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Prueba de PCR Prueba de PCR Presentation Transcript

  • BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA Laboratorio de Microbiología y Virología Prueba de “PCR” Mariana Paz Rossainz Cruz
  • ¡Que es la Prueba de PCR? La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado
  • Fundamento Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Las temperaturas del ciclo (95 C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. como: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Thermus aquaticus
  • Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Necesaria para cada etapa de la reacción. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción
  • Optimización La PCR es una técnica de gran sensibilidad, necesita una mínima cantidad de ADN para obtener un gran número de copias. Además, puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a la amplificación de ADN no correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a conclusiones inciertas). Se han de tomar una serie de precauciones para evitar la contaminación con ADN extraño. Ejemplos en los que es especialmente importante la amplificación son la detección de enfermedades o el diagnóstico de identidad y parentesco. Posibles precauciones son: *Tener especial cuidado durante los pasos previos a la amplificación: recogida, envío, custodia y procesado de muestras. *Limpieza exhaustiva y esterilización (lejía, etanol, luz UV) de la superficie de trabajo entre la realización de una PCR y la siguiente. *En laboratorios de diagnóstico genético, se suelen tener áreas separadas de trabajo: un laboratorio para la preparación de la mezcla madre para la PCR, otro para la adición del ADN a amplificar, otro donde se encuentra la maquinaria para realizar la PCR y otro donde se abre y analiza la muestra ya amplificada. *Cabinas de seguridad biológica para reducir vapores cargados de amplicones de enfermedades. *Protección adecuada de los operarios que manipulen las muestras y los instrumentos del laboratorio: guantes, bata, botas, gafas de seguridad, pelo recogido... En el diagnóstico molecular es conveniente que se cambien estos elementos al pasar de una zona de trabajo a otra.
  • Ciclo de Amplificación El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos de 2-3 pasos a diferentes temperaturas. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choque térmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje. Dependen de gran variedad de parámetros: como la enzima usada para la síntesis de ADN (la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en 7580 °C ), la concentración de iones divalentes y de los dNTP en la reacción, y la temperatura de unión de los cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplificar
  • Pasos en el ciclo de amplificación Inicio Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 C (ó 98 C con una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor. Desnaturalización En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas del ADN). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 C) de la muestra la forma más habitual. La temperatura que se meplea para la desnaturalización depende de la proporción de G+C que tenga la cadena, como el largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados son la adición de sales o agentes químicos para la desnaturalización. Alineamiento o unión del cebador A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.
  • Cebador ADN Polimerasa
  • Extensión o elongación de la cadena Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de el ADN polimerasa que usemos Elongación final Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado. Conservación Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo. Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN, se emplean técnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud y en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamaño: típicamente se emplean en gel de agarosa para fragmentos grandes; en acrilamida para los más pequeños; y más rápida y aplicable a PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.