Inmunodiagnosticoeinmunoterapia Umsa 2008
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Inmunodiagnosticoeinmunoterapia Umsa 2008 Inmunodiagnosticoeinmunoterapia Umsa 2008 Presentation Transcript

  • BIOTECNOLOGIA EN INMUNOLOGIA CLÍNICA Dr. Martin Villarroel Mareño Doctorando Inmunología Experto en Docencia Universitaria UAH - Alcalá de Henares, España Instituto Boliviano de oncohematología Paolo Belli. Laboratorio de Biología Celular Facultad de Medicina. Universidad Mayor de San Andrés. La Paz - Bolivia
  • Plan de la clase
    • Tecnología de anticuerpos
      • Uso de los anticuerpos en el laboratorio: inmunodiagnóstico
      • Uso clínico de los anticuerpos: inmunoterapia
      • Producción de anticuerpos para uso clínico y diagnóstico
  • 1. Usos diagnósticos y terapéuticos de los anticuerpos
    • Técnicas analíticas/diagnósticas: miden generalmente fuera del organismo por técnicas " in vitro " algún parámetro
      • ELISA enzima inmunoensayo mediadores, seropositividad
      • WESTERN inmunoelectroforesis de proteínas, inmunodetección
      • IMMUNOHISTOQUIMICA , biopsias, anatomía patológica
      • NEFELOMETRIA turbidometría, Ig séricas
      • CITOMETRIA DE FLUJO Diagnóstico de leucemias
    • Técnicas terapéuticas : diseñadas para curar.
      • Tratamiento antineoplásico destrucción células tumorales
      • Tratamientos antiinflamatorios . Neutralización de mediadores proinflamatorios
  • 1. Uso de anticuerpos en el laboratorio
    • Fundamento: Pueden ser utilizados como nanoherramientas capaces de reconocer específicamente y a las que nosotros podemos sujetar, localizar o medir.
    • Especificidad en el reconocimiento aportada por la región Fab del anticuerpo.
    • 2. Posibilidad de marcaje : radioactivo, enzimatico, fluorescente, con puente biotina-avidina. Detección y medida.
    • 3. Unión a soportes ( magnéticos o de plástico) por región Fc. Separación y purificación molecular y celular.
    1. Ag. 2. * 3.
  • Cuantificación de antígeno
    • Miden analitos mediante anticuerpos especificos unidos a isotopos ra dioactivos (RIA) o a enzimas (ELISA), comparan con una curva estándar con concentraciones conocidas de la sustancia problema.
    • ELISA o RIA competitivo . Antígeno pegado. El antígeno de la muestra inhibe la unión de un anticuerpo indicador al antígeno pegado al pocillo.
    •   ELISA o RIA sandwich . 1 er anticuerpo pegado captura antígeno segundo anticuerpo indicador unido a enzima o radiomarcado reconoce otro determinante del antígeno.
  • Identificación, purificación y caracterización de antígenos proteicos
    • Inmunoprecipitación
    • Se solubilizan proteinas celulares con detergentes
    • S e usa un anticuerpo especifico para precipitar una proteína,
    • Se lava y así se la separa de las otras sustancias.
    • Se libera el antígeno por cambio de pH que reduce la afinidad de la unión Ab-Ag.
    • Estudios de coinmunoprecipitación +western . Estudio de complejos moleculares.
  • Identificación, purificación y caracterización de antígenos proteicos
    • Western e inmunoblot
    • S eparación analítica por electroforesis en gel de (SDS)-poliacrilamida separa proteínas por su peso molecular
    • Son transferidas a un filtro poroso por capilaridad.
    • Las proteínas son reconocidas por anticuerpos radiomarcados o unidos a enzimas.
  • Identificación, purificación y caracterización de células
    • Citometría de flujo.
    • La expresión de antígenos es medida en cada célula haciéndolas pasar de una en una por delante de un haz de luz, anticuerpos marcados fluorescentes son utilizados como moléculas indicadoras.
    • Marcaje de superficie celular
    • Marcaje intracelular
    • Marcaje de células secretoras
  • Localización del antígeno en tejidos o células
    • Inmunofluorescencia Anticuerpos fluoromarcados en microscopia óptica. estructuras no marcadas no se ven, dificultando la localización precisa del marcaje fluorescente.
    • Citometría Láser de barrido ilumina con láser, lee fluorescencia a varios colores
    • Inmunohistoquímica: Utilización en microscopia óptica de anticuerpos unidos a enzimas que producen compuestos coloreados e insolubles que precipitan en la posición del ag .
    • Microscopia inmunoelectrónica: Utiliza anticuerpos unidos a compuestos electrodensos, como el oro coloidal.  
  • Localización del antígeno en pacientes
    • Inmunoresonancia marcaje con anticuerpos unidos a sustancias con propiedades de conservación de spin caracteristicas
    • Inmuno scanner radiológico marcaje de anticuerpo con compuestos radio-opacos
    • InmunoPET . Marcaje con anticuerpos sustancias emisoras de positrones.  
    • Inmunoliposomas permiten marcar anticuerpos con casi cualquier cosa
  • Uso de anticuerpos para separación celular .
    •   Métodos de fase sólida Fijación de anticuerpos por su región Fc a una fase sólida.
      • Panning
      • Fijación de anticuerpos a plástico. Células portadoras del antígeno se unen al soporte. lavado y separación mecánica o química.
      • MACS (Magnetic Activated Cell Sorting)
      • Anticuerpos unidos a micropartículas magnéticas son retenidos en una matriz ferromagnética (fase sólida) cuando se aplica un campo magnético. Células portadoras del antígeno se unen al soporte. lavado y elución por eliminación del campo magnético.
  • Métodos fluorescentes inteligentes
    • FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting)
    • anticuerpos unidos a compuestos fluorescentes son reconocidos en la superficie de cada célula.
    • Células de los fenotipos seleccionados son reconocidas una a una y separadas en función de las combinaciones de parámetros seleccionados.
    • Aplica un campo eléctrico que desvía trayectoria de caída de la célula hacia el contenedor de fracción deseado.
    • Se pueden clonar células de características específicas.
  • 2. Terapia con anticuerpos monoclonales “from magical bullets to smart bombs”
    • La idea era de principios del siglo XX
    • Tecnología anticuerpos monoclonales 1975. Nobel a un Posdoc Kohler
    • Limitaciones de anticuerpos murinos
      • Vida media corta en humanos
      • No interaccionan óptimamente con sistemas efectores humanos
      • Estimulan formación de anti-anticuerpos (reacciones anafilácticas)
    • Anticuerpos humanizados
    • 200 anticuerpos distintos en pruebas clínicas y a diferencia de antiangiogénicos están funcionando en terapia antitumoral.
    • Estimulan activación complemento, ADCC, fagocitosis.
  • 2. Uso terapéutico de los anticuerpos
    • Radioconjugados
      • Fósforo, Estroncio, Yodo, Ytrio
      • I-antiCD45 leucemias mieloides agudas
      • Zevalin antiCD20 de ratón vida corta Itrio 90 emisión 
      • Bexxar antiCD20 de ratón Iodo131
    • Quimioconjugados
      • AntiCD33 Mylotarg conjugado con chaleomicina (CMA-676) produce especies altamente reactivas que dañan el DNA e inducen apoptosis.
      • Se emplea en leucemias mieloides agudas. El antígeno CD33 se endocita al ser reconocido por el anticuerpo anti CD33.
      • AntiCD22 Conjugados con RNAsas se experimentan en linfomas.
    • Anticuerpos puros
      • AntiCD40 induce AICD en linfomas.
      • AntiCD20 mata células de linfomas y leucemias (depende de polimorfismo Receptores Fc).
  • Anticuerpos sin conjugar
    • Terapia antitumoral selectiva
      • 1999 AntiCD20 Rituximab para linfomas y Leucemias de células B
      • 2001 Anti CD52 Campath 1H tumores de células B, enfermedad mínima residual, rechazo de órganos e injerto contra huésped, enfermedades autoinmunes
    • Eliminación de células indeseables de inóculos para trasplante de médula ósea.
      • AntiCD3 OKT-3 Purgado de linfocitos T de inóculos alogénicos anti-CD3
      • Purgado de células tumorales de inóculos autólogos.
  • Conjugados con partículas magnéticas
    • AntiCD34 para purificación de células madre hematopoiéticas (CD34+) por selección inmunomagnética.
    • Permite purificar células madre a partir de sangre periférica.
  • Antagonistas de citocinas
    • Anticuerpos anticitocina Anti-TNF  Infliximab
      • Neutralizan mediadores proinflamatorios
      • Tienen un efecto drástico efecto antiinflamatorio
      • Se usan en Enfermedad de Chron, Artritis reumatoide.
    • Receptores solubles de TNF Etanercep
      • También neutralizan TNF pero tienen vida más corta.
    • Quimeras con región Fc. IgG. alargan vida media del receptor soluble
  • 3. Producción de anticuerpos
    • Obtención de antisueros (anticuerpos policlonales)
    • Síntesis de anticuerpos monoclonales
    • Reducción de su inmunogenicidad. Síntesis de anticuerpos quiméricos
  • Obtención de antisueros (anticuerpos policlonales)
    • Uso diagnóstico
    • En terapia antisueros antitetánicos
    • VENTAJAS: rápido y de bajo coste
    • INCONVENIENTES: Reproducibilidad limitada, cantidad limitada de Ab.
  • Síntesis de anticuerpos monoclonales Kohler G. Y Milstein C. (Nature, 1975). - PROTEÍNA - PLÁSMIDO - CÉLULAS -VÍA: parenteral, intramuscular... -DOSIS: 3/4 inóculos -ADYUVANTES Y CARRIERS. CEPA: BALB/c, Y3 PROTEÍNAS VIRALES MÉTODOS ELECTRICOS CEPAS: P3/x63.Ag8.653, NSI/0, NSI/1 ELISA, IFI, RIA, WESTERN, INMUNOCITOQUÍMICAS, FACS....... - DILUCIÓN - AGAR
  • Problemas para el uso terapéutico inmunogenicidad de los anticuerpos xenogénicos
  • Disminución de la Inmunogenicidad de los anticuerpos
    • Anticuerpos xenogénicos
      • Estimulan la formación de antianticuerpos
    • Anticuerpos quiméricos
      • Regiones variables murinas
      • Regiones constantes humanas funciones efectoras
    • Anticuerpos humanizados
      • Reemplazo de regiones armazón originales del domino variable por otras humanas para disminuir todavía más la inmunogenicidad.
  • Síntesis de anticuerpos quiméricos Morrison et al.(PNAS, 1986 ) y Boulianne (Nature, 1984).
  • Variantes biotecnológicas
    • Quimeras con región Fc. alargan vida media de la molécula asociada
    • Anticuerpos biespecíficos.
    • Inmunopartículas biespecíficas
    • Inmunoliposomas liposomas recubiertos de anticuerpos monoclonales
    • letales como transportadores de sustancias toxicas intracelulares ej. RNAasas
  • El “toque humano” ha permitido el uso clínico
    • Anticuerpos quiméricos (1995-) V murina C humana
      • Simulect rechazo
      • Remicade Infliximab Crohn, AR
    • Humanizados HVR murina FR humana C humana
      • Zenapax (1997) (CD25)
      • Herceptin (1998) cáncer de mama metastático que expresa EGF receptor
      • Campath (2001) antiCD52
      • Xolair Omalizumab(2003) anti IgE asma alérgica
      • Efalizumab (2004) psoriasis
      • 200 tipos más están actualmente utilizándose en ensayos clínicos en humanos.
  • Citometria de flujo
  • Ejemplo de aplicación de la citometria de flujo. Inmunofenotipo en mieloma múltiple y evaluación de la EMR
  • VALORACION DE RESPUESTA CELULAR
  • Hemos aprendido
      • Métodos de uso de los anticuerpos en el laboratorio
      • Posibilidades de uso clínico de los anticuerpos en inmunoterapia
      • Tecnologías de producción de anticuerpos para uso clínico y diagnóstico