Guias Laboratorio 1 Y 2

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Guias Laboratorio 1 Y 2

  1. 1. FACULTAD DE FARMACIA CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA MICROBIOLOGIA APUNTES TRABAJOS PRACTICOS LABORATORIO Nº 1 Medios de cultivo y métodos de esterilización Esterilización y Desinfección Dentro del área de la salud pública, controlar el crecimiento bacteriano es fundamental para prevenir la transmisión de enfermedades infecciosas. El crecimiento microbiano puede ser controlado aplicando procedimientos que limiten dicho crecimiento (inhibición), o que maten los microorganismos de un ambiente particular. Estos procedimientos pueden ser físicos o químicos. En términos generales, ellos comprenden la esterilización, la desinfección y el uso de antimicrobianos. Desinfección: tiene por objeto la destrucción de los microorganismos con el fin de disminuir su número a niveles mínimos. Esto se logra mediante el uso de agentes químicos denominados desinfectantes (Tabla 1). Asepsia: término aplicado a los procedimientos utilizados para prevenir que los microorganismos progresen en un ambiente determinado, por ejemplo: quirófanos. Antisépticos: agentes desinfectantes que pueden aplicarse sobre las superficies corporales con el fin de reducir la microbiota normal y los contaminantes microbianos de carácter patógeno. Tienen un menor grado de toxicidad que los desinfectantes y en general, menor grado de actividad (Tabla 1). Esterilización: es un proceso (físico o químico), que destruye toda forma de vida microbiana, incluidas las esporas (Tabla 2). Antimicrobianos: sustancias químicas producidas por microorganismos (antibióticos) o sintetizadas químicamente (agentes quimioterapeúticos), los cuales a bajas concentraciones son capaces de inhibir, e incluso de destruir, microorganismos sin producir efectos tóxicos en el huésped. En relación al microorganismo que inactivan se clasifican como antibacterianos, antivirales, antifúngicos y antiprotozoarios. Los antimicrobianos ejercen su acción en forma específica sobre alguna estructura u función microbiana. Poseen una elevada potencia biológica, es decir, que inhiben o destruyen las bacterias a muy baja concentración. Presentan una toxicidad selectiva, es decir, una mínima toxicidad para las células del organismo huésped. Esto es una diferencia fundamental con los antisépticos y desinfectantes, que también poseen alta eficacia antimicrobiana a bajas concentraciones, pero que son muy tóxicos para las células humanas. Tabla 1: Ejemplos de desinfectantes y antisépticos Compuestos inorgánicos Compuestos orgánicos Nitrato de plata: usado en el tratamiento de quemaduras al 0,5% y en la profilaxis de Alcoholes: su acción es rápida pero se la Oftalmia neonatarum por Neisseria evaporan con facilidad. gonorrhoeae. Fenoles: derivados fenólicos unidos a Derivados mercuriales: ej. jabones son buenos desinfectantes. mercuriocromo como desinfectante de la Propilenglicol y etilenglicol: se aplican en piel. forma de aerosoles para desinfección Permanganato potásico: usado en ambiental. dermatología por ser antifúngico. Clohexidina: derivado fenolito de acción Derivados yodados: ej. povidona yodada rápida, es bien tolerado por la piel. Se para las heridas. emplea en muchos hospitales en el lavado de superficies cutáneas.
  2. 2. FACULTAD DE FARMACIA CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA Tabla 2: Métodos de esterilización Métodos Tipos Procedimiento Condiciones de uso FISICOS Calor húmedo Autoclave Horno a presión que consiste en una cámara en la 121ºC a 1 atmósfera de que el aire puede ser sustituido por vapor de agua a presión por 15 a 20 min. presión. Útil para esterilizar medios de cultivo o soluciones. Tindalización Se somete el producto que se desea esterilizar, a 56 a 100 ºC por 30 min. calentamientos intermitentes entre 56 y 100ºC. En Intervalo a 37ºC. Repetir los intervalos se deja a 37ºC o a temperatura el ciclo. ambiente. Calor seco Flameado Exposición de un objeto pequeño al efecto de una Alta temperatura llama hasta incandescencia (ej. asa de cultivo a la llama del mechero). Incineración Aplicación de alta temperatura a aquellos productos Alta temperatura en los que no importa se destrucción (ej. desechos como apósitos, basura, etc.). Horno Pasteur Horno en el que se aplica aire caliente, que, al tener 180ºC por 2 h. menor eficacia que el calor directo, se aplica a altas temperaturas por largo tiempo. Eficaz para esterilizar material de vidrio y metales (ej. instrumental odontológico). Radiaciones Luz ultra violeta Útil en la preparación de vacunas, esterilización de áreas hospitalarias críticas (quirófanos, salas de prematuros, etc.). Ionizantes Se usan principalmente en procesos industriales para esterilizar dispositivos quirúrgicos (guantes, jeringas). Filtración Útil para esterilizar líquidos. Los microorganismos quedan retenidos en el filtro. QUIMICOS Oxido de etileno* Gas inflamable eficaz en la esterilización de Se expone el material a 5- sustancias termolábiles: prótesis, catéteres, etc. 10% de óxido de etileno Después de aplicar se debe airear el material debido en anhídrido carbónico a al carácter mutagénico del gas. 50-60ºC con humedad controlada por 4-6 h. Formaldehído* En forma gaseosa y en cámara cerrada se usa en la Se usa disuelto en agua al esterilización hospitalaria y en la industria 40%. farmaceútica. También se usa como desinfectante ambiental en salas altamente contaminadas, que una vez tratadas deben airearse. Glutaraldehído* Se emplea sobre todo en oftalmología y Se aplica sumergiendo el otorrinolaringología. En la esterilización de material en una solución instrumentos ópticos y los usados en terapia al 2%. respiratoria. * Agentes alquilantes reaccionan con gran facilidad con diferentes grupos de los ácidos nucleicos y de las proteínas inactivándolos.
  3. 3. FACULTAD DE FARMACIA CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA Medios de cultivo Cultivo de microorganismos El cultivo de microorganismos en el laboratorio es fundamental para comprender sus características individuales, ya que su identificación sólo por métodos microscópicos no es posible. Así uno de los métodos más importantes para diferenciar un microorganismo de otro, es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. Este procedimiento permite conocer en parte, los requerimientos nutricionales y también las características metabólicas de un microorganismo dado. El material nutritivo en el cual se hace crecer el microorganismo en el laboratorio se llama medio de cultivo, y el crecimiento mismo se denomina cultivo. Para el buen crecimiento del microorganismo, no basta con inocularlo en un medio de cultivo apropiado, también es necesario, darle las condiciones ambientales óptimas para su desarrollo, por ejemplo: temperatura, pH, humedad, etc. Composición de un medio de cultivo En general los requerimientos nutricionales de los microorganismos reflejan el ambiente natural en el cual viven. Por lo mismo, conocer el hábitat de un organismo es de gran utilidad para desarrollar medios de cultivo apropiados a un microorganismo particular. Los componentes básicos que deben estar presentes en todo medio de cultivo se resumen en la Tabla 3. Además de estos componentes un medio también puede ser enriquecido con ciertos factores orgánicos de crecimiento y con suplementos. La presencia de estos elementos en un medio dependerá de los requerimientos nutricionales del microorganismo que se desea cultivar. Los factores orgánicos de crecimiento son compuestos orgánicos específicos requeridos en muy pequeñas cantidades y que no pueden ser sintetizados por la célula. Ejemplos: vitaminas, purinas y pirimidinas, aminoácidos. Los suplementos son componentes que sin ser esenciales para el desarrollo del microorganismo, favorecen de manera significativa su crecimiento. Ejemplos: extractos de carne y levadura, infusiones de cerebro, peptonas, suero, sangre. Según el uso que se desee dar a un medio de cultivo, este puede tener distinta consistencia. Así, se pueden diferenciar medios líquidos, semisólidos y sólidos. El agar-agar es el agente solidificante más usado. El agar es un polisacárido complejo que se extrae de un alga, en solución forma una jalea que se licua solamente sobre los 100ºC. Un medio líquido no lleva agar-agar, un medio semisólido lleva agar al 0,8% y un medio sólido contiene agar a una concentración de 1,5 a 2 %. Tipos de medios de cultivo Medios de mantención: tienen como finalidad preservar un stock de microorganismos viables (vivos). Se usan también para aislar microorganismos a partir de una muestra de procedencia diversa, por ejemplo suelo, orina, heces, agua, alimentos, etc. Medios selectivos: son medios de cultivo que por sus características favorecen el desarrollo de un determinado tipo de microorganismo. Son útiles cuando se desea aislar un microorganismo particular a partir de una muestra mixta, es decir, aquella que presenta diversos tipos de microorganismos. Generalmente poseen sustancias que inhiben el desarrollo de especies microbianas distintas a la que se desea obtener. Por ejemplo, las bacterias el género Staphylococcus toleran altas concentraciones de
  4. 4. FACULTAD DE FARMACIA CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA sales, por lo tanto, un medio con altas concentraciones de NaCl favorecerá el desarrollo de este género e inhibirá el desarrollo de otros grupos bacterianos. Medios de diagnóstico: son medios que poseen componentes que permiten diferenciar distintos tipos de microorganismos, en base a sus características metabólicas. Estos medios son útiles para fines diagnósticos (ver más detalles sobre las características de cada tipo de medio en página 8). Preparación Los medios de cultivo vienen preparados comercialmente. Se debe disolver en un volumen de agua destilada según las indicaciones del fabricante y si es necesario calentar para disolver completamente. Una vez disuelto, los medios de cultivo se esterilizan en autoclave. Si el medio llevara una sustancia termolábil (por ejemplo vitaminas o antibióticos), esta se adiciona después de esterilizar, mediante filtración. Todo el instrumental usado en este proceso debe estar previamente esterilizado y el proceso mismo se realiza en condiciones de asepsia (por ejemplo, a la llama del mechero). Tabla 3: componentes básicos a un medio de cultivo Fuente de: Autótrofos Heterótrofos Función Energía Luz solar Compuestos orgánicos Carbono CO2 y CO3 Glucosa, lactosa, etc. Síntesis de compuestos carbonados Nitrógeno N2, NH3, NO2 y NO3 Proteasas, peptones, Síntesis de aminoácidos y extractos de carne bases nitrogenadas. Azufre H2S, S y SCO4 Metionina, cisteína, Síntesis de metionina, cistina cistina, coenzima A Iones inorgánicos Fe, Ca, Cu, Co, Ni, Fe, Ca, Cu, Co, Ni, Usados como K, Na, Mg, Mn K, Na, Mg, Mn cofactores enzimáticos Sales Sulfatos, fosfatos, Sulfatos, fosfatos, Equilibrio iónico y cloruros, carbonatos cloruros, carbonatos amortiguadores de pH Preguntas de Revisión y Aplicación 1. Señale la diferencia entre esterilización y desinfección. 2. ¿Qué se entiende por toxicidad selectiva de un antimicrobiano? 3. ¿Por qué el alto potencial biológico de los antimicrobianos representa una ventaja cuando se comparan con los desinfectantes? 4. Señale al menos cuatro diferencias entre autoclave y horno Pasteur. 5. Mediante que método Ud. esterilizaría: a. un medio de cultivo b. bisturí y pinzas quirúrgicas c. jeringas d. un quirófano e. instrumentos ópticos 6. Señale utilidad de los factores orgánicos de crecimiento en un medio de cultivo 7. Diferencia medio diferencial de medio de diagnóstico
  5. 5. FACULTAD DE FARMACIA CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA LABORATORIO Nº 2 Siembra de microorganismos Se denomina siembra el procedimiento mediante el cual los microorganismos son depositados asépticamente en un medio de cultivo. Durante la siembra es absolutamente necesario observar las medidas de asepsia con el fin de evitar contaminantes y preservar los cultivos puros. La siembra se realiza usando asas metálicas o pipetas. Durante el procedimiento el asa se esteriliza por flameado (ver Tabla 2). Las pipetas u otro instrumento usado para sembrar deben estar previamente esterilizados. Enriquecimiento y aislamiento En muestras provenientes de ambientes naturales, por ejemplo suelos, agua de mar, saliva, orina, heces etc., existen normalmente comunidades microbianas formadas por diferentes especies de microorganismos. Sin embargo, el conocimiento de las propiedades de los microorganismos está basado en estudios con cultivos puros, entendiéndose por esto, un cultivo que contiene un solo tipo de organismo. Debido a esto, es de gran importancia disponer de métodos y procedimientos que permitan aislar un microorganismo a partir de una muestra mixta. Una vez aislado un microorganismo particular, este puede ser cultivado en el laboratorio separadamente de los demás, para así estudiar sus características morfológicas, fisiológicas y moleculares. Enriquecimiento: con la finalidad de obtener cultivos puros, se aplican técnicas de enriquecimiento, que consisten en usar medios de cultivo y/o condiciones de incubación que sean selectivas para el microorganismo que se desea aislar y desfavorables para los demás. Las técnicas de enriquecimiento pueden aplicar métodos físicos, químicos y biológicos. Enriquecimiento por métodos físicos: hacen uso de factores como la temperatura, radiaciones, presión, etc. Las cuales matan o inhiben al resto de las poblaciones microbianas presentes en una muestra, pero no los microorganismos de interés. Por ejemplo, usar altas temperaturas de incubación para enriquecer bacterias termófilas, que son aquellas que crecen óptimamente a altas temperaturas. Enriquecimiento por métodos químicos: usa agentes tóxicos que matan o inhiben el resto de las poblaciones microbianas sin afectar el microorganismo que se desea enriquecer. También puede hacer uso de un nutriente en particular que sea usado preferentemente por el microorganismo de interés. Por ejemplo uso de altas concentraciones de NaCl para enriquecer Staphylococcus, o uso de sales biliares para enriquecer bacterias intestinales. Enriquecimiento por métodos biológicos: estos métodos hacen uso de huéspedes específicos para seleccionar un tipo de microorganismo. También pueden tomar ventaja de propiedades patógenas que el resto de los microorganismos no poseen. Por ejemplo, las bacterias del género Rhizobium tienen su hábitat normal en las raíces de plantas leguminosas con las cuales establecen una relación de simbiosis. Así los nódulos presentes en las raíces representan un sistema naturalmente enriquecido con Rhizobium. Aislamiento: los métodos de aislamiento tienen por finalidad separar espacialmente las células microbianas unas de otras. Una vez separadas estas pueden ser resembradas
  6. 6. FACULTAD DE FARMACIA CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA separadamente, obteniéndose así un cultivo puro. El aislamiento se puede lograr mediante procedimientos especiales de siembra. La figura 1, muestra dos de estos procedimientos. Preguntas de Revisión y Aplicación 1. ¿Por qué en microbiología es indispensable trabajar con cultivos puros? 2. ¿Cuál es la finalidad del Enriquecimiento? 3. ¿Cuál es la diferencia entre enriquecimiento y aislamiento? 4. ¿Qué precauciones se deben mantener durante un proceso de siembra? ¿Por qué? (ver actividades prácticas) 5 . Enriquecimiento y aislamiento ¿son procesos complementarios? Fundamente su respuesta. 6. ¿Qué se entiende por cultivo puro? Aislamiento por agotamiento por estría en placas
  7. 7. FACULTAD DE FARMACIA CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA Aislamiento por dilución y plaqueo O,1 ml O,1 ml O,1 ml O,1 ml O,1 ml Figura 1: Esquemas mostrando dos diferentes métodos de aislamiento Actividades demostrativas El profesor expondrá brevemente los conceptos fundamentales desarrollados en la parte teórica de este apunte. El profesor realizará una demostración del proceso de siembra y aislamiento. Actividades a realizar por los alumnos Los alumnos en grupos de 2 o 3 realizarán siembras en Agar nutritivo (AN), Una vez sembrados los cultivos serán llevados a 37º C donde se incubarán por 24-48 h. Los cultivos serán guardados a 8ª C, para ser observados y caracterizados en el práctico Nº 3. Recomendaciones: 1. Procure aplicar correctamente las normas de esterilización, como por ejemplo: trabajar al lado del mechero, flamear la boca de los tubos a la llama del mechero, abrir las placas en ángulo enfrentando al mechero, esterilizar el asa antes y después de cada siembra. 2. Conservar los algodones de los tubos en los dedos, nunca dejarlos sobre los mesones, de este modo se previene la contaminación de la muestra a trabajar. Recordar que la identificación final de los microorganismos requiere la obtención de cepas puras.
  8. 8. FACULTAD DE FARMACIA CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA Caracteristicas de los medios a sembrar: El Agar nutritivo es un medio de mantención apropiado para el desarrollo de la gran mayoría de las bacterias.

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