Mitogen-activated Protein Kinase-independent Pathways Mediate the Effects of Nerve Growth Factor and cAMP on Neuronal Surv...
Neurotrofinas. Contribuyen a la regeneración neuronal. Relacionadas estructuralmente. Factores Ntr. Regulan el numero fina...
Neurotrofinas. <ul><li>Factor de Crecimiento Nervioso NGF. </li></ul><ul><li>Factor Neurotròfico Derivado del Cerebro BDNF...
Vías  de acción.
NGF. Nudo de cisteìnas. Dos Péptidos idénticos unidos por enlaces no covalentes. El monómero cuenta con una forma alargada...
Estabilización de la estructura molecular de algunos factores de crecimiento. 50% de similitud entre las NT. Las regiones ...
NGF y TRK. Se han descrito alrededor de 66-88% de similitud entre los tres receptores.
TRK A. Confiere especificidad para NGF en  TRK A Thr319,  His 320, Asn323 importantes en la unión a NGF <ul><li>El recepto...
NGF, TRK y p75 NTR .
Células PC 12. <ul><li>Son líneas celulares derivadas del feocromocitoma de la rata. </li></ul><ul><li>Al ser tratadas con...
VIA DE SEÑALIZACIÓN.
Estudio. <ul><li>Investigar el rol de MAP Kinasa en la acción de CPTcA y NGF sobre supervivencia de neuronas simpáticas pr...
Procedimientos. 1 ¿NGF promueve la activación de la vía MAP Kinasa? EN SCG. Después de retirado NGF, ¿se puede rehabilitar...
Procedimiento 1. Cultivo celular. Reemplazo del medio  de cultivo después de 6 días Centrifugado a 4ºC y durante 10 minuto...
Resultado. Incremento de las concentraciones de NGF sobre la actividad kinasa de MBP  en neuronas disociadas. Proteína Bás...
Resultado. Efecto del retiro de NGF sobre la actividad kinasa de MBP a razón del tiempo  De retirada. Inicial.
Procedimiento 2. Cultivo celular. Reemplazo del medio  de cultivo después de 6 días Centrifugado a 4ºC y durante 10 minuto...
Resultados. Actividad kinasa en neuronas que habían sido privadas de NGF y fueron inmersas En tres diferentes medios: NGF,...
Resultados.
Conclusión. <ul><li>CPTcA es una molécula análoga a NGF en cuanto a promover supervivencia neuronal se trata. </li></ul><u...
Resultados. Actividad kinasa en neuronas que habían sido privadas de NGF y fueron inmersas En tres diferentes medios: NGF,...
Procedimiento 3. <ul><li>Para descartar la posibilidad de CPTcA activara selectivamente alguna de las isoformas de MAPK la...
Resultado. En cada una de las bandas hay actividad  Kinasa a la altura de ERK1 y ERK 2. Esto motiva ensayos de inmunopreci...
Resultado ERK 1.
Complemento y conclusión. <ul><li>Estudios muestran que células PC12 CPTCA promueve un significativo incremento en MAPK y ...
Cultivo celular. <ul><li>2nm de MGF. </li></ul><ul><li>10% de suero fetal bovino. </li></ul><ul><li>2nm l glutamina. </li>...
Reemplazo después de 12 a 16 horas del medio de cultivo 2. <ul><li>En este proceso se asignaron las células a diferentes m...
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Mitogen activated protein cinasa

  1. 1. Mitogen-activated Protein Kinase-independent Pathways Mediate the Effects of Nerve Growth Factor and cAMP on Neuronal Survival* Douglas J. Creedon, Eugene M. Johnson, Jr., and John C. Lawrence, Jr. From the Departments of ‡ Molecular Biology and Pharmacology and § Neurology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri 63110 Carlos Gabriel Contreras Serrano. Bsc. Mj. Maestría en ciencias básicas biomédicas. Universidad el Bosque.
  2. 2. Neurotrofinas. Contribuyen a la regeneración neuronal. Relacionadas estructuralmente. Factores Ntr. Regulan el numero final de neuronas y conexiones del SN. Proteínas endógenas. Promueven la supervivencia. Favorecen la diferenciación de Ciertas poblaciones neuronales. Regulan el proceso de formación y establecimiento De conexiones sinápticas.
  3. 3. Neurotrofinas. <ul><li>Factor de Crecimiento Nervioso NGF. </li></ul><ul><li>Factor Neurotròfico Derivado del Cerebro BDNF </li></ul><ul><li>Neurotrofina 3. </li></ul><ul><li>Neurotrofina 4/5. </li></ul><ul><li>Factor Neurotròfico Ciliar. CNTF. </li></ul><ul><li>Factor Neurotròfico Derivado de la Glìa GDNF. </li></ul>
  4. 4. Vías de acción.
  5. 5. NGF. Nudo de cisteìnas. Dos Péptidos idénticos unidos por enlaces no covalentes. El monómero cuenta con una forma alargada con tres pares de estructuras beta antiparalelas conectadas por loops.
  6. 6. Estabilización de la estructura molecular de algunos factores de crecimiento. 50% de similitud entre las NT. Las regiones activas se encuentra ubicadas en los mismos sitios. NT cuentan con un motivo denominado nudo de cisteínas que estabilizan la estructura terciaria de los polipéptidos. Consiste en la formación de un anillo donde participan cuatro residuos de cisteína y tres puentes disulfuro.
  7. 7. NGF y TRK. Se han descrito alrededor de 66-88% de similitud entre los tres receptores.
  8. 8. TRK A. Confiere especificidad para NGF en TRK A Thr319, His 320, Asn323 importantes en la unión a NGF <ul><li>El receptor TrkA cuenta con dos isoformas: </li></ul><ul><li>Con un segmento de 6 aminoácidos que se expresa en neuronas. </li></ul><ul><li>Sin los seis residuos que se expresan extracelularmente y sobreregula en células PC12 al ser tratadas con NGF. </li></ul>
  9. 9. NGF, TRK y p75 NTR .
  10. 10. Células PC 12. <ul><li>Son líneas celulares derivadas del feocromocitoma de la rata. </li></ul><ul><li>Al ser tratadas con NGF exhiben características de neuronas simpáticas incluyendo extensiones neuríticas, excitabilidad eléctrica y expresión de proteínas neuronales. </li></ul><ul><li>La mayoría de estudios y conclusiones a las que se han llegado con respecto a vías de señalización para diferenciación y supervivencia neuronal se han llevado a cabo en estas células. </li></ul>
  11. 11. VIA DE SEÑALIZACIÓN.
  12. 12. Estudio. <ul><li>Investigar el rol de MAP Kinasa en la acción de CPTcA y NGF sobre supervivencia de neuronas simpáticas primarias derivadas del ganglio superior cervical. </li></ul>
  13. 13. Procedimientos. 1 ¿NGF promueve la activación de la vía MAP Kinasa? EN SCG. Después de retirado NGF, ¿se puede rehabilitar la función kinasa en la célula?., ¿CPTcA y PMA pueden tener los mismos efectos que NGF?. 2 3 Las mediciones de fosforilación de MBP revela que hay actividad de las dos isoformas de MAPK. ¿CPTcA activa selectivamente los isomorfismos ERK-1 y ERK 2 de MAP kinasa?
  14. 14. Procedimiento 1. Cultivo celular. Reemplazo del medio de cultivo después de 6 días Centrifugado a 4ºC y durante 10 minutos. Siguiente .
  15. 15. Resultado. Incremento de las concentraciones de NGF sobre la actividad kinasa de MBP en neuronas disociadas. Proteína Básica de Mielina.
  16. 16. Resultado. Efecto del retiro de NGF sobre la actividad kinasa de MBP a razón del tiempo De retirada. Inicial.
  17. 17. Procedimiento 2. Cultivo celular. Reemplazo del medio de cultivo después de 6 días Centrifugado a 4ºC y durante 10 minutos. Siguiente. Reemplazo del medio de cultivo después de 12 a 16 horas.
  18. 18. Resultados. Actividad kinasa en neuronas que habían sido privadas de NGF y fueron inmersas En tres diferentes medios: NGF, PMA y CPTcA luego de haber estado en medio con Anticuerpos antiNGF.
  19. 19. Resultados.
  20. 20. Conclusión. <ul><li>CPTcA es una molécula análoga a NGF en cuanto a promover supervivencia neuronal se trata. </li></ul><ul><li>CPTcA no tiene efectos significativos sobre la vía MAPK. </li></ul><ul><li>H MAPK no es una vía promotora de supervivencia en neuronas </li></ul><ul><li>Aun así solo un pequeño incremento en MAP kinasa puede ser necesario para promover supervivencia neuronal.. </li></ul>
  21. 21. Resultados. Actividad kinasa en neuronas que habían sido privadas de NGF y fueron inmersas En tres diferentes medios: NGF, PMA y CPTcA luego de haber estado en medio con Anticuerpos antiNGF. Activa la vía MAP en diferentes células, se observa que con PMA hay un aumento en la actividad MBP kinasa pero no un efecto promotor de supervivencia en neuronas. Inicial.
  22. 22. Procedimiento 3. <ul><li>Para descartar la posibilidad de CPTcA activara selectivamente alguna de las isoformas de MAPK las actividades de ERK 1 y ERK II fueron evaluadas mediante SDS-PAGE. </li></ul>
  23. 23. Resultado. En cada una de las bandas hay actividad Kinasa a la altura de ERK1 y ERK 2. Esto motiva ensayos de inmunoprecipitación Para evaluar confirmar estos resultados Y discriminar el rol especifico de CPTcA en La activación de ERK 1 y ERK 2.
  24. 24. Resultado ERK 1.
  25. 25. Complemento y conclusión. <ul><li>Estudios muestran que células PC12 CPTCA promueve un significativo incremento en MAPK y potencia los efectos de NGF y PMA. </li></ul><ul><li>En neuronas SCG CPTcA por si solo no activa ninguna isoforma de MAPK y causa una leve potenciación del efecto de NGF en la isoforma ERK 1. </li></ul>
  26. 26. Cultivo celular. <ul><li>2nm de MGF. </li></ul><ul><li>10% de suero fetal bovino. </li></ul><ul><li>2nm l glutamina. </li></ul><ul><li>100 microgramos por ml de streptomicina. </li></ul><ul><li>20 mM fluorodeoxiuridina </li></ul><ul><li>10 mM afidicolin. </li></ul>Regresar.
  27. 27. Reemplazo después de 12 a 16 horas del medio de cultivo 2. <ul><li>En este proceso se asignaron las células a diferentes medios: </li></ul><ul><li>Medio NGF. </li></ul><ul><li>Medio CPTcA. </li></ul><ul><li>Medio PMA. </li></ul>Regresar.
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