Check
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×
 

Check

on

  • 702 views

 

Statistics

Views

Total Views
702
Views on SlideShare
701
Embed Views
1

Actions

Likes
0
Downloads
1
Comments
0

1 Embed 1

http://www.slideshare.net 1

Accessibility

Categories

Upload Details

Uploaded via as Adobe PDF

Usage Rights

© All Rights Reserved

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Processing…
Post Comment
Edit your comment

Check Check Document Transcript

  • Chem. Listy 102, 269−273 (2008) Laboratorní přístroje a postupy LABORATORNÍ PŘÍSTROJE A POSTUPY PROTEÍNOVÉ ČIPY PRI ŠTÚDIU Mass Spectrometry)7 – rýchla a extrémne citlivá metóda, ktorá je schopná vytvoriť a porovnať proteínový profil EXPRESIE CYTOKÍNOV pacientov a zdravých jedincov a takto identifikovať viace- NA NÁDOROVOM MODELE − OPTI- ro navzájom korelujúcich biomarkerov. Citlivosť MALIZÁCIA PRÍPRAVY VZORIEK a výpovedná hodnota takejto analýzy potom umožňuje stanoviť diagnózou pre niektoré nádorové ochorenia tak- mer v 90 % (cit.8). JÁN STRNÁDELa,b, MILOSLAV KVERKAc, Výhody detekcie viacerých proteínov v rámci jedného HANA REISNEROVÁb, JANA HLUČILOVÁa, experimentu pomocou proteínových čipov je možné využí- DUŠAN USVALDa, DANIELA PLÁNSKÁa, vať aj bez nákladnej prístrojovej techniky (laserové ioni- PETR VÁŇAa, FRANTIŠEK JÍLEKb, LUCA začné zariadenie, hmotnostný spektrometer). Na trhu sa objavujú proteínové čipy, tvorené pevnou fázou [sklo, VANNUCCIa,c a VRATISLAV HORÁKa plast, PVDF (polyvinylidenfluorid) alebo nitrocelulózová a membrána] s naviazaným spektrom protilátok proti rozlič- Ústav živočišné fyziologie a genetiky Akademie věd České ným antigénom, prítomným v biologických vzorkách republiky, v.v.i., Rumburská 89, 277 21 Liběchov, b Česká (sérum, plazma, slzy, mozgomiešny mok, moč, tkanivový zemědělská univerzita v Praze, Kamýcká 129, 165 21 Pra- exudát, nádorové tkanivo)9. Protilátky proti jednotlivým ha 6, c Mikrobiologický ústav Akademie věd České repub- cytokínom sú viazané (imobilizované) na pevnú fázu ad- liky, v.v.i., Vídeňská 1083,142 20 Praha 4 sorpciou alebo pomocou chemickej väzby na dvoch neoplasma_9@post.sk (duplety), troch (triplety) prípadne aj štyroch miestach naraz. Súbor protilátok potom vytvára na povrchu pevnej Došlo 20.3.07, prijaté 27.9.07. fázy mapu, s presne lokalizovateľnou polohou naviazané- ho antigénu. Prítomnosť, či neprítomnosť antigénov vo vzorke sa detekuje pomocou zmesi sekundárnych protilá- Kľúčové slová: proteínové čipy, cytokíny, matricový tok, značených biotínom. Po inkubácii so streptavidín- efekt, mikroprostredie nádoru, sarkóm potkana Lewis peroxidázovým komplexom a následne s chromogénnym, či chemiluminiscenčným substrátom je možné detekovať signál vizuálne (pri použití chromogénneho substrátu) Úvod alebo pomocou expozície na fotografický film, či chemilu- miniscenčným detektorom. Rozdiel v expresii proteínov V období posledných desiatich rokov došlo k prudké- medzi vzorkami indikujú zmeny vo veľkosti a intenzite mu rozvoju metód, umožňujúcich štúdium expresie génov škvŕn (tzv.“spotov“) na definovaných miestach proteíno- a mapovanie génových mutácii pomocou tzv. „DNA či- vého čipu. Denzitometrická analýza pomocou rozličných pov“ na úrovni genómu1−3. Pozornosť biochemického, softvérových produktov napr.voľne dostupného programu biomedicínskeho a klinického výskumu sa však čoraz viac ImageJ (National Institute for Health, USA)10 umožňuje sústreďuje na štúdium proteínov alebo celkového proteíno- tieto zmeny porovnávať a semikvantitatívne hodnotiť. vého profilu – proteómu4. K realizácii informácie Existuje viacero modifikácií proteínových čipov – o zvýšenej expresii génov dochádza práve cez proteíny, usporiadanie využívajúce systém dvoch protilátok na imo- z nich niektoré majú potenciál stať sa biomarkermi pato- bilizáciu a detekciu antigénu (analógia so sendvičovým logických procesov napr. pri nádorových chorobách. Vý- usporiadaním protilátok v testoch ELISA) je označovaný skum na úrovni proteómu podnietilo aj poznanie, že zvý- ako „antibody array protein chip“. Medzi jeho výhody šená expresia génov v mnohých prípadoch nekoreluje so patrí citlivosť pre daný súbor antigénov, pohybujúca sa zvýšenou expresiou kódovaných proteínov5. Základnou v oblasti koncentrácií rádovo 10−12g ml−1. Citlivosť v tejto technikou proteomiky, používanou pri charakterizácii roz- oblasti, spolu s možnosťou sledovať zmeny v expresii dielov v expresii proteínov, stále zostáva dvojrozmerná viacerých proteínov v jednom experimente predurčuje gélová elektroforéza (2D PAGE). Niektoré nedostatky použitie metódy na detekciu malých signálnych proteíno- tejto metódy (časová náročnosť, problémy v reprodukcii vých modulátorov imunitného systému – cytokínov. výsledkov, nemožnosť prenosu výsledkov priamo do kli- Cytokíny sú hlavnými protagonistami v procese imu- nického testu) viedli k vývoji metód, založených napríklad nitnej odpovede na infekciu a nádor11. Fyziologicky sú na princípe dvojrozmernej HPLC chromatografie6, či prítomné a účinné už pri koncentráciách 10−12 g ml−1 krvi. hmotnostnej spektrometrie, kombinovanej s tzv. proteíno- Cytokíny nepôsobia jednotlivo, ale v kaskáde na seba na- vými čipmi. Príkladom je SELDI TOF-MS (Surface- vzájom nadväzujúcich interakcií. Zmena v expresii jedné- Enhanced Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight ho cytokínu indukuje zmeny v expresii ďalších cytokí- 269
  • Chem. Listy 102, 269−273 (2008) Laboratorní přístroje a postupy nov. Sledovať zmeny viacerých parametrov naraz je dôle- sérum zbavené krvného koláča opätovne centrifugovali pri žitým krokom k pochopeniu a vysvetleniu vzájomných rovnakých podmienkach. Ku vzorkám sme pridali azid interakcií v rámci zložitej cytokínovej siete. sodný vo finálnej koncentrácii 0,2−0,4 % na inhibíciu Použitie proteínových čipov na detekciu zmien aktivity endogénnych peroxidáz (koncentrácia azidu sod- v hladinách viacerých cytokínov v jednej vzorke je preto ného bola optimalizovaná na základe inhibičného efektu logické. Experimentátor sa pri práci s nimi môže stretnúť na aktivitu peroxidáz, určovanú meraním absorbancie s niektorými nežiadúcimi javmi, vyplývajúcimi zo samot- chromogénneho substrátu). Takto ošetrené sérum sme nej povahy vzoriek, z postupu ich izolácie a uskladnenia alikvotovali a uložili pri –80 °C až do analýzy. a z prítomnosti interferujúcich zložiek. Jedným z význam- ných nežiadúcich efektov je tzv. „matricový efekt“ (matrix Nádorové lyzáty effect), ktorý je definovaný ako súbor nežiadúcich inter- akcií zložiek vzorky, nepriaznivo ovplyvňujúcich detekciu V celkovej anestézii sme vykonali excíziu nádorov, analytu. V prípade metód založených na detekcii ktoré vznikli po podkožnej aplikácii buniek, izolovaných a kvantifikácii analytov pomocou protilátok je jedným zo sarkómu, objaveného na jednom jedincovi laboratórne- z najčastejšie sa uplatňujúcich efektov tzv. efekt proteíno- ho potkana línie Lewis12 na našom pracovisku. Vzorky vej matrice vzorky. Vo vzorke s vysokým obsahom proteí- s rozmermi 1×1×1 cm sme fixovali na korkovú podlož- nov dochádza k stérickej blokácii interakcie antigénov ku, následne celé zaliali kryoprotektívnym médiom (Jung s protilátkou, imobilizovanou na pevný povrch. Analyt je tissue freezing medium) a zmrazili v tekutom dusíku. Ná- prítomný, ale nedochádza k jeho interakcii s protilátkou. sledne sme ich preniesli a uschovali pri –80 °C alebo pria- Inkubácia na trepačke (kedy dochádza k premiešavaniu mo spracovali na sériové kryorezy hrúbky 8–10 µm (Leica vzorky), spolu s vhodným riedením vzorky (ktoré zníži CM 1850 cryocut) pri teplote –25 °C. Cca 100 kryorezov viskozitu, ale zároveň nenariedi analyt vo vzorke pod de- z každej vzorky sme preniesli do polypropylénovej skú- tekčnú hladinu metódy) môže pomôcť odstrániť tento mavky, v ktorej sme ich zaliali 1 ml vychladeného lyzač- problém, resp. ho minimalizovať. Optimálne riedenie vzo- ného pufru (50 mM Tris, pH 7,4, 250 mM NaCl, 5 mM riek, pri ktorom sa dosiahne najvyšší pomer signál/šum si EDTA, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1% Triton X-100, však musí pre každý typ vzorky určiť samotné pracovisko. Sigma). Tesne pred použitím sme do lyzačného pufru pri- Druhým významným nežiadúcim javom je prítomnosť dali zmes inhibítorov proteáz (Complete Protease Inhibitor endogénnych peroxidáz. Proces optimalizácie získavania, Tablets, Roche) a 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl prípravy a úpravy vzorky teda výrazne ovplyvňuje výsle- fluoride, Roche). Samotnú extrakciu proteínov sme usku- dok celého stanovenia a je kľúčovým krokom pri práci točnili pri 0 °C na ľade počas 30 min s občasným vortexo- s proteínovými čipmi. vaním vzorky. Následne sme extrakty centrifugovali Cieľom tejto práce je preto prezentovať optimalizova- 15 min pri 4 °C (12 000 × g). Táto procedúra viedla ný protokol na šetrnú extrakciu cytokínov z nádorového k prečisteniu vzorky. (V prípade použitia vzoriek melanó- tkaniva a úpravu vzoriek (nádorové lyzáty a séra) pred mov, napr. myšacej nádorovej línie B16 alebo vzoriek detekciou na proteínových čipoch typu „antibody array“. melanómov miniprasiat línie MeLiM, viedol tento postup Protokol vznikol na základe skúseností z Laboratoře biolo- k úplnému vyčíreniu vzorky a odstráneniu melanínu gie nádorů ÚŽFG v Liběchove a v spolupráci s MBÚ AV z pigmentovaných nádorov). ČR v Prahe. Lyzáty z niektorých nádorov možu byť značne hemo- ragické a vykazujú vysokú koncentráciu interferujúcich látok s peroxidázovou aktivitou. Keď sme k takémuto ly- Experimentálna časť zátu pokusne pridali chromogénny, prípadne chemilumi- niscenčný substrát pre peroxidázu, zaznamenali sme vyso- Metódou proteínových čipov sme mapovali expresiu ký signál (pre niektoré vzorky až 1,5–3,5 jednotiek absor- 19 cytokínov v krvnom sére a lyzátoch z nádorov bancie pri vlnovej dĺžke 450 nm pre TMB substrát). (sarkómov) na potkanoch línie Lewis. K odstráneniu tohto javu a inhibícii zložiek s endogénnou peroxidázovou aktivitou sme opätovne použili azid sodný Krvné sérum (0,8–1,5 %). Pred samotnou detekciou pomocou proteíno- vých čipov sme nádorové lyzáty ekvilibrovali t.j. upravili Krv na izoláciu séra sme pokusným zvieratám odobe- na rovnakú koncentráciu celkových proteínov v každej rali z chvostovej žily do polypropylénovej skúmavky vzorke. Celkovú koncentráciu proteínov sme stanovovali (skúmavky z polystyrénu nie sú vhodné kvôli adsorpcii pomocou kitu (BCA Protein assay kit, Pierce). Na základe proteínov na povrch skúmavky), množstvo odobranej krvi výsledkov sme vzorky upravili na rovnakú hodnotu kon- bolo cca 1,5 ml. Krv sme nechali vyzrážať 1 hodinu pri centrácie proteínov riedením pomocou vzorkového pufru, laboratórnej teplote. Hodinový interval postačuje na vý- priloženého ku každej sade proteínových čipov. Zvýšenie ťažnosť cca 0,4–0,7 ml séra z 1,5 ml krvi. Dlhšia doba signálu pre daný cytokín(y) v porovnaní s kontrolnou zrážania nie je potrebná, ani vhodná kvôli možnej degradá- vzorkou takto skutočne reflektuje vyššiu expresiu cyto- cii vzorky. Po centrifugácii (1100 × g, 4 °C, 10 min) sme kínov (analógia s ekvilibráciou vzoriek pri SDS-PAGE). 270
  • Chem. Listy 102, 269−273 (2008) Laboratorní přístroje a postupy Detekcia cytokínov roenviroment“). Veľmi dôležitým aspektom pri príprave vzorky je Na detekciu cytokínov v krvnom sére a nádorových optimálne riedenie − v komerčných ELISA kitoch lyzátov sme použili proteínové čipy firmy RayBiotech a uvedených proteínových čipoch sa doporučené riedenie (USA). Ide o produkt pod názvom „RayBio Rat Cytokine pohybuje v rozmedzí 2–10krát, nie je však univerzálne. Pri Antibody Array“. Sada obsahuje proteínové čipy, tvorené skúšaní vhodného riedenia vzorky je možné pozorovať nitrocelulózovou membránou s presne lokalizovanými paradoxný jav – so zvyšujúcim sa riedením sa zvyšuje oblasťami naviazaných protilátok proti 19 potkaním cyto- signál pre analyt až po určitý inflexný bod, kedy dochádza kínom. Každý cytokín detekuje protilátka na dvoch para- k poklesu signálu v dôsledku veľkého riedenia lelne pod sebou ležiacich miestach na čipe. Sadu ďalej a dosiahnutia podprahových hodnôt detekcie. Dáta, de- tvorí súbor pufrovacích roztokov na riedenie vzoriek monštrujúce efekt proteínovej matrice boli získané pomo- a premývanie medzi jednotlivými inkubáciami, zmes de- cou komerčného ELISA kitu na detekciu IFN-gamma tekčných protilátok značených biotínom a koncentrovaný (interferón gama) na spektrofotometri TECAN SUNRISE roztok komplexu streptavidín-chrenová peroxidáza. (Scholler) pri vlnovej dĺžke 450 nm, po zastavení reakcie Signál sme detekovali pomocou chemiluminiscenčné- 1 M H2SO4 (obr. 1). Absorbancia vzoriek je nižšia ako ho detektora LAS-1000, je možné ho však detekovať aj absorbancia prislúchajúca nulovej koncentrácii analytu expozíciou na film, podobne ako pri metóde SDS-PAGE. (koncentrácii 0 pg ml−1 v kalibračnej čiare). Tento zdanli- Obrazové súbory boli spracované pomocou programu Ima- vo nezmyselný výsledok je spôsobený vysokou koncen- geJ (National Institute for Health, USA)10, voľne dostup- tráciou proteínov vo vzorke, ktoré znemožňujú kontakt nom na Internete. antigénu s protilátkou a zároveň pôsobia ako blokačný roztok. Nešpecifická väzba sekundárnej protilátky, prípad- ne komplexu streptavidínu s peroxidázou na plast je potom Výsledky a diskusia nižšia, ako v prípade nulovej koncentrácie štandardu v kalibračnej čiare. S týmto javom sa často stretávajú pra- V práci uvádzame postup izolácie cytokínov z ná- coviská, používajúce metódu ELISA na detekciu dorov pomocou extrakcie z kryorezov. Táto metóda je a kvantifikáciu niektorých proteínov v biologických vzor- síce časovo náročnejšia ako bežné postupy s homoge- kách. V mnohých prípadoch môže byť efekt proteínovej nizátormi, na druhej strane však umožnuje šetrnejšie spra- matrice príčinou nepoužiteľnosti údajov, nameraných po- covanie vzorky, čo može mať vplyv na väčšiu výťažnosť mocou drahých ELISA detekčných súprav, rovnako ako cytokínov. Okrem toho je možné sériové rezy, pripravené „antibody array“ proteínových čipov. Vhodné riedenie z rovnakej oblasti nádoru, z akej sa pripravuje lyzát, histo- vzoriek je preto kľúčovým krokom pri detekcii cytokínov logicky spracovať a konkrétne cytokíny a bunky, ktoré ich pomocou týchto dvoch metód. Optimálne riedenie pre naše produkujú, detekovať aj imunofluorescenčne značenými vzorky séra bolo 1:8 (vzorka : vzorkový pufor), pre ná- protilátkami. Táto metóda teda umožňuje komplexne dorové lyzáty 1:7 (lyzát : vzorkový pufor). a detailne študovať mikroprostredie nádoru („tumour mic- Vzorky séra i lyzátu z nádorového tkaniva často vy- 0,30 1,5 A, 450 nm A, 450 nm 1,25 0,20 1 0,75 0,10 0,5 0,25 0,00 0 30 15 7,5 0 vz1 vz2 vz3 vz4 0 0,0125 0,025 0,05 0,1 0,2 0,4 azid sodný, % Obr. 1. Demonštrácia tzv. efektu proteínovej matrice (protein Obr. 2. Aktivita endogénnych peroxidáz a myeloperoxidáz vo matrix effect). Neriedené vzorky séra 1−4 vykazujú paradoxne vzorke séra potkana línie Lewis s indukovaným nádorom, nižšiu hodnotu absorbancie, ako je hodnota pre 0 pg ml−1 meraná pred pridaním (0 %) a po pridaní rôznych koncent- v kalibračnej čiare (zobrazené posledné štyri hodnoty). Namerané rácií azidu sodného. Dostatočný inhibičný účinok má azid sodný údaje sú z analýzy interferónu-gama pomocou metódy ELISA, v oblasti 0,2–0,4 %. Absorbancia meraná po zastavení reakcie pracujúcej na rovnakom princípe, ako proteínové čipy 1 M H2SO4 pri 450 nm 271 View slide
  • Chem. Listy 102, 269−273 (2008) Laboratorní přístroje a postupy kazujú vysokú aktivitu endogénnych peroxidáz a b a myeloperoxidáz. Ich prítomnosť vo vzorkách znižuje citlivosť detekcie antigénu zvýšovaním nešpecifického signálu pozadia a znížením pomeru signál/šum. „Cytokine antibody array“ proteínový čip rovnako ako ELISA a iné imunodetekčné techniky využívajú peroxidázové konjugá- ty na detekciu naviazaného antigénu. Prítomnosť zložiek s endogénnou peroxidázovou aktivitou vo vzorke je teda nežiadúca, pretože nepriaznivo ovplyvňuje samotné stano- venie. Prídavok azidu sodného vo vhodne zvolenej kon- centrácii môže pomôcť odstrániť tento problém. Testovali sme inhibičnú aktivitu azidu sodného na endogénne pero- xidázy pomocou merania zmien absorbancie pri 450 nm (substrátom, indikujúcim mieru aktivity peroxidáz bol TMB) pre rozličné koncentrácie azidu sodného. Optimálna Obr. 4. Porovnanie intenzity pozadia a pomeru signál/šum na dvoch vzorkách nádorových lyzátov na dvoch proteínových finálna koncentrácia azidu pre vzorky séra bola určená čipoch; a) s prídavkom azidu sodného (1,5 %), b) bez prídavku v rozsahu 0,2−0,4 %, pre nádorové lyzáty sa pohybovala azidu sodného. Obrázok invertovaný v programe ImageJ v rozmedzí 0,8−1,5 %. Ďalšie zvyšovanie koncentrácie azidu sodného, pridávaného do vzoriek, nie je žiadúce, pretože pri nedokonalom premytí počas analýzy na proteí- a b novom čipe hrozí inhibícia detekčnej peroxidázy. Na do- siahnutie požadovanej koncentrácie sme azid sodný pridá- vali do vzoriek zo zásobného 20% roztoku. Pre ilustráciu je prítomnosť endogénnych peroxidáz (detekovaná prídav- kom chromogénneho substrátu pre peroxidázu – TMB) a následná inhibícia ich aktivity pomocou azidu sodného uvedená na obr. 2 a obr. 3. Ako pridanie azidu sodného vo vhodnej koncentrácii ovplyvní výsledok stanovenia pomo- cou proteínového čipu je markantné z obr. 4. Po prevedení intenzít signálu vzoriek, pozitívnych kontrol a pozadia do formátu 3D píkov je táto situácia ešte zretelnejšia (obr. 5). Použitie azidu sodného v uvedených nízkych koncentrá- ciách je výhodné aj kvôli jeho konzervačným účinkom na vzorky (bežne sa používa na konzervovanie protilátok a štandardných proteínov). Obr. 5. 3D mapa dvoch proteínových čipov s vyobrazenými píkmi intenzít signálov pre jednotlivé cytokíny. Vzorka na 1 proteínovom čipe „b“ má zreteľne vyššie pozadie (nešpecifický A, 450 nm signál), oproti situácii pozorovanej na čipe „a“, kde sa na detek- ciu použila vzorka (lyzát z nádoru), ošetrená prídavkom azidu 0,75 sodného (1,5%). Spracované v programe ImageJ Záver 0,5 V tejto práci prezentujeme optimalizáciu prípravy 0,25 vzoriek séra a nádorových lyzátov na štúdium cytokínov pomocou techniky „antibody array“ proteínových čipov. S ohľadom na možnú degradáciu cytokínov vo vzorkách 0 nádorov sme navrhli postup ich izolácie priamo 0 0,025 0,1 0,2 0,4 0,8 1,5 z kryorezov pri zníženej teplote počas celej extrakcie. Po- azid sodný, % mocou údajov, získaných technikou ELISA, pracujúcou na rovnakom princípe ako „antibody array“ čip, sme demon- Obr. 3. Inhibičný účinok azidu sodného na endogénne peroxi- štrovali efekt proteínovej matrice vzorky, ktorý nepriaznivo dázy a myeloperoxidázy v nádorovom lyzáte, meraný na zá- ovplyvňuje samotné stanovenie cytokínov vo vzorkách klade poklesu absorbancie chromogénneho substrátu pre s vysokým obsahom proteínov. Dokázanú prítomnosť endo- peroxidázu (TMB). Dostatočná inhibičná koncentrácia azidu génnych peroxidáz a látok s peroxidázovou aktivitou vo bola v oblasti 0,8–1,5 % vzorkách sme inhibovali prídavkom azidu sodného vo vhod- ne zvolených (po sérii titrácií) koncentráciách. 272 View slide
  • Chem. Listy 102, 269−273 (2008) Laboratorní přístroje a postupy Proteínové čipy v usporiadaní „cytokine antibody 10. http://rsb.info.nih.gov/ij/ , stiahnuté 13.3. 2007. array“ predstavujú techniku, vhodnú na multiparametrovú 11. Dranoff G.: Nat.. Rev. Cancer 4, 11 (2004). analýzu niektorých cytokínov, uplatňujúcich sa v rôznych 12. Morávková A., Málek O., Pokorná E., Strnádel J., fyziologických i patologických procesoch. Laboratoř bio- Hradecký K., Horák, V.: Folia Biol. (Praha) 51, 159 logie nádorů ÚŽFG AV ČR, v.v.i. v Liběchove využíva (2005). túto techniku na štúdium interakcie sarkómových buniek s imunitným systémom počas progresie a pri spontánnej regresii nádorov u potkanov línie Lewis. J. Strnádela,b, M. Kverkac, H. Reisnerováb, J. Hlučilováa, D. Usvalda, D. Plánskáa, P. Váňaa, Táto práca vznikla s podporou grantov GAČR F. Jílekb, L. Vannuccia,c and V. Horáka (a Institute of 524/04/0102, 523/03/H076 a 310/03/H147, GA AV ČR Animal Physiology and Genetics, Academy of Sciences of IAA600450601 a IAA500200510, Výzkumného záměru the Czech Republic, Liběchov, b Czech University of Life ÚŽFG AV ČR v. v. i. č. AV OZ50450515, č. AV Sciences, Prague, c Institute of Microbiology, Academy of OZ50200510, MSM 6046070901 a NPVII 2B06130. Sciences of the Czech Republic, Prague): Protein Chips in Cytokine Expression Study on Tumour Model: Opti- Zoznam použitých skratiek malization of Sample Preparation 2D PAGE two-dimensional polyacrylamide gel elec- Background and Objectives trophoresis (dvojrozmerná gélová elektro- Two-dimensional SDS PAGE (sodium dodecyl sul- foréza) fate polyacrylamidegel electrophoresis) coupled with MeLiM Melanoma-bearing Libechov Minipigs mass spectrometry is still a mainstream approach to ana- (melanóm nesúce miniprasiatka z Libě- lysing multiple protein expression levels. The requirement chova) for some sophisticated devices and the lack of quantitative PVDF polyvinylidenfluorid measurements for low-abundant proteins (e.g. cytokines) SDS PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel greatly limit its broad application. Cytokines present in the electrophoresis (SDS gélová elektroforéza) pg/ml levels in non-stimulated biological samples are tra- TMB tetramethyl benzidine (tetrametylbenzidín) ditionally detected by ELISA. We used a cytokine anti- body array, a highly sensitive protein chip, for simultane- ous detection of multiple cytokine expression levels in rat LITERATÚRA sarcoma lysates and serum samples . 1. Schena M., Shalon D., Davis R. W., Brown P. O.: Science 270, 467 (1995). Material and methods 2. Lockhart D. J., Winzeler E. A.: Nature 405, 827 We present here an optimized protocol for preparation (2000). and handling of tumour tissue lysates in protein chip detec- 3. Shyamsundar R., Kim Y. H., Higgins J. P., Montgo- tion. The sarcoma samples were processed at low tempera- mery K., Jorden M., Sethuraman A., van de Rijn M., tures to prevent cytokine degradation. Tumour cryosec- Botstein D., Brown P. O., Pollack J. R.: Genome Biol. tions (8–10 mm) were used for extraction of cytokines. 6, 404 (2005). The addition of NaN3 destroyed a high endogenous peroxi- 4. Srinivas P. R., Verma M., Zhao Y., Srivastava S.: dase activity, which may interfere with protein chip assay Clin. Chem. 48, 1160 (2002). and decrease the signal/noise ratio. The data for the protein 5. Varambally S., Yu J., Laxman B., Rhodes D. R., Meh- matrix effect from sandwich ELISA can also affect the ra R., Tomlins S. A., Shah R. B., Chandran U., Mon- protein chip detection. The optimal dilution of samples zon F. A., Becich M. J., Wei J. T., Pienta K. J., Ghosh must be found to prevent pitfalls due to the non-optimal D., Rubin M. A., Chinnaiyan A. M.: Cancer Cell 8, signal-to-noise ratio. This also enables recovery of low 393 (2005). amounts of cytokines from difficult samples. 6. Skalníková H., Kovářová H., Moos J., Filová V., Ha- lada P.: Chem. Listy 99, 952 (2005). Results 7. Issaq H. J., Veenstra T., Conrads T. P., Felschow D.: We report optimized procedures for extraction, sam- Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 587 (2002). ple handling, inhibition of endogenous peroxidase activity 8. Bhattacharyya S., Siegel E. R., Petersen G. M., Chari and prevention of the protein matrix effect in serum and S. T., Suva L. J., Haun R. S.: Neoplasia 6, 674 (2004). tumour lysates by detection of cytokine expression using 9. Haab B. B.: Mol. Cell. Proteomics 4, 377 (2005). the cytokine antibody array protein chip. 273