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Anne Langenbach: “Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischen Belastung von humanen mesenchymalen Stammzellen”
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Verteidigung der Masterarbeit von Anne Langenbach: “Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischen Belastung von humanen mesenchymalen Stammzellen”

Verteidigung der Masterarbeit von Anne Langenbach: “Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischen Belastung von humanen mesenchymalen Stammzellen”

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  • 1. Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischenBelastung von humanen mesenchymalen Stammzellen 19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach
  • 2. Mesenchymale Stammzellen (MSZ) •  Stammzellnische (Knochenmark, Knorpel, Fettgewebe, Blut u. a.) •  chemische Signale •  Zellform •  mechanische Signale www.sciencephoto.com à regenerative Medizin19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 2
  • 3. Zielstellung Hat die Modifikation des Aktinzytoskeletts durch Inhibitoren Einfluss auf die Mechanotransduktion in MSZ?19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 3
  • 4. Zielstellung Hat die Modifikation des Aktinzytoskeletts durch Inhibitoren Einfluss auf die Mechanotransduktion in MSZ? •  humane MSZ aus dem Knochenmark •  Modifikation des Aktinzytoskeletts •  mechanische Stimulation •  Signaltransduktion (ERK und AKT)19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 3
  • 5. Zytoskelett Aktinfilamente www.sciencephoto.com19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 4
  • 6. Fokaladhäsion und Mechanotransduktion Integrin Fokale Adhäsionskinase Vinculin Aktin modifiziert nach www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/migration/adhesion.htm19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 5
  • 7. Fokaladhäsion und Mechanotransduktion Integrin Fokale Adhäsionskinase Vinculin Aktin modifiziert nach www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/migration/adhesion.htm19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 5
  • 8. Fokaladhäsion und Mechanotransduktion Integrin Fokale Adhäsionskinase Vinculin P Aktin modifiziert nach www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/migration/adhesion.htm19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 5
  • 9. Fokaladhäsion und Mechanotransduktion Integrin Fokale Adhäsionskinase Vinculin P Aktin ERK1/2 P modifiziert nach www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/migration/adhesion.htm19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 5
  • 10. Fokaladhäsion und Mechanotransduktion Integrin Fokale Adhäsionskinase Vinculin P Aktin AKT P ERK1/2 P modifiziert nach www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/migration/adhesion.htm19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 5
  • 11. Aktin und Inhibitoren Jasplakinolid G-Aktin F-Aktin Cytochalasin D Latrunculin A19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 6
  • 12. Aktin und Inhibitoren Jasplakinolid G-Aktin F-Aktin Cytochalasin D Latrunculin A19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 6
  • 13. Aktin und Inhibitoren Jasplakinolid G-Aktin F-Aktin Cytochalasin D Latrunculin A19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 6
  • 14. Aktin und Inhibitoren Jasplakinolid G-Aktin F-Aktin Cytochalasin D Latrunculin A19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 6
  • 15. Aktin und Inhibitoren Jasplakinolid G-Aktin F-Aktin Cytochalasin D Latrunculin A19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 6
  • 16. Verwendung der Inhibitoren •  Konzentrationen ohne Beeinträchtigung der Zellvitalität •  Jasplakinolid: 0,01 µM •  Cytochalasin D: 0,5 µM •  Latrunculin A: 0,1 µM •  Kontrolle: 0,1 % DMSO 0,01 µM 0,1 µM19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 7
  • 17. Kontrolle (DMSO) Morphologie und Aktinzytoskelett 0,01 µM 0,1 µM 19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 8
  • 18. Kontrolle (DMSO)Jasplakinolid 0,01 µM Morphologie und Aktinzytoskelett – Jasplakinolid 0,01 µM 19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 8
  • 19. Kontrolle (DMSO) Morphologie und Aktinzytoskelett – Cytochalasin D 0,01 µM 0,1 µM 19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 9
  • 20. Kontrolle (DMSO)Cytochalasin D 0,5 µM Morphologie und Aktinzytoskelett – Cytochalasin D 0,01 µM 0,1 µM 19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 9
  • 21. Kontrolle (DMSO) Morphologie und Aktinzytoskelett – Latrunculin A 0,01 µM 19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 10
  • 22. Kontrolle (DMSO)Latrunculin A 0,1 µM Morphologie und Aktinzytoskelett – Latrunculin A 19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 10
  • 23. Mechanische Stimulation MSZ Integrine Paramagnetische Mikrobeads = 0,2 nN / Bead modifiziert nach Kasten et al., 201019.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 11
  • 24. Mechanische Stimulation MSZ Integrine Paramagnetische Clustern Mikrobeads = 0,2 nN / Bead modifiziert nach Kasten et al., 201019.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 11
  • 25. Mechanische Stimulation MSZ Integrine Paramagnetische Clustern Mikrobeads = 0,2 nN / Bead modifiziert nach Kasten et al., 201019.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 11
  • 26. Mechanische Stimulation MSZ Integrine Paramagnetische Clustern Mikrobeads = 0,2 nN / Bead Reiz modifiziert nach Kasten et al., 201019.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 11
  • 27. Aktivierung von ERK und AKT Magnetfeld Kontrolle Clustern Reiz mit DMSO19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 12
  • 28. Aktivierung von ERK und AKT Magnetfeld Kontrolle Clustern Reiz mit DMSO B 800 ** 700 phERK 600 ** Intensität in % 500 400 DMSO 0,1 % 300 Jasp 0,01 µM 200 p ≤ 0,1 100 **p ≤ 0,05 0 Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=319.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 12
  • 29. Aktivierung von ERK und AKT – Jasplakinolid Magnetfeld Magnetfeld Kontrolle Kontrolle Clustern Clustern Reiz Reiz mit DMSO Jasplakinolid 0,01 µM B 800 ** 700 phERK 600 ** Intensität in % 500 400 DMSO 0,1 % 300 Jasp 0,01 µM 200 p ≤ 0,1 100 **p ≤ 0,05 0 Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=319.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 12
  • 30. Aktivierung von ERK und AKT – Jasplakinolid Magnetfeld Magnetfeld Kontrolle Kontrolle Clustern Clustern Reiz Reiz mit DMSO Jasplakinolid 0,01 µM B 800 ** 700 phERK 600 ** Intensität in % 500 400 DMSO 0,1 % 300 Jasp 0,01 µM 200 p ≤ 0,1 100 **p ≤ 0,05 0 Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=319.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 12
  • 31. Aktivierung von ERK und AKT C 700 ** 600 phAKT 500 Intensität in % 400 DMSO 0,1 % 300 ** Jasp 0,01 µM 200 p ≤ 0,1 100 **p ≤ 0,05 0 Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=319.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 13
  • 32. Aktivierung von ERK und AKT – Jasplakinolid C 700 * 600 phAKT 500 Intensität in % 400 DMSO 0,1 % 300 * Jasp 0,01 µM 200 p ≤ 0,1 100 **p ≤ 0,05 0 Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=319.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 13
  • 33. Aktivierung von ERK und AKT – Jasplakinolid C 700 * 600 phAKT 500 Intensität in % 400 DMSO 0,1 % 300 * Jasp 0,01 µM 200 p ≤ 0,1 100 **p ≤ 0,05 0 Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=3 •  keine Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 13
  • 34. Aktivierung von ERK und AKT – Cytochalasin D Magnetfeld Magnetfeld Kontrolle Kontrolle Clustern Clustern Reiz Reiz mit DMSO Cytochalasin D 0,5 µM19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 14
  • 35. Aktivierung von ERK und AKT – Cytochalasin D Magnetfeld Magnetfeld Kontrolle Kontrolle Clustern Clustern Reiz Reiz mit DMSO Cytochalasin D 0,5 µM B 700 * * 600 phERK 500 Intensität in % 400 DMSO 0,1 % 300 CytoD 0,5 µM 200 100 p ≤ 0,1 0 **p ≤ 0,05 Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=319.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 14
  • 36. Aktivierung von ERK und AKT – Cytochalasin D C 700 * 600 phAKT 500 Intensität in % 400 DMSO 0,1 % ** 300 CytoD 0,5 µM 200 100 p ≤ 0,1 0 **p ≤ 0,05 Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=319.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 15
  • 37. Aktivierung von ERK und AKT – Cytochalasin D C 700 * 600 phAKT 500 Intensität in % 400 DMSO 0,1 % ** 300 CytoD 0,5 µM 200 100 p ≤ 0,1 0 **p ≤ 0,05 Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=3 •  keine Hemmung der Aktivierung von ERK •  Hemmung der Aktivierung von AKT nach Zugstress19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 15
  • 38. Aktivierung von ERK und AKT – Latrunculin A Magnetfeld Magnetfeld Kontrolle Kontrolle Clustern Clustern Reiz Reiz mit DMSO Latrunculin A 0,1 µM19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 16
  • 39. Aktivierung von ERK und AKT – Latrunculin A Magnetfeld Magnetfeld Kontrolle Kontrolle Clustern Clustern Reiz Reiz mit DMSO Latrunculin A 0,1 µM B 700 ** 600 phERK 500 * Intensität in % 400 DMSO 300 LatA 0,1 µM 200 100 p ≤ 0,1 0 **p ≤ 0,05 Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=319.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 16
  • 40. Aktivierung von ERK und AKT – Latrunculin A C 700 ** 600 phAKT 500 Intensität in % 400 DMSO 0,1 % 300 ** LatA 0,1 µM 200 100 p ≤ 0,1 0 **p ≤ 0,05 Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=319.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 17
  • 41. Aktivierung von ERK und AKT – Latrunculin A C 700 ** 600 phAKT 500 Intensität in % 400 DMSO 0,1 % 300 ** LatA 0,1 µM 200 100 p ≤ 0,1 0 **p ≤ 0,05 Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=3 •  komplette Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 17
  • 42. Zusammenfassung Jasplakinolid •  verdickte Aktinbündel •  keine Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT Cytochalasin D •  Fragmentierung des Aktinzytoskeletts •  keine Hemmung der Aktivierung von ERK •  Hemmung der Aktivierung von AKT nach mechanischer Reizung Latrunculin A •  Aktinfilamente nicht mehr parallel •  komplette Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 18
  • 43. Zusammenfassung Jasplakinolid •  verdickte Aktinbündel •  keine Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT Cytochalasin D •  Fragmentierung des Aktinzytoskeletts •  keine Hemmung der Aktivierung von ERK •  Hemmung der Aktivierung von AKT nach mechanischer Reizung Latrunculin A •  Aktinfilamente nicht mehr parallel •  komplette Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 18
  • 44. Zusammenfassung Jasplakinolid •  verdickte Aktinbündel •  keine Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT Cytochalasin D •  Fragmentierung des Aktinzytoskeletts •  keine Hemmung der Aktivierung von ERK •  Hemmung der Aktivierung von AKT nach mechanischer Reizung Latrunculin A •  Aktinfilamente nicht mehr parallel •  komplette Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 18
  • 45. Zusammenfassung Jasplakinolid •  verdickte Aktinbündel •  keine Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT Cytochalasin D •  Fragmentierung des Aktinzytoskeletts •  keine Hemmung der Aktivierung von ERK •  Hemmung der Aktivierung von AKT nach mechanischer Reizung Latrunculin A •  Aktinfilamente nicht mehr parallel •  komplette Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 18
  • 46. Fazit •  Inhibitoren des Aktinzytoskeletts wie Latrunculin A können die durch mechanische Interferenz induzierte Aktivierung von ERK und AKT hemmen •  allerdings führte eine strukturelle Modifikation des Aktinzytoskeletts nicht immer zur Hemmung der Signaltransduktion •  das spricht für kompensatorische Mechanismen innerhalb des gesamten Zytoskeletts19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 19
  • 47. Fazit •  Inhibitoren des Aktinzytoskeletts wie Latrunculin A können die durch mechanische Interferenz induzierte Aktivierung von ERK und AKT hemmen •  allerdings führte eine strukturelle Modifikation des Aktinzytoskeletts nicht immer zur Hemmung der Signaltransduktion •  das spricht für kompensatorische Mechanismen innerhalb des gesamten Zytoskeletts19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 19
  • 48. Fazit •  Inhibitoren des Aktinzytoskeletts wie Latrunculin A können die durch mechanische Interferenz induzierte Aktivierung von ERK und AKT hemmen •  allerdings führte eine strukturelle Modifikation des Aktinzytoskeletts nicht immer zur Hemmung der Signaltransduktion •  das spricht für kompensatorische Mechanismen innerhalb des gesamten Zytoskeletts19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 19
  • 49. Fazit •  Inhibitoren des Aktinzytoskeletts wie Latrunculin A können die durch mechanische Interferenz induzierte Aktivierung von ERK und AKT hemmen •  allerdings führte eine strukturelle Modifikation des Aktinzytoskeletts nicht immer zur Hemmung der Signaltransduktion •  das spricht für kompensatorische Mechanismen innerhalb des gesamten Zytoskeletts19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 19
  • 50. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 20
  • 51. Quellen •  Caplan AI (2009) Why are MSZs therapeutic? New data: new insight. J Pathol 217(2): 318-24 •  Casella JF, Flanagan MD und Lin S (1981) Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature 293(5830): 302-5 •  del Rio A, Perez-Jimenez R, Liu R, Roca-Cusachs P, Fernandez JM und Sheetz MP (2009) Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding. Science 323(5914): 638-41 •  Disanza A, Steffen A, Hertzog M, Frittoli E, Rottner K und Scita G (2005) Actin polymerization machinery: the finish line of signaling networks, the starting point of cellular movement. Cell Mol Life Sci 62(9): 955-70 •  Discher DE, Mooney DJ und Zandstra PW (2009) Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science 324(5935): 1673-7 •  Horwitz A, Duggan K, Buck C, Beckerle MC und Burridge K (1986) Interaction of plasma membrane fibronectin receptor with talin-a transmembrane linkage. Nature 320(6062): 531-3 •  Horwitz EM, Le Blanc K, Dominici M, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini FC, Deans RJ, Krause DS und Keating A (2005) Clarification of the nomenclature for MSZ: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 7(5): 393-5 •  Kasten A, Müller P, Bulnheim U, Groll J, Bruellhoff K, Beck U, Steinhoff G, Möller M und Rychly J (2010) Mechanical Integrin Stress and Magnetic Forces Induce Biological Responses in Mesenchymal Stem Cells Which Depend on Environmental Factors. J Cell Biochem 111(6): 1586-97 •  Pantaloni D, Le Clainche C und Carlier MF. (2001) Mechanism of Actin-Based Motility. Science 292(5521): 1502-6 •  Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S und Marshak DR (1999) Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science 284(5411): 143-719.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 18
  • 52. Quellen •  Scadden DT (2006) The stem-cell niche as an entity of action. Nature 441(7097): 1075-9 •  Scott VR, Boehme R und Matthews TR (1988) New class of antifungal agents: jasplakinolide, a cyclodepsipeptide from the marine sponge, Jaspis species. Antimicrob Agents Chemother 32(8): 1154-7 •  Spector I, Shochet NR, Blasberger D und Kashman Y (1989) Latrunculins--novel marine macrolides that disrupt microfilament organization and affect cell growth: I. Comparison with cytochalasin D. Cell Motil Cytoskeleton 13(3): 127-44 •  www.sciencephoto.com •  www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/migration/adhesion.htm19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 19
  • 53. Anhang19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach
  • 54. Anhang www.invitrogen.com19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach
  • 55. Kontrolle (ohne DMSO) Kontrolle (mit DMSO) DMSO – Morphologie und Aktinzytoskelett 0,01 µM 0,1 µM 19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach
  • 56. Jasp und Lat A – Morphologie Kontrolle (ohne DMSO) Jasplakinolid 0,01 µM Jasplakinolid 0,1 µM Kontrolle (mit DMSO) Latrunculin A 0,01 µM Latrunculin A 0,1 µM Latrunculin A 0,5 µM 0,01 µM 0,1 µM19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach
  • 57. Vitalitätstest - MTS19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach
  • 58. Vitalitätstest - KV19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach
  • 59. Vitalitätstest – MTS / KV19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach
  • 60. Schematischer Ablauf des Integrinreizes19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach
  • 61. Coomassie Latrunculin A Jasplakinolid Cytochalasin D19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach
  • 62. Kontrolle 2100 ** ** 1800 1500 phERK Intensität in % 1200 EM ** 900 DMSO 0,1 % 600 300 0 K Cl MF Reiz19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach
  • 63. Kontrolle 600 ** 500 400 ** phAKT Intensität in % EM 300 DMSO 0,1 % 200 100 0 K Cl MF Reiz19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach

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