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    • Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo- USP Departamento de Fisiologia Curso de Verão 2013 Ação da Urocortina 2 em músculo esquelético de ratos Wistar normais Laboratório de Controle do metabolismo Prof. Dr. Luiz Carlos C. Navegantes Prof. Dra. Isis do Carmo Kettelhut Matheus Garcia de Fragas Thays Maria C.S. Carvalho
    • 1. É o tecido mais abundante no corpo humano (~50% da massa corporal total) 2. É responsável pela geração de força para locomação, para a respiração e para sustentação postural 3. Está envolvido na produção de calor durante períodos de exposição ao frio 4. Fornece aminoácidos para diversos processos metabólicos (e.g., a neoglicogênese) POWERS & HOWLEY. Fisiologia do Exercício, 5 ed, 2005; KETTELHUT et al. Diabetes Metab Rev. 4, 1988. Músculo Esquelético
    • Síntese e Degradação proteica Síntese Degradação Síntese e/ ou Degradação Hipertrofia Degradação e/ou Síntese Atrofia
    • Vias de degradação Proteolítica Lisossomal Dependente de Ca²⁺ UUbiquitina- Proteassoma (UbP)
    • Sistema Ubiquitina- Proteassoma (UbP) Kaiser and Huang Genome Biology 2005 6:233
    • Família de neuropeptídeos dos fatores liberadores de corticotropina Urocortina 1 CRH Urocortina 2 (homologia de 45 % ao CRH) Urocortina 3 Sauvagina Urotensina 1
    • Urocortina 2 Descoberto em 2001; Peptídeo com 38 aminoácidos; É expressa no sistema nervoso central e em diversos tecidos periféricos como músculo cardíaco, tecido adiposo marrom, pele e inclusive na musculatura esquelética; Agonista seletivo do receptor CRF do tipo 2.
    • Funções conhecidas • Efeito cardioprotetor; • Ação vasodilatadora; • Ação anorexígena; • Reduz a velocidade de esvaziamento gástrico; • Proteção contra o estresse crônico; • Redução da pressão arterial; • Regulação da massa muscular (mecanismos ?) Sheau et al 2001 Gu et al 2010 Hashimoto et al 2004 Willey et al 2004 Hinkle et al 2003; 2004
    • Intracellular Extracellular Modified from POURQUIÉ, O. Nature 433, 2005. Catalytic subunits Protein Protein-PO4 Urocortin 2
    • NAVEGANTES et al. Am. J. Physiol. 279: E663-E668,2000 cAMP inibe a degradação de proteínas 0,0 0,1 0,2 0,3 EDL * ** * * Clemb + IBMX Clemb + d-cAMPClemb d-cAMP IBMX Control Tirosinaliberada (nmol/mg.2h-1)
    • • Considerando que a Urocortina 2 é capaz de elevar os níveis intracelulares de AMPc... • A Urocortina 2 exerce efeito antiproteolítico em músculo esquelético de ratos normais?
    • Proteólise Total Pré-incubação 1 hora Incubação 2 horas Troca-se o meio Meio aerado 37°C Tampão Krebs- Ringer, + glicose e cicloheximida Alíquota para a dosagem de tirosina (método fluorimétrico) Peso entre 80 e 90 gramas
    • Atividade da Via Ubiquitina- proteassoma Controle Urocortina 2 (5. 10 -7 M) Livre MG132 Livre MG132 Tampão Glicose 95% O2 5% CO2 A diferença da tirosina liberada entre o músculo da pata livre e o músculo da pata com inibidor representa a atividade da via Ubiquitina-Proteassoma.
    • Resultados 0.0 0.1 0.2 0.3 Controle Ucn2 (5.10-7 M) EDL * Proteólisetotal (nmol.tyr.mg-1 .2h-1 ) Figura 1. Proteólise total em músculos EDL de ratos Wistar normais (n=7) incubados por 2 horas na ausência ou na presença de Ucn2 (5.10-7M). *p<0.05. 19 %
    • 0.0 0.1 0.2 Controle Ucn2 (5.10-7 M) Ub-Proteassoma EDL n.s. Tyrnmol-1 .mg.2h-1 Figura 2. Tirosina liberada na avaliação da atividade da via Ub-proteassoma (nmol.mg-1.2h-1) em músculos EDL de ratos Wistar normais (n=7) na presença e na ausência de Ucn2 (5.10-7M).
    • Conclusão • A Urocortina 2 exerce efeito antiproteolítico em músculos EDL de ratos normais; • O efeito antiproteolítico da Urocortina 2 parece não ser mediado pela via dependente de ATP Ubiquitina- proteassoma. • Entretanto, pode ser que a Ucn2 tenha ação nos outros sistemas proteolíticos.
    • Outras técnicas experimentais • Canulação da veia jugular; • Retirada de tecidos: muscular esquelético (Soleus, EDL), adiposo branco (retroperitonial, epididimal) e tecido adiposo marrom. • Adrenalectomia; • Adrenodemedulação; • Western blotting; • Cultura primária de cardiomiócitos; • Avaliação da atividade enzimática da PEPCK.
    • Grupos de Pesquisa Luiz C. C. Navegantes, PhD Ísis do Carmo Kettelhut, PhD Renato Hélios Migliorini, PhD (in memoriam) Técnicos: Neusa M. Zanon, BSc. Elza Fillipin, BSc. Maria Antonieta R. Garófalo, BSc. Lilian Zozernon, Undergraduate Víctor D. Galban, PhD Dawit A. P. Gonçalves, FAPESP PhD fellowship Flavia A. Graça, FAPESP PhD fellowship Franciele Przygodda, CNPq PhD fellowship Graziela N. Sodré, CNPq PhD fellowship Juliano Machado, CNPq PhD fellowship Leandro Manfredi, CAPES PhD fellowship Natalia Lautherbach, CNPq Msc fellowship Priscila Cassola, PhD Rafael Rossi-Valentim, CNPq PhD fellowship Samyra L. Buzelle, CAPES PhD fellowship Silvia Paula-Gomes, CAPES PhD fellowship Wilian A. Silveira, FAPESP PhD fellowship