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Sguazza produccion proteinas

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  • 1. BACTERIAS Y LEVADURAS COMO SISTEMAS HETERÓLOGOS DEPRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS DE INTERÉS EN MICROBIOLOGÍA Guillermo Hernán Sguazza Cátedra de Virología Facultad de Ciencias Veterinarias - UNLP
  • 2. Proteínas Recombinantes Proteínas de origen natural Organismo Organismo original Gen de Interés recombinante Métodos Extractivos Fáciles de cultivar.Organismos difíciles de cultivar. Alto rendimiento. Bajo rendimiento. Muy reproducibles. Poco reproducibles. Económicos. Métodos costosos. Bajo riesgo. Alto riesgo biológico. También pueden producirse proteínas recombinantes que no existen en la naturaleza.
  • 3. Uso de las proteínas recombinantesAgropecuarias: Inoculantes Sanidad animal Biopesticidas y bioherbicidasIndustriales: Alimentos (quimosinas, amilasas) Textil (amilasas, pectinasas,etc) Papel (xilanasas; celulasas)Salud humana: Diagnóstico Terapéuticas Actualmente más de 254 fármacos Vacunas biotecnológicos han sido aprobados para más de 392 indicaciones terapéuticas
  • 4. EjemplosINSULINA (1982)(Diabetes mellitus)Páncreas porcino (Ala30→Thr) → Distinta farmacocinéticaSOMATOTROPINA (1985)(Enanismo congénito)Hipófisis humana → Algunos casos de enfermedad de Creutzfeldt-JakobHBsAg (1986)(Vacuna VHB)Plasma sanguíneo de enfermos crónicos (~20L/dosis).ERITROPOYETINA (1989)(Pacientes anémicos con insuficiencia renal crónica)2550 litros de orina para obtener 10 mg EPO
  • 5. Obtención del gen de interés Clonación del vector Selección de las colonias productoras EscaladoExtracción Cultivo a baja escalaPurificaciónFormulación Pruebas piloto
  • 6. Sistemas de expresiónLa elección del organismo depende de:Las propiedades de la proteína – Modificaciones post-traduccionales.El grado de pureza requerida.Demanda del producto – Escala de producción.Capacidad de expresión del sistema.Costo de producción.Equipamiento requerido. Bacterias. Levaduras. Baculovirus - Células de Insecto. Posibles sistemas: Células de mamífero. Plantas transgénicas. Animales transgénicos.
  • 7. Bacterias Levaduras C. insecto C. mamíferoDesarrollo AnimalesPlantasCosto      Dificultad      Tiempo      Expresión      Producción Versatilidad     Costo      Escalado      Purificación      Riesgos      
  • 8. BacteriasEscherichia coliBacillus subtilisCaulobacter crescentusPseudomonas sp.Streptomyces lividansLactobacillus lactisVentajasBuen conocimiento sobre su fisiología y genética.Fácil manipulación.Cultivos baratos con altas densidades celulares.DesventajasNo poseen un sistema eficiente para realizar modificaciones post-traduccionales.Baja secreción de la proteína al medio de cultivo.Formación de cuerpos de inclusión insolubles en el citoplasma celular.Generan endotoxinas.
  • 9. LevadurasSaccharomyces cerevisiaeHansenula polymorphaPichia pastorisYarrowia lipolyticaKluyveromyces lactisVentajasSon capaces de glicosilar proteínas de manera similar a los eucariotas superiores.Muchos son organismos GRAS.Manipulación sencilla a nivel de laboratorio e industrial.Medios de cultivos baratos.Secreción eficiente de la proteína heteróloga.Libres de toxinas y pirógenos.DesventajasActividad proteolítica.Presentan fenómenos de hiperglicosilación.Algunas proteínas no se producen de forma eficiente.
  • 10. TerapeuticosInsulina E. coli (Diabetes mellitus)Activador de plasminógeno E.coli (Anticoagulante)Hormona de Crecimiento E.coli (Ciertos defectos en el crecimiento)Antagonista HCH E. coli (Acromegalia)Calcitonina E. coli (Osteoporosis postmenopáusica)Glucagon S. cerevisiae (Hipoglucemia)Hirudina S. cerevisiae (Anticoagulante)INF alfa E. coli (Hepatitis B y C)Interleukina – 1 E. coli (Artritis reumatoidea)Interleukina – 2 E. coli (Carcinoma renal)INFγ 1b E. coli (Anti viral)VacunasPapiloma Humano S. cerevisiaeHepatitis B S. cerevisiaeBorrelia burgdorferi E. coliAnticuerpos monoclonalesAsma, psoriasis, artritis reumatoidea, esclerosis múltiple y algunos tipos de cáncerDiagnóstico.