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SIMULAÇÃO DE DOCKING MOLECULAR DE AÇÚCARES EM HEXOQUINASE 1
FELTRIN, Ana Carla2
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1.2. Glicólise
A glicólise inicia com uma molécula de glicose e então realiza uma série de
transformações químicas compo...
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Figura 01: Hexoquinase antes do ajuste induzido (esquerda) e após o acoplamento de ATP
e glicose (direita).
Quando diver...
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1.4.Metabolismo da D-frutose e da D-manose
A hexoquinase também é responsável pela conversão de outros açúcares em
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As associações entre moléculas biologicamente relevantes desempenha um papel
central na transdução de sinais. Além disso...
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2) Uso da função de score: O algoritmo posiciona o ligante em uma determinada
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Figura 03: Rotas de metabolismo de açúcares.
Essa etapa permitiu selecionar a hexoquinase como a enzima-alvo desse estud...
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Escolhida a enzima, procedeu-se à otimização de geometria da frutose e da manose
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Determinada a cavidade-alvo, o docking molecular com a frutose e com a manose foi
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Foi possível, também, determinar a orientação espacial preferencial de dois açúcares
(frutose e manose) no sítio ativo ...
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Docking de açúcares na enzina hexoquinase

  1. 1. 1 SIMULAÇÃO DE DOCKING MOLECULAR DE AÇÚCARES EM HEXOQUINASE 1 FELTRIN, Ana Carla2 ; MARTINS, Márcio Marques3 , APPELT, Helmoz Roseniaim4 , KERSTING, Renato Luiz5 1 Trabalho de iniciação científica PROBIC/UNIFRA 2-4 Curso de Química do Centro Universitário Franciscano (UNIFRA), Santa Maria, RS, Brasil 5 Curso de Eng. de Materiais do Centro Universitário Franciscano (UNIFRA), Santa Maria, RS, Brasil E-mail: marciomm@unifra.br RESUMO Através do uso de uma técnica de modelagem molecular conhecida como docking, simula- se o encaixe (docking) da -D-frutose e da -D-manose à enzima glicolítica hexoquinase. A hexoquinase é conhecida pelo papel que desempenha na metabolização de açúcares e na produção de ATP. A geometria dos açúcares frutose e manose foi otimizada usando teoria do funcional de densidade (DFT) no software Spartan. O cálculo de docking foi realizado no software Molegro Virtual Docker, o qual emprega função de score MolDock. A hexoquinase utilizada atende pelo número EC 2.7.1.1 ou 3BD8 no http://pdb.org. Essa estrutura pertence à levedura saccharomyces cerevisae e está complexada com uma molécula de glicose, o que facilitou o processo de identificação do sítio ativo. Foram obtidas 5 poses para cada um dos complexos hexoquinase-substrato, apenas as de maior score são exibidas nesse artigo. Cálculos DFT serão realizados a posteriori a fim de verificar a estabilidade dos complexos. Palavras-chave: Modelagem Molecular. Físico-Química. Docking Molecular. Açúcares. 1. INTRODUÇÃO 1.1. Enzimas Glicolíticas A glicose é a molécula responsável por fornecer energia às células do corpo humano. Ela é uma molécula que atua como um combustível conveniente devido ao fato de sua estabilidade e solubilidade em meios aquosos. Assim, é fácil transportá-la pelo sangue para lugares onde ela pode ser estocada e usada quando necessário. A glicose é embutida de uma energia química considerável, apta a ser usada imediatamente pelo organismo. Em um tubo de ensaio, pode-se queimar glicose, formando dióxido de carbono e água e uma quantidade de calor igual a -2813 kJ/mol (BALL, 2004). Nossas células também queimam glicose, mas elas o fazem em quantidades muito menores que um mol, com passos bem controlados, de tal forma que elas possam capturar a energia em formas mais utilizáveis, tais como Adenosinatrifosfato (ATP). A rota metabólica conhecida por glicólise (quebra de açúcar) é o primeiro processo na combustão celular da glicose e de outros açúcares.
  2. 2. 2 1.2. Glicólise A glicólise inicia com uma molécula de glicose e então realiza uma série de transformações químicas composta por dez etapas. Durante esse processo, as moléculas de açúcar recebem dois fosfatos (usando até duas moléculas de ATP), então são quebradas em duas peças, e finalmente são reformadas e desidratas, formando quatro moléculas de ATP no processo. Globalmente, a glicólise forma duas novas moléculas de ATP usando a energia dessa quebra parcial do açúcar. A ATP pode então ser usada para fornecer energia aos processos moleculares nas células. Em adição, um passo da glicólise também extrai quatro átomos de hidrogênio da molécula de açúcar, os quais podem ser usados na biossíntese de outras moléculas ou para criar energia química adicional. (VOET, 1995) 1.3.Hexoquinase A glicólise é um processo fascinante. Existem dez enzimas responsáveis pelo aproveitamento energético dos açúcares e que auxiliam na manutenção energética das nossas células. Elas foram aperfeiçoadas pelos processos evolutivos a fim de desempenhar seu papel de forma rápida e eficiente – adicionando, removendo e alterando átomos sem cometer erros. A rota glicolítica é cuidadosamente regulada, de tal forma que a glicose é quebrada apenas quando energia é necessária na célula. Dentro da rota glicolítica, existe uma grande quantidade de enzimas alostéricas (que alteram sua estrutura tridimensional quando acopladas a um ligante); enzimas que formam ligações covalentes com seus substratos durante a reação; e enzimas que usam íons metálicos ou moléculas orgânicas como co-fatores. Algumas dessas enzimas são tão eficientes que cada passo procede suavemente, mas não incontrolavelmente, em direção a um objetivo que é o de capturar a energia do açúcar assim que ele é quebrado. As enzimas glicolíticas são em número de dez, a saber: hexoquinase, fosfoglicose isomerase, fosfofrutoquinase, frutose-1,6-bifosfato-aldolase, triose-fosfato-isomerase, gliceraldeído-3-fosfato deidrogenase, fosfogliceratoquinase, fosfoglicerato mutase, enolase, piruvato quinase. A hexoquinase realiza a primeira etapa na glicólise, usando uma molécula de ATP para iniciar o processo. Ela transfere um fosfato da ATP para a glicose, formando a glicose- 6-fosfato. Daniel Koshland descobriu, uma década antes da estrutrura ser conhecida, que essa reação química devia ser protegida da água, para evitar do fosfato ser clivado do ATP por uma molécula de água. Então, ele propôs que a hexoquinase realiza um ajuste induzido (induced fit), fechando-se em torno da ATP e da glicose quando essas ligam-se a ela (Figura 01).
  3. 3. 3 Figura 01: Hexoquinase antes do ajuste induzido (esquerda) e após o acoplamento de ATP e glicose (direita). Quando diversas estruturas de hexoquinase de leveduras foram resolvidas em 1970, essa afirmação mostrou-se verdadeira. Hexoquinase tem a forma de uma braçadeira, com um grande sulco em um dos lados (figura 01, indicada pela seta na figura da direita). A estrutura sem glicose é exibida na direita da figura 01, corresponde à entrada 2YHX no banco de estruturas de proteínas - PDB (http://www.pdb.org). Ela é aberta, permitindo a entrada dos substratos no sítio catalítico. Mas quando a glicose se liga (como mostrado na estrutrura à direita da figura 01), a hexoquinase fecha-se, circundando a molécula. Essa estrutura fechada pode ser acessada no PDB através do código 1HKG. Essas duas estruturas foram resolvidas antes da sequência de aminoácidos ser conhecida, então as estruturas estão incompletas. Para uma visão mais acurada da estrutura, a entrada 1IQ8 no PDB permite visualizar a forma aberta, assim como a entrada 1BDG permite visualizar a forma fechada. Quando se trata da hexoquinase humana, a complicação é um pouco maior. Diversas tentativas de resolver a estrutura da hexoquinase foram feitas, usando diferentes tipos de células e buscando resolver diferentes necessidades. A entrada 1DGK representa uma hexoquinase de células cerebrais, com o dobro do tamanho da hexoquinase de levedura. A 1DGK possui duas cadeias praticamente idênticas, apenas uma das metades se especializou em realizar a reação catalítica enquanto a outra metade se especializou na regulação e não realiza a reação de transferência de fosfato.
  4. 4. 4 1.4.Metabolismo da D-frutose e da D-manose A hexoquinase também é responsável pela conversão de outros açúcares em energia. Particularmente, a hexoquinase catalisa a reação de metabolização da glicose e outras hexoses. A frutose é uma pentose, sua reação de fosforilação é catalisada pela frutoquinase. Simularemos o encaixe da frutose à hexoquinase apenas com o intuito de testar o funcionamento do software e observar as diferenças de comportamento no docking de uma hexose e de uma pentose à hexoquinase. A D-frutose é um açúcar presente nas frutas e no mel, geralmente em conjunto com a glicose e com a galactose. A D-manose não é muito bem metabolizada pelo organismo humano, tampouco está presente nas dietas alimentares comuns. Ela é vendida como um medicamento natural para tratamento de infecções do trato urinário e, acredita-se, impeça a adesão das bactérias presentes no trato urinário nas paredes do mesmo. Figura 02: Estruturas da alfa-D-manose (esquerda) e beta-D-frutose (direita) 2.FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1.Docking molecular Essa técnica de modelagem molecular consiste de um método que prediz a orientação preferencial de uma molécula quando ligada a uma segunda molécula (normalmente uma proteína enzimática) para formar um complexo estável. O conhecimento da orientação preferencial, por sua vez, pode ser usado para predizer a intensidade da associação ou afinidade de ligação entre essas duas moléculas usando, por exemplo, funções de score.
  5. 5. 5 As associações entre moléculas biologicamente relevantes desempenha um papel central na transdução de sinais. Além disso, a orientação relativa de dois parceiros interagentes pode afetar o tipo de sinal produzido. Assim, docking é útil para predizer tanto a força quanto o tipo de sinal produzido. A técnica de docking molecular é usada frequentemente para predizer a orientação de ligação de pequenas moléculas candidatas a drogas ao seus alvos proteicos a fim de predizer a afinidade e a atividade da molécula menor. Dessa forma, o docking molecular desempenha um papel importante no desenvolvimento racional de drogas. O problema do docking pode ser associado a uma espécie de jogo de “chave-e- fechadura”, onde o interesse recai em encontrar a orientação relativa correta da “chave” que irá abrir a “fechadura”. A proteína desempenha o papel da fechadura e o ligante o papel da chave. O problema é encontrar o melhor ajuste da chave na fechadura. Durante o processo de busca dessa oritentação preferencial, o ligante e a proteína ajustam suas conformações a fim de encontrar a melhor conformação possível com a menor energia global possível, no que convencionou-se chamar de “ajuste induzido”. Para realizar uma busca de melhor configuração espacial substrato-enzima, é necessário possuir uma estrutura da proteína de interesse. Comumente, a estrutura da proteína é resolvida usando cristalografia de raios-x ou espectroscopia de RMN. O sucesso da busca recai no algoritmo de busca e na função de score. O algoritmo de busca estocástico divide-se em duas partes (MOLEGRO, 2009): 1) Predição de cavidade: uma malha de 0,8Å cobrindo toda a proteína é criada. A cada ponto da malha uma esfera de 1,4Å é posicionada. O programa checa se cada esfera está sobreposta com alguma das esferas determinadas pelo raio de Van de Walls dos átomos da proteína. Os pontos da malha onde isso acontece são marcados como parte do volume excluído da proteína, os demais pontos são marcados como acessíveis. Cada ponto acessível da malha sofre uma verificação para verificar se faz parte de uma cavidade. No ponto em questão, uma direção aleatória é escolhida e uma linha é traçada. Se um ponto inacessível é encontrado, nova verificação é realizada com outra direção aleatória. O procedimento é repetido 16 vezes, e se mais do que 12 direções resultarem em pontos inacessíveis, o ponto em questão é considerado como parte de uma cavidade. Dois pontos inacessíveis vizinhos são conectados até que uma cavidade com volume maior que 10,0 Å3 seja formada. Quanto maior uma cavidade, maior a probabilidade de que seja um sítio catalítico.
  6. 6. 6 2) Uso da função de score: O algoritmo posiciona o ligante em uma determinada orientação relativa à cavidade e a função de score é usada para calcular a possibilidade de que aquela pose represente uma interação de ligação favorável. A função de score MolDock I tem a seguinte forma geral: (01) Onde Einter representa a energia intermolecular, expressa abaixo na equação 02. (02) A função de score PLP (equação 03) foi proposta por Gehlhaar (GEHLHAAR, 1995;1998) e aperfeiçoada por Yang et al. (YANG 2004), trata-se de uma função de potencial linear aditiva por partes. (03) A energia calculada é retornada em unidades de kilocaria/mol. Interações eletrostáticas a distâncias maiores que 2,0 Å são elimindas do cálculo. A função de score PLP conta ainda com um termo que permite diferenciar um hidrogênio supramolecular (que forma pontes) de um hidrogênio molecular. O termo Eintra representa a energia interna do ligante (equação 04). (04) O somatório duplo ocorre entre os pares de átomos do ligante excluíndo os pares que estão conectados por duas ligações ou menos. O segundo termo é um termo de energia torsional, parametrizado de acordo com a hibridização dos átomos ligados. O ângulo T é o ângulo torsional da ligação. O termo Eclash representa uma penalização de 1000 se a distância entre dois átomos pesados (separados por mais de duas ligações) for menor que
  7. 7. 7 2,0 Å, punindo ligações conformações dos ligantes não realistas. Se um átomo pesado do ligante é posicionado fora da região do sítio ativo, uma penalidade de 10000 é aplicada à energia total. Após a aplicação da função de score, a pose do ligante tem sua energia total calculada e os valores de energia são armazenados no arquivo de resultados. O algoritmo propõe uma nova pose, de forma randômica, e o processo é reiniciado. Isso é repetido até que um número grande de poses tenha sido testado. 2. OBJETIVOS Utilizar um software comercial de docking molecular para estudar a ligação de frutose e manose à enzima hexoquinase. 3. METODOLOGIA A fim de simular o docking da -D-frutose e da -D-manose à hexoquinase, o software Molegro Virtual Docker foi utilizado. Esse software facilita a busca por estruturas, visto que basta fornecer o código da enzima que será usada na simulação de docking molecular e ele acessa o banco de dados de proteínas, faz o download e exibe na tela. Acessando a base de dados KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), é possível visualizar diversas informações acerca de rotas enzimáticas de diversos substratos. Nesse caso, é possível visualizar a rota de metabolismo de açúcares (figura 03).
  8. 8. 8 Figura 03: Rotas de metabolismo de açúcares. Essa etapa permitiu selecionar a hexoquinase como a enzima-alvo desse estudo, visto que ela está associada tanto à manose quanto à frutose (recebe o código EC 2.7.1.1 – Enzyme Comission number). Buscando na base de dados PDB, foram encontradas diversas enzimas hexoquinase que correspondem ao número EC 2.7.1.1 (WIKIPEDIA): 3B8A, 2YHX,1HKG, 1IQ8, 1BDG e 1DGK. Todas são estruturas de enzimas hexoquinase, mas a preferência para a simulação de docking recaiu sobre a primeira, por ela possuir a estrutura de braçadeira com sulco descrita na introdução desse trabalho. A estrutura resolvida com resolução de 2,1 Å corresponde a uma hexoquinase-I, pertencente a uma enzima de levedura de saccharomyces cerevisiae. Ela possui uma molécula de glicose complexada com o sítio catalítico, facilitando a tarefa de buscar a cavidade mais adequada para o docking dos açúcares frutose e manose. 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
  9. 9. 9 Escolhida a enzima, procedeu-se à otimização de geometria da frutose e da manose no por cálculos ab initio usando a teoria do funcional de densidade (DFT) no software Spartan. A estrutura da 3B8A complexada com a glicose é mostrada na figura 04. Figura 04: Hexoquinase complexada com glicose (3B8A). A próxima etapa consistiu em determinar as possíveis cavidades da enzima, tarefa facilitada pela presença da molécula de glicose complexada. A figura 05 exibe as cavidades encontradas, bem como o volume calculado da maior delas. Figura 05: A cavidade que contém a molécula de glicose possui um volume de 28,672 Å3 , a maior cavidade tem volume igual a 206,336 Å3 (direita).
  10. 10. 10 Determinada a cavidade-alvo, o docking molecular com a frutose e com a manose foi realizado separadamente. Os resultados são exibidos na sequência (figura 06). Figura 06: Orientação da melhor pose da -D-frutose (esquerda) -D-manose (direita) à enzima hexoquinase 3B8A. Foi possível observar que embora a cavidade com maior volume tenha sido escolhida para realizar o docking molecular, a cavidade menor onde a glicose encontrava-se inicialmente mostrou-se mais adequada para o acoplamento da frutose e da manose. Pode- se atribuir diferenças de polaridade nas duas cavidades em questão como uma possível causa para esse comportamento aparentemente estranho. Uma maior compreensão sobre as pontes de hidrogênio presentes nessa região da hexoquinase pode lançar maior luz sobre a preferência desse sítio catalítico em detrimento dos sítios com maior volume. Um estudo sobre as energias de interação frutose/manose-hexoquinase está em andamento, bem como um estudo sobre a formação de ligações de hidrogênio também está em curso. Os resultados aqui demonstrados ainda são preliminares, pois o projeto de pesquisa está em andamento. Como próximo passo, as regiões selecionadas e exibidas nas figuras 05 e 06 serão separadas do resto da enzima e a estrutura estática terá a energia total calculada por metodologia ab initio-DFT. 5. CONCLUSÃO O presente artigo apresentou resultados preliminares do projeto de pesquisa sobre a atividade biológica de açúcares. Foi possível estudar o funcionamento de um software de simulação de docking molecular em uma enzima de estrutura e funcionamento bem conhecido, a hexoquinase.
  11. 11. 11 Foi possível, também, determinar a orientação espacial preferencial de dois açúcares (frutose e manose) no sítio ativo da hexoquinase. As estruturas preferenciais obtidas servirão como base para desenvolvimentos futuros, onde a energia total e as ligações de hidrogênio serão determinadas. Essas últimas servirão para determinar as diferenças na formação dos complexos enzima-substrato com a frutose e a manose, as quais estão evidenciadas nas figuras 05 e 06. REFERÊNCIAS BALL, D. W., Físico-Química vol.1, Thomson Learning, São Paulo, 2005 GOODSELL, D., The Glycolitic Enzymes, <http://www.pdb.org/pdb/static.do?p=educa tion_discussion/molecule_of_the_month/pdb50_1.html>, acessado em 20/09/2010 KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, www.genome.jp/kegg, acessado em 20/09/2010 MOLEGRO, Molegro Virtual Docker 2010.4.0 User Manual, 2009 VOET, D., VOET, J. G., Biochemistry, 2nd ed., John Wiley and Sons Inc, 1995 WIKIPEDIA, EC number, http://en.wikipedia.org/wiki/EC_number, acessado em 20/10/2010

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