Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischenBelastung von humanen mesenchymalen Stammzellen              Masterarbeit v...
InhaltsverzeichnisInhaltsverzeichnis1	        Einleitung ....................................................................
Inhaltsverzeichnis        3.7	      Zellen ..................................................................................
Inhaltsverzeichnis        4.3	       Einfluss der Inhibitoren auf die Stoffwechselaktivität und die Proliferation von     ...
1.1 Mesenchymale Stammzellen                                                1 Einleitung1 Einleitung1.1 Mesenchymale Stamm...
1.1 Mesenchymale Stammzellen                                                 1 Einleitung1.1.2 VorkommenMSZ kommen neben d...
1.1 Mesenchymale Stammzellen                                                       1 Einleitung1.1.3 CharakterisierungDie ...
1.1 Mesenchymale Stammzellen                                               1 Einleitung1.1.4 Therapeutischer EinsatzAuf Gr...
1.2 Zytoskelett                                                              1 EinleitungEin weiterer Einsatzbereich für d...
1.3 Aktin                                                                       1 EinleitungZugkräften effektiver standhal...
1.3 Aktin                                                                     1 EinleitungPeptidkette, bestehend aus 275 A...
1.4 Vinculin                                                                    1 EinleitungNukleationskerne, die aus Dime...
1.5 Fokaladhäsion und Integrine                                               1 EinleitungFokalkontakte, welche das Zytosk...
1.6 Mechanotransduktion                                                      1 EinleitungStoffwechselwege an die äußeren B...
1.7 Inhibitoren                                                                1 Einleitungz. B. der extrazellulär regulie...
1.7 Inhibitoren                                                              1 Einleitung1.7.2 JasplakinolidAuch bei Jaspl...
2 Zielstellung2 ZielstellungMit dieser Arbeit wird das Ziel verfolgt die Rolle des Aktinzytoskeletts für dieÜbertragung me...
3.1 Chemikalien                                                         3 Material und Methoden3 Material und Methoden3.1 ...
3.2 Verbrauchsmaterialien                                               3 Material und Methoden3.2 VerbrauchsmaterialienDi...
3.5 Antikörper                                                            3 Material und Methoden    •   Leica Confocal So...
3.8 Medien für die Zellkultur                                 3 Material und Methoden3.8 Medien für die ZellkulturAls Expa...
3.9 Zellbiologische Methoden                                     3 Material und Methodenmit HBSS entfernt. Die weitere Kul...
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3.10 Proteinbiochemische Methoden                              3 Material und Methodenindem der Laserstrahl über die Probe...
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3.12 Mechanische Stimulation                                   3 Material und MethodenAbschließend wurde die Assay-Platte ...
3.13 Statistik und Auswertung                                 3 Material und MethodenDie Kulturwells wurden einzeln zwisch...
4.1 Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie                             4 Ergebnisse4 Ergebnisse4.1 Einfluss der Inhi...
4.1 Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie                                                    4 Ergebnisseabgerundet...
4.2 Einfluss der Inhibitoren auf das Aktinzytoskelett von hMSZ               4 Ergebnisse4.2 Einfluss der Inhibitoren auf ...
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4.4 Einfluss der Inhibitoren auf Signalproteine                            4 Ergebnisse4.4 Einfluss der Inhibitoren auf Si...
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Anne Langenbach: “Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischen Belastung von humanen mesenchymalen Stammzellen”
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Anne Langenbach: “Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischen Belastung von humanen mesenchymalen Stammzellen”

  1. 1. Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischenBelastung von humanen mesenchymalen Stammzellen Masterarbeit von Anne Langenbach Medizinische Biotechnologie Eingereicht am 17.01.2012 an der Medizinischen Fakultät der Universität Rostock Gutachter: Prof. Joachim Rychly Zweitgutachter: Dr. Petra Müller
  2. 2. InhaltsverzeichnisInhaltsverzeichnis1   Einleitung .................................................................................................... 4   1.1   Mesenchymale Stammzellen .................................................................... 4   1.1.1   Allgemeiner Überblick....................................................................... 4   1.1.2   Vorkommen ..................................................................................... 5   1.1.3   Charakterisierung ............................................................................. 6   1.1.4   Therapeutischer Einsatz ..................................................................... 7   1.2   Zytoskelett ............................................................................................. 8   1.3   Aktin..................................................................................................... 9   1.4   Vinculin............................................................................................... 11   1.5   Fokaladhäsion und Integrine .................................................................. 11   1.6   Mechanotransduktion ........................................................................... 13   1.7   Inhibitoren ........................................................................................... 14   1.7.1   Latrunculin A .................................................................................. 14   1.7.2   Jasplakinolid .................................................................................. 15   1.7.3   Cytochalasin D .............................................................................. 15  2   Zielstellung ................................................................................................ 16  3   Material und Methoden .............................................................................. 17   3.1   Chemikalien ........................................................................................ 17   3.2   Verbrauchsmaterialien .......................................................................... 18   3.3   Geräte ................................................................................................ 18   3.4   Software ............................................................................................. 18   3.5   Antikörper ........................................................................................... 19   3.6   Kits ..................................................................................................... 19   1
  3. 3. Inhaltsverzeichnis 3.7   Zellen ................................................................................................. 19   3.8   Medien für die Zellkultur ....................................................................... 20   3.9   Zellbiologische Methoden ..................................................................... 20   3.9.1   Isolation von hMSZ ......................................................................... 20   3.9.2   Zellen einfrieren und auftauen .......................................................... 21   3.9.3   Mediumwechsel ............................................................................. 21   3.9.4   Zellpassagen ................................................................................. 21   3.9.5   Zellaussaat .................................................................................... 22   3.9.6   Verwendung der Inhibitoren ............................................................ 22   3.9.7   Lichtmikroskopie ............................................................................. 23   3.9.8   Kolorimetrische Assays .................................................................... 23   3.9.9   Immunfluoreszenzfärbung ................................................................ 25   3.9.10   Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie ........................................... 25   3.10   Proteinbiochemische Methoden ........................................................... 26   3.10.1   Zelllyse und Probenvorbereitung .................................................... 26   3.10.2   SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)........................... 27   3.10.3   Western Blot und Immundetektion .................................................. 28   3.11   Bio-Plex-Assay ................................................................................... 29   3.12   Mechanische Stimulation .................................................................... 30   3.12.1   Aussaat ...................................................................................... 30   3.12.2   Vorbereitung der Mikrobeads ....................................................... 30   3.12.3   Mechanischer Reiz ...................................................................... 30   3.13   Statistik und Auswertung .................................................................... 31  4   Ergebnisse................................................................................................. 32   4.1   Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie ............................................ 32   4.2   Einfluss der Inhibitoren auf das Aktinzytoskelett von hMSZ ......................... 34   2
  4. 4. Inhaltsverzeichnis 4.3   Einfluss der Inhibitoren auf die Stoffwechselaktivität und die Proliferation von hMSZ 36   4.4   Einfluss der Inhibitoren auf Signalproteine ............................................... 39  5   Diskussion ................................................................................................. 46  6   Zusammenfassung ...................................................................................... 51  7   Literatur ..................................................................................................... 52  8   Abkürzungsverzeichnis ............................................................................... 59  9   Tabellenverzeichnis .................................................................................... 60  10   Abbildungsverzeichnis ............................................................................. 61  12   Erklärung ............................................................................................... 62   3
  5. 5. 1.1 Mesenchymale Stammzellen 1 Einleitung1 Einleitung1.1 Mesenchymale Stammzellen1.1.1 Allgemeiner ÜberblickMesenchymale Stammzellen, die auch als multipotente mesenchymale Stromazellen(MSZ) bezeichnet werden (Horwitz et al., 2005), zählen zu den adulten Stammzellen.Sie spielen im menschlichen Organismus eine wichtige Rolle beiRegenerationsprozessen und haben die Aufgabe, Zellen, die durch Alterung, Traumaoder Krankheit zu Grunde gehen, im Gewebeverband, ersetzen (Caplan undGoldberg, 1999; Caplan, 2009). Adulte Stammzellen sind undifferenzierte Zellen, diedurch klonale Expansion zur ständigen Selbsterneuerung fähig sind (Pittenger et al.,1999). Unter Einfluss von spezifischen Stimulatoren, wie beispielsweise speziellerWachstumsfaktoren, differenzieren sie in spezialisierte Zellen aus (Bianco und Robey2001). MSZ differenzieren abhängig von der Art der Stimulation in unterschiedlicheRichtungen. So sind sie in der Lage Osteoblasten, Chondrozyten oder Adipozyten zubilden (Pittenger et al., 1999). Entgegen früherer Annahmen ist dasDifferenzierungspotential von MSZ jedoch nicht auf Zelllinien des Mesodermsbeschränkt. Es konnte gezeigt werden, dass MSZ in vitro unter anderem zu Zellen mitneuronalen (Sanchez-Ramos et al., 2000), hepatischen (Weng et al., 2003) undmyokardialen Charakteristika (Toma et al., 2002) differenziert werden können. Durchdiese Erkenntnisse hat sich das Spektrum der möglichen medizinischenAnwendungsbereiche enorm vergrößert. Obwohl die Richtung der Differenzierung invitro beeinflusst werden kann, erhält man lediglich gemischte Zellkulturen, welche inihren biochemischen und biomechanischen Eigenschaften nicht vollständig demZielgewebe entsprechen (Tuan, 2006). 4
  6. 6. 1.1 Mesenchymale Stammzellen 1 Einleitung1.1.2 VorkommenMSZ kommen neben den hämatopoetischen Stammzellen (HSZ), einer zweitenPopulation von adulten Stammzellen, überwiegend im Knochenmark vor (Friedensteinet al., 1974; Da Silva Meirelles et al., 2008). Dort machen sie 0,001 bis 0,01 % allerkernhaltigen Zellen aus (Pittenger et al., 1999). Lokalisiert sind die MSZ innerhalb desKnochenmarks in sogenannten Stammzellnischen. Darunter versteht man eineMikroumgebung innerhalb eines Organismus, welche die MSZ umgibt undVoraussetzung für ihre Existenz ist (Watt und Hogan, 2000; Fuchs et al., 2004).Gebildet wird die Stammzellnische aus einer Vielfalt komplexer Signale. Zu diesenzählen lösliche, intrinsische Faktoren, die von den MSZ selbst sezerniert werden, Zell-Zell-Kontakte und Signale der extrazellulären Matrix (EZM), die sowohl chemischer alsauch mechanischer Natur sein können (Scadden, 2006; Discher et al., 2009; Guilaket al., 2009). Auf diese Weise bewirkt sie den Ausgleich zwischen Selbsterneuerungs-und Differenzierungspotential der MSZ und somit die Aufrechterhaltung derFunktionalität und des Phänotyps.Zusätzlich konnten MSZ aus einer Vielzahl anderer Gewebe isoliert werden, wie zumBeispiel dem Fettgewebe (Zuk et al., 2002), der Skelettmuskulatur (Williams et al.,1999), der Lunge (Fan et al., 2005), der Leber (Campagnoli et al., 2001), derKopfhaut (Shih et al., 2005), der Plazenta (In’t Anker et al., 2004) und aus diversenfetalen Geweben (In’t Anker et al., 2003). Auch wurden MSZ im peripheren Blut(Kuznetsov et al., 2001), im Nabelschnurblut (Sarugaser et al., 2005) und imFruchtwasser (De Coppi et al., 2007) nachgewiesen. Alle diese MSZ weisenuntereinander trotz unterschiedlicher Herkunft große phänotypische Ähnlichkeit auf.Auf Grund der spindelförmigen Morphologie ähnelt ihr Erscheinungstyp dem derFibroblasten.Das gebräuchlichste Verfahren zur Isolation von MSZ stellt dieDichtegradientenzentrifugation von Knochenmarkaspiraten dar (Pittenger et al., 1999).Auf Grund ihrer Eigenschaft auf Plastikoberflächen zu adhärieren, können sie nachAufbringen auf Kulturschalen von nicht adhärenten HSZs getrennt werden (Le Blancund Pittenger, 2005). 5
  7. 7. 1.1 Mesenchymale Stammzellen 1 Einleitung1.1.3 CharakterisierungDie direkte Identifizierung und Charakterisierung von Zellen als MSZ gestaltet sichschwierig. Das liegt daran, dass sie mitunter in sehr geringer Anzahl vorkommen undes außerdem keinen spezifischen Oberflächenmarker gibt, mit welchem MSZ eindeutigidentifiziert werden können. Aus diesem Grund werden sie durch ihre spindelförmigeMorphologie und Adhäsionsvermögen auf Plastikoberflächen charakterisiert. Weiterhinsind sie durch ihr enormes Vermögen zur klonalen Expansion in vitro (Gregory et al.,2005), die Fähigkeit der Differenzierung in osteogene, adipogene und chondrogeneRichtung und einer Kombination verschiedener Oberflächenmarker charakterisiert.Trotz der Heterogenität unter MSZ verschiedener Herkunft und Funktion weisen diemeisten von ihnen eine Reihe von Oberflächenproteinen wie CD29, CD44, CD73,CD105, CD106, CD166, stro-1, und HLA- ABC auf. Die Oberflächenmarker CD34,CD14 und CD45 werden dagegen von keiner MSZ exprimiert. Häufig werdenKombinationen aus diesen Positiv- und Negativmarkern genutzt, um MSZ zuidentifizieren und zu isolieren (Kolf et al., 2007).Zusammenfassend hat die International Society for Cellular Therapy (ISCT) folgendeMinimalkriterien zur Definition von MSZ aufgestellt (Dominici et al., 2006). • MSZ adhärieren unter standardisierten Kulturbedingungen auf Plastikoberflächen • MSZ sind positiv für die Expression der Oberflächenmarker CD105, CD73 und CD90 und negativ für die Expression der Oberflächenmarker CD45, CD34, CD14 oder CD11b, CD79 oder CD19 und HLA-DR. • MSZ besitzen osteogenes, adipogenes und chondrogenes Differenzierungspotential in vitro. 6
  8. 8. 1.1 Mesenchymale Stammzellen 1 Einleitung1.1.4 Therapeutischer EinsatzAuf Grund ihrer spezifischen Eigenschaften, wie dem extensiven Proliferationspotentialund der Fähigkeit in verschiedene Zelltypen zu differenzieren, sind MSZ einvielversprechendes Werkzeug in der regenerativen Medizin. MSZ sind vergleichsweiseeinfach aus unterschiedlichen Geweben zu isolieren und in vitro bis zur 500fachenMenge zu expandieren (Gregory et al., 2005). Diese Zellen können anschließendgenutzt werden, um die Regeneration von beschädigtem Gewebe zu fördern (Caplan,2009). Zur Geweberegeneration tragen zum einen Differenzierungsprozesse unddaraus resultierende Ersatzzellen und zum anderen die Sekretion trophischer Faktorenbei (Caplan und Dennis, 2006). Diese trophischen Faktoren sind von MSZ sezerniertelösliche Moleküle, wie Wachstumsfaktoren, Zytokine und Adhäsionsmoleküle, dieentscheidenden Einfluss auf die Regeneration des umliegenden, verletzten Gewebeshaben (Caplan, 2009).Es konnte gezeigt werden, dass systemisch applizierte MSZ fähig sind in Gewebe undOrgane einzuwandern und sich in diesen über lange Zeiträume stabil anzusiedeln(Devine und Hoffman, 2000). Auch wurde im Tiermodel beobachtet, dass MSZ aufdiese Weise direkt in verletztes Gewebe von Knochenbrüchen oder Herzinfarktenmigrieren können (Shake et al., 2002). Es bieten sich außerdem viele Möglichkeitenim Bereich des Tissue Engineering. Es können beispielsweise Gewebekonstruktehergestellt werden, in denen in vitro expandierte MSZ enthalten sind. Diese könnendann in einen Patienten eingesetzt werden (Wakitani et al., 1994; Young et al.,1998).Da MSZ auch eine immunsuppressive Wirkung haben, besteht die Möglichkeit siewährend der Transplantation von HSZ einzusetzen, um die Gefahr vonAbstoßungsreaktionen zu reduzieren. Außerdem ist es möglich sich dieseimmunsuppressiven Eigenschaften bei der Therapie der Graft-versus-Host-Reaktion zuNutze zu machen (Le Blanc et al., 2003). Die Kombination ausDifferenzierungspotential und immunsuppressiven Effekten machen MSZ zu idealenKandidaten für Zelltransplantationstherapien. 7
  9. 9. 1.2 Zytoskelett 1 EinleitungEin weiterer Einsatzbereich für die medizinische Verwendung von MSZ ist dieGentherapie. Genetisch modifizierte MSZ, in welche z. B. therapeutische Genetransduziert wurden, bieten ein enormes therapeutisches Potential (Prockop et al.,2003; Niyibizi et al., 2004).1.2 ZytoskelettDas Zytoskelett ist ein intrazelluläres Filamentsystem, bestehend aus zahlreichen Faser-und Regulationsproteinen. Es ist maßgeblich für die Form einer Zelle verantwortlich undnimmt außerdem Schlüsselpositionen in Bewegungs- und Transportprozessen, sowie inZellteilung und Differenzierung ein (Disanza et al., 2005; Lauffenburger und Horwitz,1996; Welch und Mullins, 2002).Es besteht hauptsächlich aus drei Fasertypen, den Aktinfilamenten, den Mikrotubuli undden Intermediärfilamenten. Bei allen dreien handelt es sich um Polymere, die sich inNetzwerken organisieren. Da sie ständigen Auf- und Abbauprozessen unterlegen sind,bilden sie dynamische, anpassungsfähige Strukturen aus. Solche Umstrukturierungenfinden meist als Reaktion auf äußere Krafteinwirkungen statt. Die Unterschiedezwischen den drei Fasertypen liegen in der Polarität, der Steifigkeit, derZusammensetzungsdynamik und dem Vorhandensein von Motorproteinen.Mikrotubuli sind die steifsten der drei Filamenttypen. Sie bilden komplexe, zylindrischeStrukturen, die sich aus α- und β-Tubulin-Heterodimeren zusammensetzen (Bieling et al.,2007). Aktinfilamente sind flexible, hoch dynamische Mikrofilamente von geringererSteifigkeit als Mikrotubuli (dos Remedios et al., 2003). Aktinfilamente sind genau wieMikrotubuli polarisierte Polymere, da sie aus asymmetrischen Monomerenzusammengesetzt sind. Beide Filamenttypen haben spezielle Motorproteine, die unterATP-Hydrolyse der Bewegungserzeugung dienen. Sowohl Aktin als auch Mikrotubulikönnen durch Polymerisierung bzw. Depolymerisierung Kräfte generieren, die zurVeränderung der Zellform führen.Intermediärfilamente weisen die geringste Steifigkeit auf. Ihre Hauptaufgabe bestehtdarin das Zytoskelett gegenüber mechanischen Belastungen zu stabilisieren, wobei sie 8
  10. 10. 1.3 Aktin 1 EinleitungZugkräften effektiver standhalten als Druckbelastung. Im Gegensatz zu Mikrotubuli undAktinfilamenten sind die Intermediärfilamente nicht polarisiert, binden keineMotorproteine und leisten keinen direkten Beitrag zu Bewegungsprozessen (Wiche,1998).Neben den Polymeren, die die Netzwerkarchitektur des Zytoskeletts bilden, gibt esnoch eine Vielzahl regulatorischer Proteine, die an diese andocken und diesekontrollieren. Solche Regulatorproteine werden in verschiedene Klassen unterteilt. Esgibt sogenannte Nukleationspromotoren, durch welche die Filamentbildung initialisiertwird. Durch Polymerasen wird das Wachstum der Filamente beschleunigt.Cappingproteine dagegen führen zum Abbruch des Filamentwachstums. Zusätzlichgibt es depolymerisierende und abbauende Faktoren. Stabilisiert wird dieFilamentstruktur durch quervernetzende Faktoren und andere Stabilisierungsproteine(Fletcher und Mullins, 2010).1.3 AktinDie ATPase Aktin ist ein universales Protein, das in allen bekannten Organismenvorkommt. Es ist eines der am häufigsten in eukaryotischen Zellen vertretenen Proteine(Dominguez, 2009). Aktin ist ein funktionell vielfältiges Protein. Es ist beteiligt anzahlreichen Prozessen, unter anderem im Zusammenhang mit Zellmotilität, Zellteilung,Transportvorgängen, Signaltransduktion und Zellmorphologie. Lokalisiert ist Aktinsowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma. Erstmals wurde Aktin 1859 von Kühne,einem Physiologen aus Heidelberg, in Muskelzellen von Säugetieren identifiziert(Kühne, 1859). In den folgenden Jahren wurden viele weitere Isoformen undHomologe in verschiedensten Zellen, Geweben und letztlich auch in Prokaryotenidentifiziert und charakterisiert. Diese Tatsache lässt auf große funktionelle Vielfaltdieses Proteins schließen.Aktin kommt in zwei unterschiedlichen Formen vor: globulär und filamentös. FibriläresAktin (F-Aktin) wird unter physiologischen Bedingungen in einer reversiblenPolymerisationsreaktion aus globulären Aktinmonomeren (G-Aktin) gebildet (Pantaloniet al., 2001). Bei G-Aktin handelt es sich um ein Protein, das aus einer einzelnen 9
  11. 11. 1.3 Aktin 1 EinleitungPeptidkette, bestehend aus 275 Aminosäureresten, aufgebaut ist. Es ist ein kleines,kompakt gefaltetes Protein mit einer Molekülmasse von 43 kDa. G-Aktin besteht auszwei etwa gleich großen Hauptdomänen, die sich wiederum in jeweils zweiSubdomänen unterteilen. Insgesamt setzt sich die Molekülstruktur also aus vierverschiedenen Domänen zusammen (Schüler, 2001; Aguda et al., 2005). Zwischenden beiden Hauptdomänen befindet sich eine Spalte. Diese enthält eine Bindungstaschefür kleine Moleküle, wie z. B. Adenosintriphosphat oder Phalloidin. Insgesamt sind heutemehr als 150 Proteine bekannt, die eine spezifische Bindungsstelle für Aktin besitzen(dos Remedios et al., 2003). Auf Grund von Interaktionen mit dieser Vielzahl anunterschiedlichen Liganden ist es möglich, dass ein kleines, kompakt gefaltetes Proteinwie G-Aktin in so vielen physiologischen Prozessen beteiligt ist. Die Bindung einesLiganden resultiert in einer Änderung der Konformation im Aktinmolekül. Da dieAktinisoformen in den diversen Geweben unterschiedliche Affinitäten zu gleichenLiganden aufweisen, können gleiche Liganden abhängig vom Gewebe verschiedeneReaktionen hervorrufen. Das ist ein Punkt, der die funktionelle Vielfältigkeit von Aktinerklären kann. Zusätzlich können Aktinmoleküle einer Reihe von posttranslationalenModifikationen wie Phosphorylierung, Acetylierung oder Ubiquitinierung unterzogenwerden. Da Aktinmonomere asymmetrisch geformte Proteine sind, besitzen auchAktinfilamente strukturelle und kinetische Polarität, d. h. beide Enden weisenunterschiedliche biochemische Eigenschaften auf. Es gibt ein schnell wachsendes (+)-Ende und ein langsam wachsendes (-)-Ende (Welch und Mullins, 2002). Ein effektivesFilamentwachstum findet nur am (+)-Ende statt. Ein Faktor, der dieses polarisierteWachstum bedingt ist Profilin, ein reichlich vorhandenes Protein, welchesAktinmonomere bindet und somit deren Assoziation mit dem (-)-Ende verhindert.Voraussetzung für das Filamentwachstum sind folglich freie (+)-Enden. Diese könnenauf drei unterschiedliche Arten generiert werden. Die ersten beiden sind entweder dasAbspalten sogenannter Cappingmoleküle oder das Aufbrechen bereits vorhandenerFilamente. Die dritte Möglichkeit ist die De novo Synthese von F-Aktin aus monomeremAktin. Die spontane Polymerisation von G-Aktin zu Filamenten ist allerdings eine sehrlangsame Reaktion, die zusätzlich durch G-Aktin bindende Proteine inhibiert wird.Damit die Polymerisation überhaupt ablaufen kann, werden sogenannte 10
  12. 12. 1.4 Vinculin 1 EinleitungNukleationskerne, die aus Dimeren oder Trimeren von G-Aktin bestehen, benötigt. Dadie Bildung solcher Kerne eine thermodynamisch ungünstige Reaktion darstellt, müssendiese durch Nukleationsfaktoren wie dem Arp2/3-Komplex und dessen Aktivatoreninitialisiert und stabilisiert werden (Disanza et al., 2005). Als Reaktion auf äußere undinnere Einflüsse unterliegt das räumlich und zeitlich eng regulierte Aktinzytoskelettständigen Auf-, Ab- und Umbauprozessen. Infolgedessen ist es sehr anpassungsfähigund besitzt eine hohe Variabilität.1.4 VinculinVinculin ist ein hochkonserviertes Strukturprotein des Zytoskeletts, das in nahezu allentierischen Zellen vorkommt. Als wichtiger struktureller Bestandteil von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Verbindungen bindet Vinculin zytoplasmatische Proteinkomplexe, welcheMikrofilamente in der Zellmembran verankern (Ziegler et al., 2006). Aufgebaut ist esaus 1066 Aminosäureresten und besitzt ein Molekulargewicht von 117 kDa. DasVinculinmolekül besteht aus einer globulären Kopf- und einer Schwanzdomäne. BeideDomänen besitzen Bindungsstellen für andere Proteine. So binden an der Kopfdomänez. B. Talin und α-Aktinin und an der Schwanzdomäne finden sich Bindungsstellen fürPaxillin, diverse Lipide und F-Aktin (Goldmann und Ingber, 2002). Kopf- undSchwanzdomäne sind in der Lage einander zu binden und auf diese WeiseBindungsstellen für verschiedene Liganden zu blockieren. Die Talinbindungsstelle spielteine besondere Rolle bei der Aktivierung der Integrine und der Zusammensetzung derFokalkontakte, indem sie für die Verknüpfung der β-Integrine mit dem Aktinzytoskelettzuständig ist (Critchley, 2000; Johnson und Craig, 1994).1.5 Fokaladhäsion und IntegrineDie zelluläre Adhäsion hat grundlegende Bedeutung für vielzellige Organismen. Siesorgt durch mechanische Verknüpfung von Zellen untereinander und mit der EZM fürden Zusammenhalt von Geweben und verleiht diesen so Stabilität und Zugfestigkeit.Die Vermittlung der Adhäsion erfolgt über spezialisierte Bereiche der Zellmembran, die 11
  13. 13. 1.5 Fokaladhäsion und Integrine 1 EinleitungFokalkontakte, welche das Zytoskelett über Transmembranproteine mit extrazellulärenStrukturen verbinden.Fokalkontakte wurden Anfang der 70er Jahre erstmals von Abercrombie inFibroblasten entdeckt und als adhäsive Membranbereiche mit Kontakt zumumliegenden Substrat beschrieben (Abercrombie und Dunn, 1975). Es handelt sich ummultimolekulare Verankerungsstrukturen, die aus mehr als 100 verschiedenen Proteinenzusammengesetzt sind. Durch diese ist das Aktinzytoskelett mechanisch an die EZMgekoppelt. Zentraler Bestandteil der Fokaladhäsionen sind Integrine, EZM-bindendeOberflächenrezeptoren, die in Clustern organisiert und über Adapterproteine wie z.  B.Vinculin und Talin intrazellulär mit den Aktinfilamenten verbunden sind (Horwitz et al.,1986).Somit besitzen Integrine als Oberflächenrezeptoren zentrale Funktion bei der Adhäsionund den damit verbundenen Prozessen. Bei den Integrinrezeptoren handelt es sich umheterodimere Transmembranproteine, die aus zwei nichtkovalent gebundenenUntereinheiten, der α- und der β-Kette, bestehen. Zurzeit sind 18 verschiedene α- undacht β-Ketten bekannt, die durch Dimerisierung 22 unterschiedliche αβ-Heterodimerebilden können, die zur Integrinfamilie zusammengefasst werden. Jedes der Integrinebindet an spezifische Liganden. Diese können zum einen Proteine der EZM wie z. B.Kollagen, Fibrinogen, Fibronektin oder Laminin oder zum anderenOberflächenrezeptoren benachbarter Zellen sein. Integrine induzieren nach derBindung eines extrazellulären Liganden Signalkaskaden im Zellinneren. Auf Grund derIntegrine, einer Vielzahl assoziierter Kinasen und anderen Signalproteinen sindFokalkontakte nicht nur passive, mechanische Verbindungsstrukturen, sondern auchintensiv an intrazellulären Signaltransduktionswegen beteiligt. Die Art derSignalweiterleitung ist bidirektional, d. h. sie kann sowohl von außen nach innen(Outside-In), als auch von innen nach außen (Inside-Out) erfolgen. Auf Grund derRezeptoreigenschaften der Fokalkontakte ist es einer Zelle möglich Parameter aus ihrerUmgebung, wie die Beschaffenheit der Matrix oder den Adhäsionsstatus, zu messenund ihr Verhalten den Gegebenheiten anzupassen. So können beispielsweiseDifferenzierung, Migration, Bewegung, aber auch andere Signal- oder 12
  14. 14. 1.6 Mechanotransduktion 1 EinleitungStoffwechselwege an die äußeren Bedingungen angepasst werden. Im Vergleich dazureagiert die Zelle bei der Inside-Out-Signalweiterleitung auf intrazelluläre Signale, wasin den meisten Fällen zu Konformationsänderungen in extrazellulären Domänen führtund somit in einer veränderten Affinität zu Liganden resultiert.1.6 MechanotransduktionIntegrine sind Rezeptoren, die mechanische Reize in die Zelle übertragen. DieserProzess der Mechanotransduktion beinhaltet die Umwandlung äußerer physikalischerKräfte in intrazelluläre biochemische Signale, die dann zu einer adäquaten Zellantwortführen. Es wird angenommen, dass ein Mechanismus der Mechanotransduktion aufKonformationsänderungen der Proteine des fokalen Adhäsionskomplexes durchZugkräfte beruht. In diesem Zuge werden Bindungsstellen freigelegt, an welcheLiganden binden können, wodurch es dann zur Auslösung intrazellulärerSignalkaskaden kommt (del Rio et al., 2009). Mechanische Interaktionen von Zellenmit der umliegenden Matrix sind bidirektional und haben große Bedeutung für dieRegulation vieler zellulärer Prozesse. Die Integrine als transmembrane Rezeptoren sindfür die Mechanorezeption und –transduktion besonders gut geeignet, da sie dasAktinzytoskelett über assoziierte Proteine direkt an die EZM koppeln. Zugkräfte, die aufdie EZM wirken, können folglich über Integrine auf das Zytoskelett übertragen und inbiochemische Signale umgewandelt werden. Die Zellen sind ihrerseits ebenfalls in derLage Kräfte auf umliegende Matrixproteine auszuüben und deren Umorganisierung zubewirken (Guilak et al., 2009). Die Elastizität des umliegenden Substrates, welche aufdie Richtung der Differenzierung Einfluss hat, kann von MSZs wahrgenommen werden(Engler et al., 2006; Winer et al., 2009). Die Zellen reagieren mit einer Veränderungihrer Zellform. Das hat wiederum starke Veränderungen der Organisation desAktinzytoskeletts zur Folge (Zajac und Discher, 2008). Es konnte bereits gezeigtwerden, dass Zugkräfte an Integrinrezeptoren von Osteoblasten zu einer Anhäufungvon Proteinen der fokalen Adhäsionskomplexe in der unmittelbaren Umgebung desgereizten Integrins führen. Außerdem kommt es zur Aktivierung der fokalenAdhäsionskinase (FAK). Dies bewirkt dann weiterhin die Aktivierung von MAP-Kinasen 13
  15. 15. 1.7 Inhibitoren 1 Einleitungz. B. der extrazellulär regulierten Kinasen (ERK) 1 und 2 (Rychly et al., 1998; Schmidtet al., 1998; Pommerenke et al., 2002).1.7 InhibitorenDas Aktinzytoskelett ist in eine Vielzahl zellulärer Prozesse involviert. Es sind einigeSubstanzen bekannt, die diese Prozesse beeinflussen, indem sie die intrazelluläreOrganisation der Aktinfilamente (F-Aktin) verändern und das Aktinzytoskelett damithäufig zerstören. Solche Substanzen kommen in der zellbiologischen Forschung oftzum Einsatz. Die destruktiven Wirkmechanismen solcher Substanzen sind sehrunterschiedlich. So wird z.B. durch Cytochalasine die Elongation von F-Aktin verhindert(Brown und Spudich, 1979). Latrunculine binden G-Aktin (Coué et al., 1987).Jasplakinolide führen dagegen durch übersteigerte Polymerisation von F-Aktinen zurVerfestigung des Zytoskeletts (Yarmola et al., 2000).1.7.1 Latrunculin ALatrunculin A ist ein marines Toxin, das von verschiedenen, im Roten Meervorkommenden Schwammarten, z. B. Latrunculia magnifica, gebildet wird. Chemischhandelt es sich um ein bioaktives, makrozyklisches 2-Thiazolidinon mit derSummenformel C22H31NO5S und einem Molekulargewicht von 421,6 Dalton.Latrunculin A ist in der Lage G-Aktin mit moderater Affinität zu binden (Andavan undLemmens-Gruber, 2010). Diese Bindung erfolgt im stöchiometrischen Verhältnis 1:1und führt zur Ausbildung stabiler Komplexe aus G-Aktin und Latrunculin A (Spector etal., 1989). Auf diese Weise inhibiert Latrunculin A die Polymerisierung von G-Aktin zuF-Aktin sowohl in vitro (Morton et al., 2000; Coué et al., 1987), als auch in vivo(Spector et al., 1983). Infolge dessen wird die Organisation intrazellulärerMikrofilamente blockiert und das Zytoskelett innerhalb kurzer Zeit zerstört.Latrunculin A beeinträchtigt folglich physiologische Prozesse, die durch Mikrofilamentereguliert werden. Zu diesen zählen Prozesse der frühen Embryonalentwicklung, derFertilisation und der Phagozytose von Immunkomplexen (Ayscough et al., 1997). 14
  16. 16. 1.7 Inhibitoren 1 Einleitung1.7.2 JasplakinolidAuch bei Jasplakinolid handelt es sich um ein marines Toxin. Es ist ein aus demMeerschwamm Jaspis johnstoni stammendes makrozyklisches Peptid mit einemMolekulargewicht von 709,7 Dalton und der Summenformel C36H45BrN4O6.Jasplakinolid besetzt am Aktinmolekül die gleiche Bindungsstelle wie Phalloidin. Esfördert die Polymerisierung von F-Aktin und führt zur Verfestigung des Zytoskeletts,indem es durch sogenannte unkontrollierte Nukleation neue Polymerisationsstelleninduziert. Es kommt anstelle von Filamenten zur Bildung von großen Aktinaggregaten(Scott et al., 1988). Durch diese Stabilisierung können Aktinstressfasern nicht mehrumgebaut werden, wodurch die Integrität des Zytoskeletts gestört wird (Posey undBierer, 1999).1.7.3 Cytochalasin DCytochalasin D ist ein Mykotoxin, das von verschiedenen Pilzen wie z.  B. Zygosporiummansonii oder Helminththosporium dematiodideum gebildet wird. Auch CytochalasinD ist ein makrozyklisches Peptid. Es hat die Summenformel C30H37NO8 und einMolekulargewicht von 507,6 Dalton. Cytochalasin D inhibiert die Polymerisation vonAktin in vitro, indem es mit sehr hoher Affinität an die schnell wachsenden Enden(‚barbed ends’) von Aktinfilamenten bindet und so die Addition weiterer Monomereverhindert (Casella et al., 1981; Goddette und Frieden, 1986). Die Bildung und dieVerteilung der Mikrofilamente im Zytoplasma werden folglich durch Cytochalasin Dinhibiert. Außerdem besitzt Cytochalasin D eine antibiotische bzw. antitumorigeneWirkung und führt zur Erhöhung des intrazellulären Kalziumlevels. 15
  17. 17. 2 Zielstellung2 ZielstellungMit dieser Arbeit wird das Ziel verfolgt die Rolle des Aktinzytoskeletts für dieÜbertragung mechanischer Kräfte im Zusammenhang mit der funktionellen Steuerungvon mesenchymalen Stammzellen näher zu analysieren. Zu diesem Zweck werdenIntegrinrezeptoren mit Hilfe von Magnetpartikeln mechanisch stimuliert. Zusätzlich solldas Aktinzytoskelett unter dem Einfluss der mechanischen Kräfte mitdepolymerisierenden und polymersierenden Substanzen beeinflusst werden. DieBeurteilung der Effekte einer solchen Behandlung auf die Signaltransduktion wird überdie Bestimmung der Aktivierung der Signalmoleküle ERK und AKT erfolgen. 16
  18. 18. 3.1 Chemikalien 3 Material und Methoden3 Material und Methoden3.1 ChemikalienDie im Folgenden aufgelisteten Chemikalien wurden verwendet. • Acrylamid (40 %) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) • Ammoniumperoxodisulfat (Merck, Darmstadt) • Antibiotische-antimykotische Lösung (AB/AM) (Invitrogen, Karlsruhe) • Coomassie-Lösung (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) • Cryo-SFM (Promocell, Heidelberg) • Cytochalasin D (CytoD) (Calbiochem, Merck, Darmstadt) • Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (Invitrogen, Karlsruhe) • Essigsäure (J.T. Baker, Phillipsburg NJ) • Fetales Kälberserum (PAN-Biotech, Aidenbach) • Fluoroshield (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) • Glycin (Carl Roth, Karlruhe) • Isopropanol (J.T. Baker, Phillipsburg NJ) • Jasplakinolide (Jasp) (Calbiochem, Merck, Darmstadt) • Kristall-Violett (Fluka, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) • Ladepuffer (Laemmli, 1970) • Latrunculin A (LatA) (Calbiochem, Merck, Darmstadt) • Methanol (Carl Roth, Karlruhe) • Milchpulver (Carl Roth, Karlruhe) • Natriumclorid (Carl Roth, Karlruhe) • Paraformaldehyd (PFA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) • Phalloidin, Fluorescein Isothiocyanat (FITC) markiert (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) • Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) (Invitrogen, Karlsruhe) • Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) (Serva, Heidelberg) • Tetramethylethylendiamin (TEMED) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) • Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) (Carl Roth, Karlruhe) • Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) • Trypsin/EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) • Tween20 (GE Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien) 17
  19. 19. 3.2 Verbrauchsmaterialien 3 Material und Methoden3.2 VerbrauchsmaterialienDie im Folgenden aufgelisteten Verbrauchsmaterialien wurden verwendet. • Costar® 96-Well EIA/RIA Stripwell™ Plate (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) • Criterion Stain Free Gel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) • Deckgläser (Menzel GmbH, Braunschweig) • Dynabeads® M-280 Schaf anti-Maus IgG (Dynal, Hamburg) • Filterpapier (Whatman, GE Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien) • Low Protein Binding Tubes (Sarstedt, Nümbrecht) • Mikrotiterplatten (Greiner Bio-One, Frickenhausen) • Objektträger (Engelbrecht GmbH, Edermünder) • Pastikwaren (Greiner Bio-One, Frickenhausen) • PVDF-Membranen (Roche, Basel) • Zellkulturflaschen (Greiner Bio-One, Frickenhausen)3.3 GeräteDie im Folgenden aufgelisteten Geräte wurden benutzt. • Anlage zur Erzeugung eines inhomogenen Magnetfeldes für die mechanische Stimulation • Anthos Reader (Anthos, Krefeld) • Axiovert 40 C (Zeiss, Jena) • CASY® Cell Counter (OLS, Bremen) • Leica TCS SP2 (Leica, Heidelberg) • Molecular Imager Gel Doc XR System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) • Qubit® 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Karlsruhe)3.4 SoftwareDie im Folgenden aufgelistete Software wurde verwendet. • AxioVision (Zeiss, Jena) • Image Lab (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) • LAS AF Lite (Leica, Heidelberg) 18
  20. 20. 3.5 Antikörper 3 Material und Methoden • Leica Confocal Software (Leica, Heidelberg) • Microsoft Excel 2010 (Microsoft, Redmond, USA) • Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) • The GIMP (The GIMP Team)3.5 AntikörperDie im Folgenden aufgelisteten Antikörper wurden verwendet. • β1-Integrin Maus-Antikörper (Beckman Coulter, Fullerton, CA) • Kaninchen anti-Maus IgG-Cy3 (Dianova, Hamburg) • p44/42 MAPK (ERK 1/2) Kaninchen-Antikörper, polyklonal (Cell Signaling, Boston, MA) • Schwein anti-Maus IgG/HRP, polyklonal (Dako, Hamburg) • Schwein anti-Kaninchen IgG/HRP, polyklonal (Dako, Hamburg) • Vinculin Maus-Antikörper, monoklonal, Clone hVIN-1 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)3.6 KitsDie im Folgenden aufgelisteten Kits wurden verwendet. • Bio-PlexTM cell lysis Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) • Bio-PlexTM Phospho-AKT (S473) Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) • CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI, USA) • Qubit® Protein Assay Kit (Invitrogen, Karlsruhe) • SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce, Rockford, USA)3.7 ZellenAlle zellbiologischen Untersuchungen wurden mit humanen mesenchymalenStammzellen aus dem Knochenmark (hMSZ) durchgeführt. Als Quelle dienten zumeinen Zellen aus dem Knochenmark von Patienten, die während einer medianenSternotomie entnommen wurden, zum anderen kommerzielle hMSZ (Lonza, Basel). 19
  21. 21. 3.8 Medien für die Zellkultur 3 Material und Methoden3.8 Medien für die ZellkulturAls Expansionsmedium wurde Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) verwendet,welchem vor dem Gebrauch fetales Kälberserum (FKS) bis zu einer Endkonzentrationvon 10 % bzw. 0,5 % und antibiotische-antimykotische Lösung (AB/AM) bis zu einerEndkonzentration von 1 % steril hinzugegeben wurde.Als Medium zur Kryokonservierung der hMSZ wurde Cryo-SFM verwendet.3.9 Zellbiologische MethodenDie Isolierung und Kultivierung der Zellen wurden unter sterilen Bedingungen untereiner Sicherheitswerkbank durchgeführt. Alle Inkubationsschritte erfolgten unterstandardisierten Bedingungen bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit in einemBrutschrank.3.9.1 Isolation von hMSZDie hMSZ wurden aus Knochenmark gewonnen, das Patienten während einermedianen Sternotomie entnommen wurde (Klinik für Herzchirurgie, UniversitätRostock). Dieses Knochenmark (ca. 6 ml) wurde zur Antikoagulation 1:2 mit PBS/EDTAverdünnt, sodass das Gesamtvolumen 12 ml betrug. Zur Isolation der mononukleärenZellen wurde eine Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Dafür wurden in einFalconröhrchen 12 ml Pancoll vorgelegt. Pancoll enthält Ficoll 400, ein starkverzweigtes Zuckerpolymer aus Saccharose und Epichlorhydrin.Das vorgelegte Pancoll wurde mit dem verdünnten Knochenmark überschichtet und für30 min bei 1 800 rpm und Raumtemperatur in einem Swingout-Rotor zentrifugiert.Nach der Zentrifugation wurde der dabei entstandene, weiße Lymphozytenringabgenommen und in Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) gewaschen. Die Zellenwurden anschließend in 5 ml DMEM aufgenommen und in T 25 Kulturflaschenkultiviert. Nach 24 h wurden die nicht-adhärenten Zellen durch Spülen des Zellrasens 20
  22. 22. 3.9 Zellbiologische Methoden 3 Material und Methodenmit HBSS entfernt. Die weitere Kultivierung erfolgte, bis die Zellen zu 80 % konfluentwaren. Danach wurden sie entweder gesplittet oder für weitere Versuche ausgesät.3.9.2 Zellen einfrieren und auftauenDamit hMSZ eingefroren werden konnten, wurden diese zuvor mit Hilfe vonTrypsin/EDTA vom Boden der Kulturflasche abgelöst und bei 1 200 rpm für 5 minsedimentiert. Das entstandene Zellpellet wurde in DMSO-haltigem Medium, Cryo-SFM,resuspendiert und anschließend in Kryoröhrchen überführt. Bis zur weiterenVerwendung wurden die Zellen in der Gasphase flüssigen Stickstoffs gelagert.Um kryokonservierte Zellen erneut in Kultur zu nehmen, wurden diese in DMEMaufgenommen. Um das zytotoxische DMSO zu entfernen, wurde die Zellsuspensionpelletiert und der Überstand dekantiert. Das Zellpellet wurde in frischem DMEMresuspendiert und auf Zellkulturflaschen verteilt. Die Kultivierung erfolgte unterstandardisierten Bedingungen im Brutschrank. Nach einem Tag wurden die nichtadhärenten Zellen entfernt, indem das Medium gewechselt und die Kultivierungfortgesetzt wurde.3.9.3 MediumwechselDer Verbrauch von Nährstoffen im Medium ist unter anderem abhängig von derStoffwechselaktivität und der Anzahl der Zellen - er geht einher mit einem Absinken despH-Wertes. Dieser äußert sich in einem Farbumschlag des Mediums. Um einkonstantes Milieu und gleiche Bedingungen für die Zellen zu gewährleisten, wurde dasMedium alle zwei bis drei Tage gewechselt.3.9.4 ZellpassagenIm Laufe der Kultivierung bildeten die Zellen einen konfluenten Zellrasen aus. Durch dieKonfluenz kommt es einerseits zur Kontakthemmung, wodurch die weitereZellproliferation inhibiert wird, andererseits besteht die Gefahr, dass sich der Zellrasenvom Flaschenboden ablöst, wodurch Zellen verloren gehen. Um nach Erreichen der 21
  23. 23. 3.9 Zellbiologische Methoden 3 Material und MethodenKonfluenz die weitere Zellvermehrung zu gewährleisten, wurden die Zellen gesplittet.Hierfür wurden die Zellen nach zweimaligem Waschen mit PBS durch Inkubation mitTrypsin/EDTA vom Flaschenboden abgelöst und in DMEM resuspendiert.Anschließend wurde die Zellsuspension in neue Kulturflaschen überführt und dieKultivierung entsprechend fortgesetzt.3.9.5 ZellaussaatFür die folgenden Versuche war die Aussaat definierter Zellzahlen notwendig. Hierfürwurden die konfluenten Zellen mittels Trypsin/EDTA vom Boden der Kulturflaschenabgelöst und in Medium resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen bei 1 200 rpmfür 5 min pelletiert und in einer definierten Menge Medium aufgenommen. DieBestimmung der Zellzahl wurde mit Hilfe des CASY® Cell Counter vorgenommen. Diefür die folgenden Versuche jeweils benötigten Zellkonzentrationen wurden durchVerdünnung der Zellsuspension mit Medium eingestellt. Die Zellsuspension wurde dannin die jeweiligen Kulturgefäße mit einer Dichte von 6 000 Zellen pro cm² ausgesät undfür mindestens 24 h inkubiert.3.9.6 Verwendung der InhibitorenDie Inhibitoren Cytochalasin D, Jasplakinolide und Latrunculin A sollten inKonzentrationen eingesetzt werden, welche die Funktionen des Aktinzytoskelettshemmen, aber die Zellvitalität nicht beeinträchtigen. Da jede der drei Substanzen inDMSO gelöst vorlag, wurde DMSO-haltiges DMEM mit einer Endkonzentration von0,1 % für alle Experimente als Vehikelkontrolle mitgeführt. Auf diese Weise wurdesichergestellt, dass beobachtete Effekte allein auf die Inhibitoren und nicht auf ihrLösungsmittel zurückzuführen sind. Um herauszufinden, welcheInhibitorkonzentrationen für die weiteren Experimente geeignet waren, wurden dieZellen zunächst unter verschiedenen Konzentrationen kultiviert. Zu diesem Zweckwurde das Zellkulturmedium mit unterschiedlichen Mengen der inhibitorischenSubstanzen versetzt und die Zellen darin suspendiert. Nach 30-minütiger 22
  24. 24. 3.9 Zellbiologische Methoden 3 Material und MethodenVorinkubation der Zellen in Suspension, wurden diese in die für die jeweiligenVersuche benötigten Kulturgefäße ausgesät.3.9.7 LichtmikroskopieBei der lichtmikroskopischen Betrachtung der Zellen handelt es sich um einenmorphologischen Assay zur Beurteilung der Zellform, der Adhäsion und der Vitalität.Zu diesem Zweck wurden 20 000 Zellen pro cm² in Petrischalen (d=3,5 cm) ausgesätund unter verschiedenen Inhibitorkonzentrationen für 24 h inkubiert. Dann wurden dieZellen im Kulturmedium im Durchlicht lichtmikroskopisch betrachtet und morphologischbeurteilt. Auffälligkeiten bezüglich Zellform und Zellzahl wurden dokumentiert.3.9.8 Kolorimetrische AssaysDie kolorimetrischen Assays unter dem Einfluss der Inhibitoren wurden inMikrotiterplatten im 96-Well-Format jeweils als Triplettansatz durchgeführt. Dafürwurden in jedes Well 7 000 Zellen ausgesät und diese dann für 24 h inkubiert.MTS-TestUm Rückschlüsse auf die metabolische Aktivität der Zellen unter verschiedenenKonzentrationen der Inhibitoren zu ziehen, wurde der MTS-Test (Cory et al., 1991)durchgeführt. Dafür wurde der CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell ProliferationAssay verwendet. Hierbei handelt sich um einen kolorimetrischen Test, der auf derAktivität zellulärer Dehydrogenasen basiert, die in metabolisch aktiven Zellenvorliegen. Der Test enthält 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), ein gelbes, wasserlösliches Tetrazoliumsalz. Dieseswird durch enzymatische Reduktion in ein oranges Formazan umgewandelt. DiesesFormazan liegt dann gelöst im Kulturmedium vor und kann durchAbsorptionsmessungen bei einer Wellenlänge von 490 nm quantifiziert werden. DieMenge des gemessenen Formazans ist proportional zur Stoffwechselaktivität allerlebenden Zellen in der Kultur. 23
  25. 25. 3.9 Zellbiologische Methoden 3 Material und MethodenNach der 24-stündigen Inkubation wurde das Medium aus allen Wells entfernt. Injedes Well wurden dann jeweils 100 µl frisches DMEM und 20 µl MTS-Reagenzgegeben. Drei weitere Kontroll-Wells wurden ausschließlich mit DMEM/MTS-Gemischgefüllt, um als Leerwert mitgeführt zu werden. Nach einstündiger Inkubation der Zellenmit dem MTS-Reagenz wurden je 100 µl des Überstandes für die Absorptionsmessungin eine neue Miktrotiterplatte überführt. Die photometrische Bestimmung der Absorptionwurde mit dem Anthos-Reader bei einer Wellenlänge von 490 nm durchgeführt.Kristallviolett-TestDer Kristallviolett-Test wurde im direkten Anschluss an den MTS-Test auf derselbenMikrotiterplatte durchgeführt. Um die Ergebnisse des MTS-Tests auf die Zellzahl zurelativieren, wurde der Kristallviolett-Test zur Bestimmung der Anzahl der Zellendurchgeführt. Hierbei handelt es sich ebenfalls um einen kolorimetrischen Assay, beidem über Kristallviolett die DNA angefärbt wird. Durch Solubilisation des Zellrasens istes dann möglich, den aufgenommenen Farbstoffs photometrisch zu quantifizieren. Diegemessene Absorption bei 570 nm ist proportional zur Menge aller adhärenten Zellender Kultur.Alle Wells inklusive der drei Leerwerte wurden zu Beginn zweimal mit PBS gespült.Anschließend wurden die Zellen für 10 min bei Raumtemperatur mit Isopropanol fixiertund dann dreimal mit Tween/PBS (0,05 %) gewaschen und permeabilisiert. ZurFärbung wurden die Zellen dann mit Kristallviolett (0,1 %) bedeckt und für 20 min aufdem Schüttler inkubiert, damit der Farbstoff optimal in den Zellinnenraum penetrierenkonnte. Im Anschluss wurden die Zellen mehrmals mit destilliertem Wasser gespült, bisdas Kristallviolett vollständig aus dem Überstand entfernt war. Der gefärbte Zellrasenwurde dann durch Zugabe von Essigsäure (33 %) für 15 min unter Schüttelnsolubilisiert. Danach wurden je 70 µl des Überstandes für die Absorptionsmessung inneue Wells transferiert. Die photometrische Bestimmung der Absorption wurde mit demAnthos-Reader bei einer Wellenlänge von 570 nm durchgeführt. 24
  26. 26. 3.9 Zellbiologische Methoden 3 Material und Methoden3.9.9 ImmunfluoreszenzfärbungDie Immunfluoreszenzfärbung wurde genutzt, um die Art und das Ausmaß desZytoskelettumbaus bei hMSZ durch verschiedene Konzentrationen der SubstanzenCytochalasin D, Latrunculin A und Jasplakinolid zu charakterisieren. Dafür wurden dieZellen zum einen mit FITC markiertem Phalloidin (1:100) gegen F-Aktin und zumanderen mit Anti-Vinculin-Antikörpern (1:100) und Cy3-konjugiertenSekundärantikörpern (1:200) angefärbt.Die Aussaat der Zellen für die Immunfärbung erfolgte auf Deckgläsern mit einemDurchmesser von 12 mm. Auf jedes Deckglas wurden ca. 20 000 Zellen ausgesät, diedann für 24 h inkubiert wurden, damit die Zellen adhärieren konnten. Nach Ende derInkubationszeit wurde das Medium abgenommen und die Zellen vorsichtig mit PBSgewaschen. Zur anschließenden Fixierung wurden die Zellen mit Paraformaldehyd(PFA) (4 %) überschichtet und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutemWaschen des Zellrasens mit PBS wurden die Zellen für 10 min mit Triton X-100 (0,1 %)permeabilisiert, damit die folgenden Antikörper an die entsprechenden intrazellulärenStrukturen binden können. Die Inkubation mit den unterschiedlichen Antikörpernerfolgte nacheinander für jeweils 30 min, bei Raumtemperatur, im Dunkeln. Um nichtgebundene Antikörper zu entfernen, wurden die Deckgläser nach jedemInkubationsschritt mehrfach mit PBS gespült. Vor dem Einbetten der Präparate wurdendiese abschließend mit destilliertem Wasser gespült, um Kristallisationen zu vermeiden.Zum Einbetten wurde Fluoroshield, ein kommerzielles, aushärtendes Einbettmedium,verwendet. Die fertigen Präparate wurden lichtgeschützt bei 4 °C gelagert.3.9.10 Konfokale Laser-Scanning-MikroskopieDie konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) wurde zur Auswertung derImmunfluoreszenzfärbungen genutzt. Sie ermöglicht die Aufnahme hochauflösenderBilder durch punktweises Abrastern von Präparaten mit einem fokussierten Laserstrahl.Die Fluoreszenz, die durch das Laserlicht hervorgerufen wird, kann entsprechendpunktweise detektiert werden. Informationen über das gesamte Präparat erhält man, 25
  27. 27. 3.10 Proteinbiochemische Methoden 3 Material und Methodenindem der Laserstrahl über die Probe bewegt wird und die emittierte Fluoreszenz vomjeweiligen Probenort pixelweise detektiert wird. Das konfokale LSM unterscheidet sichmaßgeblich vom gewöhnlichen Lichtmikroskop durch eine konfokale Blende. Diesebefindet sich in der Zwischenbildebene. Am Detektor trifft also nur das Licht auf,welches diese Blende passiert hat. Der Grad der Konfokalität variiert folglich mit demBlendendurchmesser. Je kleiner dieser ist, desto mehr Signale unter- und oberhalb derFokusebene werden ausgeblendet. Das konfokale LSM ermöglicht auf diese Weise dieAufnahme dünner optischer Schnitte aus einem Präparat. Durch digitale Überlagerungmehrerer solcher Schnitte können sogar dreidimensionale Bilder rekonstruiert werden.Für Aufnahmen im Rahmen dieser Arbeit wurde das Leica TCS SP2 benutzt, welchesunter anderem einen Argon-Ionen-Laser und einen Helium-Neon-Laser besitzt. DerArgon-Ionen-Laser emittiert Licht der Wellenlänge 488 nm und wurde zur Anregungvon FITC (λex 495 nm; λem 520 nm), welches an Phalloiden gekoppelt war,verwendet. Die Cy3-gekoppelten Antikörper (λex 550 nm; λem 570 nm) wurden mitLicht der Wellenlänge 543 nm durch den Helium-Neon-Laser angeregt. DieAuswertung der Daten erfolgte mit der Leica Confocal Software und LAS AF Lite.3.10 Proteinbiochemische Methoden3.10.1 Zelllyse und ProbenvorbereitungDie Lyse der adhärenten Zellen erfolgte 30 min nach der mechanischen Stimulation.Sie wurde mit dem Bio-PlexTM Cell Lysis Kit nach Angaben des Herstellers durchgeführt.Die Zelllysate wurden für mindestens 24 h bei -20 °C gelagert.Für die Bestimmung der Proteinmenge wurden die Lysate aufgetaut und bei 4 °C und4 500  x g für 20 min herunterzentrifugiert. Die Überstände wurden in neue Röhrchenüberführt. Die Proteinbestimmung wurde mit dem Qubit® Protein Assay Kit nachHerstellerprotokoll durchgeführt. Die extrahierten Proteine wurden in Proteinladepuffernach Laemmli (1970) aufgenommen. Der Proteinladepuffer enthielt ein 26
  28. 28. 3.10 Proteinbiochemische Methoden 3 Material und MethodenReduktionsmittel. Um die Proteine vollständig zu denaturieren wurden sie für 5 min auf95 °C erhitzt.3.10.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)Die SDS-PAGE wurde zunächst genutzt um die Gleichmäßigkeit des Proteinauftrags mitHilfe der Coomassie-Färbung zu bestätigen. Zu diesem Zweck wurden gleicheProteinmengen auf ein 10 %iges Polyacrylamid-Gel aufgetragen. Die Auftrennung derProteine nach ihrem Molekulargewicht wurde in einer vertikalen Proteingelkammer, diemit Laufpuffer gefüllt war, bei 180 V durchgeführt. Nach Beenden der Elektrophoresewurde das Gel aus der Kammer entfernt und für mehrere Stunden mit Coomassiegefärbt. Die Entfärbung des Gels erfolgte über Nacht. Anhand der Intensität undKomplexität der Banden konnte der Probenauftrag beurteilt werden.Um die Proteine weiter im Western Blot zu verwenden, wurde eine weitere SDS-PAGEdurchgeführt. Hierfür wurde das Criterion Precast Gel System verwendet.Tabelle 1 Zusammensetzung des Sammelgelpuffers (pH 6,8)Tris 0,5M 6,06  gSDS 138  mM 0,4  gH2 O 100  mlTabelle 2 Zusammensetzung des TrenngelpuffersTris 1,5  M 36,33  gSDS 10 Mm 0,8  gH2 O 200  mlTabelle 3 Zusammensetzung des TrenngelsH2 O 10,9  mlAcrylamid (40  %) 5,5  mlTrenngelpuffer 5,5  mlTEMED 20  µlAPS (10  %) 300  µlTabelle 4 Zusammensetzung des SammelgelsH2 O 10,2  mlAcrylamid (40  %) 2  mlSammelgelpuffer 4,2  ml 27
  29. 29. 3.10 Proteinbiochemische Methoden 3 Material und MethodenTEMED 20  µlAPS (10  %) 200  µlTabelle 5 Zusammensetzung des LaufpuffersH2 O 5  lTris 45,45  gGlycin 211,5  gSDS 15  g3.10.3 Western Blot und ImmundetektionDer Western Blot wurde als Tank-Blot-Verfahren durchgeführt. Nach der Elektrophoresewurden die ungefärbten Gele in Transferpuffer bei 370 mA für 1 h auf Membranen ausPolyvinylidenfluorid (PVDF) transferiert. Im Anschluss wurden die noch freienProteinbindungsstellen der Membran mit Proteinen abgesättigt, indem die Membran für1 h in 5 %iger Blockierungsmilch inkubiert wurde. Die PVDF-Membranen wurden überNacht bei 4 °C mit dem Primärantikörper inkubiert. Dieser war im Verhältnis 1:1000in Blockierungsmilch verdünnt. Danach wurden ungebundene Antikörper durch dreizehnminütige Waschschritte in Waschpuffer entfernt. Die Inkubation mit demPeroxidase gekoppeltem Sekundärantikörper erfolgte für 1 h bei Raumtemperatur.Dieser lag in einer Verdünnung 1:10 000 in Blockierungsmilch vor. UngebundeneAntikörper wurden wieder in mehreren Waschschritten entfernt. Danach erfolgte dieDetektion mittels Chemilumineszenz mit dem SuperSignal  West  Femto  Maximum  Sensitivity  Substrate. Hierzu wurde die Membran mit der nach Protokoll hergestelltenDetektionslösung in einer lichtdurchlässigen Folie inkubiert. Die Aufnahme desChemilumineszenzsignals erfolgte mit dem Molecular Imager Gel Doc XR System. Diedensitometrische Auswertung wurde mit Quantity One® 1-D Analysis und Image Lab™vorgenommen.Tabelle 6 Zusammensetzung des TransferpuffersTransferpufferH2 O 4  lTris (25  mM) 9  gGlycin (190  mM) 43,5  gMethanol (10  %) 300  ml 28
  30. 30. 3.11 Bio-Plex-Assay 3 Material und MethodenTabelle 7 Zusammensetzung des WaschpuffersWaschpuffer (10fach)H2 O 4  lNaCl 350  gTris 48,4  gTween20 20  mlmit H2O auf 5  l auffüllenmit HCl (37  %) auf pH  7,4 einstellen3.11 Bio-Plex-AssayDas Bio-Plex-Verfahren ist eine von der Firma Bio-Rad Laboratories etablierte Methode.Sie dient der Detektion von Proteinexpressionen und Phosphorylierungen in Zelllysatenund wird im Format von 96-Well-Mikrotiterplatten durchgeführt. Das Bio-Plex-Verfahrenbasiert auf Beads, die in verschiedenen Spektralfarben fluoreszieren. Diese Beads sindmit Antikörpern gegen verschiedene Zielproteine gekoppelt. Jedem Protein ist hierbeieine bestimmte Fluoreszenz zugeordnet. Auf diese Weise ist es möglich, verschiedeneProteine in derselben Probe gleichzeitig differenziert nachzuweisen. Des Weiterenerfolgt die Detektion über die Bindung eines biotinylierten Sekundärantikörpers, dergegen ein anderes Epitop des Zielproteins gerichtet ist. An diesen sekundärenAntikörper bindet ein fluoreszierender Streptavidin-Reporter. Der entstandene Komplexaus Beads, Zielprotein, Antikörpern und Reporter kann mit dem Bio-Plex Array Readerdetektiert werden. Das geschieht über zwei Laser, einen roten und einen grünen. Derrote Laser ist für die Identifizierung der Proteine über die Farbe der Beads zuständigund der grüne misst über die Intensität des Reporter Signals die Menge desgebundenen Zielproteins.Für diesen Versuch wurde der Bio-PlexTM Phospho-AKT (S473) Assay verwendet. Zuerstwurden die Beads in die Wells der Multititerplatte gegeben und gewaschen. Imzweiten Schritt wurden die Zelllysate, die mit dem Bio-PlexTM Cell Lysis Kit vorbereitetwurden, zu den Beads gegeben und über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurdedie Platte gewaschen, die Biotin-gekoppelten Sekundärantikörper zu den Probengegeben und der Ansatz für 30 min inkubiert. Nach erneutem Waschen der Plattewurde der fluoreszierende Streptavidin-Reporter hinzugefügt und für 10 min inkubiert. 29
  31. 31. 3.12 Mechanische Stimulation 3 Material und MethodenAbschließend wurde die Assay-Platte noch gespült und die Proben in Assay-Pufferresuspendiert, um dann mit dem Bio-Plex Array Reader gemessen zu werden.3.12 Mechanische Stimulation3.12.1 AussaatDie mechanische Stimulation der hMSZ wurde in Mikrotiterplatten im 96-Well-Format(Costar® 96-Well EIA/RIA Stripwell™ Plate) durchgeführt. Pro Well wurden zwischen7 000 und 9 000 Zellen ausgesät. Die Zellen wurden 24 h vor mechanischerStimulation in serumreduziertem Medium bei 0,5 % FKS kultiviert.3.12.2 Vorbereitung der MikrobeadsUm die Integrinrezeptoren mechanisch zu reizen, wurden paramagnetischeMikrobeads mit Antikörpern gegen die β1-Untereinheit der Integrine beschichtet. DieBeads haben eine Größe von 2,8 µm und sind mit Schaf anti-Maus Antikörpernbeschichtet. Diese Beads wurden dann mit 1 µg Maus anti-β1-Integrin Antikörpernschüttelnd für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurden die Beads mit PBSgewaschen und in DMEM resuspendiert. Die präparierten Beads wurden dann auf dieausgesäten Zellen gegeben und für 30 min inkubiert. 5 bis 10 Mikrobeads bindendurchschnittlich an β1-Integrin-Untereinheiten an der apikalen Seite einer Zelle.3.12.3 Mechanischer ReizZur Ausübung der mechanischen Stimulation wurde eine spezielle magnetische Anlageverwendet. Diese Anlage besteht aus Spulen mit einem Eisenkern und zweiunterschiedlich geformten Polen, zwischen denen das inhomogene Magnetfeld erzeugtwird. Der Abstand beider Pole voneinander beträgt 1 cm. Die durchschnittliche Stärkedes erzeugten Magnetfeldes liegt bei 0,015 T (Pommerenke et al., 1996). 30
  32. 32. 3.13 Statistik und Auswertung 3 Material und MethodenDie Kulturwells wurden einzeln zwischen den beiden Polen positioniert. Die Zugkräftewurden über die an die Rezeptoren gekoppelten Mikrobeads auf die Zellen ausgeübt.Sie wirkten in horizontaler Ebene, das heißt parallel zur apikalen Seite der Zellen. DieKräfte, die auf einen einzelnen Bead wirken, betragen 2 x 10-10 N. Dadurch, dass jedeZelle mit einer unterschiedlichen Anzahl Beads, die unterschiedlich lokalisiert waren,beladen war, variierte die ausgeübte mechanische Belastung von Zelle zu Zelle. Beidem für 15 min applizierten Reiz handelte es sich um eine zyklische, mechanischeBelastung mit der Frequenz von 1 Hz. Zum Vergleich wurden Zellen jeweils nur mitMikrobeads beladen oder dem Magnetfeld ausgesetzt.3.13 Statistik und AuswertungJeder experimentelle Ansatz wurde insgesamt dreimal, jeweils mit Zellenunterschiedlicher Präparationen, durchgeführt. Die Auswertung der Messwerte erfolgtemit Microsoft Excel 2010. Von allen Messwerten für die Absorption wurde derLeerwert subtrahiert. Um eine Aussage über die spezifische metabolische Aktivität derZellen treffen zu können, musste der Quotient aus den Werten des MTS- und desKristallviolett-Tests gebildet werden. Anschließend wurden die arithmetischenMittelwerte gebildet und die Standardabweichungen bestimmt. Die Ergebnisse wurdendann auf die entsprechenden Kontrollwerte normiert. Zur weiteren Analyse wurde derungepaarte t-Test durchgeführt. Als minimales Signifikanzniveau wurde eineIrrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 festgelegt. Für Tendenzen wurde eineIrrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,1 angenommen.Die Auswertung der densitometrischen Daten aus der Western Blot-Analyse und derMesswerte des Bio-Plex-Assays erfolgte mit Microsoft Excel 2010. Für die Analysewurde der ungepaarte t-Test durchgeführt. Als minimales Signifikanzniveau wurde eineIrrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 festgelegt. Für Tendenzen wurde eineIrrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,1 angenommen. Es wurden der arithmetischeMittelwert sowie die Standardabweichung angegeben. Wobei die Mittelwerte zuvorauf die entsprechenden Kontrollen normiert wurden. 31
  33. 33. 4.1 Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie 4 Ergebnisse4 Ergebnisse4.1 Einfluss der Inhibitoren auf die MorphologieUm den Einfluss der Substanzen Cytochalasin D, Jasplakinolid und Latrunculin A aufstrukturelle und funktionelle Zellparameter untersuchen zu können, mussten zuvorgeeignete Konzentrationen für deren Einsatz bestimmt werden. Es solltenKonzentrationen verwendet werden, welche die Zellen in ihrer Vitalität nichtbeeinträchtigen. Zu diesem Zweck wurden hMSZ jeweils mit unterschiedlichenKonzentrationen der Inhibitoren für 24  h inkubiert, um anschließend lichtmikroskopischauf morphologische Veränderungen untersucht zu werden.Die Kontrollzellen in Abbildung 1A zeigen den für hMSZ typischen, Fibroblastähnlichen Erscheinungstyp. Die Zellen sind schlank, langgestreckt und weisen keineFortsätze auf. Ein sehr ähnliches morphologisches Erscheinungsbild haben die Zellen,die als Vehikelkontrolle unter Zusatz von 0,1 % DMSO kultiviert wurden(Abbildung 1B). Diese Zellen sind ebenfalls spindelförmig, schlank und überwiegendbipolar. Sie weisen kaum morphologische Unterschiede zu den Kontrollzellen auf.HMSZ, die mit 0,5 µM Cytochalasin D kultiviert wurden (Abbildung 1C), sind in ihrerZellform stark verändert. Die Zellen sind nicht mehr länglich sondern rundlich, einigeweisen kleine, kurze Fortsätze auf. Ein Teil der Zellen ist bereits abgekugelt. Zellen diemit Jasplakinolid der Konzentration 0,01 µM (Abbildung 1D) kultiviert wurden, zeigendagegen nur geringfügige morphologische Veränderungen. Sie sind länglich, ähnlichwie die Kontrollzellen. Im Vergleich sind sie jedoch etwas bereiter und weisen häufigVerzweigungen auf. Zellen, die für 24 h mit 0,1 µM Jasplakinolid behandelt wurden,waren größtenteils abgerundet (Abbildung 1E). Nach 24 h Inkubation mit 0,01 µMLatrunculin A weisen die Zellen keine wesentlichen Veränderungen in ihrerMorphologie gegenüber den Kontrollzellen auf (Abbildung 1F). Beim Zehnfachendieser Konzentration von Latrunculin A sind die Zellen breiter und zeigen einigeVerzweigungen (Abbildung 1G). Ein Teil der Zellen ist bei dieser Konzentration bereits 32
  34. 34. 4.1 Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie 4 Ergebnisseabgerundet. Abbildung 1H zeigt, dass die meisten Zellen bei einer Konzentration von0,5 µM Latrunculin A abgerundet sind. Nur vereinzelt sind noch stark verzweigte hMSZzu sehen.Kontrolle A: EM B: DMSOCytoD C: 0,5 µMJasp D: 0,01 µM E: 0,1 µMLatA F: 0,01 µM G: 0,1 µM H: 0,5 µMAbbildung 1 Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie von hMSZLichtmikroskopische Aufnahmen von hMSZ nach 24 h Inkubation mit Cytochalasin D (CytoD) (C), Jasplakinolid(Jasp) (D, E) und Latrunculin A (LatA) (F, G und H), Kontrolle (EM): ohne Inhibitoren (A), Vehikelkontrolle (DMSO):ohne Inhibitoren, mit DMSO (B) 33
  35. 35. 4.2 Einfluss der Inhibitoren auf das Aktinzytoskelett von hMSZ 4 Ergebnisse4.2 Einfluss der Inhibitoren auf das Aktinzytoskelett von hMSZUm Aussagen über den Einfluss der Inhibitoren auf das Aktinzytoskelett treffen zukönnen, wurden die Zellen mit Phalloidin-FITC für F-Aktin und einem Antikörper gegenVinculin angefärbt und unter dem Konfokalmikroskop analysiert. Abbildung 2 zeigt diekonfokalmikroskopischen Aufnahmen von hMSZ, die für 24  h mit den inhibitoischenSubstanzen Cytochalasin D, Jasplakinolid und Latrunculin A kultiviert wurden.Bei den Kontrollzellen sind die Aktinfilamente gleichmäßig im Zytoplasma verteilt(Abbildung 2A bis 2C), sie zeigen ein intaktes, charakteristisches Aktinzytokelett. DieAktinfilamente sind gleichmäßig im Zytoplasma verteilt. Die feinen Fasern sind linearund verlaufen in gleichgerichteten Bündeln entlang der Zellen. Die Aktinfilamentbündelenden an Vinculinen. Dort sind Aktin und Vinculin kolokalisiert. Die Vinculine sindgleichmäßig in der Zelle verteilt.Die Zellen der Vehikelkontrolle (Abbildung 2D bis 2F) zeigen ebenfalls ein typischesAktinzytoskelett, in welchem die Aktinbündel weitgehend parallel entlang der Zelleverlaufen. An den Enden der Aktinbündel sind die Vinculine lokalisiert, diese sindauffallend lang und überwiegend randständig gelegen.Nach 24  h Inkubation mit 0,5 µM Cytochalasin D (Abbildung 2G bis 22I) ist dasAktinzytoskelett weitgehend zerstört. F-Aktin ist fragmentiert und gleichmäßig imgesamten Zytoplasma verteilt, filamentöse Strukturen sind nur noch vereinzelt zuerkennen. An den Enden der unzerstörten Aktinfilamente ist auch in diesem FallVinculin lokalisiert. Der Großteil der Vinculine ist jedoch nicht mit Aktin gekoppelt undist diffus im gesamten Zytoplasma verteilt. Randständige Vinculine zeigen überwiegendkurze, längliche, feine Strukturen, während die übrigen fragmentiert und ohne klareStruktur sind. 34
  36. 36. 4.2 Einfluss der Inhibitoren auf das Aktinzytoskelett von hMSZ 4 ErgebnisseEM A B C D E FDMSO G H ICytoD 0,5 µM J K LJasp 0,01 µM M N OLatA 0,01 µM P Q RLatA 0,1 µMAbbildung 2 Einfluss der Inhibitoren auf das Zytoskelett von hMSZKonfokale fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von hMSZ nach Inkubation mit 0,5  µM Cytochalasin  D (G, H undI), 0,01  µM Jasplakinolid (J, K und L) und 0,01  µM (M, N und O) bzw. 0,1  µM Latrunculin  A (P, Q und R), Kontrolle(A, B und C): ohne Inhibitoren; Vehikelkontrolle (D, E und F): ohne Inhibitoren, mit DMSO; F-Aktin (grün) undVinculin (rot). 35
  37. 37. 4.3 Einfluss der Inhibitoren auf die Stoffwechselaktivität und die Proliferation von hMSZ 4 ErgebnisseIn Zellen, die mit 0,01 µM Jasplakinolid (Abbildung 2J bis 2L) inkubiert wurden, sinddie Aktinfilamente verdickt und ungleichmäßig im Zytoplasma verteilt. Die F-Aktin-Aggregate sind um den Zellkern herum lokalisiert, von dort aus verlaufen siestrahlenförmig, in stärkeren Bündeln zu den kleinen Fortsätzen, die sich am Zellrandausgebildet haben. Dort enden die Aktinbündel in Vinculinen, welche hauptsächlichrandständig lokalisiert sind und in den Fortsätzen gehäuft vorliegen.Die Abbildungen 2M bis 2R zeigen Zellen, die mit Latrunculin A kultiviert wurden. Beieiner Konzentration von 0,01 µM Latrunculin A (Abbildung 2M bis 2O) sind die F-Aktinfilamente leicht gewellt und wirken teilweise verklebt. Die Vinculine, die mit denAktinfilamentenden kolokalisiert sind, befinden sich größtenteils am Rand der Zelle. Beieiner Konzentration von 0,1 µM Latrunculin A (Abbildung 2P bis 2R) sind dieAktinfilamente stärker gewellt und unregelmäßig im Zytoplasma verteilt, sodass dassAktinzytoskelett vereinzelt Löcher zum Zellrand hin aufweist, die Vinculine sind hiervermehrt im Zentrum der Zelle lokalisiert.4.3 Einfluss der Inhibitoren auf die Stoffwechselaktivität und die Proliferation von hMSZUm die Stoffwechselaktivität und das Proliferationsvermögen der hMSZ unter demEinfluss der drei unterschiedlichen Inhibitoren bestimmen zu können, wurden die Zellennach 24-stündiger Inkubation mittels MTS-Test basierend auf zellulärenDehydrogenaseaktivitäten kolorimetrisch analysiert. Der Kristallviolett-Test diente alsweiterer kolorimetrischer Test zur Bestimmung des Proliferationsvermögens bzw. derZahl der lebenden Zellen. Der Farbstoff Kristallviolett färbt die DNS adhärenter Zellenan.Die Resultate beider Assays sind in Abbildung 3 dargestellt. Die Werte derKontrollzellen sind jeweils auf 100 Prozent gesetzt und dienen als Referenzwerte, alleanderen Messwerte sind auf diese Referenzwerte normiert.Die Ergebnisse der Analyse der metabolischen Aktivität, die nach Inkubation mit denInhibitoren erhalten wurden, sind in Abbildung 3A dargestellt. Die Absorptionswerte 36
  38. 38. 4.3 Einfluss der Inhibitoren auf die Stoffwechselaktivität und die Proliferation von hMSZ 4 Ergebnissedie unter Einfluss von DMSO erhalten wurden, dienen als Vehikelkontrolle undunterscheiden sich nicht signifikant vom Referenzwert. Die Analysenwerte der Zellen,die unter 0,5 µM Cytochalasin D, 0,01 µM bzw. 0,1 µM Latrunculin A und 0,01 µMJasplakinolid erhalten wurden, zeigen keine signifikanten Unterschiede zu denen derKontrollzellen. Zellen, die mit 1,0 µm Latrunculin A und 0,1 µM Jasplakinolid inkubiertwurden, weisen um 50 Prozent signifikant reduzierte Stoffwechselaktivitäten auf. BeimWert für 1,0 µM Jasplakinolid ist keine Standardabweichung angegeben, da es sichum eine Einzelmessung handelt. Dieser Wert ist deshalb eher als Trend zu betrachten.Abbildung 3B zeigt die Resultate der Analyse des Proliferationsvermögens. DieMesswerte der Vehikelkontrolle unterscheiden sich unwesentlich vom Kontrollwert. DieAnalysewerte der Zellen, die unter 0,5 µM Cytocalasin D, 0,01 µM bzw. 0,1 µMLatrunculin A und 0,01 µM Jasplakinolid erhalten wurden, zeigen ebenfalls keinesignifikanten Unterschiede zu denen der Kontrollzellen. Bei einer Konzentration von1,0 µM Latrunculin A ist die Proliferation signifikant um mehr als die Hälfte verringert.Die Verwendung von 0,1 µM Jasplakinolid zeigt ein signifikantes Absinken derProliferation gegenüber der Vehikelkontrolle auf um 20 Prozent. Beim Wert für 1,0 µM  Latrunculin A ist keine Standardabweichung angegeben, da es sich um eineEinzelmessung handelt. Dieser Wert ist deshalb eher als Trend zu betrachten.Um eine Aussage über die Intensität der Stoffwechselaktivität pro Zelle treffen zukönnen, wurde der Quotient aus den Absorbtionswerten des MTS- und desKristallviolett-Tests gebildet. Das Ergebnis ist in Abbildung 3C dargestellt. Der Wert derKontrolle ist auch hier auf 100 Prozent gesetzt worden, wobei die übrigen Werte aufdiesen normiert sind. Keiner der Werte zeigt einen signifikanten Unterschied zurKontrolle, was darauf schließen lässt, dass die Zellen durch die Inhibitoren eineverminderte Proliferation aufweisen. Die Stoffwechselaktivität der einzelnen Zelle unterden Inhibitoren bleibt dagegen weitgehend unbeeinflusst. 37
  39. 39. 4.3 Einfluss der Inhibitoren auf die Stoffwechselaktivität und die Proliferation von hMSZ 4 Ergebnisse A 200 ** rel. Absorption bei 490 nm in % ** 100 0 EM DMSO 0,5 µM 0,01 µM 0,1 µm 1 µM 0,01 µM 0,1 µM 1 µM Kontrolle CytoD LatA Jasp B 200 rel. Absorption bei 570 nm in % ** 100 ** 0 EM DMSO 0,5 µM 0,01 µM 0,1 µm 1 µM 0,01 µM 0,1 µM 1 µM Kontrolle CytoD LatA Jasp C 300 rel. met. Aktivität pro Zelle in % 200 100 0 EM DMSO 0,5 µM 0,01 µM 0,1 µm 1 µM 0,01 µM 0,1 µM 1 µM Kontrolle CytoD LatA JaspAbbildung 3 Einfluss der Inhibitoren auf die metabolische Aktivität und die Proliferation von hMSZA: MTS-Test (metabolische Aktivität) und B: Kristallviolett-Test (Proliferation) nach 24 h Inkubation mit unterschiedlichenKonzentrationen der Inhibitoren Cytochalasin D (CytoD), Jasplakinolid (Jasp) und Latrunculin A (LatA), Kontrolle: ohne Inhibitoren(EM) bzw. mit DMSO; C: Quotient MTS/KV (metabolische Aktivität pro Zelle); Alle Werte wurden auf die Kontrolle normiert,dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung, eckige Klammern zeigen signifikante Unterschiede (**p ≤ 0,05; n=3). 38
  40. 40. 4.4 Einfluss der Inhibitoren auf Signalproteine 4 Ergebnisse4.4 Einfluss der Inhibitoren auf SignalproteineUm den Einfluss der Inhibitoren Cytochalasin D, Jasplakinolid und Latrunculin A auf dieAktivierung der Signalproteine ERK und AKT in Zellen nach mechanischer Stimulationder β1-Integrin-Untereinheit zu untersuchen, wurde das Western Blot Verfahren bzw.der Bio-Plex Assay durchgeführt. Alle Zelllysate wurden zum einen auf die Expressionvon ERK1/2 und Phospho-ERK1/2 und zum anderen auf die Expression von AKT undPhospho-AKT untersucht.Um auszuschließen, dass DMSO, als Lösungsmittel der Inhibitoren, einen Einfluss aufdie Aktivierung der Signalproteine ERK und AKT ausübt, wurden Zellen, die in reinemEM mechanisch stimuliert wurden, mit Zellen, die in DMSO-haltigem Erhaltungsmediummechanisch stimuliert wurden, miteinander verglichen (Abbildung 4). Die Western BlotAnalyse von Phospho-ERK1/2 (Abbildung 4A) zeigt deutlich intensivere Bandensowohl bei mechanisch stimulierten Kontrollzellen in Erhaltungsmedium als auch beidenen der Vehikelkontrolle mit DMSO. Clustern der Integrinrezeptoren durchInkubation mit den Beads induzierte bereits eine Aktivierung von ERK1/2 im Vergleichzu Kontrollzellen. Die Aktivierung ist aber geringer als nach mechanischer Belastungder Integrine durch Zugkräfte. Die densitometrische Auswertung der Western BlotAnalyse (Abbildung 4B) konnte diese Aussagen durch objekte Messswerte bestätigenund signifikante Unterschiede zwischen Clustern der Rezeptoren und mechanischerBelastung nachweisen. In beiden Fällen war der Effekt gegenüber den Kontrollzellensignifikant erhöht.Die Werte der Vehikelkontrolle zeigen keine signifikanten Unterschiede zu denentsprechenden Werten der Kontrollzellen in reinem EM. Die Ergebnisse der Bio-PlexAnalyse für die Phosphorylierung von AKT (Abbildung 4C) zeigen ein ähnliches Bild.Die geclusterten und die mechanisch stimulierten Zellen zeigen beide eine signifikanterhöhte Signalintensität im Vergleich zur Kontrolle. Die Intensitäten der entsprechendenProben, die in reinem EM und unter DMSO erhalten wurden, zeigen keinesignifikanten Unterschiede zueinander. Auf Grund dieser Ergebnisse werden alle 39
  41. 41. 4.4 Einfluss der Inhibitoren auf Signalproteine 4 ErgebnisseWerte der folgenden Untersuchungen mit den Inhibitoren auf die Resultate bezogen,die unter Behandlung mit DMSO erhalten wurden.Um herauszufinden, welchen Einfluss die Inhibitoren auf die Phosphorylierung von ERKund AKT nach mechanischer Stimulation haben, wurde Zellen 24 h vor und auchwährend der mechanischen Stimulation mit den entsprechenden Inhibitoren inkubiert.Nach Behandlung mit 0,5 µM Cytochalasin D ist im Western Blot (Abbildung 5A) dieAktivierung von ERK sowohl durch Clustern der Integrine als auch nach mechanischerStimulation deutlich zu sehen. Dieses Ergebnis wird durch die densitometrischeAuswertung (Abbildung 5B) bestätigt.Im Falle von AKT (Abbildung 5C) konnte ebenfalls eine Aktivierung nach Clustern derIntegrine gezeigt werden. Für mechanisch stimulierte Zellen dagegen war dieseAktivierung unter dem Einfluss von Cytochalasin D gehemmt. 40
  42. 42. 4.4 Einfluss der Inhibitoren auf Signalproteine 4 Ergebnisse A B 2100 ** ** 1800 phERK 1500 Intensität in % 1200 ** EM 900 DMSO 0,1 % 600 300 0 K Cl MF Reiz C 600 ** 500 phAKT 400 ** Intensität in % EM 300 DMSO 0,1 % 200 100 0 K Cl MF ReizAbbildung 4 Einfluss mechanischer Stimulation auf die Phosphorylierung von ERK und AKT in hMSZA: Western Blot Analyse der Phosphorylierung von ERK1/2, die dargestellten Blots sind repräsentative Beispiele aus neununabhängigen Experimenten. B: Densitometrische Auswertung der Western Blot Analyse der Phosphorylierung von ERK1/2.C: Quantitative Analyse (Bio-Plex) der Phosphorylierung von AKT. Kontrolle: ohne Inhibitoren (EM) bzw. mit DMSO;K: unbehandelte Kontrolle, Cl: mit Beads geclustert, MF: Magnetfeld, Reiz: mechanische Stimulation. (B, C) Dargestellt sindMittelwert und Standardabweichung, alle Werte wurden auf die Kontrolle in EM normiert, eckige Klammern zeigen signifikanteUnterschiede (* p ≤ 0,1; **p ≤ 0,05; n=9). 41
  43. 43. 4.4 Einfluss der Inhibitoren auf Signalproteine 4 Ergebnisse A B 700 * 600 * phERK 500 Intensität in % 400 DMSO 0,1 % 300 CytoD 0,5 µM 200 100 0 K Cl MF Reiz C 700 * 600 phAKT 500 Intensität in % 400 DMSO 0,1 % 300 ** CytoD 0,5 µM 200 100 0 K Cl MF ReizAbbildung 5 Einfluss mechanischer Stimulation auf die Phosphorylierung von ERK und AKT in hMSZ nachInkubation mit Cytochalasin DA: Western Blot Analyse der Phosphorylierung von ERK1/2, die dargestellten Blots sind repräsentative Beispiele aus dreiunabhängigen Experimenten. B: Densitometrische Auswertung der Western Blot Analyse der Phosphorylierung von ERK1/2.C: Bio-Plex Analyse der Phosphorylierung von AKT. K: unbehandelte Kontrolle, Cl: mit Beads geclustert, MF: Magnetfeld, Reiz:mechanische Stimulation. (B, C) Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung, alle Werte wurden auf die Kontrolle in EMnormiert, eckige Klammern zeigen signifikante Unterschiede (* p ≤ 0,1; **p ≤ 0,05; n=3). 42
  44. 44. 4.4 Einfluss der Inhibitoren auf Signalproteine 4 ErgebnisseDie Analyse der Zellen, die mit 0,01 µM Jasplakinolid behandelt wurden, zeigen imWestern Blot eine verstärkte Phosphorylierung von ERK nach Clustern und mechanischeStimulation (Abbildung 6A). Durch die densitometrische Analyse wird dieses Ergebnisbestätigt (Abbildung 6B). Für Phospho-AKT konnte ein ähnliches Ergebnis gezeigtwerden(Abbildung 6C). In Anwesenheit von Jasplakinolid bleibt die Aktivierung vonAKT durch mechanische Reize am β1-Integrin unverändert.Die Resultate der mechanischen Stimulation unter dem Einfluss von 0,1 µMLatrunculin  A zeigen im Western Blot, dass die Aktivierung von ERK unter Einfluss desmechanischen Reizes durch Latrunculin  A komplett gehemmt wird. Weder durchClustern noch durch mechanisches Ziehen an Integrinen wird Phospho-ERK exprimiert(Abbildung 7A). Die densitometrische Auswertung bestätigt das Ergebnis und zeigt,dass die Expression von Phospho-ERK bei mechanischer Reizung unter dem Einflussvon Latruculin A gehemmt ist (Abbildung 7B). Unter dem Einfluss von Latrunculin  A istdie Aktivierung von AKT infolge eines mechanischen Integrinreizes völlig blockiert(Abbildung 7C). Es ist im Vergleich zu den unbehandelten Zellen kein Anstieg derSignalintensität für geclusterte und mechanisch stimulierte Zellen mit Latrunculin  A zusehen. 43
  45. 45. 4.4 Einfluss der Inhibitoren auf Signalproteine 4 Ergebnisse A B 800 ** 700 phERK 600 Intensität in % 500 DMSO 0,1 % 400 Jasp 0,01 µM 300 200 100 0 K Cl MF Reiz C 700 * 600 phAKT 500 Intensität in % 400 DMSO 0,1 % * 300 Jasp 0,01 µM 200 100 0 K Cl MF ReizAbbildung 6 Einfluss mechanischer Stimulation auf die Phosphorylierung von ERK und AKT in hMSZ nachInkubation mit JasplakinolidA: Western Blot Analyse der Phosphorylierung von ERK1/2, die dargestellten Blots sind repräsentative Beispiele aus dreiunabhängigen Experimenten. B: Densitometrische Auswertung der Western Blot Analyse der Phosphorylierung von ERK1/2.C: Quantitative Analyse (Bio-Plex) der Phosphorylierung von AKT. K: unbehandelte Kontrolle, Cl: mit Beads geclustert,MF: Magnetfeld, Reiz: mechanische Stimulation. (B, C) Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung, alle Werte wurdenauf die Kontrolle in EM normiert, eckige Klammern zeigen signifikante Unterschiede (* p ≤ 0,1; **p ≤ 0,05; n=3). 44
  46. 46. 4.4 Einfluss der Inhibitoren auf Signalproteine 4 Ergebnisse A B 700 ** 600 phERK 500 * Intensität in % 400 DMSO 300 LatA 0,1 µM 200 100 0 K Cl MF Reiz C 700 ** 600 phAKT 500 Intensität in % 400 DMSO 0,1 % ** 300 LatA 0,1 µM 200 100 0 K Cl MF ReizAbbildung 7 Einfluss mechanischer Stimulation auf die Phosphorylierung von ERK und AKT in hMSZ nachInkubation mit Latrunculin AA: Western Blot Analyse der Phosphorylierung von ERK1/2, die dargestellten Blots sind repräsentative Beispiele aus dreiunabhängigen Experimenten. B: Densitometrische Auswertung der Western Blot Analyse der Phosphorylierung von ERK1/2.C: Quantitative Analyse (Bio-Plex) der Phosphorylierung von AKT. K: unbehandelte Kontrolle, Cl: mit Beads geclustert,MF: Magnetfeld, Reiz: mechanische Stimulation. (B, C) Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung, alle Werte wurdenauf die Kontrolle in EM normiert, eckige Klammern zeigen signifikante Unterschiede (* p ≤ 0,1; **p ≤ 0,05; n=3). 45

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