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ENZIMAS: REGULACIÓN POR pH, TEMPERATURA Y CONCENTRACIÓN DE SUSTRATOS

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Tp nº1 bioquimica medica 2012

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ENZIMAS: REGULACIÓN POR pH, TEMPERATURA Y CONCENTRACIÓN DE SUSTRATOS

  1. 1. Fundación H. A. Barceló-Facultad de Medicina Guía de Trabajos Prácticos: Enzimas: regulación por pH, temperatura y concentración de sustratos FUNDACIÓN BARCELOINSTITUTO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS DE LA SALUD FACULTAD DE MEDICINABIOQUÍMICA, INMUNOLOGÍA Y NUTRICION NORMAL 3° AÑO GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS ENZIMAS: REGULACIÓN POR pH, TEMPERATURA Y CONCENTRACIÓN DE SUSTRATOS 1
  2. 2. Fundación H. A. Barceló-Facultad de Medicina Guía de Trabajos Prácticos: Enzimas: regulación por pH, temperatura y concentración de sustratos ENZIMASAspectos generales: Las enzimas son en su mayoría proteínas que catalizan reacciones químicasen los seres vivos. Las enzimas son catalizadores biológicos, sustancias que sin consumirse enuna reacción, aumentan notablemente su velocidad.No hacen factibles las reacciones imposibles, sino que solamente aceleran aquellas reaccionesque se producen espontáneamente. Las enzimas hacen posible la existencia de seres vivos, yaque permiten que se produzcan aquellas reacciones químicas que, sin catalizador, requeriríande tiempos y condiciones de presión, temperatura y pH incompatibles con la vida.Prácticamente todas las reacciones quimicas que tienen lugar en los seres vivos estáncatalizadas por enzimas. Las enzimas son catalizadores específicos: cada enzima cataliza un solotipo de reacción, y casi siempre actúan sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducidode ellos.El sustrato se une a una región concreta de la enzima, llamada centro activo. El centro activocomprende un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto directo con elsustrato y un sitio catalítico formado por los aminoácidos directamente implicados en elmecanismo de la reacción. Una vez formados los productos, la enzima puede comenzar unnuevo ciclo de reacción.Propiedades de las enzimas: Las propiedades de las enzimas se encuentran íntimamenterelacionadas con su estructura. Dada la alta complejidad estructural que presentan es quepueden llevar a cabo procesos catalíticos complejos. Por consiguiente cualquier modificación enla estructura nativa de la misma suele ir asociado a cambios en la actividad catalítica. Losfactores que influyen de manera más directa sobre la actividad de una enzima son: • Cambios de pH • Cambios de Temperatura • Presencia de Cofactores • La concentración de sustrato y producto • La fuerza iónica de la soluciónEfecto del pH sobre la actividad enzimática: las enzimas poseen grupos químicos ionizables(carboxilos –COOH, aminos –NH2, tiol –SH, imidazol, etc.) en las cadenas laterales de susaminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva,negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargaseléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividadcatalítica. Éste es el llamado pH óptimo.La mayoría de las enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocasdécimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Así, 2
  3. 3. Fundación H. A. Barceló-Facultad de Medicina Guía de Trabajos Prácticos: Enzimas: regulación por pH, temperatura y concentración de sustratosla pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2, la ureasa tiene un pH óptimo de 7 y la arginasatiene un pH óptimo de 10.Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática: en general, los aumentos detemperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10°C de incremento, la velocidad dereacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sinembargo, debido a su estructura biológica, a partir de cierta temperatura, se empiezan adesnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llamatemperatura óptima. Por encima de esta temperatura el aumento de la velocidad de la reaccióndebido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a ladesnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.Efecto de las concentraciones de sustrato sobre la actividad enzimática: La velocidad de unareacción enzimática depende de la concentración del sustrato mientras la enzima no seencuentre saturada. TRABAJO PRÁCTICOOBJETIVOS • Determinar la variación de la actividad de una enzima frente a variaciones en el pH del medio de reacción. • Determinar la variación de la actividad de una enzima ante cambios de temperatura en la reacción química. • Observar el incremento de la actividad enzimática frente a concentraciones crecientes de sustrato.La determinación de la actividad de una enzima se realiza por métodos colorimétricos querequieren de la utilización del ESPECTROFOTOMETRO, que permite medir la cantidad de luzabsorbida de una sustancia, preferentemente coloreada. La determinación de la concentraciónse realiza al pasar un fino haz de luz a través de la solución. La porción de luz que pasa a travésde la solución colorida es la trasmitancia porcentual, la luz que no pasa es absorbida por lasolución y es medida como unidades de absorvancia. Las soluciones concentradas dejan pasarmenos luz que las diluidas. Así podemos decir que cuanto mayor es la concentración de unasolución mayor es su absorvancia y menor su trasmitancia. Tanto la absorvancia como latrasmitancia pueden ser leídas en los espectrofotómetros.El fundamento del método colorimétrico consiste en realizar una reacción que nos de cómoproducto un compuesto coloreado, el cual va a ser valorado a través de la absorvancia quepresente la solución. ENZIMA SUSTRATO PRODUCTO (coloreado)El espectrofotómetro tiene la capacidad de medir la cantidad de luz que absorbe el productocoloreado en base a la siguiente relación: ABSORBANCIA = a × l × c 3
  4. 4. Fundación H. A. Barceló-Facultad de Medicina Guía de Trabajos Prácticos: Enzimas: regulación por pH, temperatura y concentración de sustratosDonde a: es una constante propia de la sustancia coloreada, l: es el diámetro del tubo quecontiene la sustancia coloreada, c: es la concentraciónLa absorbancia es directamente proporcional a la concentración de una solución dentro de unrango, a altas concentraciones se pierde la relación lineal. A mayor concentración de productomayor concentración de sustrato reacción en presencia de la enzima. ACTIVIDADES DE LABORATORIOPara el desarrollo de los objetivos del TP se utilizará un sistema constituido por una enzima quecataliza la transformación de un sustrato en un producto coloreado.Efecto del pH:Reactivos y materiales • Buffer de reacción pH cercano a 7 (A) • Buffer de reacción pH ácido (B) • Buffer de reacción pH alcalino (C) • Sustrato • Enzima • Baño termostatizado a 37 °CProcedimiento experimentalEn tres tubos de ensayo se colocarán respectivamente: Tubo 1: pH óptimo Tubo 2: pH ácido Tubo 3: pH alcalino Buffer A 1 ml Buffer B 1 ml Buffer C 1 ml Enzima ….. µl ……µl …..µl Sustrato (1 g/l) 10 µl 10 µl 10 µl Incubar los tres tubos en baño de agua a 37°C, durante 10 minutos Observar el color obtenido en cada tubo, leer la absorbancia a 505 nm frente a blanco de reactivo y relacionar con la actividad enzimáticaEfecto de la temperatura:Reactivos y materiales • Buffer de reacción pH cercano a 7 (A) • Sustrato • Enzima • Baño termostatizado a 37 °C • Hielo • Agua hirviendo 4
  5. 5. Fundación H. A. Barceló-Facultad de Medicina Guía de Trabajos Prácticos: Enzimas: regulación por pH, temperatura y concentración de sustratosProcedimiento experimentalEn tres tubos de ensayo se colocará respectivamente: Tubo 1: 0°C Tubo 2: 37°C Tubo 3: 100°C Buffer A 1 ml 1 ml 1 ml Enzima …..µl …..µl …..µl Sustrato (1 g/l) 10 µl 10 µl 10 µl Incubar 10 min en baño de Incubar 10 min a Incubar 10 min a hielo (0 °C) 37°C 100°C Observar el color obtenido en cada tubo, leer la absorbancia a 505 nm frente a blanco de reactivo y relacionar con la actividad enzimáticaEfecto de la concentración de sustrato:Reactivos y materiales • Buffer de reacción pH cercano a 7 (A) • Sustrato • Enzima • Baño termostatizado a 37 °CProcedimiento experimentalEn dos tubos de ensayo se colocará respectivamente: Tubo 1 Tubo 2 Buffer A 1 ml 1 ml Sustrato (1 g/l) 10 µl 30 µl Enzima ….µl ….µl Incubar los tubos en baño de agua a 37°C, durante 10 minutosObservar el color obtenido en cada tubo, leer la absorbancia a 505 nm frente a blanco dereactivo y relacionar con la actividad enzimática 5
  6. 6. Fundación H. A. Barceló-Facultad de Medicina Guía de Trabajos Prácticos: Enzimas: regulación por pH, temperatura y concentración de sustratosCUESTIONARIO:1- Grafique los resultados obtenidos en las experiencias de actividad enzimática en función de lavariación del pH y temperatura. Compare con los gráficos teóricos. ¿Qué conclusiones obtiene?2- Teniendo en cuenta la experiencia de efecto de la concentración de sustrato sobre laactividad enzimática, discuta:a) ¿En que tubo se observa mayor cantidad de producto y por qué?b) ¿Dónde se observa mayor actividad enzimática y de que dependió la misma?c) En este sistema el aumento de actividad enzimática, ¿dependió de la cantidad de enzima?3- El sabor dulce del maíz recién cosechado es debido a la gran cantidad de azúcar de los granos.Varios días después de la cosecha el maíz no es tan dulce debido a que el 50% del azúcar libre seconvierte en almidón durante el primer día posterior a la cosecha. Para mantener el sabor dulcedel maíz recién cosechado se sumergen las espigas en agua hirviendo durante unos minutos,enfriándolo después con agua fría. El maíz procesado de este modo mantiene su dulzorperfectamente. Utilizando lo estudiado sobre enzimas, trate de explicar esta situación.4-¿Cómo se valora a través de un método colorimétrico la aparición de producto de unareacción enzimática y qué relación tiene con la actividad enzimática? 6

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