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Estrazione del dna
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  • 1. L’estrazione del DNA della frutta e della verdura ISIS ANDREA PONTI GALLARATE
  • 2. Introduzione Lo scopo di questa esperienza è quello di osservare la molecola del DNA. Il DNA è una struttura a forma di elica, sede delle informazioni genetiche, contenuta all’interno della cellula nel nucleo di tutte le molecole eucariote, mentre in quelle procariote è sparsa nel citoplasma.
  • 3. Il campione di partenza da cui estrarremo il DNA potrebbe essere di vario tipo ma per la facile reperibilità, useremo la polpa di alcuni frutti. Possiamo suddividere questa esperienza in cinque diverse fasi: • Preparazione del materiale (preparazione della poltiglia e della soluzione di estrazione); • Demolizione della struttura cellulare; • Digestione delle proteine; • Precipitazione del DNA; • Colorazione del DNA.
  • 4. Preparazione del materiale : Campione in esame • Pesare circa 50 g di frutta o di verdura e pestarla delicatamente in un mortaio per non più di 2-3 minuti aggiungendo qualche mL di acqua, se necessario. N.B: se si pesta troppo a lungo, il DNA si rompe e i filamenti risulteranno troppo corti e difficili da osservare.
  • 5. Preparazione del materiale: Soluzione di estrazione In un cilindro graduato da 100 ml misurare 10 ml di detersivo per piatti, pesare 4 g e versarli nel cilindro, portare a volume con acqua distillata. Mescolare con una bacchetta evitando la formazione di schiuma. N.B: L’NaCl si dissocia in Na+Cl- denaturando le proteine (istoni), la cui funzione è quella di compattare il filamento di DNA. Il detersivo contiene sostanze tensioattive che sciolgono i lipidi presenti nelle membrane cellulari.
  • 6. Dal DNA AI CROMOSOMI
  • 7. Demolizione della struttura cellulare • Mettere in un beker il campione in esame e la soluzione di estrazione. • Prendere il beker e metterlo a bagno maria a 60°C per 15 minuti agitando di tanto in tanto (l’alta temperatura facilita la rottura delle membrane e inibisce l’attività della DNasi). • Raffreddare poi in bagno di ghiaccio per circa 5 minuti agitando per uniformare la temperatura (si deve impedire che l’alta temperatura protratta nel tempo possa causare la rottura del DNA); • Filtrare il contenuto in una provetta fino ad ottenere circa 5ml di soluzione.
  • 8. Digestione delle proteine • Aggiungere 5 gocce di pepsina attivata in HCl , agitare delicatamente e far agire per 5 minuti (liberazione definitiva del DNA dagli istoni).
  • 9. Precipitazione del DNA • Aggiungere circa 5 ml di alcol etilico gelato (tenuto in freezer) facendolo scorrere lungo le pareti della provetta, mantenuta inclinata, in modo da farlo stratificare sulla soluzione. • Far riposare nel portaprovette; • Osservare il DNA che appare come un filamento gelatinoso nello strato superiore di etanolo.
  • 10. Colorazione del DNA • Allestire un vetrino “a fresco” colorando con blu di metilene (0,02% - 0.04%).
  • 11. Ricapitolando…. Preparare soluzione Preparare soluzione estrazione, pesare 4g di NaCl + estrazione, pesare 4g di NaCl + 10 ml di detersivo per piatti, 10 ml di detersivo per piatti, portare aa100 mL con H2O portare 100 mL con H2O distillata distillata Preparazione poltiglia, Preparazione poltiglia, schiacciare frutta sbucciata in un schiacciare frutta sbucciata in un mortaio con qualche mL di H2O mortaio con qualche mL di H2O distillata. distillata. Versare in un beker entrambe le soluzioni, mescolare delicatamente, Versare in un beker entrambe le soluzioni, mescolare delicatamente, mettere aabagno maria aa60°C per 15 minuti eesuccessivamente in mettere bagno maria 60°C per 15 minuti successivamente in bagno di ghiaccio per 5 minuti. bagno di ghiaccio per 5 minuti. Filtrare, raccogliere 5 mL di filtrato in una provetta Filtrare, raccogliere 5 mL di filtrato in una provetta eeaggiungere 5 gocce di pepsina, lasciando agire aggiungere 5 gocce di pepsina, lasciando agire per 5 minuti. Aggiungere alcol etilico gelato al per 5 minuti. Aggiungere alcol etilico gelato al filtrato facendolo scorrere lungo le pareti, far filtrato facendolo scorrere lungo le pareti, far riposare eeosservare la formazione del DNA. riposare osservare la formazione del DNA. Allestire un vetrino colorando con blu di metilene. Allestire un vetrino colorando con blu di metilene.