• Share
  • Email
  • Embed
  • Like
  • Save
  • Private Content
Molekulárně cytogenetické vyšetření - FISH
 

Molekulárně cytogenetické vyšetření - FISH

on

  • 4,889 views

 

Statistics

Views

Total Views
4,889
Views on SlideShare
4,877
Embed Views
12

Actions

Likes
0
Downloads
38
Comments
0

1 Embed 12

http://www.slideshare.net 12

Accessibility

Categories

Upload Details

Uploaded via as Microsoft PowerPoint

Usage Rights

© All Rights Reserved

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Processing…
Post Comment
Edit your comment

    Molekulárně cytogenetické vyšetření - FISH Molekulárně cytogenetické vyšetření - FISH Presentation Transcript

    • Molekulárně cytogenetické vyšetření Metoda FISH
    • Pacient Základní cytogenetické vyšetření chromozomů (karyotypizace) Molekulárně cytogenetické vyšetření Příbuzní pacienta Molekulárněbiologické vyšetření
    • Molekulárně cytogenetická vyšetření
      • Identifikují změny chromozomů molekulárně biologickými metodami
      • Příklady metod
        • hybridizace in situ a její modifikace (CGH, M-FISH, fiber FISH atd.)
        • Genové čipy, resp. array CGH, DNA microarray atd.
        • PRINS, PCR in situ
        • fluorescenční kvantitativní PCR
        • metody založené na dodatečné amplifikaci navázané sondy (MLPA, MAPH)
      • K vyšetření většinou postačí jádra interfázních buněk (s výjimkou M-FISH)
    • Hybridizace cílová DNA sonda denaturace hybridizace
    • Hybridizace
      • Molekulární (na izolované DNA)
      • In situ (v původních buněčných strukturách – tj. interfázních jádrech, metafázních chromozomech, popř. celých buňkách)
    • Test
      • 10 minut
      • Nezapomeňte uvést své jméno a verzi, kterou píšete.
      • Otázky zaměřené na výběr z více variant mohou mít jednu i více správných odpovědí.
    • Sonda (probe, „próba“)
      • Úsek DNA, eventuálně RNA komplementární k určité sekvenci na vyšetřované DNA ( target DNA , resp. cílové DNA)
      • Plazmid (15 – 20 kbp), fágová DNA, kosmid (popř. jiné kombinace fágové a plazmidové DNA – PAC, BAC), YAC (až 1,5 Mbp)
      • Též možno připravit jako PCR-produkt amplifikací vybraného úseku DNA
    • Značení sond
      • Radioaktivní
      • Enzymatické
      • Fluorescenční
        • Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)
      • Neznačné sondy (značíme vyšetřovanou DNA)
        • např. u CGH, resp. array CGH (genové čipy)
    • Značení sond
      • Přímé
      • Nepřímé (biotin, antigenní látka)
        • možnost amplifikace signálu
        • zdlouhavá manipulace, větší fluorescenční (popř. radioaktivní) pozadí
      cílová DNA FITC - avidin FITC - avidin anti avidin biotin biotin sonda
    • Metody značení sond
      • Přímá chemická adice „reportérské“ molekuly
      • PCR se značenými dNTP
      • Nick-translace
    • FISH
    • Typy sond
      • Satelitní
        • Centromerické
        • Telomerické
      • Lokus specifické („genové“)
      • Malovací („painting probes“; celochromozomové)
    • Satelitní sondy – chromozom 7
    • Satelitní sondy Centromerická sonda na X – DXZ1 Možný karyotyp 45,X nebo 46,XY
    • X- a Y-centromerická sonda
    • X-centromerická sonda – vyšetření marker chromozomu marker = derivovaný chromozom X
    • Výsledek hybridizace s telomerickou sondou
    • Lokus specifická sonda – detekce regionu SRY
    • Lokus specifická sonda – detekce mikrodelece chromozomu 7q11.23 Jako kontrola byla použita centromerická sonda (D7Z1).
    • Lokus specifické sondy – vyšetření amplifikace onkogenu HER2/NEU Normální nález Amplifikace prokázána
    • Malovací sondy – současné vyšetření chromozomů 1, 4 a 8 Malovací sondy nelze použít při vyšetření interfázních jader!
    • Malovací sondy Výsledek hybridizace s malovací sondou pro chromozom 19
    • Malovací sondy – detekce nebalancované translokace chromozomů 11 a 21 t(11;21)
    • Kdy je třeba indikovat FISH?
      • V materiálu nejsou přítomny mitózy
        • Neúspěšná kultivace
        • Odebranou tkáň nelze kultivovat (preimplantační vyšetření, rychlá prenatální vyšetření, vyšetření solidních tumorů, popř. sekčního materiálu z jiných tkání)
      • Verifikace složitějších chromozomových přestaveb, identifikace marker chromozomů
      • Verifikace mozaiky (zejména nízkofrekvenční)
      • Diagnostika submikroskopických (kryptických) chromozomových přestaveb
        • Mikrodeleční syndromy
        • Amplifikace onkogenů a mikrodelece tumor-supresorových genů u malignit
    • Referáty
    • Referáty
      • M-FISH – 7 min
      • CGH – 7 min
      • (fiber FISH – 5 min )
    • Praktické úkoly viz „Praktická cvičení z klinické cytogenetiky“ – kapitola 9
    • 9.4 Úkol 2 (str. 40)
      • 46,XX nebo 47,XXY
      • Indikujeme vyšetření se sondou pro chromozom Y.
    • 9.5 Úkol 3 (str. 40)
      • Pravděpodobně mozaika:
      • 45,X/46,XX
      • 46,XY/46,XX
      • 47,XXY/46,XY
      • 45,X/47,XXY
    • 9.6 Úkol 4 (str. 41) – 1. část
    • 9.6 Úkol 4 – 1. část
      • 5 signálů svědčí o trizomii chromozomu 13 nebo chromozomu 21
      • Signálem jsou označeny:
        • 2 větší akrocentrické chromozomy (tj. 13)
        • 3 menší akrocentrické chromozomy (tj. 21)
      • Výsledek svědčí pro trizomii chromozomu 21 – tj. Downův syndrom.
    • 9.6 Úkol 4 – 2. část – a)
      • Pacient s t(14;21) ... 5 signálů
        • 2 x 21, 1 x der(21;14), 2 x 13
      Pacient s robertsonskou translokací der(14;21) 13 13 14 der(14;21) 21 21
    • 9.6 Úkol 4 – 2. část – b)
      • Pacient s t(21;21) ... 4 signály (1 fúzní)
        • 1 x 21, 1 x der(21;21), 2 x 13
      Pacient s robertsonskou translokací der(21;21) 13 13 14 14 21 der(21;21)
    • 9.6 Úkol 4 – 2. část – c)
      • Pacient s t(13;21) ... 4 signály (1 fúzní)
        • 2 x 21, 1 x der(13;21) – fúzní, 1 x 13
      Pacient s robertsonskou translokací der(13;21) 13 der(13;21) 14 14 21 21
    • 9.6 Úkol 4 – 2. část – d), e), f)
      • Přenašeč s t(14;21) ... 4 signály
        • 1 x 21, 1 x der(14;21), 2 x 13
      • Přenašeč s t(21;21) ... 3 signály (1 fúzní)
        • 1 x der(21;21) – fúzní, 2 x 13
      • Přenašeč s t(13;21) ... 3 signály (1 fúzní)
        • 1 x 21, 1 x der(13;21) – fúzní, 1 x 13
    • 9.6 Úkol 4 – 2. část – g), h)
      • Pacient s t(13;13) ... 4 signály (1 fúzní)
        • 2 x 21, 1 x der(13;13) – fúzní, 1 x 13
      • Přenašeč s t(13;13) ... 3 signály (1 fúzní)
        • 2 x 21, 1 x der(13;13) - fúzní
      13 der(13;13) 21 21 der(13;13) 21 21 Pacient Přenašeč
    • Nejednoznačné výsledky při hybridizaci centromerických sond pro chromozomy 13 a 21 (resp. 14 a 22) jsou důvodem, že při prenatálním vyšetření aneuploidií těchto chromozomů požíváme lokus specifické sondy.
    • 9.7 Úkol 5 (str. 42)
      • Plod je postižen Downovým syndromem (viz obr. 9.4B)
      • V případě chromozomu 13 je nález normální.
      • Zdvojené signály se vyskytují u jader v G2 fázi.
    • Prenatální vyšetření aneuploidií chromozomů 13, 21 a 18 pomocí centromerických a lokus specifických sond Interpretujte molekulárně cytogenetický nález.
    • Prenatální vyšetření aneuploidií chromozomů 13, 21 a 18 pomocí centromerických a lokus specifických sond Trizomie chromozomu 18 Edwardsův syndrom
    • 9.8 Úkol 6 (str. 42 – 43)
      • Marker chromozom vznikl z chromozomu 13 nebo 21 (viz obr. 9.5A).
      • Další možnosti vyšetření – malovací nebo lokus specifické sondy; popř. připravit z markeru sondu a sledovat, se kterými chromozomy hybridizuje.
      • Zjistit, zda zdravá matka nebo zdravý otec mají ve svém karyotypu stejný chromozom.
    • 9.9 Úkol 7 (str. 43) PACIENT 1 PACIENT 2 delece 7q11.23
    • 9.9 Úkol 7 (str. 43)
      • U pacienta 1 je mikrodelece 7q11.23 prokazatelná – chybí signál lokus specifické sondy na kritickém regionu
      • Lze potvrdit diagnózu Williams-Beuren syndrom.
    • Syndrom Williams-Beuren
      • irides stellatae
      • hypertelorismus
      • otevřená ústa, silné rty
      • abnormální dentice
      • supravalvulární aortální stenóza
      • hyperkalcémie, hypoparathyreoidismus
      • psychomotorická retardace
      • mikrodelece chromozomu 7q11.23
      „ elfin face“
    • Supravalvulární aortální stenóza
    • 9.9 Úkol 7 (str. 43)
      • U pacienta 2 mikrodelece není prokazatelná. Možné důvody:
        • Delece nebo jiná mutace malého rozsahu v kritickém regionu.
        • Postižení v jiném lokusu
        • Afekce na negenetické bázi (vliv teratogenů během těhotenství?)
    • 9.10 Úkol 8 (str. 44)
    • Syndrom DiGeorge
      • vrozená srdeční vada – nejčastěji Fallotova tetralogie
      • nízká hladina ionizovaného vápníku v krvi (hypokalcémie)
      • aplázie, popř. hypoplázie thymu – v některých případech vede k defektu imunity
      • rozštěp patra, popř. gotické patro
      • abnormální obličejové rysy
    • Syndrom DiGeorge - facies
    • Syndrom DiGeorge – typické znaky Nejčastějším cytogenetickým nálezem je mikrodelece dlouhých ramének chromozomu 22 (22q11.2). hypertelorismus mikromandibula níže nasedající dysplastický ušní boltec „ antimongoloidní“ směr očních štěrbin
    • 9.10 Úkol 8 (str. 44) Sonda pro kritický region – lokus HIRA na 22q11.2 (červeně značena) Kontrolní sonda – lokus ARSA v subtelomerické části 22q (zeleně značena)
    • 9.10 Úkol 8 (str. 44)
      • Mikrodelece chromozomu 22q11 prokázána – diagnózu syndrom DiGeorge lze potvrdit.
      • Vyšetřit familiární výskyt, zejména u matky (vzhledem k nápadné stigmatizaci)
        • 50% pravděpodobnost přenosu mikrodelece na každého potomka.
    • Na shledanou!
    • M-FISH Multicolor FISH Zpět k referátům
    • Značení sond pro M-FISH
    • M-FISH – normální chromozomy
    • M-FISH – translokace t(9;22)
    • Multicolor banding
    • Zpět k referátům
    • CGH Komparativní genomová hybridizace Zpět k referátům
    • CGH
    • CGH chromozomy po hybridizaci
    • CGH – uspořádané chromozomy
    • CGH – normální nález
    • CGH – abnormální nález
    • Genový čip (DNA-microarray) normální DNA vyšetřovaná DNA
    • Genový čip (DNA-microarray)
    • Zpět k referátům