Konfokalni Mikroskopie

1,656 views

Published on

Published in: Travel, Business
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
1,656
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
37
Actions
Shares
0
Downloads
17
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Konfokalni Mikroskopie

  1. 1. Konfokální mikroskopie Pavel Svítil, Jan Kuchař
  2. 2. Klasická mikroskopie <ul><li>Předpokládá nekonečně malou tloušťku preparátu </li></ul><ul><li>Při zkoumání silných vzorků je kvalita zobrazení nepříznivě ovlivňována překrýváním obrazu roviny, do níž je mikroskop právě zaostřen, s neostrými obrazy rovin ležících nad ní a pod ní. </li></ul><ul><li>Lze zkoumat jen vzorky o tloušťce menší, než je hloubka ostrosti objektivu, která závisí na jeho numerické apertuře (Z min = 0,25 nλ/NA 2 ). </li></ul>
  3. 3. Klasická mikroskopie <ul><li>Obrazem bodu není bod, ale tzv. Airyho kroužky </li></ul><ul><li>difrakční obrazec vznikající ohybem zobrazujícího se světla na čočkách objektivu. Při zobrazení blízkých bodů se mohou jejich Airyho kroužky překrývat, až se stanou téměř nerozlišitelnými. </li></ul>
  4. 4. Zobrazení klasickou mikroskopií <ul><li>Apertura 0,03 </li></ul><ul><li>Apertura 0,2 </li></ul>
  5. 5. Vznik konfokální mikroskopie <ul><li>Marvin Minsky 1957 – patentoval nápad na konfokální mikroskopii, ale nenašel vhodný zdroj světal </li></ul><ul><li>M. Petráň a M. Hadravský 1967 – Tandem Scanning Confocal Microscope </li></ul><ul><li>Koncem 70. Let – první spolehlivý konfokální mikroskop s rozmítaným laserovým paprskem. </li></ul>
  6. 6. Laserový rastrovací konfokální mikroskop <ul><li>Osvětlení: bodový zdroj světla (laserový paprsek fokusovaný na clonu) </li></ul><ul><li>Clona: je objektivem mikroskopu zobrazena na vzorek, do bodu o průměru rovnajícím se rozlišovací schopnosti objektivu (difrakční mez). </li></ul><ul><li>Objektiv: sbírá světlo vzorkem odražené nebo rozptýlené. </li></ul><ul><li>Zpětný průchod objektivem: obraz bodové clonky => </li></ul><ul><li>fotonásobič </li></ul><ul><li>Druhá konfokální bodová clonka, blokující </li></ul>
  7. 7. Princip <ul><li>čárkovaně: paprsky jdoucí z mimoohniskových rovin, zachycené clonou. </li></ul>
  8. 8. Rastrování <ul><li>rozmítáním laserového paprsku </li></ul><ul><li>příčným posouváním vzorku před objektivem </li></ul><ul><li>posouváním objektivu nad vzorkem </li></ul><ul><li>Počítačové zpracování: </li></ul>
  9. 9. Popis celého systému
  10. 10. Výhody konfokální mikroskopie <ul><li>Potlačení mlhavého pozadí obrazu </li></ul><ul><li>Optická tomografie </li></ul><ul><li>Není limitována Rayleighovým kriteriem: (Obraz vzniká skládáním z jednotlivých bodů, které jsou navíc pozorovány přes clonku, jejíž rozměry bývají menší než průměr Airyho kroužků.) </li></ul>
  11. 11. Nevýhody konfokální mikroskopie <ul><li>Zatíženost statistickým šumem, jehož velikost je úměrná √N/N, kde N je počet detegovaných fotonů. </li></ul><ul><li>Nelze snadno řešit zvýšením intenzity záření </li></ul><ul><li>(Interakce s /fluorescenčním/ preparátem) </li></ul>
  12. 12. Počítačové zpracování <ul><li>Rastrovací algoritmizace </li></ul><ul><li>Prostorová rekonstrukce </li></ul><ul><li>Tvorba stereoskopických párů </li></ul><ul><li>Fluorescence v reálných barvách pomocí tří fotonásobičů (RGB) </li></ul>
  13. 13. Využití konfokální mikroskopie – technické <ul><li>studium povrchových vlastností materiálů </li></ul><ul><li>mikrotesty tvrdosti kovů i plastických materiálů </li></ul><ul><li>měření se výšky strukturních elementů na polovodičových čipech </li></ul><ul><li>v reflexním modu zobrazování se zkoumá textura a složení povrchů i eroze materiálů. </li></ul><ul><li>zkoumání vlastností nových polymerů </li></ul><ul><li>testování jídla, které obsahuje velké množství vody, nebo oleje. </li></ul>
  14. 14. Využití konfokální mikroskopie – Lékařské a biologické <ul><li>studium složité architektury neuronových sítí v mozkové tkáni (Golgiho metoda kontrastování neuronů částečkami stříbra) studium intracelulární koncentrace fyziologicky významných iontů (např. K + , Ca 2+ ) </li></ul><ul><li>měření membránového potenciálu, </li></ul><ul><li>studium struktury typu zubní skloviny </li></ul><ul><li>měření vnitrobuněčného pH. Imunofluorescenčními metodami: rozložení receptorů v membránách, organizace cytoskeletu, mitotický aparát </li></ul>
  15. 15. Srovnání <ul><li>A: nekonfokální mikroskop </li></ul><ul><li>B: konfokální mikroskop </li></ul>
  16. 16. Srovnání 2 <ul><li>Klasický fluorescenční vs. konfokální mikroskop </li></ul>
  17. 17. Ukázka
  18. 18. Literatura <ul><li>Kočárek: Úvod do klinické cytogenetiky </li></ul><ul><li>Jaromír Plášek: Konfokální mikroskopie (in: Vesmír, 1995/9) </li></ul><ul><li>www.wikipedia.cz </li></ul><ul><li>Stránky výrobců (Leica) </li></ul>

×