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Seminario molecular 2
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Seminario molecular 2

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papel de los ZnO en el desarrollo del cancer

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  • Macrófago de un ratón, BEAS-2B si eran humanas
  • Tail moment: la cola se obeserva en mayor cantidad con una concentracion de 20microgramos de ZnO
  • Los Ensayos metabólicos como tal no están correlacionados directamente con el número de células pues ese mismo número de células que son del mismo tipo  pueden tener  actividades metabólicas muy diferentes. diferentes entornos
  • Shp53 : p53 derribado WT p53: p53 funcionando normal
  • La apoptosis se disminuye en B por fallo de p53
  • Transcript

    • 1. <ul><li>Kee Woei Ng, Stella P.K. Khoo, et al. </li></ul>THE ROLE OF THE TUMOR SUPPRESSOR P53 PATHWAY IN THE CELLULAR DNA DAMAGE RESPONSE TO ZINC OXIDE NANOPARTICLES María José Álverez Natalia Zuleta Rendón Estudiantes 3° Semestre Medicina Universidad Pontificia Bolivariana 2011 http://www.aprea.com/home/content/view/21/75/
    • 2. INTRODUCTION <ul><li>Protein p53 </li></ul><ul><li>Is a DNA binding protein that responds to cellular damage. </li></ul><ul><li>Is found at low levels in the cell, but when there is damage level increases </li></ul>Texto adicional Texto adicional Texto adicional texto adicional Texto adicional texto adicional http://www.bioinf.org.uk/p53/
    • 3. <ul><li>It works producing proteins that stop the cell cycle for DNA repair mechanisms repair. </li></ul><ul><li>When damage is very big and irreparable, p53: by regulating transcription of genes that produce proteins to induce apoptosis and cell suicide. </li></ul>http://www.web-books.com/eLibrary/ON/B0/B9/47MB9.html
    • 4. <ul><li>Tumors </li></ul><ul><li>It is an abnormal mass of tissue. Tumors can be cancerous (malignant) or noncancerous (benign). </li></ul><ul><li>Tumors appear to occur when there is a problem with the division of cells in the body. Altering the balance of division and death of cells, can form a tumor. </li></ul>
    • 5.  
    • 6. <ul><li>Dna Damage </li></ul><ul><li>Changes in the DNA molecule leading to alterations in transcription and replication. These changes may be point mutations, insertions or deletions. </li></ul><ul><li>May be caused by: </li></ul><ul><li>Spontaneous mutations (replication) </li></ul><ul><li>Induced mutations(mutagens): physical or chemical agents that cause mutations; as reactive oxygen species, UV radiation and heat. </li></ul>http://www.disinfo.com/2010/12/los-alamos-scientist-tsa-scanners-shred-human-dna/
    • 7. <ul><li>Zinc oxide nanoparticles </li></ul><ul><li>Is an inorganic salt, often used in consumer products such as sunscreens and cosmetics. </li></ul><ul><li>It is believed to have genotoxic effects. </li></ul>
    • 8. SUPPRESSION OF p53 INDUCED BY ZnO Exposure to particles of ZnO entering the cell They produce   reactive oxygen species Nuclear  membrane cross causing damage to DNA p53 protein is activated If the damage is minor apoptosis occurs If the damage is severe there may be a tumor
    • 9. GENERAL AIM <ul><li>The deep understanding of whether the cellular DNA damage pathway, through tumor suppressor p53, is activated by ZnO nanoparticles . </li></ul>
    • 10. Materiales y métodos Método Material & fundamento Función DMEM*:high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Media FBS**: fetal bovine serum Caracterización de las nanopartículas de ZnO Nanopartículas preparadas en metanol y sometidas a ultrasonido. Observadas bajo microscopio de transmisión de electrones, medidas y dispersadas a un pH de 6 en soluciones coloidales. Para determinar el tamaño hidrodinámico, el índice de poli-dispersidad y el potencial zeta de las partículas Cultivo celular Células epiteliales bronquiales humanas, fibroblastos de prepucio neonatal y macrófagos de roedores, fueron cultivadas en DMEM*, suplementadas con FBS** 10%, L-glutamina 1% y antibiótico/antimicóticos FBS: usado en la producción de proteínas, anticuerpos monoclonales, enzimas. DMEM para estabilizar el medio de cultivo con aminoácidos y vitaminas.
    • 11. Método Material & fundamento Función BEAS-2B:Human bronchial epithelial cells BJ: human neonatal foreskin broblasts RAW264.7: murine macrophages DMEM: high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Empaquetamiento del retrovirus shp53 y transducción de las células BJ Células 2-239, por medio del fosfato de calcio, infectadas con plásmidos retrovirales codificados con shp53, o un vector de control vacío y lavadas con PBS. Células con virus almacenadas a -80 C. Células BJ de receptor ecotrópico guardadas en contenedores después de transducción. igual volumen de medio viral mezclado con medio de crecimiento de polibreno y añadido a las células. El calcio queda en el fondo y los fostatos quedan en la parte más alta del precipitado junto con el DNA. Exposición de las células a las nanopartículas Soluciones de nanopartículas de ZnO preparadas en PBS estériles, adicionadas al DMEM y 'sonicadas' para obtener las concentraciones deseadas de 5, 10, 15, 20, 25 µg/ml. Cultivo de BEAS-2B y RAW264.7 por 24H expuestas a nanopartículas. Células BJ cultivadas por 24 H en contacto con nanopartículas. BEAS-2B y RAW264.7: análisis de citotoxicidad Células BJ: estudios de genotoxicidad Células sonicadas y cultivadas en DMEM: control negativo.
    • 12. Método Material & Fundamento Función Proliferación celular y perfil metabólico las células tratadas con nanopartículas fueron lavadas en PBS, lisadas con tritón X-100 0.1% v/v en agua desionizada. Todo se mezcla por 30 min a 80 RPM. solución pico-green mezclada con las células lisadas, y todo incubado por 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Cuantificación de las cantidades de DNA. Picogreen: prepara los ejemplares lisados para la fluorescencia Lavado con PBS: para el análisis de los perfiles metabólicos de las células que interactuaron con las nanopartículas. los perfiles metabólicos relativos se obtienen comparando los niveles de absorbancia con los valores de DNA cuantificado por fluorescencia. Ensayo cometa células BEAS-2B sembradas e incubadas 16 H. Nanopartículas adicionadas e incubadas 4 h. Células lavadas con PBS, tripsina y mezcladas con agarosa en relación 1: 3. Suspensión célula-agarosa distribuida sobre una lámina de vidrio con agarosa pre-cubierta. Todo colocado en 1.2M NaCl, 100mM EDTA, 1% Tritón, 0.26M NaOH por 16h en oscuridad. Láminas lavadas y teñidas con verde SYBR. Almacenamiento por 16 H con las soluciones lisantes: para preparar la mezcla para electroforesis. verde SYBR: para observación bajo microscopio de fluorescencia y respectivo score.
    • 13. Método Material y fundamento Función SDS-PAGE*: electroforesis en gel de poliacrilamida Western blotting células lavadas con PBS, se les agrega 50µl de Buffer: (31.25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 12.5% glicerol, 0.05% ß-mercaptoetanol, 1% SDS, 0.005% azul bromofenol) Adición de inhibidores de proteasas y fosfatasas . almacenamiento en hielo, sonicación y centrifugación. sobrenadante analizado con kit de ensayos de proteínas y agente de compatibilidad con detergentes iónicos. muestras de 7µg de proteínas fueron calentadas antes del SDS-PAGE* usando geles de gradiente a 120 V, 90 min, electrotransferidas a membranas de nitrocelulosa. INMUNOBLOTTING: bloqueo de sitios inespecíficos con leche seca sin grasa filtrada en TBS-T. Las membranas fueron puestas en contacto con anticuerpos primarios diluidos en un buffer e incubados con agitación constante. después de lavados, fueron incubadas con anticuerpos secundarios conjugados con HRP. sonicación, buffer y detergentes iónicos: lisis celular centrifugación: Precipitación de restos celulares. Kit de ensayos: análisis de proteínas del sobrenadante.
    • 14. RESULTADOS <ul><li>Caracterización de ZnO </li></ul><ul><li>El diámetro de las nanopartículas: 22.5 - 4.9 nm, obtenidos de las mediciones de 50 nanopartículas. </li></ul><ul><li>Las nanopartículas de diferentes propiedades físico-químicas, tales como tamaño, forma y carga superficial puede ejercer diferentes efectos citotóxicos en las células. </li></ul>
    • 15. <ul><li>Citotoxicidad y la genotoxicidad de las nanopartículas de ZnO </li></ul>
    • 16.  
    • 17. <ul><li>El ensayo cometa muestra migración del DNA en la cavidad de agarosa lo cual comprueba el daño de éste. </li></ul>
    • 18. <ul><li>Efectos en la p53 </li></ul><ul><li>Se demostró una disminución de la función metabólica de las células BJ con respecto al grupo de control (sin ZnO). </li></ul><ul><li>Se cuantificó el DNA (ensayo PicoGreen) y se observó que el número de células disminuía a medida que se incrementaba la concentración de ZnO. </li></ul>
    • 19.  
    • 20. Microscopía electrónica que muestra la poca proliferación de células tras la exposición de 24h a ZnO.
    • 21. <ul><li>Papel de la p53 </li></ul><ul><li>A </li></ul>P53 responde al aumento de ZnO por lo cual lleva a la célula a un estado pre-apoptótico. <ul><li>B </li></ul>P53 no responde a aumento de Zno, debido a su fosforilación lo que disminuye su acción sobre el ciclo celular.
    • 22. <ul><li>El daño del DNA también pudo haber sido causado por incrementos de ROS inducidos por el ZnO, estos también son citotóxicos. </li></ul>http://circres.ahajournals.org/content/101/7.cover-expansion
    • 23. DISCUSSION Xia et. al [16]* salts and proteins could help in nanoparticle dispersion in an aqueous environment Yes Singh et. al [2] removal of structural defects from MWCNT was sufficient to substantially reduce their inflammatory response and overall toxicity. Yes Heng et.al [33]* 13.9% of BEAS-2B cells were found to have internalized the same spherical ZnO nanoparticles used here, introduced at 15 mg/ml, after 4 h incubation’’ Yes Brayner et. al * [34] decreased progressively due to stress induced by the presence of the nanoparticles in the culture medium. After contact with ZnO-TOPO nanoparticles, this decrease was followed by cell death. yes
    • 24. Heng et. al [14] * the high cell density monolayer was consistently more resistant to the cytotoxic effects of ZnO nanoparticles compared to the sparse monolayer for all four different cell types Yes Heng et. al [15] Hence, it is obvious that initial transient exposure of BEAS-2B cells to oxidative stress sensitized their sub- sequent response to cytotoxic challenge with ZnO nanoparticles Yes Xia et. al [16]* results demonstrate that metal oxide nanoparticles induce a range of biological responses that vary from cytotoxic to cytoprotective No mention of cytoprotection. Yuan et. al [17] The results indicated the obvious dose-effect cyto- toxicity relationship between all the ZnO NPs and HELF cells. In Yes
    • 25. Puzin et. al [35] * the number and variety of engineered nanoparticles will increase rapidly over the next few years, and there is a need for new methods to quickly test the potential toxicity of these materials. Yes Ng et. al [36]* Metabolic assays by themselves are not directly correlated with cell numbers since the same number of cells of the same cell type may have very different metabolic activities in different environments Yes Muller et. al [37]* Our study demonstrates that ZnO toxicity in HMMs is due to pH-triggered, intracellular release of ionic Zn 2+ rather than the high-aspect nature of the Cell death had features of necrosis, apoptosis, with mitochondria displaying severe structural changes Yes Xia et. al [38]* the dissolution of ZnO nanoparticles and Zn 2+ shedding leads to a series of sublethal and lethal toxicological responses at the cellular level that can be alleviated by iron doping. Yes
    • 26. Wätjen et. al [38] the mechanism of induction of apoptosis by zinc may involve calcium mobilization Yes Saji et. al [40]* Among the materials, dissolution of ZnO nanoparticles and Zn 2+ release were capable of ROS generation and activation of an integrated cytotoxic pathway that includes intracellular calcium flux, mitochondrial depolarization, and plasma membrane leakage. Yes Huan et. al [41]* The predictive toxicological approach is defined as establishing and using mechanisms and pathways of injury at a cellular and molecular level to prioritize screening for adverse biological effects and health outcomes in vivo Yes Schiestl et. al [42] * Although TiO 2 is chemically inert, TiO 2 nanoparticles can cause negative health effects, such as respiratory tract cancer in rats. Yes
    • 27. Osmond et. al [6] post-production processing and packaging, is the possibility that ZnO nanoparti- cles may be released incidentally as ‘dust’ or as aerosol droplets into the ambient air. Yes Borm et. al [43] The formation of large complex particles incorporating nano- scale components will need to be considered in the risk assessment for nanotechnology because they create a potential route for uptake of Nanoparticles and fibre Yes Nohynek et. al [44]* Vesicle materials do not penetrate into living human skin. Vesicle formulations may enhance or reduce skin absorption of ingredients, albeit at a limited scale Yes Mortensen et. al [45] Our findings raise concern that NP of similar size and surface chemistry, such as metal oxide NP found in sunscreens, may also penetrate UV damaged skin. Yes
    • 28. Korting et. al [46] Since inhibition of mitotic activity is linked to the atrophogenicity of topical corticosteroids, the results suggest that liposome encapsulation may improve the benefit-risk ratio in eczema Yes kocbek et. al [47]* Transmission electron microscopy images show NPs in vesicles within the cell cytoplasm. Keratinocyte alterations. Yes Geiser et. al [48] Uptake of ZnO nanoparticles may also occur via passive diffusion through the cell membrane into the cytoplasm Yes
    • 29. CONCLUSIONS <ul><li>This study is very important to the medical practice because  through this we can determine that generate particles damage the genetic material that can cause cancer. </li></ul><ul><li>This investigation proves once again the importance of p53 in cell cycle control. </li></ul>
    • 30. <ul><li>Some components of your commonly used products could induce cellular damage, so it’s important to know the composition of them. </li></ul><ul><li>Specifically ZnO nanoparticles can cause skin cancer because it induces DNA damage. </li></ul>
    • 31. MAPAS CONCEPTUALES Natalia Zuleta Rendón
    • 32.  
    • 33. BIBLIOGRAFÍA <ul><li>MARTINEZ SÁNCHEZ, Lina María. Biología molecular. 6. ed. Medellín: UPB. Fac. de Medicina, 2011. p 127-133 </li></ul><ul><li>http://www.adcis.net/es/Applications/SuccessStories/CometAssay.html </li></ul>

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