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Jornadas de microbiología
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Jornadas de microbiología

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  • 1. INTERACCIÓN DE LACTOBACILOS PROBIÓTICOS CON Escherichia coli ENTEROHEMORRÁGICAHugo, A. A. 2007. Tesis Doctoral Capacidad probiótica de la cepa CIDCA 133 (Lactobacillus delbrueckii subsp lactis):un recorrido desde modelos in vitro a in vivoKakisu, E. 2010. Tesis Doctoral. Desarrollo y optimización del proceso para la elaboración de leches fermentadas conmicroorganismos aislados de gránulos de kefir con características tecnológicas y probióticas definidas.Hugo, A. A.; Kakisu, E.J.; De Antoni G.L y Pérez, P.F. 2008. “Lactobacilli antagonize biological effects ofenterohaemorrhagic Escherichia coli in vitro”. Trabajo publicado en Letters in Applied Microbiology. 46: 613-619.Kakisu, E; Abraham, A. G; Tironi Farinati, C, Ibarra, C y De Antoni, G.L. Lactobacillus plantarum isolated from kefir protectsfrom damage induced by shiga toxin type II- produced by enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Trabajo enprensa en el Journal of Dairy Research.
  • 2. PROBIÓTICOS•“Los probióticos son microorganismos vivos que administrados en cantidadesapropiadas confieren un beneficio en la salud del hospedador” (FAO y WHO, 2001).• Generalmente se trata de bacterias de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium.• El género Lactobacillus conforma un grupo heterogéneo de microorganismos,perteneciente al grupo de las bacterias ácido lácticas (BAL).• La cepa CIDCA 133 (Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis) constituye un aislado deleche cruda. La cepa CIDCA 83114 (Lactobacillus plantarum) constituye un aislado degránulos de kefir. Ambos pertenecen al grupo de lactobacilos homofermentativos.
  • 3. ¿Qué hacen los probióticos? Control de la inflamación Alivio de intestinal alergia Resistencia a la Normalización de la alimentaria colonización microbiota intestinal Balance de la rta inmune Mejora de la Supresión de Inmuno rta inmune patógenos modulación innata PROBIÓTICOS Reducción delriesgo de cáncer Fuente de SCFA y Deconjugación y Disminución de colon vitaminas secreción de sales biliares del colesterol Efectos metabólicos Disminución de las reacciones químicas Hidrólisis de Mejora de la mutagénicas a nivel lactosa tolerancia a la intestinal lactosa
  • 4. Interacción entre lactobacilos probióticos y E. coli EHEC: modelos in vitroEpidemiología• E. coli enterohemorrágica (EHEC) es un conjunto de cepas patógenas que producendiarrea, colitis hemorrágica (CH) o síndrome urémico hemolítico (SUH) en el hombre.• El SUH complica el 10% de los casos de infección por E. coli EHEC, con una tasa demortalidad entre el 2-10%, siendo los niños menores de 5 años especialmente susceptibles• En Argentina el SUH es endémico con aproximadamente 300 nuevos casos anualesreportados.• La transmisión de EHEC se realiza principalmente través de alimentos contaminados conmateria fecal, particularmente de origen bovino.
  • 5. Patogenia Principales factores de virulencia de EHEC Shiga toxinas Región LEE Stx1 Stx2 TTSS Tir Intimina Interrupción de la Lesión A/E síntesis proteica Diseño experimental Células EHEC 0157:H7 Células Lactobacilos Vero (Stx2+;eae+) y/o + Hep-2 sobrenadantes Daño celular
  • 6. Efecto de sobrenadantes de EHEC sobre células Vero Rojo Neutro 140 sn EHEC 133 GEN+sn EHEC La presencia de la cepa CIDCA 133 LBR GEN+sn EHEC (Lb delbrueckii subsp lactis) protegió control b bPorcentaje de células sobrevivientes 120 b a las células Vero del daño 100 provocado por los sbdtes de EHEC. b 80 Las células coincubadas con la cepa b a b LBR, (Lb delbrueckii subsp. a 60 a a a a bulgaricus) mostraron un daño 40 semejante al control. 20 0 1/5 1/30 1/180 Concentración de sobrenadante de EHEC
  • 7. Efecto de sobrenadantes de EHEC sobre células Vero Lb delbrueckii subsp lactis (CIDCA133) LDH Lb plantarum (CIDCA 83114) i p 30 n a sn EHEC 30 a r a c e v 25 t d i 25 Percentage LDH release i e aPorcentaje de LDH liberado v s b 20 20 a b l b e * * 15 15 b 10 10 5 5 0 c li 14 114 . co nt 831 sch rnata E e sn EHEC a rum CIDCA tarum 83 Paredes sup ant an Lb . pl 114Lb. p-lwalls 0 cel l El efecto protector de los lactobacilos se Kakisu et al, 2012 (en prensa) verifica tanto con la bacteria entera, como con sus paredes.
  • 8. Efecto de sobrenadantes de EHEC sobre células Vero LDH 1 2 3 4 SN EHEC + SN EHEC VLMW LMW 30 paredes SN EHEC 100 ºC Pep 25 Prt K α QuimP 94Percentage LDH release Trip 67 20 * * 43 15 30 10 26.9 5 20.1 16.9 0 14.4 a nt 14 w it h ernat 311 4 8 31 min w it h w it h 14 w it h EC sup ta r Paredes ldearum0 ºC 10 m 83114 m 83114 rum 831 8 um 8 31 ant 10 Paredes con tratamiento térmico y enzimático 14 EH an b. p e d a t u tar k ru ta in rum . pl nta lan tryps Lb plantarum b. plan ase b. plan Lb. p ymo b. plan L at nta Lb tre n L L 6.5 L tei si -c h psi pro pep try Péptidos termosensibles de la superficie celular de Lb. plantarum CIDCA 83114 intervienen en la SDS-PAGE captura o proteólisis de la Stx 2 Kakisu et al, 2012 (en prensa)
  • 9. Interacción de E. coli EHEC y lactobacilos con células Hep-2 EHEC en Cristal violeta sobrenadante M EHEC G LBB LBR G 133 114 133 114 UV UV 200X control Hugo et al, 2010Lb . delbrueckii susp lactis (CIDCA 133) y 200X Lb. plantarum (CIDCA 83114)protegieron las monocapas tratadas con 133 + EHEC enEHEC resuspendida en su sobrenadante. sobrenadante
  • 10. Microscopía electrónica de barrido (MEB) 1000X 1000X 1000X Control EHEC 114 + EHEC2500X 2500X 2500X EHEC MLP blebs EHEC 133 + EHEC Control Hugo et al, 2010
  • 11. Interacción de E. coli EHEC y lactobacilos con células Hep-2 Asociación de EHEC a 1e+7 a células Hep-2 en a EHEC en sn 133 + EHEC en snpresencia de la cepa 133 1e+6 b Log (UFC/ml) b 1e+5 La disminución de la c asociación de EHEC no sería 1e+4 d el mecanismo que explica la protección que ejerce el lactobacilo sobre las células 1e+3 EHEC 108 EHEC 107 EHEC 106 eucarióticas
  • 12. CONCLUSIONES• Los lactobacilos CIDCA 133 y CIDCA 83114 fueron capaces de antagonizar el efectobiológico de los distintos factores de virulencia de E. coli enterohemorrágica (EHEC)sobre células Vero y Hep-2.• La viabilidad de los lactobacilos no es necesaria para ejercer el efecto protector tantosobre la acción de la Shiga toxina en las células Vero como sobre la acción combinada deEHEC y su sobrenadante sobre las células Hep-2.• La capacidad de ejercer un efecto antagónico sobre la Shiga toxina reside en lasparedes del lactobacilo y estaría asociada al secuestro o proteólisis por parte de uncomponente proteico.• La protección observada en las células Hep-2 infectadas con EHEC no se debe aldesplazamiento del patógeno por el lactobacilo.• El efecto protector observado en los sistemas ensayados no es una propiedadinherente a todos los lactobacilos sino que es cepa dependiente.
  • 13. MUCHAS GRACIASPOR SU ATENCIÓN

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