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  • 1. LABORATORIO Nº 4 Pruebas Bioquímicas Debido a la diversidad de especies bacterianas existentes en la naturaleza, la información obtenida a través de tinciones, aunque importante, no es suficiente para identificar una especie bacteriana. Por lo mismo, es necesario también detectar las propiedades fisiológicas y bioquímicas de cada microorganismo. Dichas propiedades son características más puntuales por cuanto demuestran la existencia de enzimas, las cuales son la expresión de un determinado gen en el DNA bacteriano. En microbiología para caracterizar bioquímicamente un microorganismo, se dispone de numerosas técnicas agrupadas en su conjunto como Pruebas Bioquímicas. 1. Pruebas bioquímicas relacionadas con la respiración celular El oxígeno es un excelente aceptor de electrones durante la respiración, pero también un poderoso agente oxidante. Especies altamente tóxicas del oxígeno, se forman como subproductos del proceso de respiración aerobia. Estas formas tóxicas incluyen: peróxido de hidrógeno (H2O2), anión superóxido (O2-)y el radical hidroxilo (OH•): O2 + e- → O2- supeóxido O2- + e- + 2H+ → H2O2 peróxido de H H2O2 + e- + H+ → H2O + OH• radical hidroxilo OH• + e- + H+ → H2O agua Reacción neta: O2 + 4 e- + 4H+ → H2O Los microorganismos poseen mecanismos de defensa enzimáticos para protegerse de las especies tóxicas del oxígeno. Estas enzimas son la peroxidasa, la catalasa y la superóxido dismutasa. La catalasa ataca el peróxido de hidrógeno según la reacción siguiente: H2O2 + H2O2 → catalasa → 2H2O + O2 Prueba de la catalasa: esta prueba tiene por finalidad determinar la presencia de esta enzima. Para realizar la prueba se usa un cultivo de 18 a 24 h de incubación en medio sólido. A dicho cultivo se le agregan unas gotas de peróxido de hidrógeno. La inmediata observación de burbujas, indicativo de la liberación de oxígeno, señala un resultado catalasa positivo (presencia de la enzima). Por el contrario, un organismo catalasa negativo no produce burbujas. 2. Pruebas bioquímicas relacionadas con el uso de distintas fuentes de carbono Prueba del agar hierro Kliger: este medio (Kliger) corresponde a un medio diferencial que permite determinar si el microorganismo es capaz de utilizar glucosa y lactosa o sólo la glucosa, además de producir ácido sulfídrico (H2S ) y gas. El agar hierro Kliger contiene tiosulfato de sodio y sulfato férrico de amonio, los cuales permiten determinar la producción de H2S, lo cual se detecta por la formación de un precipitado negro en el tubo. En relación al uso de azúcares, algunos microorganismos tienen la facultad de usar tanto la lactosa como la glucosa, otros solamente la glucosa y un tercer grupo no usan ninguno de los dos azúcares. En
  • 2. caso de usar los azúcares esto puede producirse con o sin liberacióbn de gases, en forma aerobia o anaerobia. El medio Kliger lleva lactosa1 al 1% y glucosa al 0,1%, además posee como indicador de pH rojo fenol. Resultados de la prueba • K/A = superficie alcalina (color fucsia) sobre fondo ácido (amarillo): el microorganismo es capaz de usar sólo la glucosa. En la superficie del tubo la glucosa es degradada aeróbicamente (vía oxidativa). A las 24 h, tiempo requerido para la lectura de esta prueba, la glucosa ha sido agotada y el microorganismo comienza a usar las peptonas, con lo cual el medio se alcaliniza dando una superficie de color fucsia. En el fondo del tubo, la glucosa es fermentada produciéndose ácidos estables, por lo tanto se observa un fondo amarillo. • A/A = superficie ácida (amarillo) sobre fondo ácido (amarillo): el microorganismo es capaz de usar ambos azucares. Después de 24 h, cuando el microorganismo a usado toda la glucosa comienza a usar la lactosa. Debido a que éste azúcar está 10 veces más concentrado, aún no se ha consumido totalmente, por lo que el medio se mantiene ácido (color amarillo). • K/K = superficie alcalina (fucsia) sobre fondo alcalino (fucsia): el microorganismo no usa ninguno de los dos azúcares, por lo que usa directamente las peptonas del medio. Si el microorganismos puede usar este compuesto tanto aerobia como anaeróbicamente, el resultado es K/K. Por el contrario, si sólo usa las peptonas aeróbicamente el resultado es K/sin cambio (fucsia/rojo). 3. Pruebas bioquímicas relacionadas con compuestos nitrogenados Prueba de la ureasa: esta prueba detecta la enzima ureasa, la cual cataliza la hidrólisis de la úrea con producción de dos moléculas de amonio. El medio e cultivo usado en esta prueba contiene una solución de úrea al 40% y rojo fenol como indicador de pH. Si el microorganismo a probar posee la enzima ureasa, éste hidroliza la úrea con la consecuente formación de amonio, lo cual alcaliniza el medio. Por lo tanto, una coloración fucsia es indicativo de un resultado positivo. 1. Pruebas del IMViC Corresponde a un conjunto de 4 pruebas bioquímicas: Indol, rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato. Estas pruebas se usan para diferenciar bacterias entéricas, las cuales pueden ser usados como indicadores biológicos de contaminación fecal en agua y alimentos. 1.1. Prueba del Indol Detecta la capacidad de un microorganismo para producir indol a partir del aminoácido triptofano. Esta habilidad se debe a la presencia de la enzima triptofanasa. El microorganismo a estudiar se siembra en un caldo peptonado. Después de 24 h, se agrega el reactivo de Kovacs, el cual reacciona con el indol dando un color rosado intenso. Así, la prueba positiva (indol +) corresponde a un anillo rosado en la superficie del cultivo; y un resultado negativo a un anillo amarillo o sin color. 1.2. Prueba del Rojo metilo Esta prueba detecta si el microorganismo es capaz de producir y mantener estables los derivados ácidos de las fermentación ácido mixta de la glucosa. Las bacterias rojo metilo (+) producen ácidos estables, es decir, que no continúan siendo degradados a otros productos. 1 La lactosa es un dímero de glucosa y galactosa, por lo tanto, primero debe ser desdoblada a dichos azúcares por medio de la enzima beta-galactosidasa.
  • 3. En consecuencia el medio se mantiene ácido. Por el contrario, en las bacterias rojo metilo (-), los ácidos formados durante a fermentación ácido mixta de la glucosa continúan siendo degradados a carbonatos y CO2, por ello la acidez del medio no se mantiene. El medio usado en esta prueba es un caldo suplementado con glucosa. El microorganismo se siembra y se incuba en condiciones apropiadas. Después de 24 a 48 h, se agregan unas gotas de rojo metilo. Si el indicador detecta ácidos, mantiene su color rojo, lo cual indica un resultado positivo. Por el contrario si el indicador vira a amarillo, significa un resultado rojo metilo (-). 1.3. Prueba del Voges Proskauer Esta prueba detecta si el microorganismo es capaz de realizar la fermentación butanodiólica de la glucosa. Las bacterias pueden usar varias vías fermentativas según el sistema enzimático que cada una posea. Una de estas fermentaciones es la bitanodiólica, llamada así porque esta genera como producto final bitanodiol. La acetoína es un producto intermediario de esta vía, precursor del butanodiol. Cuando la acetína reacciona con alfa naftol + KOH (40%), se produce una coloración rojiza indicativo de un resultado positivo (ver recuadro). Para esta prueba se usa el mismo medio que para la Glucosa prueba del Rojo metilo. La bacteria se siembra y se Ácido pirúvico incuba por 48 h. Para leer el resultado se agregan 6 a 8 gotas de KOH y 1 ml de α Acetoína + α naftol + KOH coloración naftol en solución rojiza alcohólica (5%, actúa como 2,3 – butanodiol catalizador). La mezcla se deja unos 20 min en estufa resultado (+) tiempo después del cual se lee el resultado. La formación de un anillo rojizo indica resultado (+), un anillo incoloro resultado (-). 1.4. Prueba del Citrato Esta prueba determina si el microorganismo es capaz de usar el citrato como única fuente de carbono. Para esta prueba se usan los medios Koser citrato (líquido) o Simón citrato (sólido). Este medio posee citrato como única fuente de carbono, sales de amonio como única fuente de nitrógeno, sales minerales y azul de bromotimol como indicador de pH. El medio originalmente es de color verde, pero a medida que la bacteria usa el citrato, éste se va alcalinizando y virando a un color azul intenso, lo cual es indicador de un resultado citrato (+). Si por el contrario, el medio permanece verde después de un periodo de incubación, esto indica resultado citrato (-). Tabla 4: Principales características de las pruebas del IMViC Resultados Prueba Objetivo Reactivos Positivo Negativo Detectar capacidad para producir indol Kovacs Anillo fucsi Anillo amarillo Indol a partir de triptófano Detectar producción de ácidos estables Rojo metilo Rojo Amarillo Rojo Metilo
  • 4. desde la fermentación ácido mixta. Voges Detectar capacidad para realizar KOH + α naftol Anillo rojizo Anillo incoloro Proskauer fermentación butanodióloca Detectar capacidad para usar el citrato Medio azul Medio verde Citrato como única fuente de carbono Tabla 5: Reacción a ciertas pruebas bioquímicas claves para la diferenciación de bacterias entéricas Producción Voges Producción de Géneros Indol Rojo Citrato Ureasa de H2S Proskauer gas desde metilo glucosa Escherichia - + + - - + - Enterobacter - - - + + + - Shigella - +/- + - - - - Salmonella + - + - +/- + - Klebsiella - - - +/- + + + Citrobacter +/- - + - + + - Proteus +/- +/- + - +/- +/- + Preguntas de revisión y aplicación 1. Señale la utilidad e importancia de las pruebas bioquímicas. 2. Explique como se generan dentro de la célula las formas tóxicas del oxígeno. Nombre dos de ellas. 3. Investigue la función de las enzimas peroxidasa y superóxido dismutasa en la defensa contra las especies tóxicas del oxígeno. 4. Indique el objetivo de las siguientes pruebas bioquímicas: agar hierro Kliger, ureasa, citrato e indol. 5. ¿Qué se entiende por IMViC y cuál es su finalidad?