Encuentro de Seguridad Alimentaria y Nutrición

  5º aniversario de la creación de la AESAN

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Microbiota Intestinal




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Microbiota Intestinal: Localización

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Microbiota Intestinal: Funciones



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                                         Ilja Metchnikoff




        “ Desde tiempos ...
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                                         Ilja Metchnikoff




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                          Ilja Metchnikoff
Fisiología de las bacterias comensales

FUNCION DE LA MICROBIOTA


• Función nutritiva
• Función trófica
• Prevención de i...
Fisiología de las bacterias comensales

 Protección frente a Infecciones
  • Competencia de unión

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FUNCIÓN INMUNOMODULADORA




  Producción metabolitos inmunomoduladores


  Inmunoactividad de los componentes bacterianos...
El Sistema Inmunitario Intestinal




GALT/NALT:

80% de los linfocitos
50% del total de Inmunoglobulinas
90% del total de...
Flora Intestinal

     * 10% Hombre/90% bacteria
     * 1014 células procariotas
     * > 400 especies distintas
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Probióticos
Probióticos

• Metchnikoff 1902       consumo leches fermentadas)
• Moro 1900; Beijerinck 1901; Cahn 1901; Cohendy 1906;
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Probiótico




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Probiótico
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Efectos beneficiosos

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Probióticos
Mercado

 Según el informe de Frost and Sullivan (2003) el valor del mercado de prebióticos en EEUU está
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Selección de bacterias probióticas




  Criterios fundamentales:
     • Correcta identificación al nivel de cepa
     • C...
Selección de bacterias probióticas
 I+D, regulación, producción y comercialización
Elementos clave




           • Seguridad
           • Eficacia
           • Estabilidad
Seguridad (antecedentes)



• Normativa aplicable al empleo de cultivos microbianos varía, en el
caso de que exista, depen...
Seguridad (antecedentes)



 • Regulación Europea de Nuevos Alimentos (258/97 UE) incluye
 “alimentos o ingredientes alime...
QPS: Presunción de seguridad cualificada

                    2002




Ventajas:
   • Marco legal unificado UE
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QPS: Presunción de seguridad cualificada
2003: EFSA responsable evaluación seguridad alimentos
2003: EFSA responsable evaluación seguridad alimentos
Seguridad
Seguridad
Seguridad
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QPS
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Seguridad
Evaluación
  1.- Género, especie, cepa
     • Técnicas tradicionales:
        • medios selectivos
        • patrones de fe...
Evaluación
Tipaje de cepas
    Amplificación al azar de DNA polimórfico (RAPD)
          - Perfiles eelectroforéticos que ...
Evaluación
Tipaje de cepas
    Electroforesis en campo de pulso (PFGE)
Evaluación

    2. Tests in vitro potencial probiótico

      Resistencia acidez gátrica
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      Resistencia sales biliare...
Seguridad
 • Determinar las propiedades intrinsecas de bacterias y
 cepas (factores de adhesión, degradación de mucinas,
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Seguridad

Especie                           DL50 (g/kg peso)
Streptococcus faecium AD1050            >6.6
Streptococcus e...
Eficacia (Ensayos humanos)

     Fase 1: Seguridad
•
     Fase 2: Eficacia-doble ciego (efectos adversos,
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Alegaciones de salud y etiquetado

    Género, especie y cepa
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    Número mínimo de viables de cada cepa a final de la
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A A A14[1] probióticos

  1. 1. Encuentro de Seguridad Alimentaria y Nutrición 5º aniversario de la creación de la AESAN Evaluación de la seguridad y eficacia de cepas probióticas con destino a la alimentación humana. Probióticos aislados de la leche materna Julio Boza Santander 11 Septiembre 2007
  2. 2. Microbiota Intestinal Hombre Microbiota 1014 1013 Nº Células >400 Especies 1 2 Kg Peso 70 Kg Cerebro 1.3 Kg Corazón 0.6 Kg 10% Hombre/90% Bacteria
  3. 3. Microbiota Intestinal: Localización Localización anatómica nºbacterias/g tejido Principales microorganismos PIEL * 2x105 Frente Staphilococcus epidermidis, Staphilococcus epidermidis, 6 2,4x10 Axila Corynebacterum, Acinetobacter calcoaceticus 2 3,1x10 Espalda S.epidermidis, Corynebacterium, Malassezia furfur 2 1x10 Antebrazo Dedos del pie Brevibacterium epidermidis Folículos capilares Demodex folliculorum Ingles Acinetobacter calcoaceticus T. REPIRATORIO Pulmones y bronquios 0 Esteriles 7 8 10 -10 Fosas nasales S.epidermidis, S. Aureus, Corynebacterium,Propionibacterium 106-107 Nasofaringe Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae,Neisseria Streptococcus spp, 106-107 Orofaringe Mycoplasma salivarum,M.orale Haemophylus parainfluenzae T. GASTROINTESTINAL Cavidad oral 8 7x10 Saliva Streptococcus salivarius, S,sanguis, S.mutans,S.mitior,Lactobacillus Dientes Streptococcus,Lactobacillus Corinebacterium,Propionibacterium Streptococcus,filamentosas G+, Encias Treponema,Haemophilus,Neisseria, Eikenella Esofago ? No evidencias de una flora común en humanos 4 1x10 Estomago y los 2 primeros Lactobacillus, Streptococcus, tercios del I.delagado (Helicobacter pylori) Lactobacillus,Enterococcus 1x108 Ileon Enterobacterias(E.coli),Bacteroides, Veillonella,Clostridium E.coli,Bacteroides,Bifidobacterium, 1010-1012 Colon Peptostreptococcus,Clostridium Bacillus,Eubacterium,Fusobacterium Enterococcus T. UROGENITAL 5 1x10 Uretra distal E.coli,Lactobacillus,Staphilococci Mucosa genital Mycobacterium smegmatis 8 1x10 Vagina entre pubertad y Lactobacillus menopausia Corynebacterium,Gardnerella vaginalis Peptococcus,E.coli 8 1x10 Vagina antes de pubertad Streptococcus,Staphilococcus y tras menopausia 1x103-1x105 LECHE MATERNA Staphylococcus,Streptococcus, Lactobacillus,Enterococcus
  4. 4. Microbiota Intestinal: Funciones Microbiota Hombre 1014 1013 Nº Células >400 Especies 1 2 Kg Peso 70 Kg Cerebro 1.3 Kg Corazón 0.6 Kg 10% Hombre/90% Bacteria Tienen alguna función?
  5. 5. Microbiota Intestinal: Funciones Ilja Metchnikoff “ Desde tiempos inmemoriales, los hombres han asimilado cantidades de bacterias de ácido láctico en forma de productos alimenticios - como leche agria, kefir o col fermentada - sometidos a un proceso de fermentación antes de ser consumidos en estado crudo. Con ello, sin saberlo,han mitigado las nocivas consecuencias del proceso de putrefacción en el organismo “. (L’immunité dans les maladies infectiouses) 1902- Los caucasianos vivían más tiempo Consumo de leches fermentadas
  6. 6. Microbiota Intestinal: Funciones Ilja Metchnikoff “ Desde tiempos inmemoriales, los hombres han asimilado cantidades de bacterias de ácido láctico en forma de productos alimenticios - como leche agria, kefir o col fermentada - sometidos a un proceso de fermentación antes de ser consumidos en estado crudo. Con ello, sin saberlo,han mitigado las nocivas consecuencias del proceso de putrefacción en el organismo “. (L’immunité dans les maladies infectiouses) 1902- Los caucasianos vivían más tiempo Consumo de leches fermentadas
  7. 7. Microbiota Intestinal: Funciones Ilja Metchnikoff
  8. 8. Fisiología de las bacterias comensales FUNCION DE LA MICROBIOTA • Función nutritiva • Función trófica • Prevención de infecciones • Inmunomodulación
  9. 9. Fisiología de las bacterias comensales Protección frente a Infecciones • Competencia de unión • Interacciones metabólicas • Competencia por nutrientes • Producción de sustancias antimicrobianas Enterocito Muco
  10. 10. FUNCIÓN INMUNOMODULADORA Producción metabolitos inmunomoduladores Inmunoactividad de los componentes bacterianos Interacción con el Epitelio Intestinal (regulación génica)
  11. 11. El Sistema Inmunitario Intestinal GALT/NALT: 80% de los linfocitos 50% del total de Inmunoglobulinas 90% del total de Ig A 95-99% de Antígenos extraños
  12. 12. Flora Intestinal * 10% Hombre/90% bacteria * 1014 células procariotas * > 400 especies distintas * 70.000 genes procariotas Tiene algún efecto beneficioso para la salud humana? Se puede modular?
  13. 13. Probióticos
  14. 14. Probióticos • Metchnikoff 1902 consumo leches fermentadas) • Moro 1900; Beijerinck 1901; Cahn 1901; Cohendy 1906; Tissier 1906) Infecciones intestinales • Isaac Carasso (1919) • Fabricación comercial yogur • Farmacia y con receta médica • Prevención y alivio trastornos muy diversos (diarrea, estreñimiento, dispepsia, colitis, colitis ulcerosa, cistitis, dermatitis, etc) •Vergio (1957) “ probiotika ”
  15. 15. Probiótico “Live microorganisms which when administered in adequate amounts confer a health benefit on the host”
  16. 16. Probiótico Probiótico: “Live microorganisms which when administered in adequate amounts confer a health benefit on the host” - Viable (producto) - Conocido - Cantidad suficiente (caducidad) - Colonización del intestino (digestión) - Efectos beneficiosos
  17. 17. Efectos beneficiosos Ampliamente demostrados Diarrea por antibióticos (Clostridium difficile) Diarrea por rotavirus Diarrea por quimioterapia Diarrea del viajero Estimulación del Sistema Inmunitario Reducción metabolitos tóxicos en colon Con evidencias Infecciones por Helicobacter pylori u otras Reducción síntomas alérgicos Prevención de cáncer Absorción de minerales (Ca ) Producción de enzimas (ß-galactosidasa)
  18. 18. Probióticos
  19. 19. Mercado Según el informe de Frost and Sullivan (2003) el valor del mercado de prebióticos en EEUU está cifrado para el 2003 en 143.9 millones de $, mientras que en Europa sería de 40.3 millones de $ con una proyección muy alta alcanzando valores de más de 400 millones de $ en EEUU para el 2010.
  20. 20. Mercado
  21. 21. Selección de bacterias probióticas Criterios fundamentales: • Correcta identificación al nivel de cepa • Capacidad para llegar viable y en nº suficiente a su lugar de acción • Seguridad • Efectividad real mediante ensayos clínicos
  22. 22. Selección de bacterias probióticas I+D, regulación, producción y comercialización
  23. 23. Elementos clave • Seguridad • Eficacia • Estabilidad
  24. 24. Seguridad (antecedentes) • Normativa aplicable al empleo de cultivos microbianos varía, en el caso de que exista, dependiendo de los países. • EFSA ha indicado la necesidad de legislar la utilización de microorganismos en alimentos destinados al consumo humano. • En general, se han clasificado como suplementos dietéticos y en la fabricante no debe notificar la introducción de nuevas cepas a la autoridad relevante, con la excepción de Dinamarca. • Estatuto danés (BEK nr. 282 af 19/4/2000) dossier ha de incluir estudios microbiológicos y toxicológicos, no especificando cuales. • AFSSA (2002) propone un esquema de evaluación de seguridad para microorganismos a emplear en el sector agroalimentario. Indica estudios toxicológicos específicos, si fuesen necesarios.
  25. 25. Seguridad (antecedentes) • Regulación Europea de Nuevos Alimentos (258/97 UE) incluye “alimentos o ingredientes alimentarios que contenga, consistan o se aíslen de microorganismos modificados genéticamente y también todos los que contengan, consistan o se aíslen de microorganismos. •Aditivos y adyuvantes no entran en el ámbito de dicha regulación • Uso de microorganismos como aditivos y adyuvantes es ambiguo. • Interpretación literal (258/97 UE) “cualquier cepa no comercializada antes de 1997 debería ser o haber sido sometida a un procedimiento (duro y costoso) para evaluar su seguridad”
  26. 26. QPS: Presunción de seguridad cualificada 2002 Ventajas: • Marco legal unificado UE • Evitarían o reducirían pruebas innecesarias y/o repetitivas para microorganismos con larga tradición de uso favoreciendo el desarrollo de nuevos productos • Evaluación seguridad limitada a aspectos relevantes dependiendo del organismo en cuestión
  27. 27. QPS: Presunción de seguridad cualificada
  28. 28. 2003: EFSA responsable evaluación seguridad alimentos
  29. 29. 2003: EFSA responsable evaluación seguridad alimentos
  30. 30. Seguridad
  31. 31. Seguridad
  32. 32. Seguridad
  33. 33. Seguridad
  34. 34. Seguridad
  35. 35. Seguridad
  36. 36. Seguridad
  37. 37. Seguridad QPS
  38. 38. QPS
  39. 39. Seguridad
  40. 40. Evaluación 1.- Género, especie, cepa • Técnicas tradicionales: • medios selectivos • patrones de fermentación específicos • Técnicas moleculares: tests fenotípicos y genéticos • fracción 16s RNA • presente en todas las células • se detecta con facilidad • posee numerosas regiones variables • existencia secuencias (> 100.000 en bases de datos (http://rdp.cme. msu.edu/html)
  41. 41. Evaluación Tipaje de cepas Amplificación al azar de DNA polimórfico (RAPD) - Perfiles eelectroforéticos que varían según el polimorfismo (huella dactilar característica) - Cómoda, rápida, poca cantidad DNA, no presupone concimientos previos secuencia, se puden distinguir fácil, rápida y simultaneamente muchos organismos - Muy sensible a condiciones amplificación
  42. 42. Evaluación Tipaje de cepas Electroforesis en campo de pulso (PFGE)
  43. 43. Evaluación 2. Tests in vitro potencial probiótico Resistencia acidez gátrica • Resistencia sales biliares • Adherencia al mucus y/o células epiteliales • Actividad antimicrobiana frente a patógenos • Capacidad de reducir adhesión patógenos a cel. • epiteliales Actividad hidrolítica frente a sales biliares • Perfil inmunológico •
  44. 44. Seguridad • Determinar las propiedades intrinsecas de bacterias y cepas (factores de adhesión, degradación de mucinas, resistencia a antibióticos, transferencia de plásmidos, actividades enzimáticas no deseables, activ hemolítica, producción aminas biógenas, producción de D-láctico, etc). • Determinar los efectos de los metabolitos producidos por las bacterias. • Estudiar la capacidad infectiva de células humanas (in vitro) y de animales inmunocomprometidos. •Determinar la toxicidad aguda tras la ingestión de grandes cantidades de bacteria. •Determinar sus efectos beneficiosos (dosis-respuesta) en modelos animales sanos y de enfermedad inducida. • Estudiar la aparición de efectos secundarios en ensayos de intervención en voluntarios o pacientes.
  45. 45. Seguridad Especie DL50 (g/kg peso) Streptococcus faecium AD1050 >6.6 Streptococcus equinus >6.4 Lactobacillus fermentum AD002 >6.6 Lactobacillus salivarius AD0001 >6.5 Lactobacillus GG (ATCC 53103) >6.0 Lactobacillus helveticus >6.0 Lactobacillus bulgaricus >6.0 Bifidobacterium longum 25 Donohue et al. 1998
  46. 46. Eficacia (Ensayos humanos) Fase 1: Seguridad • Fase 2: Eficacia-doble ciego (efectos adversos, • síntomatología, signos, well-being, reducción de riesgo de enfermedades, recuperación de enfermedades, etc) Fase 3: Efectividad en comparación con terapia estándar • Fase 4: Vigilancia • Repetir estudios en centros independientes. - Publicación resultados en revistas científicas - Health claims
  47. 47. Alegaciones de salud y etiquetado Género, especie y cepa • Número mínimo de viables de cada cepa a final de la • vidad del producto Porción alimento que contenga la dosis efectiva del • probiótico para que produzca el efecto beneficioso Alegación salud específica • Condiciones almacenamiento • Detalles de la compañía para información al consumidor •
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