Biologie pro bakaláře - Praktikum 2

2,777 views
2,354 views

Published on

0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
2,777
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
47
Actions
Shares
0
Downloads
15
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Biologie pro bakaláře - Praktikum 2

  1. 1. Mikroskopická technika
  2. 2. Úkol 1: Pojmenujte jednotlivé části mikroskopu 1 2 4 5 6 7 3 okulár objektiv stolek kondenzor stativ šroub hrubého zaostření šroub jemného zaostření
  3. 3. Měření velikosti mikroskopických objektů v optickém mikroskopu okulárové měřítko (okulárový mikrometr)
  4. 4. Kalibrace okulárového měřítka
  5. 5. Měření velikosti mikroskopických objektů
  6. 6. Barvení chromozomů pro účely světelné mikroskopie <ul><li>Giemsa-Romanowski </li></ul><ul><li>Hematoxylin </li></ul><ul><li>Acetokarmín </li></ul><ul><li>Acetoorcein </li></ul><ul><li>Fuchsin – Feulgenova reakce </li></ul>
  7. 7. Barvení Giemsou leukocyty chromozomy
  8. 8. Úkol 2: Pozorování chromozomů <ul><li>Preparáty byly získány z dělících se lymfocytů lidské periferní krve . </li></ul><ul><li>Krev jsme po odběru kultivovali v médiu, kde byly buňky přinuceny k mitotickému dělení. </li></ul><ul><li>Vzniklou suspenzi jsme fixovali, nakapali na skla a po zaschnutí obarvili roztokem Giemsa-Romanowski </li></ul>
  9. 9. Úkol 2: Prohlídka skel pod mikroskopem <ul><li>Sklo položíme (buňkami nahoru!) na stolek mikroskopu a prohlížíme objektivem 6x nebo 10x. </li></ul><ul><li>Po zaostření na plochu obsahující větší počet buněk (výrazně modrofialově zbarvená jádra nebo skupinky chromozomů) použijeme objektiv s vyšším zvětšením (nejlépe 45x). Při zaostřování s vyšším zvětšením pozor na nebezpečí poškození preparátu a znehodnocení objektivu! </li></ul><ul><li>Vyhledáme chromozomy a zkusíme je spočítat. Obraz v mikroskopu srovnáme s přiloženou fotografií. </li></ul>
  10. 10. Stereomikroskop
  11. 11. Fluorescenční mikroskop Princip fluorescence:
  12. 12. Schéma fluorescenčního mikroskopu
  13. 13. Fluorescenční barviva v genetice <ul><li>DAPI ( 4',6-diamidino-2-phenylindole ) </li></ul><ul><li>PI (propidium iodide) </li></ul><ul><li>Chinakrin </li></ul><ul><li>Ethidium bromid </li></ul>
  14. 14. Nejnovější trend – spojení mikroskopu a počítače
  15. 15. Kultivace buněk in vitro
  16. 16. Kultury <ul><li>Orgánové </li></ul><ul><li>Tkáňové </li></ul><ul><li>Buněčné </li></ul><ul><ul><li>Buňky opouštějí původní tkáň a v médiu se samostatně dělí – tak vzniká buněčná kultura . </li></ul></ul>Oba termíny se často zaměňují.
  17. 17. Alexis Carrel (1873 – 1944)
  18. 18. Složení média <ul><li>základní anorganické živiny </li></ul><ul><li>stopové prvky </li></ul><ul><li>stabilizátory pH (CO 3 2- /HCO 3 - , HPO 4 2- /H 2 PO 4 - ) </li></ul><ul><ul><li>pH = 7,2 – 7,4 </li></ul></ul><ul><li>glukóza </li></ul><ul><li>aminokyseliny </li></ul><ul><li>vitaminy a jiné složky různých enzymů </li></ul><ul><li>mastné kyseliny a lipidy </li></ul><ul><li>specifické proteiny a peptidy podporující buněčné dělení </li></ul><ul><li>sérum (zpravidla fetální bovinní sérum) </li></ul><ul><li>antibiotika (pro snížení rizika kontaminace bakteriemi) </li></ul>
  19. 19. Kultivační podmínky <ul><li>Používáme skleněné nebo umělohmotné nádobky, které plníme médiem s rozptýlenými buňkami. </li></ul><ul><li>Přechováváme v termostatu při 37 ºC. Buňky brzy ulpí na stěnách nádobky a začnou se dělit. </li></ul><ul><li>V některých případech přidáváme do kultivační atmosféry oxid uhličitý. </li></ul>
  20. 20. Práce ve sterilním boxu
  21. 21. Pasážování buněk <ul><li>Po určité době se živiny z média vyčerpají a početnost buněk stoupne na neúnosnou míru. </li></ul><ul><li>Proto je nutné část buněk odebrat, smísit s novým médiem a tuto suspenzi přenést do další kultivační nádobky </li></ul>
  22. 22. Buněčné kultury <ul><li>živočišných buněk </li></ul><ul><ul><li>savčích buněk (včetně lidských) </li></ul></ul><ul><li>rostlinných buněk </li></ul><ul><ul><li>explantátové kultury </li></ul></ul><ul><ul><li>význam ve šlechtitelství a genetickém inženýrství – produkce transgenních plodin </li></ul></ul>kultura makrofágů explantátová kultura – tzv. kalus
  23. 23. Podle typu a morfologie buněk rozlišujeme: <ul><li>kultury epiteliálních buněk </li></ul><ul><li>k. fibroblastoidních buněk </li></ul><ul><li>k. lymfoblastoidních buněk </li></ul><ul><li>k. neuroblastoidních buněk </li></ul>
  24. 24. Z hlediska životnosti dělíme buněčné kultury do 3 skupin: <ul><li>Primokultury (též primární kultury) </li></ul><ul><ul><li>obsahují buňky čerstvě izolované z organismu </li></ul></ul><ul><ul><li>Po převedení do kultivačního média přežívají pouze ty buňky, které jsou lépe přizpůsobeny daným podmínkám. </li></ul></ul><ul><ul><li>existují zpravidla jen několik dní, pak je nutné buňky, které se rozmnožily, převést do nového média. </li></ul></ul><ul><li>Buněčné kmeny </li></ul><ul><ul><li>vycházejí z primárních kultur </li></ul></ul><ul><ul><li>kultury normálních diploidních buněk, které byly již alespoň jednou pasážovány </li></ul></ul><ul><ul><li>vznikají z buněk, které se v podmínkách in vitro začaly rozmnožovat </li></ul></ul><ul><ul><li>zhruba po 40-50 děleních zanikají. </li></ul></ul><ul><li>Buněčné linie (též permanentní buněčné linie) </li></ul><ul><ul><li>mají charakter nádorových buněk </li></ul></ul><ul><ul><li>jsou plně adaptovány na podmínky in vitro </li></ul></ul><ul><ul><li>neomezeně se dělí a lze je přechovávat libovolně dlouho </li></ul></ul><ul><ul><li>vznikají transformací buněčných kmenů anebo jde o buňky původně izolované z nádorů </li></ul></ul>
  25. 25. Růstová křivka buněčné kultury <ul><li>vyjadřuje změny početnosti buněk v závislosti na čase </li></ul><ul><li>Růst buněčné kultury prochází několika fázemi: </li></ul><ul><ul><li>Lag-fáze – počáteční fáze, počet buněk nejprve mírně klesne a pak poměrně rychle vzrůstá. Buňky se adaptují na kultivační prostředí a připravují se k buněčnému dělení. </li></ul></ul><ul><ul><li>Log-fáze (též logaritmická nebo exponenciální fáze) – počet buněk exponenciálně roste. V této fázi zachytíme nejvíce buněk v mitóze, což lze využít pro chromozomové vyšetření. </li></ul></ul><ul><ul><li>Stacionární fáze – rychlost růstu buněčné populace postupně klesá, projevují se inhibiční mechanismy (např. kontaktní inhibice, produkce růstových inhibitorů) a postupné vyčerpávání živin z média. </li></ul></ul><ul><ul><li>Fáze úbytku buněk – dochází k postupnému odumírání buněk způsobenému nedostatkem živin, snížením pH (následkem zvýšení koncentrace CO 2 a dalších kyselinotvorných látek v médiu) a hromaděním toxických produktů buněčného metabolismu. </li></ul></ul>
  26. 26. Růstová křivka buněčné kultury log N čas lag log stacionární fáze úbytek
  27. 27. Praktické úkoly viz návody na stolech
  28. 28. Úkol 3: Pozorování buněčné kultury inverzním mikroskopem <ul><li>Seznamte se s použitím inverzního mikroskopu. </li></ul><ul><li>Prohlédněte pod inverzním mikroskopem kultivační nádobku s buněčnou kulturou. </li></ul><ul><li>Povšimněte si tvarů buněk a posuďte jejich denzitu. </li></ul>
  29. 29. Práce s inverzním mikroskopem
  30. 30. Úkol 4: Pozorování buněk HeLa <ul><li>Epiteliální buňky HeLa jsou stabilizovanou buněčnou linií. </li></ul><ul><li>Primární kultura byla získána z buněk karcinomu děložního krčku pacientky He nrietty La cksové v počátku 50.let 20.století. </li></ul><ul><li>Dosud se v laboratořích používají jako typický model zachovávající všechny vlastnosti nádorových buněk. </li></ul>Henrietta Lacks
  31. 31. Úkol 4: Pozorování buněk HeLa <ul><li>Buňky v předložených Petriho miskách byly po krátkodobé kultivaci fixovány methanolem a obarveny trypanovou modří. V některých miskách lze již vizuálně pozorovat jejich kolonie. </li></ul><ul><li>Prohlédněte pod inverzním mikroskopem kolonie buněk HeLa. K vyhledání a pozorování využijte objektivů 10x-20x. </li></ul><ul><li>Povšimněte si utváření jednotlivých buněk a kolonií. Vysvětlete, proč mají některé buňky kulovitý tvar. </li></ul>
  32. 32. Úkol 5: Počítání buněk v suspenzi <ul><li>Bürkerovu počítací komůrku přikryjte krycím sklíčkem, jehož okraje musí pevně přilnout k podkladu (provede vedoucí praktika). Pipetou odeberte cca 10 – 20 mikrolitrů vzorku (suspenze buněk) a kápněte ji ke hranám krycího sklíčka po obou stranách (tedy 2 x 10  µ l). </li></ul><ul><li>Vzorek nejprve prohlédněte pod malým zvětšením (objektiv 6x nebo 10x), s nímž vyhledejte mřížku s buňkami. Pak spočtěte buňky pod 20x, popř. 45x zvětšujícím objektivem. </li></ul><ul><li>Ze zjištěného údaje vypočtěte buněčnou denzitu. Její hodnotu (d) v počtu buněk na mililitr suspenze udává vzorec: </li></ul><ul><li>d = p . 10 4 / n </li></ul><ul><li>kde p - celkový počet vyhodnocených buněk a n - počet malých čtverečků mřížky, na nichž byly buňky počítány. </li></ul>
  33. 33. Úkol 5: Počítání buněk v suspenzi
  34. 34. Úkol 6: Chromozomy v buňkách stabilizované linie CHO <ul><li>Na fotografiích jsou zobrazeny chromozomy stabilizované buněčné linie CHO. </li></ul><ul><li>Jde o fibroblasty izolované z ovarií čínského křečka ( C hinese H amster O vary Cells ). </li></ul>Chromozomy byly izolovány z dělících se buněk, fixovány směsí methanol-kyselina octová a po zaschnutí suspenze na podložním skle obarveny roztokem Giemsa-Romanowski.
  35. 35. Úkol 6: zadání <ul><li>Spočtěte jednotlivé chromozomy a povšimněte si jejich utváření. </li></ul><ul><li>Zkuste vysvětlit své výsledky. </li></ul>
  36. 36. Úkol 7: Využití buněčných kultur při mapování genomu <ul><li>Při mapování genomu byly využity hybridní buněčné linie vzniklé fúzí normálních lidských buněk s nádorovými buňkami myši. Vznikla tak stabilní linie, jejíž další proliferací došlo ke vzniku několika klonů o různé chromozomové konstituci. </li></ul><ul><li>Při vývoji těchto klonů buňky ztrácejí některé lidské chromozomy, zatímco počet myších chromozomů se příliš nemění. </li></ul><ul><li>V extrémním případě může v buňkách zůstat pouze jediný lidský chromozom, zatímco zbytek karyotypu tvoří myší chromozomy. </li></ul><ul><li>Jednotlivé klony lze poměrně snadno izolovat do samostatných buněčných kultur a pak přímo v buňkách nebo v jejich médiu zjistit přítomnost konkrétních lidských proteinů. </li></ul><ul><li>Pokud se sledované proteiny v buňkách vytvářejí, lze srovnáním těchto výsledků s karyotypem buněk zjistit, na kterém chromozomu se gen pro příslušný protein nachází . </li></ul>fúze buněk karyotyp
  37. 37. Úkol 7: Využití buněčných kultur při mapování genomu <ul><li>V laboratoři byla připravena série hybridních klonů normálních lidských a myších nádorových buněk. Analýzou chromozomů se zjistilo, že uvedené klony obsahují následující lidské chromozomy: </li></ul><ul><ul><li>Klon I: 4, 7, 8, 10, 20, X </li></ul></ul><ul><ul><li>Klon II: 1, 3, 7, 21, X </li></ul></ul><ul><ul><li>Klon III: 9, 13, 19, 21, X </li></ul></ul><ul><ul><li>Klon IV: 1, 4, 10, 19, X </li></ul></ul><ul><ul><li>Klon V: 2, 3, 13, 20, X. </li></ul></ul><ul><li>Ve všech klonech byla biochemickou analýzou stanovována přítomnost 4 různých lidských enzymů. Přitom bylo zjištěno, že: </li></ul><ul><ul><li>a) Enzym A je přítomný v klonu V, ale v ostatních klonech chybí. </li></ul></ul><ul><ul><li>b) Enzym B se naopak vyskytuje ve všech pěti klonech. </li></ul></ul><ul><ul><li>c) Enzym C je přítomen pouze v klonech III a IV. </li></ul></ul><ul><ul><li>d) Enzym D není obsažen ani v jednom z hodnocených klonů. </li></ul></ul><ul><li>Lze pomocí uvedených dat upřesnit chromozomovou lokalizaci genů pro příslušné enzymy? Pokud ano, zjistěte na kterých chromozomech se tyto geny nachází. </li></ul>
  38. 38. Řešení úkolů
  39. 39. Úkol 4: Pozorování buněk HeLa Kulovitý tvar mají buňky v mitóze.
  40. 40. Úkol 6 21 chromozomů Aneuploidní počet chromozomů je výsledkem transformace buněk dlouhodobě přechovávaných v kultuře. 7 6 4 4 5 6 3 7
  41. 41. Karyotyp buněk CHO 21 chromozomů Buňky CHO mají charakter nádorových buněk.
  42. 42. Karyotyp normální a nádorové buňky normální buňka muže nádorová buňka Při vývoji nádoru dochází rychlou a nekontrolovanou proliferací ke změnám počtu a struktury chromozomů.
  43. 43. Úkol 7: Využití buněčných kultur při mapování genomu <ul><li>Klon I: 4, 7, 8, 10, 20, X </li></ul><ul><li>Klon II: 1, 3, 7, 21, X </li></ul><ul><li>Klon III: 9, 13, 19, 21, X </li></ul><ul><li>Klon IV: 1, 4, 10, 19, X </li></ul><ul><li>Klon V: 2, 3, 13, 20, X. </li></ul><ul><ul><li>a) Enzym A je přítomný v klonu V, ale v ostatních klonech chybí. </li></ul></ul><ul><ul><li>b) Enzym B se naopak vyskytuje ve všech pěti klonech. </li></ul></ul><ul><ul><li>c) Enzym C je přítomen pouze v klonech III a IV. </li></ul></ul><ul><ul><li>d) Enzym D není obsažen ani v jednom z hodnocených klonů. </li></ul></ul>Gen pro enzym A leží na chromozomu 2. Gen pro enzym B leží na chromozomu X. Gen pro enzym C leží na chromozomu 19. Gen pro enzym D neleží ani na jednom z uvedených chromozomů.
  44. 44. Význam buněčných kultur <ul><li>studium regulace buněčného cyklu a diferenciace buněk </li></ul><ul><li>studium procesů vedoucích ke vzniku a progresi nádorových chorob. </li></ul><ul><li>produkce monoklonálních protilátek, které jsou nezbytné při diagnostice mnoha onemocnění. </li></ul><ul><li>testování účinků léčiv a jiných chemických látek, které by mohly ohrozit zdraví člověka, stanovení genotoxicity </li></ul><ul><ul><li>nahrazení pokusů s laboratorními zvířaty? </li></ul></ul><ul><li>klinická genetika </li></ul><ul><ul><li>prenatální vyšetření (amniocyty z plodové vody, buňky choriových klků) </li></ul></ul><ul><ul><li>postnatální vyšetření (kultury lymfocytů periferní krve) </li></ul></ul><ul><ul><li>chromozomové vyšetření nádorových buněk </li></ul></ul><ul><li>mapování lidského genomu </li></ul><ul><li>klonování savců </li></ul><ul><li>virologie – kultivace a izolace virů </li></ul>
  45. 45. Na shledanou!

×