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Aula 2   métodos de estudo da célula
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Aula 2 métodos de estudo da célula

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  • 1. Métodos de estudo da célula
  • 2. Dimensões das estruturas celulares e subcelulares • Célula vegetal: ± 50µm • Célula animal: ± 10-20µm • Bactérias: ± 1-2µm • Vírus: ± 0,05µm• Vírus: ± 0,05µm • Núcleo: ± 3-6µm • Mitocôndrias: ± 0,5µm • Ribossomos: ± 25nm • Membrana: ± 10nm
  • 3. Como visualizar células e diferentes estruturas celulares?diferentes estruturas celulares?
  • 4. Métodos de investigação da estrutura celular Microscopia óptica (ou microscopia de luz) Descobrimento da célula e formulação da teoria celular Técnicas citoquímicasTécnicas citoquímicas Identificação e localização de diversas moléculas constituintes das células Microscopia eletrônica Grande poder de resolução; detalhes da estrutura celular Separação de organelas celulares
  • 5. Estudo celular em Microscopia Óptica MonoMono--ocularocular BinocularBinocular Múltiplos observadoresMúltiplos observadores
  • 6. Constituído de: parte mecânica + parte óptica (Lembra da prática?) Parte Óptica 3 sistemas de lentes Condensador projeta a luz sobre as células Objetiva recebe o cone de luz, projeta uma imagem aumentada Ocular recebe imagem da objetiva e amplia
  • 7. Limites de Resolução
  • 8. Estudo celular em Microscopia Óptica • Exames de tecido à fresco • Exame de tecidos mortos ou preservados • Problemas• Problemas – Células transparentes – Células pequenas e complexas • Visualização: coloração
  • 9. Estudo celular em Microscopia Óptica Exames de tecido à fresco • Corte fino ou transparente para ser posto na lâmina
  • 10. Estudo celular em Microscopia Exames de tecido à fresco • Espalhamento - células de mucosa bucal azul de metileno
  • 11. Estudo celular em Microscopia Exames de tecido à fresco • Esfregaço – células sanguíneas
  • 12. Estudo celular em Microscopia Exames de tecido à fresco • Esmagamento – cromossomos e núcleo em interfase
  • 13. Estudo celular em Microscopia CORTES HISTOLÓGICOS • Cortes extremamente finos para permitir a fixação na lâmina
  • 14. Estudo celular em Microscopia FIXAÇÃO E PREPARAÇÃO DE CORTES FIXAÇÃOFIXAÇÃO DEDE TECIDOSTECIDOS Formol,Formol, GlutaraldeídoGlutaraldeído,, MisturasMisturas fixadorasfixadoras...... PREPARAÇÃOPREPARAÇÃO DEDE CORTESCORTES HISTOLÓGICOSHISTOLÓGICOSPREPARAÇÃOPREPARAÇÃO DEDE CORTESCORTES HISTOLÓGICOSHISTOLÓGICOS CortesCortes dede tecidotecido DesidrataçãoDesidratação DiafanizaçãoDiafanização InfiltraçãoInfiltração // ImpregnaçãoImpregnação CortesCortes emem µµmm ColoraçãoColoração MontagemMontagem VisualizaçãoVisualização
  • 15. DesidrataçãoDesidratação DiafanizaçãoDiafanização InfiltraçãoInfiltraçãoFixaçãoFixação MicrotomiaMicrotomiaColoraçãoColoraçãoMontagemMontagem
  • 16. Fixação - promove a preservação das características morfológicas e macromoléculas dos tecidos ou células. • Função → impedir a autólise ou degradação bacteriana do material biológico a ser analisado • Facilitar os processamentos posteriores de coloração → muitos corantes apresentam maior afinidade pelo substrato fixado → promover o enrijecimento dos orgãos e tecidos. • Aumentar o contraste na microscopia eletrônica
  • 17. Fixadores → agentes químicos das mais diversas funções orgânicas; – Reagem quimicamente com os componentes celulares, promovendo a sua estabilização. – Principais componentes celulares que podem ser preservados → proteínas, ácidos nucléicos, polissacarídeos e lipídios → os fixadores atuam sobre estas macromoléculas tornando-as insolúveis.
  • 18. • Desidratação → retirada lenta de água • Bateria de álcool com concentrações crescentes: 70%, 80%, 90% e 100% → o tempo vai depender do material e do material de inclusão. • A água deve ser toda retirada por não ser missível em• A água deve ser toda retirada por não ser missível em XILOL ou em ÓLEO DE CEDRO → diafanização → clareamento do material • Inclusão em parafina → dar maior consistência ao material.
  • 19. • Microtomia → corte do material em micrótomo.
  • 20. Coloração para Microscopia Óptica • Corantes básicos ou catiônicos (+) - Liga-se a moléculas com carga (-) BASOFILIA → a estrutura corada é BASÓFILA Ex: Azul de Metileno, Azul de Toluidina, Hematoxilina, Orceína, lugol, Verde-janus B, violeta de genciana Núcleo → DNA e RNANúcleo → DNA e RNA Citoplasma → proteínas e carboidratos • Corantes ácidos ou aniônicos (-) - Liga-se a moléculas com carga (+) ACIDOFILIA → a estrutura corada é ACIDÓFILA Ex: Eosina, Ácido Periódico Schiff (PAS), ácido ósmico Citoplasma e núcleo → proteínas com carga (+) NEUTROS - Efeito tintorial sobre as estruturas que não revelam acidofilia nem basofilia. Ex: Vermelho neutro.
  • 21. Quanto ao papel fisiológico: VITAIS - Coram a célula sem determinar sua morte. Ex: Verde-janus B, azul de metileno, vermelho neutro, Sudan III. NÃO-VITAIS - Determinam a morte celular. Ex: Hematoxilina, eosina, lugol, Coloração para Microscopia Óptica NÃO-VITAIS - Determinam a morte celular. Ex: Hematoxilina, eosina, lugol, vermelho escarlate, violeta de genciana. Quanto às propriedades tintoriais: ORTOCROMÁTICOS - Conferem a célula a mesma cor que apresentam in vitro. Exemplos: Azul de metileno, verde-janus B, vermelho neutro. METACROMÁTICOS - Dão a célula coloração diferente da que apresentam in vitro. Exemplos: Laranja de acridina, tionina, azul de toluidina.
  • 22. Coloração para Microscopia de Fluorescência Envolve a aplicação de técnicas citoquímicas Reação com anticorpos ou corantes fluorescentescorantes fluorescentes Radiação ultravioleta como equivalente a fonte de luz em microscopia óptica
  • 23. Microscópio Eletrônico Potencial de aumento muito maior que o óptico Inventado em 1932 e vem sendo aperfeiçoado desde entãoentão Intervalo de aumento 1.000x a 200.000x. Poder de resolução = 1nm (200x maior que o MO)
  • 24. Microscópio Eletrônico • Feixes de elétrons ao invés de luz (óptica) No microscópio eletrônico não há lentes de cristal e sim bobinas, chamadas de lenteschamadas de lentes eletromagnéticas; • As lentes eletromagnéticas ampliam a imagem gerada pela passagem do feixe de elétrons no material e projetam-na sobre uma tela, onde é formada a imagem
  • 25. Obtenção dos cortes para M.E. + solução de sais de urânio e chumbo
  • 26. • Não é possível observar material vivo neste tipo de microscópio; • O material a ser estudado passa por um complexo processo: – Desidratação – Fixação– Fixação – Inclusão em resinas especiais (muito duras) – Cortes ultrafinos obtidos através das navalhas de vidro- ultramicrótomo;
  • 27. A imagem do objeto é formada simultaneamente à passagem do feixe de luz através dele. Bastante difundido no estudo de materiais biológicos, permite definição de imagens intracelulares, permitindo estudos de morfologia celular, aspectos gerais das organelas e também da interação de parasitas com células. •Tipos de microscópios eletrônicos: –Transmissão – MET - usado para a observação de cortes ultrafinos; –Varredura – MEV - capaz de produzir imagens de alta ampliação usado para a observação de superfícies;
  • 28. Fagocitose Célula animal
  • 29. Célula vegetal
  • 30. Cloroplasto Mitocôndrias Cloroplasto Complexo de Golgi
  • 31. Um feixe de elétrons bombardeia a superfície do material “varrendo-a”; então, elétrons secundários ou refletidos são utilizados para obter imagens tridimensionais. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) tridimensionais. Capaz de produzir imagens de alta ampliação e resolução aumentos 10x a 400.000x com grande profundidade de foco Poder de resolução de 10nm.
  • 32. As imagens fornecidas pelo MEV possuem um caráter virtual; O que é visualizado no monitor do aparelho é a transcodificação da energia emitida pelos elétrons, ao contrário da radiação de luz Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) contrário da radiação de luz A topografia de objetos sólidos pode ser examinada com grande facilidade, as micrografias têm aspecto tridimensional;
  • 33. Ataque de leveduras à Salmonella
  • 34. Diferentes formas de grãos de pólen
  • 35. MEV MET
  • 36. CENTRIFUGAÇÃOCENTRIFUGAÇÃO PermitePermite isolarisolar organelasorganelas dede homogeneizadoshomogeneizados celulares,celulares, parapara análisesanálises químicas,químicas, físicasfísicas ee biológicasbiológicas;; SEPARAÇÃO DE ORGANELAS CELULARESSEPARAÇÃO DE ORGANELAS CELULARES OO isolamentoisolamento dede umauma organelaorganela dependedepende dede:: -- seuseu coeficientecoeficiente dede sedimentaçãosedimentação;; -- densidadedensidade ee viscosidadeviscosidade dada soluçãosolução.. CentrifugaçãoCentrifugação FracionadaFracionada;; CentrifugaçãoCentrifugação ContraContra GradienteGradiente..
  • 37. Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc). células Homogeneização Material na fonte por ultra-som com detergente Vários métodos são possíveis para transformar células, órgãos, tecidos em um homogenado, ou extrato bruto, como mostra a figura. tecidos Homogeneização (para romper tecidos e células) por pressão (prensa francesa) liquefação (Potter) Homogenado ou Extrato bruto Material de partida
  • 38. Centrifugação FracionadaCentrifugação Fracionada
  • 39. Centrifugação Contra GradienteCentrifugação Contra Gradiente
  • 40. Cromatografia • Separação de macromoléculas, como proteínas e ácidos nucléicos • “Filtragem” de um macerado celular em uma matriz porosa, por meio da interação das macromoléculas com a matrizmacromoléculas com a matriz – Interação de Troca iônica: dependente de cargas – Interação hidrofóbica – Filtração em gel: dependente do tamanho e forma – Interação por afinidade: enzima-substrato ou antigeno-anticorpo.
  • 41. Cromatografia Matriz Tubos coletores
  • 42. CromatografiaCromatografia dede TrocaTroca IônicaIônica -A matriz da coluna cromatográfica é carregada + OU – - Proteínas ligam ao suporte por interação de carga.
  • 43. CromatografiaCromatografia dede InteraçãoInteração HidrofóbicaHidrofóbica - A matriz da coluna cromatográfica é composta por partículas com superfície hidrofóbica; - Proteínas hidrofóbicas interagem com o suporte e retardam sua passagem.
  • 44. CromatografiaCromatografia de Filtração em Gelde Filtração em Gel - A matriz da coluna cromatográfica é composta por partículas porosas, atuando como uma peneira para acomo uma peneira para a passagem de proteínas;
  • 45. CromatografiaCromatografia dede AfinidadeAfinidade - A matriz da coluna cromatográfica é composta por antígenos (ou substratos para enzimas) ligados; - Proteínas ligam ao suporte por bioafinidade e especificidade.
  • 46. Eletroforese DeterminaDetermina oo tamanhotamanho dasdas proteínasproteínas;; IdentificaIdentifica fragmentosfragmentos dede diferentesdiferentes tamanhostamanhos dede DNADNA clivadoclivado ouou sintetizadosintetizado..DNADNA clivadoclivado ouou sintetizadosintetizado.. SeparaçãoSeparação dasdas macromoléculasmacromoléculas porpor cargacarga (+(+ ouou --)) ee tamanhotamanho (do(do maiormaior parapara oo menor)menor)
  • 47. Proteínas de diferentes tamanhos e cargas Fragmentos de DNA de diferentes tamanhos
  • 48. -- HibridizaçãoHibridização exex situsitu
  • 49. Resumindo... Existem diversas formas de se explorar a célula: Ponto de vista morfológico: Microscopia óptica fluorescência eletrônica (transmissão e varredura) Ponto de vista das organelas e seus constituintes:Ponto de vista das organelas e seus constituintes: Centrifugação: isolamento de organelas fracionada e com gradiente Cromatografia: isolamento de macromoléculas Troca iônica Interação hidrofóbica Filtração em gel Afinidade Eletroforese: análise das macromoléculas

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