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Peraltro, in rare occasioni alcune cellule T attivate possono essere infettate mentre
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Questo è in parte dovuto al fatto che l’espressione del gene dell’HIV è
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Più appropriatamente, dovremmo usare una scala logaritmica, così da poter vedere
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Come menzionato, le sequenze del virus residuo nel plasma sono simili a quelle trovate nei depositi
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Cosa dire degli sforzi per eliminare i reservoir?
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Nei nostri studi, prendiamo cellule CD4+ T quiescenti e le convertiamo con il gene
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Persistenza Del Virus Hiv Nei Pazienti Sottoposti A Haart Valutazione Delle Prospettive Di Eradicazione V08

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Persistenza Del Virus Hiv Nei Pazienti Sottoposti A Haart Valutazione Delle Prospettive Di Eradicazione V08

  1. 1. Sono circa 11 anni da quando è stata introdotta la HAART, ossia la Terapia Antiretrovirale Altamente Attiva. L’impressionante riduzione della viremia sperimentata dai pazienti trattati con la HAART ci ha inizialmente portati a sperare che l’eradicazione completa dell’infezione potesse essere raggiunta con 2 o 3 anni di trattamento continuo. Invece, a oggi neanche una persona è stata curata, cioè è guarita, e le speranze iniziali per una cura hanno lasciato spazio a un pessimismo così profondo da rendere l’eradicazione quasi un tabù. Questa presentazione ha lo scopo di osservare obiettivamente i progressi che sono stati realizzati e i passi che sono ancora da fare per curare l’infezione da HIV. ### Good morning…………. I would like to first thank the organizers for the kind invitation to speak……….. It has now been 11 years since the introduction of Highly Active Antiretroviral Therapy, or HAART, was introduced. The dramatic reductions in viremia experienced by patients on HAART led initially to the hope that eradication of the infection could be achieved with 2-3 years of continuous treatment. However, to date not a single person has been cured, and the initial hopes for a cure have given way to a pessimism so profound that eradication is almost a taboo subject. What I would like to do today is to take an objective look at the steps we need to take in order to cure HIV infection and review the progress that has been made. 1
  2. 2. Ci sono tre passaggi da compiere. Anzitutto abbiamo bisogno di impedire al virus di replicarsi. Questo passaggio è essenziale, perché sottrae all’HIV la sua arma migliore, la sua capacità di evolversi. È difficile immaginare di avere successo in questa battaglia senza riuscire a fermare la replicazione. La strada è quella di usare la HAART per bloccare specifici passaggi nella replicazione del virus. In secondo luogo dobbiamo identificare tutti i depositi stabili (i cd. reservoir) che permettono alle forme non replicanti del virus di sopravvivere nel corpo umano. Infine, dobbiamo trovare un modo per eliminare ognuno di questi depositi. Vedremo ora i progressi verso ciascuno di questi obiettivi, concentrandoci sul primo e iniziando con qualche premessa generale. ### In my opinion, there are three steps. First we need to stop the virus from replicating. This step is essential because it takes away HIV’s best weapon, its ability to evolve. It is hard to see how we can succeed unless we can stop replication. The approach is to use HAART to block specific steps in virus replication. Second, we need to identify all of the stable reservoirs in which non- replicating forms of the virus persist in the body. Finally, we need to find a way to eliminate each of these reservoirs. So I will review progress towards each of these goals, concentrating in the first one. I’ll will begin with some general background. 2
  3. 3. Quando i pazienti iniziano il trattamento con una terapia HAART standard a tre farmaci, i livelli virali nel plasma crollano dalla situazione di equilibrio pre terapia verso un livello al di sotto dei limiti di identificabilità raggiunti dagli attuali esami clinici, ossia 50 molecole di HIV RNA/ml di plasma. Questa rapida riduzione della viremia riflette il fatto che le popolazioni di cellule infette responsabili della maggior parte della presenza del virus nel sangue hanno delle emivite molto brevi, nell’ordine dei giorni. Così, se la HAART impedisce nuovi cicli di infezione, le cellule precedentemente infettate moriranno con la conseguente riduzione della viremia. È stato così ipotizzato che tale processo di riduzione della viremia potesse continuare permettendo la completa e finale eradicazione dell’infezione. ### When patients start on a standard 3 drug HAART, plasma virus levels fall from the pre therapy steady state level all the way down to below the limit of detection of clinical assays – which is 50 molecules of HIV RNA/ ml of plasma. This rapid decay reflects that fact that the infected cell populations that produce most of the plasma virus have very short half lives, on the order of days. If we stop new rounds of infection with HAART, the previously infected cells die off and viremia decays. It was originally hypothesized that this decay would continue, allowing complete eventual eradication of the infection. 3
  4. 4. Nei pazienti che rispondono positivamente alla HAART, possiamo però osservare soltanto dei valori al di sotto del limite di identificabilità, sicché non sappiamo realmente se il processo di riduzione della viremia stia continuando o meno. In realtà, il processo di riduzione non continua indefinitamente, in parte a causa di un meccanismo unico di persistenza che sfrutta… ### Of course in a patient who is doing well on HAART, this is what we see, simply measurements that are below the limit of detection and so we don’t know whether decay is continuing or not. It turns out that decay does not continue, due in part to a unique mechanism of persistence that exploits … 4
  5. 5. … la normale fisiologia delle cellule CD4+ T. La maggior parte delle cellule CD4 nel corpo sono in uno stato di profonda quiete. Queste cellule inattive includono le cellule T naïve, che non hanno ancora risposto ad alcun antigene estraneo come invece le cellule T memoria, che hanno precedentemente partecipato a una risposta immunitaria. Le cellule naïve circolano attraverso i tessuti, in attesa di incontrare un antigene esterno che possano riconoscere. ### the normal physiology of CD4+ T cells. Most of the CD4 cells in the body are in a profoundly quiescent state. These resting cells include naïve T cells which have not yet responded to any foreign antigen as well as memory cells that have previously participated in an immune response. These cells circulate throughout the tissues awaiting encounter a foreign antigen that they can recognize. 5
  6. 6. Quando una di queste cellule incontra un antigene, essa diventa attivata e si divide, generando in questo modo una gran quantità di cellule effettrici con la stessa specificità. A conclusione della risposta immunitaria, molte di queste cellule muoiono, ma alcune sopravvivono e tornano nello stato di attesa come cellule T memoria. Queste cellule sopravvivono per un lungo periodo di tempo, anche per decenni, permettendo la futura risposta immunitaria agli stessi antigeni. ### When one of these cells encounters an antigen, it becomes activated and divides, ultimately generating lots of activated effector cells with the same specificity. At the conclusion of the immune response, many of these activated cells die, but some survive and return to a resting state as memory cells. These cells persist for long periods of time, decades in fact, allowing future responses to the same antigen. 6
  7. 7. Nell’infezione da HIV, il virus si replica principalmente nelle cellule T attivate, e tende ad ucciderle rapidamente. Esso non si replica invece con facilità nelle cellule quiescenti. ### In HIV infection, the virus replicates mainly in the activated cells and tends to kill them quickly. It does not replicate well in resting T cells 7
  8. 8. Peraltro, in rare occasioni alcune cellule T attivate possono essere infettate mentre stanno tornando allo stato di quiescenza. Questo dà luogo a una forma stabilmente integrata del genoma virale in una cellula T memoria a lunga attesa di vita. E, ciò che è particolarmente interessante, mentre la cellula subisce questo profondo cambiamento dallo stato di attivazione a quello di quiescenza, l’espressione del gene dell’HIV è disattivata. ### However, one rare occasions some of the activated T cells can become infected as they are in the process of returning to a resting state. This results in a stably integrated form of the viral genome in a long lived memory T cell. And what is particularly interesting is that as the cell undergoes this profound change from an activated to a resting state, HIV gene expression is turned off. 8
  9. 9. Questo è in parte dovuto al fatto che l’espressione del gene dell’HIV è pesantemente dipendente dal fattore di trascrizione NF-kB, il quale è escluso dal nucleo nelle cellule quiescenti. Perciò l’espressione del gene dell’HIV è automaticamente estinta quando la cellula torna allo stato di riposo. ### This is due in part to the fact that HIV gene expression is heavily dependent upon the host transcription factor NFkB which is excluded from the nucleus in resting cells. Thus HIV gene expression is automatically extinguished as the cells return to a resting state 9
  10. 10. Il risultato finale è una forma del genoma virale stabilmente integrata ma silente – o latente – in una cellula T memoria a lunga vita. Questo è un meccanismo perfetto per la persistenza del virus nell’organismo, esso infatti consente al virus di persistere essenzialmente come pura informazione, non colpita dalla risposta immunitaria né dai farmaci antiretrovirali. Se la cellula diverrà attivata in un futuro, essa potrà iniziare a produrre il virus. ### The end result is a stably integrated but silent or latent form of the viral genome in a long lived memory T cell. This is a perfect mechanism for viral persistence - it allows the virus to persist essentially as pure information, unaffected by immune responses or antiretroviral drugs. If the cell becomes activated in the future, it can begin to produce virus again. 10
  11. 11. Nel 1995 il gruppo di Siliciano ha sviluppato delle metodiche di analisi per individuare queste cellule infette latenti nei pazienti. È emerso che queste cellule sono presenti in ogni persona infettata dall’HIV, ma rare. Solo una cellula CD4+ T su un milione è portatrice di questa forma latente di HIV. Il problema, è che queste cellule sopravvivono nei pazienti in trattamento con HAART, come mostrato da Tony Fauci, Doug Richmond e dal loro gruppo nel 1997. Siliciano et coll. hanno misurato la velocità di decadimento di questi depositi latenti in pazienti che rispondono bene al trattamento con HAART. Come si può osservare, questo decadimento è estremamente rallentato. Osserviamo che la scala del tempo è espressa in anni, non giorni. I dati mostrati sono quelli rilevati attraverso misurazioni condotte su un gran numero di pazienti con una soppressione della viremia al di sotto delle 50 copie/ml per una durata di 7 anni. A questa velocità di decadenza, servirebbero 70 anni per “ripulire” questi depositi. ### In 1995, our group developed assays to detect these latently infected cells in patients. It turns out that they present in everybody with HIV infection, but are rare. Only one in a million resting CD4+ T cells carries this form of latent HIV. The PROBLEM is that these cells persist in patients on HAART as was shown by Tony Fauci, Doug Richmond and by our group in 1997. We have measured the decay rate of this latent reservoir in patients who have are doing well on HAART. As you can see, the decay is extremely slow. Note that the time scale is years, not days. Here are the actual data, representing measurements a large number of patients who have suppression of viremia to below 50 copies/ml for as long as 7 yrs. At this rate of decay, it would take 70 yrs to clear this reservoir/ 11
  12. 12. Sappiamo quindi che la HAART può ridurre i livelli plasmatici di virus libero al di sotto del limite di identificabilità. Ma sappiamo anche che il virus può persistere in depositi stabili latenti all’interno delle cellule CD4+ T quiescenti. Il successivo punto importante è che tutti i pazienti in trattamento con HAART sono attualmente viremici. Infatti, attraverso metodiche di speciale sensibilità, è possibile individuare le particelle libere di virus nel plasma dei pazienti in trattamento con HAART la cui carica virale è al di sotto del limite di identificabilità. Questa condizione è chiamata viremia residua. ### So, we know that HAART can reduce levels of FREE virus in the plasma to below the limit of detection. We also know that the virus can persist in a stable latent reservoir in resting CD4+ T cells. The next important point is that all patients on HAART are actually viremic. That is, with especially sensitive methods, it is possible to detect free virus particles in the plasma of patients on HAART whose viral loads are below the limit of detection. We call this residual viremia. 12
  13. 13. In altre parole, ciò che la HAART realmente fa è far crollare il livello del virus nel sangue a un nuovo livello che è leggermente al di sotto del limite di identificabilità offerto dalle attuali tecniche di esame. Questo è stato dimostrato per la prima volta da Roger Pomeranz e confermato da Sara Palmer e colleghi utilizzando una metodica di esame che può individuare una singola particella virale. La spiegazione comunemente data per questa viremia residua è che essa rifletta i cicli di replicazione in corso, che continuerebbe anche se a un livello minore a causa dell’effetto dei farmaci. Questo in realtà è uno scenario preoccupante, perché una replicazione in corso in presenza di farmaci potrebbe condurre all’emersione di resistenze e al fallimento terapeutico. Fortunatamente, è possibile proporre un’ipotesi alternativa. ### >>In other words, what HAART really does is to drop the level of virus in the blood down to a new plateau level that is a little bit below the limit of detection of current clinical assays. This was first shown by Roger Pomeranz and confirmed by Sara Palmer and colleagues using an assay that can detect a single virus particle. The explanation that is commonly given for this residual viremia is that is reflects ongoing cycles of viral replication that continue but at a lower level due to the effects of the drugs. This is a disturbing scenario because ongoing replication in the presence of drugs can lead to the evolution of resistance and treatment failure. Fortunately, there is an alternative hypothesis. 13
  14. 14. È opinione di Siliciano che, nella situazione ottimale, la HAART fermi la replicazione virale in corso e che la viremia residua sia dovuta al rilascio di virus dai depositi stabili nelle cellule a lunga sopravvivenza infettate prima dell’avvio della terapia. Per esempio le cellule T memoria che sono portatrici di HIV latente. È possibile immaginare che ogni giorno un piccolo numero di queste cellule divenga attivato e produca il virus. Questo virus non può infettare nuove cellule a causa dell’attività soppressiva condotta dai farmaci. Nondimeno, le particelle virali rilasciate da questi depositi possono essere individuate cpme HIV RNA nel plasma. Questa ipotesi è molto ottimistica, perché afferma che la HAART possa realmente fermare la replicazione del virus. Questa ipotesi propone diverse previsioni verificabili. ### We believe that in the optimal situation, HAART actually stops ongoing viral replication and that the residual viremia is due to the release of virus from stable reservoirs of long lived cells infected prior to the initiation of therapy. For example, the memory T cells that carry latent HIV. You can imagine that every day a small number of these cells become activated and produce virus. That virus cannot infect new cells because of the suppressive effects of the drugs. Nevertheless, the virus particles released from this reservoir can be detected as HIV RNA in the plasma. This is a much more optimistic hypotheis because is says that HAART can really stop the virus from replicating. This hypothesis makes several testable predictions. 14
  15. 15. Anzitutto, le particelle del virus nel plasma dovrebbero essere geneticamente simili a quelle ritrovabili nei depositi latenti. ### First, the virus particles in the plasma should be genetically similar to viruses in the latent reservoir. 15
  16. 16. Abbiamo in questa slide un albero filogenetico che mostra le sequenze di virus nei depositi latenti di un paziente in trattamento con HAART. Se aggiungiamo le sequenze che sono state individuate nel plasma utilizzando metodi estremamente sensibili possiamo osservare che i due set di sequenze sono filogeneticamente integrati e in alcuni casi identici, il che è coerente con l’idea che la viremia residua sia parzialmente derivata dal rilascio di virus da cellule infette latenti che divengono attivate. ### So here is a phylogenetic tree displaying the sequences of virus in the latent reservoir of a single patient on HAART. I will add the sequences we deteced in the plasma using extremely senstive sequencing methods. You can see that these two sets of sequences are phylogenetically intermingled and in some cases identical, consistent with the idea that the residual viremia is derived in part by release of virus from latently infected cells that become activated. 16
  17. 17. Una seconda previsione è che la viremia residua debba continuare anche senza evoluzione virale. Non dovremmo vedere né cambiamenti evolutivi né l’eventuale emersione di resistenze. Questo poiché i cicli completi di replicazione necessari per i cambiamenti evolutivi non ricorrono. ### A second prediction is that the residual viremia should continue without viral evolution. We should not see progressive evolutionary change in the residual plasma virus or the eventual appearance of resistance. This is because the complete cycles of replication necessary for evolutionary change are not occurring. 17
  18. 18. Come si può vedere, le sequenze plasmatiche, i triangoli colorati, non divergono dalle sequenze dei reservoir. Inoltre non contengono mutazioni farmaco resistenti. ### So as you can see, the plasma sequences, the colored triangles, have not diverged from the reservoir sequences. In addition they do not contain new drug resistance mutations. 18
  19. 19. Questa assenza di nuove mutazioni da resistenza è vera anche per il virus presente nel plasma durante i blip, elevazioni transitorie della viremia che molti pazienti sperimentano durante la HAART. I blip sono probabilmente un riflesso del fatto che ogni paziente durante la HAART è comunque viremico a causa del rilascio del virus dai reservoir, e che ci saranno inevitabilmente fluttuazioni statistiche e biologiche nel livello della viremia residua che possono essere occasionalmente catturate sotto forma di blip. ### This absence of new resistance mutations is also true for the virus present in the plasma during blips, the transient elevations in viremia that many patients on HAART experience. Blips are likely to be a reflection of the fact that everybody on HAART is viremic, due to release from stable reservoirs, and that there will inevitably be biological and statistical fluctuations in the level of residual viremia which can be occasionally captured as a blip,(11:46 read)(10:55) 19
  20. 20. Una terza ipotesi è che l’intensificazione della HAART non dovrebbe ridurre la viremia residua. Ossia, se aggiungessimo un quarto antiretrovirale a un regime HAART a tre farmaci… ### A third prediction is that intensification of HAART should not reduce the residual viremia. If we add a fourth antiretroviral drug to a 3 drug HAART regimen… 20
  21. 21. …non dovremmo vedere questo, perché non ci sono ulteriori cicli di replicazione in corso che il farmaco debba inibire ### we should NOT see this, because there are no more ongoing cycles of replication for the drug to inhibit. 21
  22. 22. Così, in collaborazione con Frank Maldarelli e John Coffin al NCI e John Mellors all’università di Pittsburg, abbiamo condotto uno studio di intensificazione. In questa slide, vediamo i risultati di un sottogruppo di pazienti trattati con un regime terapeutico basato su efavirenz (SUSTIVA®) e una forma potenziata del potente inibitore della proteasi atazanavir (REYATAZ®), aggiunto per 8 settimane. Prima dell’intensificazione, le cariche virali in questi pazienti erano mediamente tra 1 e 10 copie/ml, ben al di sotto del limite di identificabilità degli esami clinici, ma prontamente misurabili con un esame capace di individuare una singola copia sviluppato da Palmer e coll.. Possiamo osservare che, quando la forma potenziata di atazanavir veniva aggiunta non accadeva sostanzialmente nulla. In pratica, l’intensificazione non aveva effetti misurabili sulla viremia residua. E ciò è stato verificato in tutti e 15 i pazienti studiati, con tre diversi farmaci di intensificazione. ### So in collaboration with Frank Maldarelli and John Coffin at the NCI and John Mellors at the University of Pittsburg, we have carried out an intensification study. Here are the results from a subset of patients who were on efavirenz based regimen and had a boosted form of the potent protease inhibitor atazanavir added for 8 weeks. Prior to intensification, the viral loads in these patients averaged between 1 and 10 copies/ml, well below the limit of detection of the clinical assay but readily measurable with a single copy assay developed by Palmer and colleagues. This is what happens with boosted atazanavir is added. Basically NOTHING happens. And here are the levels after intensification. The result is that intensification has no measurable effect on residual viremia. This has been the case in all 15 patients we have studied and with 3 different intensification drugs. 22
  23. 23. Questo risultato, suggerisce con forza che la viremia residua derivi dal rilascio di virus dai reservoir. Non possiamo escludere un qualche contributo assolutamente minore proveniente da una attività replicativa in corso, ma chiaramente il problema maggiore è rappresentato dal rilascio a opera dei reservoir. Prima di passare al problema dei reservoir Siliciano descrive alcune nuove ricerche sulla farmacologia di base dei farmaci per l’HIV, che spiegano in maniera convincente come la HAART possa effettivamente fermare completamente la replicazione virale. ### This result strongly suggests that most of the residual viremia results from the release of virus from stable reservoirs. We cannot rule out some very minor contribution from ongoing replication to the residual viremia, but clearly release from stable reservoirs is the major problem. Before I turn to the problems of reservoirs, I want to describe some new research into the basic pharmacology of HIV drugs provides an a very compelling explanation for how HAART can actually stop all ongoing viral replication. 23
  24. 24. Questa è una ipotetica curva dose-risposta per un farmaco anti-HIV. Vediamo che la frazione di eventi infetti che resta non inibita diminuisce man mano che la concentrazione del farmaco cresce. Possiamo descrivere questa curva con una semplice equazione matematica, un’equazione che dice che l’ammontare dell’inibizione dipende da tre variabili: la dose D del farmaco, il parametro IC50 (una misura farmacologica standard della potenza di un farmaco) e l’esponente m, che misura il grado di inclinazione della curva dose-risposta. Questo parametro m di inclinazione è analogo al coefficiente di Hill, una misura di cooperatività nel legarsi di molecole multiple di un farmaco a un recettore multivalente. Poiché gli inibitori della trascrittasi inversa e quelli della proteasi si legano a un singolo sito sull’enzima target, questo parametro di inclinazione è generalmente stato ignorato e considerato come pari a 1 (il che lo espelle in pratica dall’equazione). Se il parametro m è maggiore di 1, allora la curva diventerà un po’ più ripida. ### This is a hypothetical dose response curve for an anti-HIV drug. The fraction of infected events that remain uninhibited decreases as the concentration of drug increases. We can describe this curve with a simple mathematical equation, I realize it is a little early in the morning for equations, but this one simply says that the amount of inhibition depends on three variables, the drug dose D, the IC50, a standard pharmacologic measure of drug potency, and the exponent m which is a measure of the steepness or slope of the dose response curve. This slope parameter is analogous to the Hill coefficient, a measure of cooperativity in the binding of multiple drug molecules to a multivalent receptor. Since the RT and protease inhibitors bind to a single site on the target enzyme, this slope parameter has generally been ignored or assumed to be equal to 1 (which makes it drop out of the equation). If the slope is greater than 1, the curve is simply a bit steeper. 24
  25. 25. Più appropriatamente, dovremmo usare una scala logaritmica, così da poter vedere le frazioni di riduzione degli eventi di infezione dal 100 al 10 all’1% e anche molto meno. Così, se tracciamo le STESSE curve dose-risposta della precedente diapositiva su questo tipo di grafico il risultato è molto sorprendente. Emerge che le curve di farmaci con differenti inclinazioni in realtà DIVERGONO IN MODO RADICALE nello spettro di concentrazione clinicamente rilevante, tale che farmaci con un maggiore valore di inclinazione provocano un livello di inibizione molto maggiore, nell’ordine di grandezze. Perciò abbiamo deciso di misurare il parametro di inclinazione dei farmaci antiretrovirali. ### Rather, we should use a log scale, so that we can see the fraction of successful infection events decrease from 100 to 10 to 1% and even much lower. So if we plot the SAME dose response curves from the previous slide on this kind of a plot, the result is very surprising. It turns out that the curves for drugs with different slopes actually DIVERGE DRAMATICALLY in the clinically relevant concentration range such that drugs with a higher slope value cause a much higher level of inhibition – by orders of magnitude. Therefore, we decided to measure the slope parameter for antiretroviral drugs. 25
  26. 26. Abbiamo usato questo esame per misurare il parametro di inclinazione per cinque differenti classi di farmaci antiretrovirali, attendendoci che l’inclinazione fosse pari a 1 per questi farmaci. Per gli Analoghi Nucleosidici Inibitori della Trascrittasi Inversa (NRTI), la pendenza era pari a 1 in ogni caso. Tuttavia, per gli Analoghi Non Nucleosidici Inibitori della Trascrittasi Inversa (NNRTI) la pendenza era di circa 1,7. Per gli Inibitori della Proteasi, questo parametro variava da 2 a 4,5. Per gli Inibitori della Fusione come T20 il grado di inclinazione era 1,7. Per cinque Inibitori dell’Integrasi strutturalmente diversi questo parametro era esattamente 1. Dal punto di vista meccanico, tutto ciò ha senso, se consideriamo che per le due classi di farmaci che mostrano un’inclinazione pari a 1, gli Analoghi Nucleosidici Inibitori della Trascrittasi Inversa (NRTI) e gli Inibitori dell’Integrasi, il target sia un complesso enzimatico per il quale c’è una sola copia rilevante per virus. All’opposto, molte copie dell’HIV proteasi sono simultaneamente coinvolte nella maturazione di una singola particella virale per una forma unica di cooperatività intermolecolare che è evidente in una curva dose-risposta ripida. Ora, si tratta di comprendere quale differenza questo comporti nel determinare l’efficacia dei singoli farmaci. ### We have used this assay to measure the slope parameter for five different classes of antiretroviral drugs, expecting that the slope would be one for these drugs. For the nucleaoside analoge RT inhibitors, the slope was 1 in every case. However, for the non-nucleoside RT inhibitors, the slope was about 1.7. For the protease inhibitors, the slope ranged from 2 up to 4.5. For the entry inhibitors like T20, the slope was 1.7. and for five structurally diverse integrase inhibitors, the slope was exactly 1. Mechanistically, this begins to make sense when we consider that for the two drug classes that show a slope of 1, the nucleoside analogue RT inhbitors and the integrase inhibitors, the target is an enzyme nuleic acid complex for which there is only one relevant copy per virus. In contrast, many copies of HIV protease are simultaneously involved in the maturation of a single virus particle allowing for a unique form of intermolecular cooperativity that is manifest in a steep dose response curve. Now what difference does this make in how well the drugs actually work. 26
  27. 27. Per rispondere a questa domanda, Lin Shen, uno studente del nostro laboratorio, ha sviluppato un semplice indice, chiamato “Potenziale Inibitorio Istantaneo” (IIP) che è semplicemente il numero di logaritmi, o riduzioni di dieci volte in un singolo ciclo di eventi di infezione provocate da un farmaco a concentrazione clinicamente rilevante. Ipotizziamo, per esempio, che ci siano due farmaci che potrebbero essere giudicati ugualmente potenti usando la misura standard IC50, ma con differenti inclinazioni (parametro “m”) Nell’ipotesi, il farmaco con un valore di inclinazione uguale a 1 provoca una riduzione di 100 volte (o 2 logaritmi) nell’infezione alla concentrazione Cmax, il picco della concentrazione plasmatica, e perciò il suo IIP è = 2. Sempre in questa ipotesi, il farmaco con un’inclinazione pari a 3 provoca invece una riduzione di 1 milione di volte( 6 logaritmi) nell’infettività, e avrà un IIP di 6. Perciò l’IIP cattura l’effetto radicale del parametro dell’inclinazione, portandolo in un indice che ha un significato intuitivo: è semplicemente il numero di grandezze (logaritmi) delle quali il farmaco riduce un ciclo di infezione. ### To answer this question, Lin Shen, a graduate student in our laboratory, developed a simple index called Instantaneous Inhibitory Potential which is simply the number of logs, or 10 fold reductions in single round of infection events caused by a drug at a clinically relevant concentration. So for example, here are two drugs that would be judged equally potent by the standard IC50 measure but with different slope values. The drug with a slope value of 1 causes a 100 fold or 2 log decrease in infection events at Cmax, the peak plasma concetration, and thus the IIP is = to 2 while a drug with a slope value of 3 causes a 1 million fold or six log reduction in infectivity and has an IIP of 6. Thus the IIP captures the dramatic effect of the slope parameter in an index that has intuitive meaning – it is simply the number of logs by which the drug inhibits a single round if infection. 27
  28. 28. Così, Lin ha misurato i valori di IIP di tutti i farmaci antiretrovirali attualmente utilizzati. Per gli analoghi nucleosidici (NRTI) il valore IIP spazia tra 1 e 4. Per gli inibitori non nucleosidici (NNRTI) questo valore varia tra 3 e 6. Per gli inibitori della proteasi (PI) il range è tra 2 e 10. Infine i valori più bassi sono osservati per gli inibitori della fusione (FI) e gli inibitori dell’integrasi (II). Forse, il risultato più notevole è quello che alcuni inibitori della proteasi (PI) possono produrre una riduzione di 10 grandezze (10 logaritmi) in un ciclo di infezione, ciò significa una riduzione di 10 miliardi di volte. Ora, non è così difficile da comprendere come la HAART possa fermare completamente i cicli di replicazione virale in corso. Difatti, con questo livello di inibizione, sarebbe sorprendente se la HAART non fermasse la replicazione in corso. Questo risultato spiega anche come mai i regimi terapeutici che hanno dato prova di maggiore efficacia in numerosi studi clinici contengano un NNRTI (inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa) o un PI (inibitore della proteasi). Sono queste classi di farmaci che hanno una straordinaria capacità di inibire la replicazione virale. Ora, per quanto la HAART abbia la capacità di bloccare completamente la replicazione virale, siamo rimasti con il problema di trovare ed eliminare i depositi del virus, i reservoir. ### So Lin has measured the IIP values for all of the current antiretroviral drugs. For the nucleoside analogues, the IIIP values range from 1 to 4. For the non-nucleoside RT inhibitors, the values go as high as 6, and for the protease inhibitors the IIP ranges from 2 up to 10. Lower values are seen for the entry and integrase inhibitors. Perhaps the most striking finding is that some of the protease inhibitors can produce a 10 log reduction in a single round of infection – that is a 10 billion fold reduction. Now it is not so hard to understand how HAART can completely stop ongoing cycles of replication. In fact, with this level of inhibition it would be suprising if HAART didn’t stop all ongoing replication. This result also provides, at long last, an explanation for why the antiretroviral drug regimens that have been proven to be the most effective in numerous clinical trials contain a NNRTI or a PI. These are the classes that have this extraordinary ability to inhibit viral replication. Now although HAART has the ability to completely block viral replication, we are left with the problem of finding and eliminating viral reservoirs. 28
  29. 29. Il nostro approccio è stato quello di esaminare la viremia residua che, come ora sappiamo, è originata dai reservoir, e provare a comprendere che natura abbiano queste cellule che continuano a produrre virus durante la HAART. ### Our approach has been to examine the residual viremia which, we now know, originates from these reservoirs, and try to deduce that nature of the cells that continue to produce virus during HAART> 29
  30. 30. Come menzionato, le sequenze del virus residuo nel plasma sono simili a quelle trovate nei depositi latenti, i reservoir. Cionondimeno, almeno in alcuni pazienti, la storia è più complessa. Questo è solo una parte dell’albero filogenetico di questo paziente. Qui c’è il resto dell’albero. Ciò che è particolarmente interessante è che in questo paziente la maggior parte delle sequenze del virus nel plasma sono identiche le une alle altre. In altre parole, le stesse sequenze esatte sono state isolate ripetutamente dal plasma in una pluralità di campioni indipendenti, indicati con colori differenti, lungo un periodo tre anni. In circa la metà dei pazienti studiati, abbiamo osservato che la viremia residua è dominata da un ristretto numero di cloni del virus. Questi cloni, non mostrano evidenza di una evoluzione delle sequenze nel tempo. Ancor più interessante, questi cloni non vengono ritrovati nelle cellule CD4+ T quiescenti, suggerendo quindi che provengano da un’altra fonte. Noi riteniamo che questo fenomeno rifletta la rara infezione di una cellula progenitrice, forse nella linea di un monocita macrofago che è capace di proliferare dopo l’infezione, in tal modo copiando il genoma virale senza errori nelle cellule da questo discendenti, che si differenziano e producono esattamente lo stesso virus durante la loro vita. L’idea che ci sia un secondo deposito maggiore per l’HIV, forse in una cellula con qualche capacità di auto rinnovamento è un’idea preoccupante, e questo fenomeno richiederà chiaramente maggiori ricerche. ### As I mentioned, sequences of the residual plasma virus are similar to those found in the latent reservoir. However, at least in some patients, the story is more complex. This is only part of the phylogenetic tree for this patient. Here is the rest of the tree. What is particularly interesting is that in this patient, most of the plasma virus sequences are identical to one another. In other words, the same exact sequence has been isolated repeatedly from the plasma in multiple independent samples, indicated by the different colors, over a 3 year period. In about half of the pateints studied we have seen that the residual viremia is dominated by a small number of viral clones. These clones do not show evidence of sequence evolution over time. Most interestingly, these clones are not found in resting CD4+ T cells, suggesting that they come from another source. We believe that this phenomenon reflects the rare infection of a progenitor cell, perhaps in the monocyte macrophage lineage, that is able to proliferate after infection, thereby copying the viral genome without error into progeny cells with differentiate and produce exactly the same virus for their normal lifespan. The notion that this is a second major reservoir for HIV, perhaps in a cell with some capacity for self renewal, is a disturbing one, and this phenomenon will clearly require more investigation. 30
  31. 31. Cosa dire degli sforzi per eliminare i reservoir? La maggior parte dei tentativi iniziali è stata centrata su agenti che inducessero l’attivazione cellulare, causando così l’emersione del virus HIV latente. Il problema di questi approcci però è che non sono selettivi e non si limitano alle cellule infette, ma attivano tutti i CD4 quiescenti, portando così alla produzione di citochine pro infiammatorie in una quantità tale da condurre a risultati di tossicità inaccettabile. La soluzione ideale del problema sarebbe di trovare agenti che riattivino l’HIV latente senza indurre una attivazione globale delle cellule T. Così facendo, i virus rilasciati non potrebbero infettare nuove cellule se il paziente rimanesse sotto trattamento con HAART, e noi potremmo sperare che le cellule infette muoiano come risultato dell’espressione del gene del virus o di un attacco del sistema immunitario. Sfortunatamente, questo agente farmacologico non c’è ancora. Ma possiamo trarre speranza dal fatto che diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato metodi per generare in vitro cellule latentemente infette da cellule T primarie. Questo ci offre un modello realistico che può essere usato per cercare farmaci che possano avere come obiettivo questi depositi nascosti. ### What about efforts to eliminate viral reservoirs. Most of the intial attempts have focused on agents that induce cellular activation and in the process turn on latent HIV. The problem inherent in these approaches is that they are not selective for infected cells, but rather activate all resting CD4 cells, leading to the production of proinflammatory cytokines in such large amounts that unacceptable toxicity results. The ideal solution to this problem would be to find agents that reactivate latent HIV without inducing global T cell activation. The viruses produced could not infect additional cells if the patient remained on a supressive HAART regimen and we would hope that the infected cells would die as a result of the virus gene expression or immune system attack. Unfortunately we do not have such an agent right now. But we can take hope from the fact that several groups have developed way to generate latently infected cells in the test tube from primary T cells. This provides a realistic model system which can be used to search for drugs that can target that latent reservoir. 31
  32. 32. Nei nostri studi, prendiamo cellule CD4+ T quiescenti e le convertiamo con il gene pro-sopravvivenza bcl-2. Possiamo quindi infettarle con una forma modificata e relativamente non citopatica di HIV in modo che esse sopravvivano abbastanza a lungo da tornare allo stato di infezione latente. A questo punto possiamo usare queste cellule per esaminare librerie di composti alla ricerca di agenti che riattivino il virus HIV latente. ### In our own studies, we take primary resting CD4+ T cells, transduce them with the pro-survival gene bcl-2. We can then infect with a modified and relatively non- cytopathic form of HIV and they will survive long enough to return to enter a latent state of infection. We can then use these cells to screen compound libraries for drugs that will reactivate latent HIV. 32
  33. 33. Così, per riassumere, suggerirei che, come risultato degli sforzi che migliaia di persone nelle università e nell’industria che hanno partecipato allo sviluppo della HAART, il primo passo è stato fatto. Sarebbe un errore concludere che siamo a un terzo della strada verso la scoperta di una cura perché il secondo e terzo passo sono verosimilmente molto difficili per quanto alcuni progressi siano stati fatti. Nondimeno, il fatto che gli attuali regini con la HAART possano fermare i cicli di replicazione in corso è estremamente significativo, poiché toglie all’HIV la principale arma che questo virus ha contro di noi, la sua abilità di mutare. Questo pone un importante sfida per tutti noi. Se la HAART può fermare la replicazione, allora il fallimento terapeutico non è inevitabile. Ciò significa che possiamo sviluppare forme dei farmaci usati nell’attuale HAART che siano sufficientemente non tossiche per essere prese per tutta la vita, e se possiamo rendere questi farmaci disponibili a ognuno a cui servono, allora possiamo offrire a tutti quelli che vivono attualmente con l’HIV la possibilità di una vita normale. Questa è la sfida. ### So to summarize, I would suggest that as a result of the efforts of literally thousands of people in academia and in industry who participated in the development of HAART, the first step has been accomplished. It would be a mistake to conclude that we are one third of the way to finding a cure because the second and third steps are likely to be very difficult although some progress has been made. Nevertheless, the fact that current HAART regimens can halt ongoing cycles of replication is extremely significant – it takes away the main weapon that HIV has against us, its ability to mutate. poses an important challenge for all of us. It HAART can stop virus replication, treatment failure is not inevitable. This means that if we can develop forms of the current HAART drugs that are sufficiently non-toxic to be taken for life, and if we can make these drugs available to everyone who needs them, then we can offer everyone who is currently living with HIV infection the change for a normal life. This is the challenge. Before I stop… 33
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  38. 38. [25:02][25:48][23:54][24:26}[25:12][26:10i][26:15i][28][25:40][23:57 with short intro and no description of andrews method]24:50 23:55 38

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