo de secuencias separadas el armado de contiguos) y los mapas genéti-por distancias menores a 500-1000 kb, ya que cos (derivados de los análisis de ligamiento).en los cromosomas metafásicos las señales de Los mapas cromosómicos permiten posicionarlas sondas separadas por estas distancias se genes y/o marcadores ligados a éstos, consuperponen. respecto a marcadores estructurales propios de los cromosomas (por ejemplo, centrómeros, - FISH en fibras de ADN extendidas (fiber- telómeros, bandas heterocromáticas y cons-FISH): se basa en la hibridación de las sondas tricciones secundarias) o a otros marcadoressobre fibras extendidas de ADN. Esta técnica cromosómicos desarrollados por FISH. Estainvolucra los siguientes pasos: 1) se aíslan los integración facilita el mapeo y el aislamiento denúcleos por medio de mallas de nylon de di- genes particulares por métodos convenciona-ferentes diámetros de poro, 2) se deposita un les y son indispensables para el aislamiento depequeño volumen de la suspensión de núcleos secuencias por microdisección y microclonado.en uno de los extremos de un portaobjetos tra- Para el clonado posicional de secuencias estado con poli-L-lisina (este compuesto reduce importante tener una estimación precisa de laal mínimo la aparición de señales inespecíficas razón kb/cM existente en la región del locusy favorece la extensión de las fibras de ADN), de interés. Esto posibilita la conversión de las3) se agrega un buffer de lisis y se realiza la distancias genéticas establecidas entre losextensión usando un cubreobjetos de manera marcadores y el gen en estudio en distanciassimilar a como se hace un frotis de sangre, y físicas. En general, se ha observado que la dis-4) sobre estos extendidos se realizan las hibri- tancia entre loci en los mapas genéticos (y nodaciones siguiendo el protocolo convencional el orden) puede diferir mucho de la distanciade FISH. Normalmente, se realizan dos o tres establecida en los mapas físicos. Los estudios42 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 44. de los nódulos de recombinación en complejos detectar está poco representado en las mues-sinaptonémicos han revelado que la discrepan- tras, se pueden utilizar protocolos que amplifi-cia entre los mapas físicos y genéticos es el can la señal mediante el precipitado enzimáti-resultado de la distribución no al azar de los co de tiramida sobre los sitios blancos (TSA,eventos de crossing-over a lo largo de los cro- Tyramide Signal Amplification). La aplicaciónmosomas. En este marco, el desarrollo de los de TSA en los protocolos estándares de ISH,mapas cromosómicos ha cobrado importancia consiste en una detección inicial de la sondadebido a que, dependiendo de las regiones marcada con anticuerpos o estreptavidina con-cromosómicas que se analicen y a la frecuen- jugados con una peroxidasa (por ejemplo lacia de recombinación propia de cada una, los de rábano picante, horseradish peroxidase omapas genéticos pueden ser mejores o peores HRP). Posteriormente, se agrega al preparadoestimadores de las distancias físicas reales. tiramida conjugada con algún hapteno o fluoro- Por tal motivo, en varias especies modelo se cromo, la cual es precipitada masivamente porha puesto especial énfasis en el desarrollo de la HRP y unida en forma covalente al sitio demarcadores cromosómicos por las técnicas de detección inicial. El sistema resultante es de-ISH (principalmente BAC-FISH, y Fiber FISH) tectado mediante anticuerpos conjugados conpara poder integrar los grupos de ligamiento fosfatasas alcalinas (para detecciones cromo-genético con cromosomas, y para relacionar génicas estándares) o directamente con mi-las estimaciones de distancia por recombina- croscopía de epifluorescencia. Debido a que lación con la distancia física real (Ver capítulo de tiramida adicionada sólo se deposita en las re-Genómica). giones próximas a la enzima, se logra aumen- tar significativamente la sensibilidad sin perder 8 Análisis de la expresión génica en teji- resolución. La principal limitante de ARN-ISHdos por ARN-ISH radica en que, generalmente, se puede anali- zar una sola sonda por cada hibridación. No Los protocolos de ISH de ARN resultan apro- obstante, esta técnica se ha utilizado parapiados para describir los patrones temporales y comparar los niveles y sitios de expresión deespaciales de expresión de un determinado gen secuencias en numerosas especies de plan-a nivel celular o subcelular. En los organismos tas. Uno ejemplo de ello, es el análisis espacialmulticelulares, ISH constituye un complemento de transcritos expresados diferencialmente ende los análisis de northern blotting, RT-PCR y plantas con reproducción sexual y apomícticasmicroarrays, en los que la extracción de ARN de Paspalum notatum (Fig 2 G y H).de los tejidos resulta invariablemente en la pér-dida de información espacial. Asimismo, si bien 9 FISH cuantitativo para estimar la expre-los microarrays constituyen una de las técnicas sión génica (QUISH)más poderosas para analizar la expresión demuchos genes simultáneamente, con frecuen- A diferencia de la técnica de ARN-FISH, quecia los resultados que se obtienen deben ser utiliza anticuerpos sobre cortes de tejidos paraverificados por métodos independientes tales la detección de la expresión génica, QUISHcomo ISH. El análisis de la expresión génica se basa en la hibridación de oligonucleótidospor ISH generalmente se efectúa sobre cortes gen-específicos marcados con fluorocromosde tejido, aunque también puede realizarse so- directamente sobre porciones de tejidos u ór-bre órganos enteros (“whole-mount ISH”, ISH- ganos enteros, combinada con el análisis deWISH). La técnica se basa en la utilización de secciones ópticas realizadas con un microsco-una sonda (generalmente cDNA) marcada con pio láser confocal de barrido. De este modo,haptenos que se hibridará directamente sobre se logra mejorar notablemente la calidad de loslos cortes de tejido. Las detecciones se reali- resultados debido a que se eliminan los pasoszan con anticuerpos conjugados con fosfata- que generan artefactos e impiden realizar unasas alcalinas o con fluorocromos. cuantificación precisa. La característica clave Para aquellos casos en los que el ARNm a de QUISH es la cuantificación de la expresión Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 43
  • 45. génica utilizando como estándar a los genes de giada para realizar estudios de este tipo ya quemantenimiento celular (genes “housekeeping”, permite unir estructuras nucleares con carac-GAPDH y 18S ARNr). El empleo de este es- terísticas bioquímicas, tales como la actividadtándar permite corregir la variación de la razón transcripcional, la replicación del ADN, las mo-citoplasma/vacuola en los diferentes tipos ce- dificaciones de las histonas y la metilación dellulares, los efectos ópticos de los tejidos y las ADN mediante la inmunodetección de distintosseñales no específicas. La naturaleza cuantita- blancos celulares con anticuerpos conjugadostiva de esta técnica hace posible el análisis de con fosfatasa alcalina o con fluorocromos. Lala expresión génica en órganos, a nivel tisular preparación del material, la fijación, la diges-o celular, independientemente de las diferen- tión de las paredes celulósicas, la permeabi-cias debidas a la edad o a los tipos de tejidos. lización y la incubación con anticuerpos seEste método es mas rápido que los métodos realizan de igual modo que en FISH, aunquetradicionales y puede utilizarse para estudiar la se omiten los pasos de desnaturalización e hi-localización celular de la expresión de uno o bridación. Las técnicas de inmunocitogenéticavarios genes en un período relativamente corto se emplean para analizar la estructura croma-de tiempo. Asimismo, con QUISH es posible in- tínica y la disposición de las diferentes molécu-vestigar los cambios en los niveles de los trans- las que intervienen en las divisiones celulares.criptos durante la ontogenia o, en respuesta a En particular, estas técnicas son útiles paracambios de las condiciones ambientales en di- estudiar la distribución de las modificacionesferentes líneas de plantas modelo. histónicas y la metilación del ADN en relación con la estructura cromatínica en cromosomas 10 Identificación de modificaciones y núcleos durante el ciclo celular. Merecen es- cromatínicas por inmunocitogenética pecial mención aquellos análisis relacionados con las modificaciones que indican estructuras La identidad celular está determinada por cromatínicas abiertas, con potencialidad deun programa nuclear establecido por un pa- transcripción, y las que delimitan estructurastrón complejo de interacciones entre el ADNy las proteínas. La organización del ADN en cromatínicas cerradas, con actividad transcrip-la cromatina regula la expresión y el manteni- cional reprimida. El advenimiento de las técni-miento de la información genética (replicación, cas de citogenética molecular y de inmunocito-reparación, recombinación y segregación) en genética ha permitido disectar progresivamen-forma dinámica. Las colas N-terminales de te el núcleo a nivel de microscopía óptica. Lalas histonas que conforman el núcleo de los detección individual de complejos proteicos ynucleosomas están sujetas a diferentes modi- de secuencias de ARNs y ADN ha revelado laficaciones pos-traduccionales (acetilación, me- existencia de muchos compartimientos nuclea-tilación, fosforilación, ubiquitinación, etc.) las res. Las variaciones en la arquitectura nuclearque, conjuntamente con la metilación del ADN, reflejan la relación existente entre la organiza-controlan el empaquetamiento de los nucleo- ción nuclear y la regulación génica. El análisissomas en arreglos de orden superior y proveen de dicha arquitectura incluye varios paráme-señales para diversos procesos celulares. tros cuantitativos y cualitativos, tales como elAunque las histonas y sus modificaciones son tamaño y forma nuclear, el contenido relativoaltamente conservadas, la distribución de las y la distribución de heterocromatina, los patro-mismas en los cromosomas puede variar a lo nes generales de modificación cromatínica, lalargo de los procesos de diferenciación y del presencia de compartimientos nucleares (nu-ciclo celular, así como dentro y entre grupos cleolos, cromocentros, territorios cromosómi-de eucariotas. Recientemente, se han produci- cos y cuerpos nucleares) y la organización dedo grandes avances en el esclarecimiento del los cromosomas en el núcleo (ie. la posición yllamado código de las histonas y del intrincado la orientación de los cromosomas en el núcleo)mecanismo de regulación epigenética. La cito- y las diferencias en la condensación cromatíni-genética se encuentra en una posición privile- ca a nivel local.44 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 46. 11 Análisis de la posición de la inserción Fernández A. and Daviña J.R. 1991. Heterochroma-de los transgenes tin and genome size in Fortunatia and Camassia (Hyacinthaceae). Kew Bulletin, 46, 307-316. Fransz P.F., Alonso-Blanco C., Liharska T.B., Pee- Diferentes ensayos han demostrado que ters A.J.M., Zabel P. and Jong J.H. 1996. High-la expresión de los transgenes puede variar resolution physical mapping in Arabidopsissignificativamente entre especies diploides thaliana and tomato by fluorescence in situ hy-relacionadas, entre líneas transformadas inde- bridization to extended DNA fibers. The Plant Jo-pendientes, y aún entre generaciones de las urnal, 9, 421-430.líneas trasformadas. Los niveles de expresión Küper H., Ort Seib L., Sivaguru M., Hoekenga O.A.de estas secuencias pueden ser afectados por and Kochian L.V. 2007. A method for cellular lo-diversos factores, entre ellos, la presencia de calization of gene expression via quantitative innumerosas copias de la construcción en uno situ hybridization in plants. The Plant Journal,o varios loci y el contexto genómico en que 50, 159-175. Laspina N.V., Vega T., Seijo J.G., González A.M.,se encuentran las copias. La técnica de FISH Martelotto L.G., Stein J., Podio M., Ortiz J.P.A.,permite mapear los trangenes en cromosomas Echenique V.C., Quarín C.L. and Pessino S.C.metafásicos, en núcleos interfásicos o en fi- 2008. Gene expression analysis at the onsetbras extendidas de ADN y, a su vez, determi- of aposporous apomixis in Paspalum notatum.nar el número de loci en que se encuentran los Plant Molecular Biology, 67, 615-628.mismos. Para el mapeo se utiliza una sonda Lavia G.I., Fernández A. and Seijo J.G. 2008. Cyto-marcada correspondiente al transgen y otras genetic and molecular evidences on the evolu-sondas que permitan identificar los pares cro- tionary relationships among Arachis species. In:mosómicos, un genoma o un subgenoma par- Sharma A.K. and Sharma A. (eds.). Plant Ge-ticular (en el caso de híbridos o alopoliploides). nome: Biodiversity and Evolution. Volume 1E: Phanerogam-Angiosperm. Science Publishers,Uno de los ejemplos clásicos, en el cual se Enfield, NH, USA, 2008. pp 101-134.combinaron diferentes técnicas moleculares y Moscone E.A., Matzke M.A. and Matzke A.J.M.citogenéticas para analizar los efectos del con- 1996. The use of combined FISH/GISH in con-texto genómico en la expresión de los transge- junction with DAPI counterstaining to identifynes fue realizado en tabaco. En el mismo se chromosomes containing transgene inserts inempleó FISH para mapear los trangenes sobre amphidiploid tobacco. Chromosoma, 105, 231-los cromosomas y GISH para identificar los ge- 236.nomas del alopoliploide. A partir de estos es- Robledo G., Lavia G.I. and Seijo G. 2009. Speciestudios, se ha demostrado que, en general, los relations among wild Arachis species with the Atransgenes con expresión estable están locali- genome as revealed by FISH mapping of rDNA loci and heterochromatin detection. Theoreticalzados en las proximidades de las regiones te- and Applied Genetics, 118, 1295-1307.loméricas y ricas en genes, mientras que los de Schwarzacher T. and Heslop-Harrison P. 2000.expresión inestable se localizan en las regio- Practical in situ hybridization. BIOS Scientificnes intercalares o paracentroméricas que son Publishers, Oxford, 2000. pp. 203.más pobres en genes. Por otra parte, la combi- Seijo J.G., Lavia G.I., Fernández A., Krapovickas A.,nación de FISH con técnicas de inmunocitoge- Ducasse D. and Moscone E.A. 2004. Physicalnética permite analizar el contexto epigenético mapping of 5S and 18S-25S rRNA genes evi-de la cromatina circundante a los transgenes dences that Arachis duranensis and A. ipaensisy su relación con la expresión de los mismos. are the wild diploid species involved in the origin of A. hypogaea (Leguminosae). American Jour- nal of Botany, 91, 1294-1303. Lecturas / sitios recomendados Seijo J.G., Lavia G.I., Fernández A., Krapovickas A., Ducasse D., Bertioli D.J. and Moscone E.A.Bennett M.D. 1995. The development and use of ge- 2007. Genomic relationships between the culti- nomic in situ hybridization (GISH) as a new tool vated peanut (Arachis hypogaea - Leguminosae) in plant biosystematics. In: Brandham P.E. and and its close relatives revealed by double GISH. Bennett M.D. (eds.). Kew Chromosome Confe- American Journal of Botany, 94, 1963-1971. rence IV. Royal Botanic Gardens, Kew, 1995. pp Solís Neffa V.G. and Fernández A. Karyotypic stu- 167-183. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 45
  • 47. dies in Turnera sidoides complex (Turneraceae, Leiocarpae). 2002. American Journal of Botany, 89, 551-558.Stein N., Ponelies N., Musket T., McMullen M. and Weber G. 1998. Chromosome micro-dissection and region-specific libraries from pachytene chromosomes of maize (Zea mays L.). The Plant Journal, 13, 281–289.Terkelsen C., Koch J., Kølvraa S., Hindkjær J., Pe- dersena S. and Bolund L. 1993. Repeated pri- med in situ labeling: formation and labeling of specific DNA sequences in chromosomes and nuclei. Cytogenetics and Genome Research, 63, 235-237.46 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 48. I.-Capítulo 4 replicación y reparación de ADN así como de la replicación de virus y plásmidos y la síntesis química de secuencias de nucleótidos. De estaHerramientas Básicas de manera, puede decirse que la tecnología delIngeniería Genética ADN recombinante esta integrada por diversas estrategias metodológicas, muchas de las cua-Ingrid Garbus, Marisa Gómez les son adaptaciones de procesos naturales dey Viviana Echenique la genética microbiana que han sido estudia- dos y se conocen en profundidad. Introducción LA CLONACIÓN MOLECULAR O Hasta principios de los años 70, el ADN CLONACIÓN DE GENESera la molécula de la célula que planteabamás dificultades para su análisis bioquímico. La finalidad de la clonación molecular es laExcesivamente larga y químicamente monóto- obtención de un determinado fragmento dena, la secuencia de nucleótidos del DNA tan ADN, que puede corresponder a un gen, inser-solo podía ser estudiada por caminos indirectos to en un vector capaz de replicarse, pudiéndo-tales como la determinación de la secuencia de se posteriormente amplificar a varios millonesproteínas, o del RNA. Actualmente, es posible de copias, por ejemplo para análisis de se-separar regiones determinadas del ADN, ob- cuencia o para obtener grandes cantidades detener cantidades ilimitadas de esos fragmen- un producto génico.tos y determinar incluso la secuencia de esos El desarrollo de la tecnología del ADN re-nucleótidos. Estos adelantos técnicos forman combinante y la clonación molecular han apor-parte de la tecnología del ADN recombinante, tado sofisticados procedimientos que permitende cuyo desarrollo han sido pilares fundamen- el aislamiento, purificación y replicación detales el conocimiento de las enzimas de res- fragmentos específicos de ADN. La clonacióntricción, el esclarecimiento de los procesos de de segmentos de ADN, también llamada crea- ción del ADN recombinante requiere esencialmente de las etapas que se enume- ran a continuación (Fig. 1) 1. Obtención del ADN a clonar Según la estrategia ex- perimental involucrada, el ADN a clonar puede tener diferentes procedencias. Puede tratarse de ADN de origen genómico, de un producto de amplifica- ción por PCR, provenir de la síntesis in vitro, a partir de una retrotranscripciónFigura 1. Etapas básicas en la clonación de un fragmento de ADN. En (ADNc) tomando comoprimer lugar el ADN a clonar y el vector (plásmido) se cortan con la mis- molde el ARNm o de lama enzima de restricción. Luego se ponen en contacto en presencia de síntesis in vitro de secuen-la enzima ligasa para obtener una molécula de ADN recombinante que cias previamente defini-se introduce en bacterias que multiplicarán el plásmido junto con el frag- das. Cuando el material demento de interés. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 47
  • 49. partida es el ADN genómico, los fragmentos a copias idénticas. Los organismos hospeda-ser clonados deben ser escindidos mediante el dores utilizados en biología molecular debenempleo de enzimas de restricción. En algunas contener toda la maquinaria genética para lasituaciones, particularmente cuando se trata amplificación del ADN recombinante. Puedede la clonación de productos de PCR, los frag- tratarse de organismos procariotas (bacterias)mentos deben ser aislados en función de su o eucariotas (levaduras, células de mamíferostamaño. Este aislamiento se lleva a cabo a tra- cultivadas). En el caso de la utilización de sis-vés de electroforesis en geles de poliacrilamida temas bacterianos, la introducción se realizao agarosa. valiéndose de los procesos naturales de la ge- nética microbiana o modificaciones específicas 2. Elección del vector de clonación de los mismos. De estos métodos modificados, el más ampliamente utilizado es el de transfor- Un vector de clonación es una molécula de mación en célula competente (ver vectores deADN que vehiculizará al fragmento de interés y clonación). Otra forma de introducir el ADN enpermitirá su amplificación, resultando de esta la célula hospedadora, de elección para molé-manera indispensable para la creación del culas de ADN de gran tamaño, es el procesoADN recombinante. Uno de los principales re- de electroporación, que consiste en la creaciónquisitos para que una molécula de ADN pueda de poros en la membrana celular inducida poractuar como vector, es la capacidad de auto- descargas eléctricas que permiten la introduc-rreplicación que irá acompañada de la replica- ción del ADN. Los plásmidos híbridos, introdu-ción del fragmento inserto. También es nece- cidos a través de alguno de estos procesos,sario que los vectores tengan un tamaño que continuarán replicándose en la célula hospeda-permita su manipulación fuera de la célula. Los dora mientras ésta crezca y se divida, siempremás pequeños se manipulan con mayor facili- que sea mantenida la presión de selección.dad que las moléculas de ADN más grandes,que tienden a ser más frágiles. Los vectores de 5. Identificación y selección de las célulasclonación más utilizados derivan del genoma que contienen al ADN recombinanteviral o de plásmidos bacterianos. Los compo-nentes esenciales de un vector de clonación En el esquema de transferencia del ADN re-son el origen de replicación, un gen marcador combinante al hospedador descripto anterior-responsable de alguna característica fenotípi- mente, se asume que durante la transforma-ca para la selección y al menos un sitio único ción, no todas las bacterias reciben una copiade restricción. del vector híbrido. Es necesario seleccionar aquellas células que han incorporado el vector, 3. Generación del ADN recombinante a través de la utilización de marcadores géni- cos presentes en los vectores de clonación. Los El término ADN recombinante se emplea más comúnmente empleados son los genes depara hacer referencia al material genético a resistencia a antibióticos y el fragmento funcio-clonar unido al vector de clonación. Para su nal de lac Z, el gen de E. coli que codifica paraobtención es requisito contar con los dos frag- la enzima β-galactosidasa (β-gal). Estos genesmentos de ADN en forma pura, y ligarlos en- marcadores tienen insertado un sitio múltiple dezimáticamente por acción de la enzima ADN restricción (polylinker), de manera que cuandoligasa, en presencia de ATP. los fragmentos de ADN son clonados en el po- lylinker del gen lacZ, anulan la actividad de la 4. Introducción del ADN recombinante en β-galactosidasa. Esta enzima hidroliza un com-el organismo hospedador puesto químico denominado X-gal, y se libera un colorante azul relativamente insoluble. El Este proceso es realmente el verdadero X-gal se incorpora al medio de cultivo en placaevento de clonación, en el cual el ADN re- de Petri donde desarrollarán las células hospe-combinante es “clonado” para producir varias dadoras del ADN recombinante. Si el ADN clo-48 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 50. nado se insertó en el polylinker y desactivó la al lector en las herramientas metodológicas deβ-galactosidasa, no se producirá pigmento azul biología molecular más ampliamente utilizadas.y las células formarán colonias que se veránblancas en la placa de Petri. Caso contrario las 1. VECTORES DE CLONACIÓNcolonias de las células hospedadoras se veránde color azul. Cuando el marcador es un gen Como hemos mencionado, un vector es unade resistencia a los antibióticos, las células se molécula de ADN a la que se unirá el fragmen-inoculan en medio agarificado que contiene el to de interés resultando en el ADN recombi-antibiótico cuya resistencia confiere el vector, nante y, debido a su capacidad de autorrepli-de manera que sólo sobrevivirán aquellas cé- cación, permitirá la amplificación del fragmentolulas que lo contienen. Luego deberá buscarse insertado. Los vectores de clonación de últimaespecíficamente aquellas células que poseen generación son muy prácticos y sencillos deel fragmento de interés. Estos dos marcadores manejar. Incluyen un sitio múltiple de clonaciónsuelen ser utilizados en forma conjunta de ma- o sitio de restricción múltiple (“polylinker”) quenera que solo las colonias portadoras del vec- es un segmento corto de ADN con sitios de res-tor crecerán en medio con antibiótico, y, para- tricción para varias enzimas diferentes, cadalelamente, las colonias que poseen el plásmido uno de ellos único para el vector (Fig. 2). Esterecombinante serán de color blanco. sitio suele formar parte del marco abierto de Una vez obtenidas las colonias recombinan- lectura (“ORF”) de un gen responsable de algu-tes los pasos a seguir incluyen la amplificación na característica fenotípica, por lo que resultade la colonia en medio líquido con antibiótico, sencillo confirmar si tras la restricción se ha ob-purificación del plásmido a partir de la suspen- tenido el plásmido híbrido, ya que la inclusiónsión de bacterias y comprobación de la presen- del inserto produce la pérdida de funcionalidadcia del inserto esperado. Para la detección del del gen mediante inactivación por inserción.inserto, pueden utilizarse diversas estrategias. Existen diferentes tipos de vectores de clo-La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) nación, entre los que se incluyen:se puede utilizar cuando la secuencia del frag-mento clonado es conocida o para identificarla secuencia de los fragmentos clonados por A) Plásmidos:amplificación con sondas complementarias a Son moléculas de ADN circular, de doblela secuencia terminal del vector. La hibridación cadena, extracromosómicas, presentes en lasmolecular con una sonda específica marcada bacterias, que poseen propiedades muy útilespuede ser utilizada cuando se conoce la se- como vectores de clonación, a saber:cuencia de interés y se dispone de dicha son- 1. Pequeño tamaño que hace sean fáciles deda. En otros casos, se realiza la selección en aislar y manipular.función del tamaño del inserto, para lo que el 2. Son circulares, lo que hace que el ADN seaplásmido recombinante es digerido median- más estable durante su aislamiento químico.te enzimas de restricción y posteriormente se 3. Su replicación transcurre independiente-realiza una corrida electroforética en gel de mente del ADN nuclear en la célula bacteriana.agarosa. 4. Existen múltiples copias en la célula, de- pendiendo del plásmido y de la especie hos- Herramientas y Procedimientos pedadora puede haber de varias a numerosasImplicados. copias (por ej. 1000 a 3000 copias de pBR322 por célula). A pesar de que la obtención de ADN recom- 5. La presencia de genes de resistencia abinante pudo ser explicada a través de cinco los antibióticos que actúan como marcadorespasos sencillos, es muy amplio el conjunto de seleccionables facilita la detección y selecciónherramientas y metodologías experimentales de los clones que los contienen.que están involucradas en su desarrollo. El El tamaño de los insertos que se pueden clo-objetivo de esta parte del capitulo es introducir nar puede ser considerable, sin embargo si son Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 49
  • 51. Figura 2. Elementos genéticos que constituyen un vector de clonación. a) Sitio de restricción múltiple queconsiste en un corto segmento de ADN con varios sitios de restricción, cada uno de ellos único para elvector. b) representación esquemática del plásmido pBR322 con el origen de replicación (Ori) y los genesmarcadores de resistencia a tetraciclina (TETR) y ampicilina (AMPR) que contienen los sitios de restricción deBamHI y PstI, respectivamente;mayores de 10 kb, el plásmido se hace gene- tanto, cuando pBR322 es digerido con BamHIralmente inestable. y se liga a un ADN, y luego se aíslan los clones Aunque en el ambiente natural los plásmidos transformados, aquellos transformantes queconjugativos generalmente se transfieren por posean resistencia a la tetraciclina y ampicilinacontacto célula a célula, los plásmidos vecto- no portan ningún ADN clonado. Aquellas célu-res de clonación generalmente han sido modi- las que continúan siendo resistentes a la ampi-ficados a fin de evitar su transferencia por con- cilina pero sensibles a la tetraciclina, contienenjugación y así lograr su contención biológica. el plásmido con el fragmento del ADN clonado.Sin embargo, en el laboratorio es posible rea- Como la resistencia a la ampicilina y a la te-lizar la transferencia a la célula hospedadora traciclina puede determinarse independiente-por transformación, utilizando choque térmico mente en placas con agar, resulta fácil aislaren presencia de cloruro de calcio o mediante bacterias que contengan los clones deseadoselectroporación. y eliminar las células que no los contengan. Aunque los primeros plásmidos utilizadosexistían en forma natural, los vectores de clo- B) Bacteriófagos o fagos:nación actuales constituyen una generaciónposterior de vectores construidos in vitro, como Fago λ: se caracteriza por ser un fago es-el plásmido pBR322 (Fig. 2). En este plásmi- pecializado en la transducción (transduccióndo, el sitio de restricción de BamHI está dentro especializada) por lo tanto este fago puede uti-del gen de resistencia a la tetraciclina, y el sitio lizarse también como vector de clonación parapara PstI está dentro del gen de resistencia ala ampicilina. Si se inserta un fragmento de un la recombinación in vitro. Es un vector de clo-ADN en uno de estos sitios, la resistencia al an- nación particularmente útil porque:tibiótico conferida por el gen que contiene este 1. Se conoce bien su estructura, genéticasitio se pierde (inactivación por inserción). Por molecular y funcionamiento50 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 52. Puede insertar mayor cantidad de ADN que coli y la capacidad de empaquetamiento in vitrola mayoría de los plásmidos (entre 10 y 20 kb) del cromosoma de λ y contienen el origen de El ADN puede ser eficientemente empaque- replicación y los genes de resistencia a los anti-tado in vitro dentro de las partículas del fago bióticos de su plásmido parental. Cos proviene Las partículas del fago son mucho más efi- de sitio cohesivo (“cohesive site”) en referen-cientes en la infección de las células hospeda- cia a la terminal de simple cadena de 12 basesdoras (transfección) que la transformación. complementaria en el cromosoma de λ madu- El fago λ tiene un mapa genético comple- ro. El sitio cos es reconocido por el sistemajo. El tercio central del cromosoma, que con- de empaquetamiento de ADN de λ, haciendotiene genes requeridos para la lisogenia pero cortes escalonados que originan los extremosno para el ciclo lítico, puede ser escindido por cohesivos complementarios en el cromosomarestricción y substituido por ADN foráneo (Fig maduro del fago. La principal ventaja de los3a). El ADN recombinante resultante puede ser cósmidos como vectores es su habilidad paraempaquetado en las cabezas del fago in vitro, insertar fragmentos de ADN de 35 a 45 kb.pudiéndolas el fago inyectar en E. coli, que sereplica produciendo colonias bacterianas que D) Fásmidos (fagémidos):contienen los fragmentos a clonar. Dado que el fago λ silvestre tiene excesiva Son vectores híbridos entre el fago M 13 ycantidad de sitios de restricción, no es indica- el plásmido pBR323 que contienen los oríge-do como vector de clonación por lo que se han nes de replicación de ambos. Normalmente laconstruido fagos λ modificados (Charon), en replicación depende del plásmido, pero cuandolos cuales los sitios de restricción no deseados una célula que contiene un fásmido se infectahan sido modificados con un fago de tipo salvaje, el origen del fago Fago M13 es un fago filamentoso que con- es responsable de la replicación y se generantiene ADN monocatenario y se replica sin ma- copias monocatenarias. Este ADN monocate-tar a su hospedador. Sin embargo, para po- nario es empaquetado en viriones y puede ais-der usar M13 para la clonación es necesario larse fácilmente y ser utilizado para secuenciar.disponer de una forma bicatenaria ya que las Habitualmente los fásmidos pueden transportarenzimas de restricción sólo trabajan sobre de forma estable un fragmento de ADN clonadoADN bicatenario. El ADN bicatenario de M13 mayor que un vector típico derivado de M13.puede obtenerse de células infectadas, dondese encuentra en forma replicativa bicatenaria. E) Cromosomas artificiales:La mayor parte del genoma del tipo silvestrecontiene información genética esencial para A partir de la creación de proyectos de se-la replicación. Sin embargo existe una peque- cuenciación de genomas completos se gestaña región, llamada secuencia intergénica, que la necesidad de obtener vectores que alber-puede ser utilizada como sitio de clonación. guen porciones de ADN de mayor tamaño paraEs posible clonar ADN de longitudes variables efectuar el análisis genómico y obtener mapashasta 5kb sin afectar la viabilidad del fago. El físicos de cromosomas. El primer sistema deADN monocatenario de M13 y de sus vectores clonado de grandes fragmentos de ADN fuederivados, ha sido extremadamente útil para informado en 1987 por Burke y colaborado-secuenciar ADN. res, los cromosomas artificiales de levaduras Tanto en el fago λ como el M13 se ha inser- (YACs), minicromosomas con la capacidad detado como marcador el gen lacZ. contener insertos de ADN de 200-500 kbp (Fig. 3b). Los YACs son vectores de DNA lineares C) Cósmidos: que contienen los elementos esenciales de los cromosomas de la levadura, como por ejemplo Son híbridos entre plásmidos y el fago λ y el origen de replicación ARS (Autonomouslycombinan las ventajas de ambos como vecto- Replicating Sequence). Introducidos en la cé-res. Poseen la habilidad del plásmido para re- lula de levadura, los YACs se replican y segre-plicarse autónomamente en las células de E. gan junto con el complemento cromosómico Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 51
  • 53. Figura 3. Vectores de clonación. Se muestran los elementos genéticos que constituyen los vectores declonación. a) Fago lambda. El cromosoma se organiza de acuerdo con las proteínas codificadas por losgenes: C&C: cabeza y cola, genes de proteínas de la cápside, de unión cabeza-cola y de estabilización yempaquetamiento de ADN, rec: genes de recombinación, proteínas para la integración y escisión del ADNdel fago en el cromosoma de la bacteria hospedadora, reg: genes regulatorios, para el cambio entre losdistintos ciclos del fago, rep: región de replicación, con el origen de replicación y los genes O y P, lisis:genes que posibilitan la lisis celular, b) Cromosoma artificial de levadura (YAC). ARS: origen de replicación,CEN: centrómero, TEL: telómeros, URA: gen marcador seleccionable para el desarrollo en medio con ura-cilo. Amp: gen marcador seleccionable en medio con ampicilina. El ADN es clonado en el sitio BamHI. C)Cromosoma artificial de bacterias (BAC). Deriva del factor bacteriano F. Su esqueleto contiene regionesesenciales que le otorgan estabilidad y bajo número de copias en cada bacteria, parA, parB y parC. oriS:origen de replicación unidireccional. CMr: gen marcador seleccionable en medio con cloranfenicol, repE:gen de proteína autoregulatoria esencial para la replicación desde oriS. pBeloBAC11, el vector BAC masutilizado, tiene tres sitios únicos de clonado, HindIII, BamHI y SphI dentro del gen marcador lacZ.habitual. El marcador seleccionable suele ser junto con la falta de familiaridad en el manejoun gen de tipo silvestre que le confiere la ca- de levaduras entre biólogos moleculares, limi-pacidad prototrófica a la célula hospedadora. taron el uso de los YACs. Para superar estasEl mas comúnmente utilizado es URA3+, que dificultades fueron desarrollados los cromo-confiere a las auxótrofos URA3- la capacidad somas artificiales de bacterias (BACs) consti-de desarrollarse en un medio de cultivo sin ura- tuyen un sistema de clonación que mantienecilo. Durante la meiosis los YACs se aparean un bajo número de copias en cada bacteria,con cualquier YAC homólogo presente, resul- garantizando una recombinación mínima entretando en una alta frecuencia de recombina- diferentes fragmentos de ADN y son de sencillación entre los fragmentos clonados. Esta alta manipulación. Los BACs se basan en el plás-frecuencia de quimerismo lleva a predicciones mido F de 7kb de E. coli y pueden llevar inser-inexactas en los mapas físicos moleculares y, tos de 300 kb aunque el promedio es de 10052 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 54. kb (Fig. 3c). Contienen como elementos esen- la de ADN y ser transformadas se denominanciales una copia del origen de replicación de E. competentes. Estas células secretan el factorcoli, un marcador de selección que suele ser de competencia, que es una pequeña proteínaun gen de resistencia a antibióticos y un siste- que induce la síntesis de otras 8 a 10 nuevasma de recombinación sitio-especifico (cre-lox), proteínas requeridas para la transformación.cuyo rol consiste en forzar la circularización de La transformación es un proceso que ocurregrandes insertos. Los cromosomas artificiales sólo en algunas especies bacterianas.derivados del fago P1 (PACs) permiten la clo-nación de fragmentos de 80-100 Kpb y, al igual Transducción: se refiere a la transferen-que los BACs, presentan bajo grado de qui- cia del ADN de una célula a otra por medio demerismo. El fago P1 se replica primero como un fago, denominación utilizada para los virusplásmido de bajo número de copias y luego cuando se trata de hospedadores bacterianos.como un largo segmento de ADN compuesto Esta transferencia de genes puede ocurrir depor múltiples copias de la secuencia repetida dos maneras:(concatemero), que es empaquetado en la ca- a) transducción generalizada: una frac-beza del fago por un mecanismo similar al del ción del ADN celular, que puede proceder delfago lambda. Las propiedades de los clones cromosoma o del plásmido del hospedador,PAC permiten la iniciación de empaquetamien- durante el ensamblaje del virus pasa a formarto en las etapas de clonación, escisión de las parte del ADN de la partícula vírica madura, re-secuencias de alto número de copias después emplazado el genoma del fago. Una vez quede la infección bacteriana y la inducción de la son liberados, estos fagos anormales puedenreplicación inmediatamente antes la amplifica- pegarse a otras células y donar ADN, pero noción del ADN. Utilizan al igual que los BACs el dan lugar a lisogenia ni a lisis dado que no pue-sistema cre-lox. den replicarse independientemente por carecer de gran parte del ADN fágico. Si los genes del Introducción del vector en la célula donador no sufren recombinación homólogahospedadora con el cromosoma de la bacteria de la célula receptora se perderán. En el caso de la utilización de sistemas bac- b) transducción especializada (restringi-terianos, la introducción del vector en la célula da): ocurre sólo en algunos virus atempera-hospedadora se realiza valiéndose de los me- dos, es decir, aquellos que se integran en elcanismos naturales de la genética microbiana genoma como parte de su ciclo biológico. Endado que en los procariotas existen mecanis- este mecanismo el ADN de una región especí-mos de intercambio genético, que permiten fica del cromosoma del hospedador se integratanto la transferencia de genes como la recom- directamente en el genoma del fago, reempla-binación del inserto, a través de uno de los si- zando algunos de sus genes. El genoma fági-guientes procesos genéticos: co recombinante puede empaquetarse segui- damente en una cabeza de fago y el resto del Transformación: es un proceso por cual fago puede ensamblarse normalmente. Esteel ADN libre del medio ambiente se incorpora fago puede carecer de la capacidad de repli-en una célula receptora, trayendo aparejado car, no obstante puede inyectar su ADN, queun cambio genético. Una cadena de este ADN contiene además algunos genes de la célulalibre, llamado donador, es captada y puede receptora a una nueva célula receptora. Pue-transformar genéticamente la célula receptora de también ocurrir recombinación homóloga,por recombinación con una región homóloga sin embargo, como el ADN donador bacteria-del cromosoma. El movimiento de las molécu- no está formando parte del genoma de un fagolas de ADN a través de la membrana y den- atemperado se presentan dos posibilidades:tro del citoplasma de la célula receptora es un que el ADN se integre en el cromosoma delproceso activo, que requiere energía. Las cé- hospedador durante la lisogenización, o que ellulas que son capaces de tomar una molécu- ADN se replique en el receptor como parte de Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 53
  • 55. cada extremo del transposón porta con ella (generalmente) seis nucleótidos de la moléculauna infección lítica. En ambos casos, la partí- hospedadora. (Estas secuencias terminales decula vírica transductora es normalmente defec- simple cadena se denominan secuencias aco-tiva como virus, ya que los genes víricos han plantes). El transposón escindido se circularizasido reemplazados. Si bien no todos los fagos entonces como resultado del apareamiento detienen la capacidad de transducir, ni todas las entre las secuencias acoplantes. Parece pro-bacterias son transducibles, el fenómeno está bable que sólo se transfiera una simple cadenalo suficientemente extendido como para asu- al receptor, y que la cadena complementaria semir que desempeña un importante papel en las sintetice, en el receptor, antes de la inserción.transferencias genéticas que se producen en Las estrategias de introducción de vectoresla naturaleza. en células hospedadoras utilizadas en las téc- nicas in vitro del ADN recombinante, han sido Conjugación: mecanismo de transferencia desarrolladas en base a modificaciones de es-genética mediada por un plásmido que requiere tos procesos naturales de transferencia de ma-contacto de célula a célula. Ciertos plásmidos y terial genético en procariotas.transposones conjugativos confieren a sus cé-lulas hospedadoras la capacidad de transferir 2. Enzimas utilizadas eN laADN a otras células por conjugación. La conju- generación de ADN recombinantegación requiere una célula donadora, que con-tiene un tipo particular de plásmido conjugativo, El requisito primordial para la clonacióny una célula receptora que carece de él. El pro- de un gen o segmento de ADN de interés esceso de conjugación, presenta características poder contar con dicho fragmento en formadiferenciales según se trate de bacterias Gram individual, aislado desde su entorno génico.positivas o Gram negativas. En el primer caso, Para ello, la tecnología del ADN recombinan-las células receptoras secretan un péptido de te cuenta con una herramienta indispensa-pequeño tamaño que provoca que la célula do- ble, las endonucleasas de restricción. Estasnadora sintetice un componente adhesivo en la enzimas reconocen secuencias específicassuperficie celular. El ADN plasmídico es pos- de ADN de 4 a 8 bases de extensión y es-teriormente transferido desde el donador a la cinden los enlaces fosfodiéster del materialcélula receptora adherida. Estos cruzamientos genético en dichos sitios, denominados sitiospueden tener lugar en medios líquidos. En el de restricción. Para actuar como sustrato desegundo caso, el plásmido codifica, entre otras estas enzimas, el ADN debe hallarse comoproteínas, las subunidades de la proteína del doble hebra.pelo sexual, mediante el cual se realiza el con- Son extraídas de organismos procarióti-tacto. El pelo constituye un puente de conjuga- cos, donde actúan como un mecanismo deción a través del cual pasa el ADN permitiendo defensa para degradar material genéticoel apareamiento específico. Durante la conju- extraño que entra en la célula, provenientegación, pueden resultar movilizados otros ele- principalmente de fagos. Para diferenciar elmentos genéticos, como grandes bloques del ADN propio del extraño, las bacterias tienencromosoma del hospedador u otros plásmidos. la capacidad de metilar su propio ADN inme- diatamente después de la replicación, ha- Transposición conjugativa: es una con- ciéndolo de este modo irreconocible por lasjugación independiente del plásmido, un tipo endonucleasas.de conjugación facilitada por un transposón Las endonucleasas se nombran en relaciónconjugativo, que pueden encontrarse tanto en a las bacterias de las que fueron aisladas porel cromosoma como en los plásmidos. El con- primera vez, considerando que la primera le-tacto entre las bacterias donadora y receptora tra representa el género de la bacteria, lasinduce la escisión del transposón en el dona- próximas dos indican la especie, una cuartador: en cada extremo del transposón (integra- letra indica la cepa, y un número al final indi-do), se producen un par de cortes alternos de ca el orden en que fue identificada la enzimamodo que al escindirse una de las cadenas en en esa cepa. Según este criterio, la enzima EcoRI, representa a la primer endonucleasa54 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 56. Figura 4. Corte del ADN por enzimas de restricción. Reconocimiento y escisión de secuencias palindró-micas originando: a) extremos cohesivos o b) extremos romos. En este caso puede utilizarse la enzimatransferasa terminal para la incorporación de extremos cohesivos. c) reconocimiento y corte de secuenciasno palindrómicas. Las flechas indican los sitios de corte mientras que las secuencias reconocidas se se-ñalan en negrita.aislada en el género Escherichia, especie Las escisiones realizadas por las endo-coli, cepa RV 13. Se utiliza el término isoqui- nucleasas de tipo II, pueden resultar enzómeros para las enzimas que reconocen la extremos romos o cohesivos. En el primermisma secuencia de ADN pero han sido ob- caso, se producen cortes escalonadostenidas de diferentes especies de bacterias. que crean colas cortas de cuatro bases de Pueden diferenciarse tres tipos de enzi- cadena simple en cada extremo del frag-mas de restricción. Las de tipo I y III escin- mento. Estas colas tienden a asociarseden en sitios alejados de la secuencia de re- con una cadena complementaria por apa-conocimiento, requiriendo de ATP para reali- reamiento de bases (Fig. 4a), a secuen-zar el traslado del sitio de reconocimiento al cias complementarias de otro fragmentode acción y tienen actividad de restricción y con colas generadas por la misma enzima.metilación simultáneamente. En cambio, las Cuando se generan extremos romos, elde tipo II cortan en el sitio de reconocimien- ADN es clivado en el centro de la secuen-to, tienen actividad de restricción exclusiva- cia de reconocimiento, en el mismo puntomente y reconocen secuencias palindrómi- en ambas cadenas, no quedando basescas (secuencias que se leen igual en ambas desapareadas en los extremos por lo quedirecciones). Estas últimas son las utiliza- no presentan tendencia a unirse con otrosdas para el clonado de ADN, aunque tienen fragmentos por complementariedad (Fig.otras aplicaciones como las construcción de 4b).mapas de restricción de un plásmido o bac- Aunque por su especificad y versatilidadteriófago, fragmentación del ADN genómico las endonucleasas de restricción son laspara su separación por electroforesis con enzimas las mas renombradas, la tecno-aplicación en técnicas como “Southern Blot” logía del ADN recombinante no sería fac-o fingerprinting o la generación de fragmen- tible sin la participación en el proceso detos para ser usados como sondas. otras enzimas de roles diversos (Tabla 1). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 55
  • 57. Enzima Acción Aplicación Endonucleasas de tipo Clivaje sitio -especifico del ADN Generación de fragmentos de II ADN Ligasa de ADN Unión de dos fragmentos de Forma enlaces covalentes ADN con extremos romos, en entre el extremo 5’ de una presencia de ATP. cadena polinucleotídica y el extremo 3’ de otra cadena Transcriptasa reversa Síntesis de una hebra de ADNc Construcción de bibliotecas de utilizando como molde ARN. cDNA. Amplificación por PCR Polinucleotido kinasa Incorporación de un grupo Permite ligado con otro fosfato al e xtremo 5´de un polinucleótido o incorporación polinucleótido. de fosfato marcado. Transferasa Terminal Adición de colas Genera extremos cohesivos homopoliméricas al extremo oligo dT u oligo dA 3´OH de ADN doble hebra lineal Exonucleasa III Remoción de nucleótidos del Expone los extremos 5´. extremo 3´ de un ADN doble hebra. Exonucleasa del fago l Remoción de nucleótidos del Expone los extremos 3´. extremo 5´ de ADN doble hebra. Fosfatasa alcalina Remoción de fosfatos Impide autoligado de vectores. terminales de extremos 5´ Permite la incorporación de fosfato 5´ marcado. Fragmento klenow Fragmento de una enzima ADN Genera extremos romos desde polimerasa, con actividad DNA el ext remo 3´, por síntesis polimerasa y exonucleasa en complementaria o clivaje de dirección 3?5. nucleótidos desapareados. Tabla 1. Algunas enzimas utilizadas en la tecnología del ADN recombinante 3. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE ciones (0,5 - 2%) forman un gel semisólido alADN: Electroforesis en gel enfriarse, constituido por una matriz o trama tri- dimensional de fibras poliméricas, que retarda La electroforesis es una técnica que permite el paso de las moléculas de ácido nucleico a sula separación de moléculas en función de su di- través, en función de su tamaño. Los geles deferente movilidad en un campo eléctrico, sien- poliacrilamida se forman por la polimerizacióndo el parámetro esencial su diferencia en carga de acrilamida y bis-acrilamida, catalizada poreléctrica. Sin embargo, determinados soportes el agente oxidante persulfato de amonio y lacomo los geles de agarosa o poliacrilamida, amina terciaria TEMED como agente reductor.ofrecen una resistencia notable al avance de La variación de la concentración de acrilamidalas moléculas. Aunque el parámetro que rige posibilita la modificación controlada el tamañoel avance es la relación carga/masa, como en del poro. Estos geles presentan menor rangolos ácidos nucleicos la carga eléctrica es pro- de separación que los geles de agarosa, peroporcional a la longitud en nucleótidos, la rela- mayor poder de resolución, pudiendo discrimi-ción carga/masa es la misma para todas las nar fragmentos de ADN con diferencia de ta-moléculas. Como resultado, el efecto de retar- maño de sólo una base. Se usan además parado del gel depende del tamaño molecular por la separación y caracterización de proteínas.lo que la electroforesis separa los fragmentos Para establecer el tamaño de fragmentosde ácido nucleico según su tamaño o longitud. separados se utilizan marcadores moleculares,La agarosa es un polisacárido, cuyas disolu- que consisten en una mezcla de fragmentos de56 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 58. ADN de tamaño conocido, a partir de los quese puede inferir el tamaño de la muestra anali-zada. Se establece una curva de calibrado enla que se consigue la linealidad graficando eltamaño en función de la inversa de la movili-dad o el logaritmo del tamaño respecto de lamovilidad. Dentro de las aplicaciones más comunes dela electroforesis en gel en biología molecular,podemos mencionar chequeo de la amplifica-ción de fragmentos de PCR, identificación depolimorfismos y la identificación de genes me-diante el establecimiento de sus patrones derestricción.4. Hibridación. Análisis molecularde ADN, ARN y proteínas La hibridación es la construcción artificial deun ácido nucleico bicatenario por apareamien-to (emparejamiento) de bases complementa-rias de dos ácidos nucleicos monocatenarios.Para que exista la formación de híbridos esta-bles debe haber un alto grado de complemen-taridad. Se define formalmente como sonda(“probe”) a un fragmento determinado de ARNo ADN marcado química o radioactivamente,utilizado para localizar determinadas secuen-cias de ácidos nucleicos mediante hibridación. A) Análisis de ADN por hibridacionesSouthern Blot Figura 5. Método de hibridación de Southern. a) Es- Los procedimientos utilizados, para separar cisión enzimática o mecánica del ADN; b) inclusiónácidos nucleicos y proteínas se rigen por el del ADN en el gel de agarosa y corrida electroforé-mismo principio, pero involucran algunas dife- tica; c) transferencia de las moléculas de ADN des-rencias de técnicas debidas a las característi- de el gel de agarosa hacia un filtro de nitrocelulosacas particulares de cada clase de moléculas. por capilaridad, previa desnaturalización del ADN; En 1975, E. M. Southern, publicó un nuevo d) hibridación con la sonda monohebra, seguida de lavados y detección por autorradiografía.procedimiento que permitió a los investiga-dores ubicar los genes y otras secuencias deADN sobre fragmentos de restricción separa-dos por electroforesis en gel. La principal ca- sus dos cadenas), ya sea antes o durante laracterística de esta técnica es la transferencia transferencia, mediante tratamiento alcalino.de las moléculas de ADN que han sido digeri- Una vez completada la transferencia, el ADNdas por endonucleasas de restricción y separa- es inmovilizado sobre la membrana por expo-das por electroforesis en gel a una membrana sición a elevada temperatura o a radiación UV.de nylon o nitrocelulosa. Esta transferencia se Una sonda de ADN conteniendo la secuenciadenomina Southern Blot, en honor al científi- de interés es entonces incubada con el ADNco que desarrolló la técnica (Fig. 5). Para rea- inmovilizado. La sonda sólo va a hibridar conlizarla, el ADN es desnaturalizado (abierto en moléculas de ADN que contienen la secuencia Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 57
  • 59. de nucleótidos complementaria a su secuencia. agente desnaturalizante de las proteínas. LosEl excedente de sonda no hibridada se elimina polipéptidos separados por electroforesis tam-mediante repetidos lavados de la membrana. bién pueden ser transferidos del gel a una mem-Las sondas pueden marcarse por diferentes brana de nitrocelulosa y pueden ser detectadosmétodos: con elementos radioactivos, o com- utilizando anticuerpos específicos. Esta trans-puestos que producen color o luminiscencia, ferencia de proteínas se denomina Westernetc. Luego de la hibridación, la membrana se blotting y se realiza utilizando una corrientesomete a diferentes procedimientos para poner eléctrica para trasladar las proteínas desde elen evidencia la sonda, de acuerdo al método gel a la superficie de la membrana. Despuéscon el que haya sido marcada. de la transferencia, la proteína de interés es identificada mediante la unión a un anticuerpo B) Análisis de ARN por transferencia e hi- específico que está conjugado (marcado) yabridación: Northern Blot sea con isótopos radioactivos, que permiten la De manera similar al tratamiento realizado detección por autoradiografía, o con enzimascon las moléculas de ADN, las moléculas de que producen un producto visible cuando se adiciona el sustrato correspondiente.ARN también pueden ser separadas por elec-troforesis en geles de agarosa, transferidas a 5. amplIficacion del adn: reacciónmembranas y analizadas. La transferencia de en cadena de la polimerasa (PCR)ARN se denomina Northern blot, en reconoci-miento al hecho de que el procedimiento es laimagen de espejo de la técnica Southern blot. La PCR constituye una tecnología poderosa Ambos procedimientos son esencialmen- que involucra la síntesis enzimática in vitro dete idénticos. Sin embargo, las moléculas de millones de copias de un segmento específicoARN son muy sensibles a la degradación por de ADN. La reacción se basa en la hibridaciónenzimas ARNasas. Por lo tanto, se debe tener de un par de oligonucleótidos, diseñados enmucha precaución para evitar la contaminación base a la secuencia de interés y sintetizadosde los materiales con estas enzimas. Además, artificialmente, a la secuencia de ADN (Fig 6).la mayoría de las moléculas de ARN contienen Estos oligonucleótidos funcionan como inicia-estructuras secundarias (producidas por apa- dores o cebadores (“primers”) que delimitan lareamiento complementario intracadenas), por secuencia a ser amplificada. La primera etapalo tanto deben mantenerse desnaturalizadas de la reacción involucra la desnaturalizacióndurante la electroforesis para poder separar- del ADN de doble cadena, por elevación delas en base a su tamaño. La desnaturalización la temperatura a 92-95°C. Posteriormente co-se provoca incorporando formaldehído u otro mienzan los ciclos de PCR, que comprenden:químico desnaturalizante a la solución tampón desnaturalización de la doble cadena, unión(“buffer”) utilizada en la electroforesis. Después por complementariedad del cebador al ADNde la transferencia a la membrana apropiada, de simple hebra y replicación del ADN a par-las moléculas de ARN pueden hibridar con tir del cebador, catalizada por la enzima Taqsondas de ADN o ARN. polimerasa. La temperatura de unión de los cebadores al ADN de cadena simple depende C) Análisis de proteínas por transferencia de la secuencia y tamaño del oligonucleótido,e inmunodetección o Western Blot así como de la estrategia especifica de trabajo, La electroforesis en gel de poliacrilamida es comprendiéndose en términos generales entreuna herramienta muy importante para la sepa- los 35-60°C. La fase de síntesis de ADN com-ración y caracterización de proteínas. Debido a plementario se lleva a cabo a la temperaturaque muchas de las proteínas están compues- óptima para que la Taq polimerasa realice latas por dos o más subunidades, las cadenas replicación a partir de cada extremo 3´ de lospolipeptídicas individuales son separadas por cebadores. Se trata de una ADN polimerasaelectroforesis en presencia del detergente do- termo-resistente aislada de Thermus aqua-decil sulfato de sodio (SDS), que actúa como ticus, bacteria que vive en fuentes termales.58 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 60. Figura 6. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). a) Representación de una reacción de PCR de tresciclos. En cada ciclo se suceden tres etapas: i- desnaturalización por calor del ADN (94°C) para separarlas hebras, ii- unión por complementariedad de los cebadores a las monohebras (en este ejemplo 55°C),iii- reacción de polimerización de por la enzima TAQ polimerasa, dando la hebra complementaria al moldede ADN (72°C); b) Comportamiento de una fragmento de ADN blanco de los cebadores, a través de losmencionados ciclos de PCR. En cada ciclo, se incrementa la cantidad de ADN blanco, siguiendo la relacion2n, donde n es el número de ciclos. En el ejemplo, con tres ciclos de PCR, se obtienen 23 copias. c) Verifi-cación de un producto de PCR sobre un gel de agarosa. En la calle de la izquierda se muestra el marcadorde peso molecular. En la primera calle, se observan dos fragmentos de 700 y 650 pares de bases (bp),respectivamente, sugiriendo que el cebador ha encontrado complementariedad en más de un sitio en elgenoma. Las calles 2 y 3 presentan banda única de 700 y 550 bp aaproximadamente en cada caso.Este ciclo es repetido por algunas decenas de Después de apenas 20 ciclos se logra másveces y, como el producto de cada polimeri- de un millón de veces la cantidad inicial de lazación sirve como molde para el siguiente, en secuencia de interés. Esta escala de amplifi-cada ciclo se duplica la cantidad de producto cación permite, por lo tanto, iniciar el procesosintetizado. Es necesario tener en cuenta que, con cantidades mínimas de ADN (del orden deademás de la enzima, los cebadores y el ADN pico o nanogramos) y terminar la reacción conde interés, para que se produzca la amplifica- grandes cantidades de una secuencia de inte-ción es necesaria la presencia de un medio rés. La versatilidad de esta reacción es enormetamponado y desoxinucleótidos (dNTPs) y clo- y la combinación de la PCR y la secuenciaciónruro de magnesio que actúa como cofactor de constituye una poderosa herramienta para ella enzima. El resultado de la reacción es un análisis de genes.fragmento de ADN de doble cadena cuyos ex- Como hemos mencionado, la técnica detremos corresponden a los extremos 5´ de los PCR es de suma utilidad para amplificar ADNcebadores y su tamaño a la distancia entre los a partir de fragmentos clonados en distintosmismos. A pesar de que se forman moléculas vectores, donde los cebadores son comple-más largas a partir del molde original en cada mentarios a los sitios del vector que flanqueanciclo, se acumulan solo a una tasa lineal y no el fragmento inserto. La versatilidad de la PCRcontribuyen significativamente a la masa final incluye la amplificación a partir de ADN de ma-de secuencia blanco. terial embebido en parafina por varios años, Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 59
  • 61. de material momificado, de restos fósiles, etc. sigla (RT- PCR). De lo expuesto es obvio, la ne-Dentro de los usos mas frecuentes, podemos cesidad de ser específicos en las denominacio-mencionar la detección de enfermedades gené- nes, sobre todo cuando se combinan ambas téc-ticas, determinación del sexo en embriones hu- nicas: “Real Time de RT – PCR”manos, clonación de genes, mutagénesis in vitroy mapeo y secuenciación de genomas. B) PCR cuantitativa (qPCR) o PCR en tiem- po real (RT-PCR). A) RT-PCR Una variante de la PCR convencional que se Se trata de una reacción de PCR, secundaria basa en la detección y cuantificación simultáneaa la transcripción reversa del ARNm, catalizada de la fluorescencia emitida por los productos depor la enzima transcriptasa reversa (RT). Esta PCR que se acumulan durante el proceso deenzima es capaz de sintetizar ADN utilizando amplificación. La PCR cuantitativa ofrece la po-ARN como molde y forma parte de la batería sibilidad de detectar, en tiempo real, el nivel deenzimática de los retrovirus, virus de ARN que amplificación de una secuencia de interés, conrequieren la síntesis de ADN para ser integrados el objeto de estimar la cantidad de esa secuen-en el genoma del hospedador. El esquema ge- cia presente en la muestra original. En la PCR aneral de la RT-PCR consiste en un primer paso tiempo real, los procesos de amplificación y de-de síntesis de ADN complementario (ADNc) de tección se producen en el mismo vial cerrado, sincadena simple tomando como molde el ARN. En necesidad de ninguna acción posterior. Además,esta etapa, llamada síntesis de la primera hebra mediante detección por fluorescencia se puede(first strand synthesis) se utilizan cebadores que medir durante la amplificación la cantidad depueden ser específicos para el gen de interés, ADN sintetizado en cada momento, ya que lahexámeros de secuencia al azar u oligodT, se- emisión de fluorescencia producida en la reac-gún se busque sintetizar sólo el ADNc específico ción es proporcional a la cantidad de ADN forma-o los ADNc correspondientes a todos los ARNs do. Esto permite conocer y registrar en todo mo-del tejido en cuestión. Por lo tanto, mientras que mento la cinética de la reacción de amplificación.el uso de primers específicos aumenta la espe- Los termocicladores para llevar a cabo la PCRcificidad, los otros dos tipos de cebadores maxi- a tiempo real incorporan un lector de fluorescen-mizan el número de moléculas de ARNm que cia y están diseñados para poder medir, en cual-pueden ser analizadas en una muestra peque- quier momento, la fluorescencia emitida en cadaña de ARN. El uso de hexámeros al azar, puede uno de los viales donde se realice la amplifica-ocasionar distorsiones por exceso en el número ción. Los sistemas de detección por fluorescen-de copias de un determinado ARNm, compara- cia empleados en la PCR a tiempo real puedendo con los cebadores específicos. La segunda ser de dos tipos: agentes intercalantes y sondasetapa consiste en subsecuentes ciclos de PCR específicas marcadas. Los agentes intercalantescon los cebadores específicos para la secuen- son fluorocromos cuya emisión de fluorescenciacia de interés, lo que permite obtener cantida- aumenta notablemente cuando se unen a ADNdes apropiadas del ADN para diversas mani- de doble hélice. El más empleado en PCR apulaciones genéticas. Esta estrategia conjunta tiempo real es el SYBR Green I. El incrementode retrotranscripción y PCR puede ser utilizada de ADN en cada ciclo se refleja en un aumen-para el estudio de ARNm a nivel de una célula to proporcional de la fluorescencia emitida. Esteindividual. Los principales alcances de esta téc- sistema de detección es de fácil implementaciónnica incluyen la determinación de la presencia o y mas económico que el uso de sondas especí-ausencia de un transcripto, estimación del nivel ficas. Sin embargo, presenta baja especificidad.de expresión y para el clonado de ADNc sin la El riesgo de amplificaciones inespecíficas pue-construcción de una genoteca. de disminuirse iniciando la reacción de PCR a La técnica de PCR por transcriptasa reversa temperaturas elevadas (hot-start PCR). Puedenes denominada como “RT-PCR”, la cual desafor- utilizarse polimerasas recombinantes que funcio-tunadamente, puede ser confundida con la PCR nan después de ser activadas por temperaturade Tiempo Real, ya que ambas tienen la misma o polimerasas unidas a anticuerpos que mantie-60 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 62. nen bloqueado el centro activo de la enzima has- lidad en la eficiencia de amplificación es menosta que son desnaturalizados por calor. Además, importante.la mayoría de los equipos de RT-PCR tienen laposibilidad de determinar el Tm de los fragmen- C) Variantes de la qPCRtos amplificados, que depende de su longitud y PCR múltiple: es una variante de la PCRde la composición de sus bases, resultando ca- cuantitativa en la que se amplifican simultánea-racterístico de cada fragmento. Las sondas de mente dos o más secuencias blanco en unasecuencia específica, están marcadas con dos única reacción. Este análisis en simultáneo detipos de fluorocromos, un donador y un aceptor. varias secuencias optimiza el aprovechamientoLas más utilizadas son las sondas de hidrólisis, de la muestra cuando se trata de materiales dedenominadas también sondas TaqMan que con- disponibilidad limitada y ofrece la posibilidad detienen un fluorocromo de extinción de fluores- realizar controles internos, por ejemplo, la expre-cencia (Q, quencher) unido en el extremo 3´ y sión de un gen constitutivo en ensayos de expre-otro reportero (R) en el extremo 5´. Cuando se sión. La PCR múltiple suele ser más complicadaproduce la extensión de la cadena de la sonda que la simple adición de varios cebadores a lapor acción de la Taq polimerasa, como resultado PCR cuantitativa simple. Se requiere extremardel clivaje del extintor por su actividad de exo- los cuidados en cuanto al diseño específico denucleasa es emitida la fluorescencia. La fluores- cebadores, sugiriéndose que tengan igual tem-cencia detectada durante cada ciclo de la PCR peratura de fusión (meeting point, Tm), un conte-será proporcional a la cantidad de ADN que se nido de GC del 45-60% y que carezcan de homo-está amplificando. logía entre sí. La alta eficiencia de los cebadores La confiabilidad de los resultados obtenidos en la PCR individual, no asegura el éxito en lamediante esta técnica requiere de la realización PCR múltiple, pero aumenta considerablementeen paralelo una curva patrón en las mismas con- las posibilidades de obtenerlo. La combinacióndiciones para conocer la cantidad total de ADN de flouróforos a utilizar en los diferentes cebado-que se está amplificando. res también debe elegirse de manera cuidadosa, Ente las principales aplicaciones de PCR en para que no exista superposición entre los es-tiempo real, podemos mencionar: pectros absorción y emisión entre ellos. Amplificación y detección de ADN o ARN Análisis de curvas de disociación. Se basaespecífico en una muestra. Los blancos de de- en la aplicación de un gradiente de temperatu-tección pueden estar asociados a la presencia ras creciente después de la PCR para monitori-de agentes patógenos, resultando una herra- zar la cinética de disociación de los fragmentosmienta de extrema utilidad para fines de diag- amplificados, pudiéndose establecer su Tm paranóstico clínico. En el caso del ARNm, debe ser comprobar su especificidad. También permite elpreviamente retrotranscripto a cDNA, mediante análisis de mutaciones puntuales, usando unauna transcriptasa reversa que posee actividad sonda complementaria con el ADN de tipo salva-endo H, es decir, remueve el ARNm permitiendo je, que abarque la posición del polimorfismo. Elque se forme la segunda hebra de ADN. Tam- híbrido formado entre sonda y ADN de tipo salva-bién puede aplicarse al estudio de las variantes je tendrá una estabilidad mayor que el formadode “splicing” (corte y empalme de intrones) del entre la sonda y el ADN mutado, puesto que enARNm. este caso la complementariedad no es absoluta, Cuantificación del ADN o ARN diana en la reflejándose en una Tm superior. Adicionalmen-muestra. Se puede cuantificar la concentración te, permite establecer además, de forma relati-inicial de ADN (o ARN) diana en la muestra de va, la cantidad de ADN de tipo salvaje y la demanera muy sencilla, a través de la construcción tipo mutado cuando ambos están presentes ende una curva de calibrado. El control de la am- la misma muestra.plificación como medida de la concentración en En la Sección IX, Capítulo 4, se detalla másla muestra se obtiene en las fases iniciales de este punto y se aplica esta técnica para la de-la reacción, en las que la concentración de los tección de organismos genéticamente modifi-reactivos no es limitante y el efecto de la variabi- cados (OGMs). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 61
  • 63. 6. Genotecas nitrógeno liquido para impedir cambios cuali o cuantitativos de la expresión. La susceptibili- Una genoteca (“gene library”) es una colec- dad del ARN al clivaje por ARNasas, requiereción de fragmentos de ADN clonados que re- de cuidados especiales en el material del labo-presentan en su conjunto el ADN total de un ratorio a ser empleado en el aislamiento. A par-organismo de interés o bien el ADNc, que re- tir del ARN total es posible separar el ARNm,presenta el conjunto de genes que se están tomando ventaja de la característica cola deexpresando en un órgano o tejido determinado poliadeninas que posee en el extremo 3´, me-o bajo una situación particular o momento de diante cromatografía de afinidad, utilizandocrecimiento o desarrollo. En el primer caso ha- columnas de celulosa que tienen ligados oligo-blamos de una genoteca genómica, donde se nucleótidos compuestos solo por desoxitiminaencuentran todas las secuencias que se expre- -oligo(dT). Al pasar el ARN por la columna, elsan y no se expresan en el organismo mientras ARNm queda unido por complementariedadque en el segundo se trata de una genoteca de al oligo(dT), a través de la cola de poliA. UnaADNc, donde se encuentran solo las secuen- vez separado del ARN total, el ARNm es eluídocias expresadas. de la columna utilizando una solución tampón Estas genotecas consisten en una colección adecuada.bacterias, conteniendo cada una un vector con Estas colas de poliA también son utilizadasel ADN inserto, dispuestas en pocillos. Las ge- en el próximo paso de clonado, donde fun-notecas carecen de un catálogo a través del cionan como sitio de unión de los cebadorescual se pueda saber cuál es el clon que con- oligo(dT), para la reacción catalizada por latiene una secuencia de interés, por lo que es enzima transcriptasa reversa. El producto denecesario realizar un relevamiento de las colo- la reacción es un híbrido ARN-ADN. La princi-nias bacterianas. Para ello se utiliza una sonda pal limitación de esta técnica radica en que ende ADN complementaria a la secuencia o gen los casos en los que el ADNc es muy largo, albuscados, que puede ser conocida o deducirse comenzar en el extremo 3´, muchas veces noa partir de la secuencia de aminoácidos de la llega la retrotranscripción al extremo 5´. Paraproteína purificada. subsanar esta dificultad, se utilizan primers al Una de las principales dificultades en el clo- azar de 6 a 10 nucleótidos de longitud y es-nado de ADN genómico es que algunas se- tán confeccionados de manera de representarcuencias están representadas una sola vez en muchas secuencias diferentes, por lo que lael genoma y es difícil hallarlas. Para superar reacción comienza a partir de muchos sitiosesta limitación de la metodología, puede clo- diferentes, no solo del extremo 3´. Cualquieranarse directamente el ADNc, ya que el número de estas estrategias conduce a la obtención dede copias del ARNm en el tejido correspondien- un híbrido ARN-ADN, a partir del cual median-te a un gen que se esta expresando es más te PCR, se obtiene ADN de doble cadena queelevado. El problema se plantea cuando no se puede clonarse en el vector apropiado.sabe en qué circunstancias o en qué tejido se Para obtener la segunda cadena, se desarro-expresa un gen en particular. Actualmente es lló inicialmente un método que tomaba ventajaposible clonar un ADNc a partir de mensajeros de una “vuelta” o “giro” que da la hebra reciénpoco abundantes en la célula, con concentra- sintetizada, como un efecto de cambio de rum-ciones de 1 a 2 moléculas por célula. bo de la transcriptasa reversa al llegar al final de la cadena de ARN. Este artefacto provee un A) Genotecas de ADNc cebador adecuado para la síntesis de la segun- El primer paso en la construcción de una ge- da cadena de ADN y puede eliminarse, una veznoteca de ADNc consiste en el aislamiento del obtenida la segunda cadena, con una nucleasaARN a partir del tejido o condición experimental S1, perdiéndose parte de la secuencia corres-planteada. Los cambios en la expresión génica pondiente al extremo 5’ del mensajero.asociados a la exposición a estímulos diversos, Existe una segunda técnica, que presentahacen necesaria la preservación del material dos ventajas sobre la anterior. Una es que ge-62 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 64. nera moléculas de ADNc más largas y la se- do del fago . Para ello se utiliza la transferasagunda es que contiene prácticamente toda la terminal, que adiciona colas de poliA o poliT,secuencia correspondiente al extremo 5´. Se o se agregan adaptadores, que son sitios ar-basa en la utilización de la enzima RNasaH, tificiales de reconocimiento de alguna enzimaque reconoce moléculas híbridas ARN-ADN y de restricción que se unen a los extremos dedigiere la cadena de ARN dejando trozos pe- la secuencia. Se trata de oligonucleótidos ar-queños que permanecen unidos a la primera tificiales (8-12 bp) que se unen al fragmentocadena del ADNc y sirven como primers para utilizando una ligasa de ADN y son cortadosla ADN polimerasa I, que usa el ADNc original con la enzima de restricción apropiada (Fig.como molde para sintetizar la hebra comple- 7). Ambos procedimientos sirven para generarmentaria de ADN. Solo queda un pequeño seg- extremos cohesivos a fin de unir el fragmentomento de ARN en el extremo 5´. La segunda al vector, que posee extremos cohesivos corta-cadena de ADN tiene algunos sectores no uni- dos por la misma enzima.dos que son sellados por una ligasa de ADN. Si se utilizan como vectores los plásmidos, Estas moléculas de ADNc de doble cadena se introducen en las células huésped (bacte-están listas ahora para ser insertadas en un rias) por transformación, Si se eligen los fa-vector, que puede ser un plásmido o un deriva- gos, son empaquetados in vitro para formarFigura 7. Clonado de ADNc de doble cadena en un fago. El ADN del fago contiene dos sitios de restricciónEcoRI. El ADN de la región central no esencial del fago se reemplaza por ADN foráneo, uniendo los frag-mentos del fago con el ADN a clonar a través de la enzima ADN ligasa. Es necesario previamente adicionaral ADNc adaptadores que llevan sitios EcoRI, para generar extremos cohesivos para acoplarse con el ADNdel fago. Se genera así una serie de moléculas recombinantes dispuestas en tandem, flanquedas por sitioscos. Este ADN recombinante se empaqueta formando partículas infecciosas del fago, que se utilizaránpara infectar un césped de bacterias. Esto se visualizará como placas o calvas. Cada placa surge de unamolécula recombinante individual, que se propaga ahora como un fago. Para la localización del gen deinterés en la genoteca, es necesario hacer una copia de la placa en membrana de nylon, que luego seráhibridada con una sonda para el gen marcada apropiadamente. Si la marcación es radiactiva, por ejemplo,será revelada por autoradiografía y el clon se identifica por comparación entre la marca de la membranade nylon y la placa de bacterias. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 63
  • 65. partículas víricas, que introducirán su ADN en Por ello, estas sondas oligonucleotídicas estánel hospedador apropiado por infección de un constituídas por una mezcla de todas las com-césped de bacterias crecido sobre la superficie binaciones posibles. Una de ellas correspon-de una placa de agar (Fig. 7). Si bien los vecto- derá a la secuencia correcta del gen buscado.res plasmídicos son más fáciles de manipular, El problema de esta estrategia es el elevadolas genotecas construídas en los fagos poseen número de falsos positivos que pueden dar lasfragmentos de mayor tamaño. secuencias adicionales. Una variante consiste Como resultado del cultivo en placa (plaqueo) en usar un menor número de oligonucleótidosde la genoteca, se obtienen cientos de miles a o uno solo pero de mayor longitud (35-75 nu-un millón colonias bacterianas o de placas de cleótidos), eligiendo una región de la proteínafagos (zonas claras o de lisis resultado de la que contenga el menor número posible de co-producción de particulas víricas), dependiendo dones degenerados, utilizando el conocimientodel vector utilizado, cada una conteniendo un de los codones más probables para la especiefragmento clonado, distribuidas sobre la placa en estudio.de agar. A fin de realizar la búsqueda de un gen Existen otras técnicas para localizar genesparticular (“screening”), la genoteca es replica- en las genotecas de ADNc, como hibridaciónda en membranas de nylon o nitrocelulosa, de diferencial, si se trata de genes expresados enmanera tal que el patrón de placas en la caja diferentes tejidos o la utilización de sondas deoriginal se vea exactamente reproducido en la regiones conservadas en familias de proteínasmembrana de nylon o filtro (Fig. 7). La búsque- para encontrar genes relacionados o bien lada se lleva a cabo por hibridación con una son- utilización de vectores de expresión.da de ácido nucleico, lo cual requiere un cono-cimiento previo de la secuencia de interés. B) Genotecas Genómicas Elección de la sonda: En algunos casos, Un genoteca genómica puede obtenerse dedonde parte del gen ha sido clonado, este se cualquier tejido ya que todas las células de unutiliza para buscar las partes faltantes. Si se organismo tienen la misma constitución genéti-usa un sonda donde la homología es completa ca. Se encuentran en ella, no solo las secuen-el “screening” puede realizarse en condiciones cias expresadas sino también las correspon-de alta rigurosidad (es decir, con lavados más dientes secuencias regulatorias. Pueden utili-fuertes, que tienden a despegar lo que se ha zarse fagos como vectores, pero sucede queunido inespecíficamente). Si la sonda no es muchos de los genomas eucariotas son muycompletamente homóloga el “screening” de- grandes, el de mamíferos por ejemplo contie-berá realizarse a menores temperaturas y uti- ne 3x109 pb de ADN. Si el promedio típico delizando concentraciones salinas más elevadas inserto es de 15.000 pb, se necesitarán unosen los lavados. Si no se tiene conocimiento 200.000 fagos para contener el genoma com-previo de la secuencia puede construirse una pleto. Para asegurar que todas las secuenciassonda a partir de la secuencia de aminoácidos estén representadas al menos una vez, losde la proteína. Cuando se utiliza esta estrate- cálculos estadísticos dicen que deberán ana-gia, el tamaño mínimo de la sonda debe ser lizarse aproximadamente de 1 a 2 millones dede 15 a 16 nucleótidos (que permite encontrar fagos.secuencias únicas en genotecas de ADNc eu- Por este motivo, especialmente cuando secarióticos. Generalmente se utilizan sondas de trata de genomas muy grandes, como es el17 a 20 nucleótidos (correspondientes a 6 ami- caso del genoma humano o de varias especiesnoácidos contiguos). Otra consideración a te- vegetales y animales, se utilizan las genotecasner en cuenta cuando se construye la sonda es de YACs o BACs.que existe más de un codón o triplete para defi-nir la mayoría de los aminoácidos (es lo que se Genotecas genómicas en cromosomasconoce como la “degeneración” del código ge- artificialesnético) por lo que un aminoácido puede estar La capacidad de clonar fragmentos de másespecificado por hasta 6 codones diferentes. de 100 kb es crucial para la genómica estruc-64 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
  • 66. tural, funcional y comparativa de organismos Separación de grandes trozos de ADN:complejos. Las primeras genotecas genómicas electroforesis de campo pulsáti. Las técni-fueron construidas utilizando como vectores los cas estándar de separación de ADN en gelesYACs, aunque por sus limitaciones se prefiere de agarosa no son adecuadas para moléculasactualmente el uso BACs y PACs como vecto- mayores de 10 kb. Esta limitación ha sido sub-res. Cuando se trata de genomas de plantas, sanada con la electroforesis de campo pulsátil,pueden utilizarse como vectores los cromoso- en la que el campo eléctrico en el gel de aga-mas artificiales de bacterias binarios (BIBACs), rosa cambia periódicamente de orientación. Deque presentan la ventaja adicional de pueden esta manera pueden separarse moléculas tanusarse directamente para transformar plantas grandes como los cromosomas de levadurasutilizando Agrobacterium tumefaciens. (200 a 3000 kb) (ver VII.-1). La separación de Para preparar una genoteca genómica el las moléculas de este tamaño depende de suADN es escindido con enzimas de restricción relativa facilidad o dificultad para reorientarseo mecánicamente al azar, si se desea evitar la en respuesta a direcciones cambiantes de unpresencia de fragmentos demasiado largos o campo eléctrico. Esta técnica puede utilizarsecortos. Un paso crítico en el proceso es el ais- para hacer mapas físicos a gran escala.lamiento de moléculas intactas de ADN de ele- Preparación de una genoteca de BACs.vado peso molecular, esencialmente ADN cro- Como todo proceso de clonación, consiste enmosómico. Para ello las células se embeben la preparación del vector, aislamiento y diges-en bloques de agarosa de baja temperatura tión del ADN, selección de los fragmentos porde gelificación y se tratan con enzimas y otros tamaño, transformación de las bacterias y en-reactivos para separar el ADN de las proteínas samblado de la genoteca.celulares y del RNAs. La función del bloque de El vector debe estar purificado, digerido yagarosa es proteger a las grandes moléculas, defosforilado (cuando se corta con una solaque, embebidas en esta matriz, se someten enzima, se eliminan los fosfatos terminales,a la digestión con enzimas de restricción que para evitar la recircularización). La digestiónrealicen cortes poco frecuentes (“rare cutters”). del ADN es crítica para obtener fragmentosLa preparación de ADN de alta calidad en plan- adecuados para clonar. Los fragmentos sontas es más complicada que la correspondiente seleccionados por electroforesis de campo pul-para el caso de animales debido a la presencia sátil y se separan de la matriz de agarosa porde la pared celular, que dificulta el embebido digestión de la misma con agarasa o gelasa, oen bloques de azarosa. Para superar esta difi- por elusión del ADN desde el gel. Esto permitecultad se trabaja directamente con los núcleos construir genotecas con fragmentos de tama-aislados. Si se desea separar estos fragmen- ños similares, de aproximadamente 150 kb.tos por electroforesis, los bloques de agarosa Estas genotecas de grandes insertos sonconteniendo el DNA digerido pueden ser direc- consideradas recursos de largo plazo para in-tamente embebidos en la matriz del gel que se vestigación genómica y deben ser mantenidascorrerá. continuamente, especialmente cuando son uti- La cantidad de clones BACs que constitu-yen una genoteca, se relaciona con el tama- lizadas para proyectos de secuenciación y ma-ño del genoma, el tamaño promedio de los peo a gran escala. En general, cuando se vainsertos y la cobertura genómica esperada. a construir una genoteca debe elegirse cuida-Considerando el tamaño de inserto promedio dosamente el genotipo de la especie utilizadade los clones BACs, para cubrir cinco veces el como fuente de ADN, el tipo de inserto, etc.,genoma, una genoteca de BACs de la especie dado que la misma puede utilizarse para varia-modelo Arabidopsis thaliana, cuyo genoma es dos propósitos.pequeño, requerirá la obtención de 7.000 clo- En la Fig. 8 se esquematiza la búsqueda denes BACs, mientras que una de trigo candeal, un gen en una genoteca de BACs. Más de-cuyo genoma es dos ordenes de magnitud ma- talles acerca del ensamblado de los distintosyor, tendrá que estar compuesta por 500.000 fragmentos clonados puede encontrarse en elclones. capítulo correspondiente a genómica. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 65
  • 67. Figura 8. Búsqueda de un gen específico en una genoteca de BACs mediante PCR. Las 180 placas decultivo, de 96 pocillos cada una, contienen un genoma vegetal completo. Estas placas se replican, agru-padas de a 4, en filtros o membranas. Se realiza luego una reacción de PCR con el cebador específico alADN obtenido de un tubo que contiene los clones correspondientes a tres filtros, representando 12 placas,que fueron previamente agrupados. Como control positivo se utiliza el ADN vegetal total, también amplifi-cado por PCR. La reacción se analiza sobre un gel de agarosa. Un resultado positivo indica la presenciadel gen en el ADN genómico del vegetal y tambi&#