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“Superbugs”
Résistance aux antibiotiques                (AB)•    Que s’est-il passé avec ces ‘médicaments miracles’ ? Une certaine    ...
Bactériophages ou Phages•  Antimicrobien évolutif et auto-amplificateur•  ‘Virus’ de bactéries (incluant les “Superbugs”)•...
Structure d’un bactériophage   Tête     QueuePlaqueterminale                Fibres
Le phage lytique qui ‘tue’ et le     lysogène qui attend
Phagothérapie ?     Une alternative potentielle à la crise mondiale des       résistances bactériennes aux antibiotiques ?...
Nous vivons dans un océan de            phages•  On estime le nombre total de particules   phagiques sur terre à : 4-6 x 1...
Phages vs. Antibiotiques   PHAGE                                 ANTIBIOTIQUE•  Très spécifiques (espèce et,       •  Non ...
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Une renaissance?                                         •  Une réelle renaissance dans le                                ...
But   (R)Amener les phages chez le patient sous forme d’un produit dequalité et sécurisé, et d’une manière          flexib...
J’ai besoin desphages… Maintenant !
Obstacles rencontrés dans ledéveloppement de la phagothérapie1/ La perception d’un phage comme « l’ennemi de  la vie »2/ L...
Perception subjective des phages            comme l’ennemi de la vie                              (LP Villarreal, 2005)Véc...
Le cadre régulateur 2007-2012•    Pas de cadre régulateur spécifique actuellement (classification EMA     comme “Biologica...
Future Virol. (2012) 7(4), 379-390. (Open Access!) A specific framework with realistic production and documentationrequire...
Un cocktail de phages     (BFC-1) avec contrôle     de qualité•    Un manque de produits bien     définis et caractérisés•...
Sécurité et contrôle de qualitéCaractérisation	  du	  phage	  :	        •  Détermination	  du	  morphotype	        •  Anal...
BFC 1
Application thérapeutique chez le Brûlé,      ‘une modeste étude pilote’•  Le protocole modeste et prudent ne permettait p...
Application de phages à l’HôpitalMilitaire Reine Astrid à Bruxelles,Belgium (sous couvert d’Helsinki)
Application de phages dans une plaiede guerre à l’Hop. Mil. de Gori, Géorgie                                   HMRA, Bruxe...
‘Prêt-à-porter’ vs ‘Sur mesure’                                       Pirnay et al., 2010                                 ...
Conclusion Un petit pas a été réalisé dans la ré-implémentation de la phagothérapie en   routine clinique, mais un pas plu...
Problèmes majeurs ?•  Le cadre juridique•  Brevets (environnement de concept   pharmaco-industriel non durable)•  Solution...
Activités en cours et perspectives•  Etude multicentrique pour décoloniser les porteurs de MRSA (UCL –   Prof. Laterre/HMR...
Effect	  of	  bacteriophage	  cocktail	  BFC	  1	  on	  nasal	  and	  pharyngeal	  carriage	  of	  Pseudomonas	  aeruginosa...
Study	  MED	  11:	  “Evalua0on	  of	  the	  impact	  of	          phage	  –	  bacterium	  coevolu0on	  on	  phage	        ...
Résultats,	  après	  100	  généra0ons	                           bactériennes	  in	  vitro	     Densité	  de	     Bactérie...
Phages	  can	  prolong	  survival	  of	  caterpillars	  	        (larvae	  of	  the	  waxmoth	  Galleria	  mellonella)	  H...
“EHEC”Enteroaggregative, Shiga toxin/verotoxin-producing E. coli (EAggECSTEC/VTEC) strain O104:H4 in Germany caused over 4...
Screening of phage collection against    ’EHEC’ O104:H4 (in BSL 3 lab)     K12	               EHEC	  O104:H4	  
‘EHEC’ phages§ Two potent phages were isolated§ DNA sequencing is nearly finished  «	  3S	  »	  Myovirus	     «	  NES	  ...
L’équipe des phages•    Serge Jennes, Thomas Rose, Sophie Deroock, Patrick Soentjens, Pierre     Neirinckx, Geert Laire. B...
Biotech Santé | La phagothérapie, une alternative aux antibiotiques ? par Daniel De Vos | Liege Creative, 02.05.12
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On constate aujourd’hui de plus en plus que des bactéries multirésistantes aux antibiotiques émergent partout dans le monde, rendant les traitements presque impossibles. La phagothérapie, c’est-à-dire l’utilisation de virus de bactéries comme antibactériens, est une voie alternative aux antibiotiques prometteuse.
Avant son utilisation en médecine quotidienne moderne, un nombre important d’obstacles doivent cependant encore être levés. Ces obstacles ne sont fondamentalement pas d’ordre scientifique et technique mais plutôt médico-légal et relèvent de sa non-compatibilité avec nos modèles pharmaco-économiques actuels.
Il faut rappeler qu’historiquement, la phagothérapie s’est développée dans l’ex-Union Soviétique et qu’elle se pratique actuellement plutôt de façon sporadique et surtout, sous couvert de la déclaration d’Helsinki. Néanmoins, suite à la crise prévisible de l’antibiothérapie, un nombre croissant de microbiologistes se penchent à nouveau sur cette pratique dans leur recherche de traitements antibactériens.

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Biotech Santé | La phagothérapie, une alternative aux antibiotiques ? par Daniel De Vos | Liege Creative, 02.05.12

  1. 1. Parole d’expertLa phagothérapie, lalternative de demainaux antibiotiques ?Daniel DE VOS – Chercheur microbiologisteUne organisation conjointe avec BIOLIEGE
  2. 2. Avec le soutien de :
  3. 3. La phagothérapie, l’alternative de demain aux antibiotiques? Daniel De Vos, PhD Laboratoire de Technologie Moléculaire et Cellulaire, Centre des Grands Brûlés, Hôpital Militaire Reine Astrid (HMRA), Bruxelles, Belgique. LIEGE CREATIVE, Château de Colonster, Liège 2 mai 2012
  4. 4. “Superbugs”
  5. 5. Résistance aux antibiotiques (AB)•  Que s’est-il passé avec ces ‘médicaments miracles’ ? Une certaine nonchalance naïve dans une société trop commercialisée (Barry Kreiswirth).•  Mais ! Egalement un manque de connaissance de la biologie évolutionnaire (une médecine trop méchanistique) → utilisation d’une substance statique non-évolutive comme antimicrobien vs une cellule vivante (bactérie) → résistance assurée !•  Deux aspects méconnus : l’antibiotique lui-même (rôle naturel, phase planctonique/biofilm bactérien…) et l’intégration de la notion d’évolution (fondement de la biologie !) (>< durabilité)
  6. 6. Bactériophages ou Phages•  Antimicrobien évolutif et auto-amplificateur•  ‘Virus’ de bactéries (incluant les “Superbugs”)•  Un couple co-évolutif (médecine Darwinienne ou évolutionnaire)•  Phages = contrôleurs (prédateurs) bactériens
  7. 7. Structure d’un bactériophage Tête QueuePlaqueterminale Fibres
  8. 8. Le phage lytique qui ‘tue’ et le lysogène qui attend
  9. 9. Phagothérapie ? Une alternative potentielle à la crise mondiale des résistances bactériennes aux antibiotiques ? (The Antibiotic Crisis)La phagothérapie consiste dans l’utilisation des contrôleurs naturels desbactéries, les virus bactériospécifiques ou phages (mangeurs de bactéries)contre les bactéries pathogènes afin de contrôler une infection ou unecolonisation bactérienne non souhaitée.‘Danger phage’ !?! Aucune infection eucaryotique à phage n’a pu êtrerapportée jusqu’à ce jour, tandis qu’aucune séquence de traces d’ADN dephage n’a pu être détectée dans le génome humain (>< séq’s de rétrovirus –8 - 10 %) (Mi et al, Nature 403, 785-789 (2000).
  10. 10. Nous vivons dans un océan de phages•  On estime le nombre total de particules phagiques sur terre à : 4-6 x 1031 = 10 x le nombre de procaryotes (Bergh. 1989. Nature 340: 467-468) (Whitamn et al. 1998. PNAS 95: 6578-6583)•  109 phages par ml d’eau de surface•  Nous-mêmes sommes en permanence porteurs de phages et nous en consommons constamment
  11. 11. Phages vs. Antibiotiques PHAGE ANTIBIOTIQUE•  Très spécifiques (espèce et, •  Non spécifique (incluant flore même, souches) commensale)•  Le développement d’une •  Le développement d’un préparation : relativement nouvel AB : long et cher facile et peu côuteux •  Large spectre, agent•  L’agent infectieux doit être infectieux ne doit pas être connu (diagnostiques connu rapides, cocktails) •  Effets secondaires multiples,•  Pas d’effets secondaires impact écologique énorme spécifiques connus (Attention : aspect immunomodulatoire, interférence oncologique, impact environnemental)
  12. 12. Phagothérapie :un potentiel de pleine durabilité Un  exemple  :  le  choléra   “Host-mediated phage amplification during the cholera epidemic likely contributed to increased environmental phage abundance, decreased load of environmental V. cholerae and, hence, the collapse of the epidemic” Faruque et al. Self-limiting nature of seasonal cholera epidemics: Role of host-mediated amplification of phage. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Apr 26;102(17): 6119-24.
  13. 13. Phagothérapie :un potentiel de pleine durabilitéInteractions phage/bactérie dynamiques (co-évolution)• an "arms race", consisting of the repeated origin and fixation ofnew parasite virulence and host defence traitsLes phages sont les contrôleurs naturels desbactéries dans tout système écologique• phage will rapidly and drastically reduce the population of themost abundant bacteria, thus preventing the best competitorsfrom building up a high biomass
  14. 14. Une renaissance? •  Une réelle renaissance dans le 1400 monde occidental qui se reflète par une augmentation exponentielle dePhage/Therapy papers (PubMed) 1230 1200 la littérature sur le sujet; 1031 1000 •  Essais thérapeutiques en cliniques; 800 •  Un intérêt significatif également dans l’agro-industrie et à la 600 Défense. 489 400 244 200 212 182 168 179 0 1970-75 1975-80 1980-85 1985-90 1990-95 1995-2000 2000-05 2005-10 (extrapolated) Time periods
  15. 15. But (R)Amener les phages chez le patient sous forme d’un produit dequalité et sécurisé, et d’une manière flexible et durable.
  16. 16. J’ai besoin desphages… Maintenant !
  17. 17. Obstacles rencontrés dans ledéveloppement de la phagothérapie1/ La perception d’un phage comme « l’ennemi de la vie »2/ L’absence d’un cadre régulateur adapté, bien que ça bouge dans le domaine…3/ Le manque de bons produits définis : sécurisés et caractérisés4/ Brevets (probablement le problème le plus important !)5/ Émergence de résistances et impact écologique
  18. 18. Perception subjective des phages comme l’ennemi de la vie (LP Villarreal, 2005)Vécu dans les rapports avec les comités éthiques, les assurances, le staff médical
  19. 19. Le cadre régulateur 2007-2012•  Pas de cadre régulateur spécifique actuellement (classification EMA comme “Biological” ou vaccin… en discussion);•  Après avoir défini officiellement la position aux autorités de la CE et à l’ITF, le phage est positionné ► comme médicament (2011!);•  En 2007, notre option était le Comité d’Ethique de notre institution;•  Mais : également possible, La déclaration d’Helsinki;•  Et aujourd’hui, bien que toutes les autorités aient été contactées et que les discussions se multiplient, nous vivons toujours dans le même carcan.
  20. 20. Future Virol. (2012) 7(4), 379-390. (Open Access!) A specific framework with realistic production and documentationrequirements, which allows a timely (rapid) supply of safe, tailor-made, naturalbacteriophages to patients, should be developedUn cadre régulatoire spécifique pour la phagothérapie doit être développé
  21. 21. Un cocktail de phages (BFC-1) avec contrôle de qualité•  Un manque de produits bien définis et caractérisés•  Souvent l’interaction récepteur- phage entre la bactérie et les phages n’était pas optimale (empirisme) Présence d’endotoxines.•  Une production “GMP-like”
  22. 22. Sécurité et contrôle de qualitéCaractérisation  du  phage  :   •  Détermination  du  morphotype   •  Analyse  complète  du  génome  (ADN)  et  protéome  (confirmer  l’absence  lysogeny  de   gène  de  toxines)   •  Tester  l’absence  de  phage  lysogénique  (mitomycin  test)  dans  la  bactérie  hôte  de   production  de  phage  Tests  de  CQ  par  des  laboratoires  qualifiés  et  accrédités  sur  la  préparation  finale  :   •  Titre  du  phage  (agar  overlay  method)   •  pH  (PhEu  )     •  Cytotoxicité  (ISO10993-­‐5)   •  Pyrogenicité  (10  ml/kg  de  lapin,  suivant  l’  USP)   •  Stérilité  (PhEu)   •  Confirmer  la  morphologie  et  l’activité  des  phages  vis-­‐à-­‐vis  des  bactéries  cibles     (Transmission  Electron  Microscopy)  
  23. 23. BFC 1
  24. 24. Application thérapeutique chez le Brûlé, ‘une modeste étude pilote’•  Le protocole modeste et prudent ne permettait pas une évaluation adéquate de l’efficacité;!•  L’application de BFC-1 ne montrait aucun effet néfaste secondaire;!•  Les staffs, médical et soignant, se sont familiarisés avec le concept de la phagothérapie et sont convaincus de la sécurité et du potentiel contre les bactéries multi-résistantes rencontrées chez les brûlés;!•  Ainsi, nous sommes convaincus que cette étude sur le terrain est un petit pas dans l’implémentation de la phagothérapie dans un futur proche.! Verbeken et al., Future Medicine, 2, 485-491, 2007. Merabishvili et al., PLoS ONE. 2009; 4(3): e4944. Kutter et al, Current Pharmaceutical Biotechnology,11, 69-86, 2010.
  25. 25. Application de phages à l’HôpitalMilitaire Reine Astrid à Bruxelles,Belgium (sous couvert d’Helsinki)
  26. 26. Application de phages dans une plaiede guerre à l’Hop. Mil. de Gori, Géorgie HMRA, Bruxelles Eliava Institute, Tbilis
  27. 27. ‘Prêt-à-porter’ vs ‘Sur mesure’ Pirnay et al., 2010 Pirnay et al., 2012 IP-issues!
  28. 28. Conclusion Un petit pas a été réalisé dans la ré-implémentation de la phagothérapie en routine clinique, mais un pas plusgrand a été réalisé dans le domaine des infections bactériennes
  29. 29. Problèmes majeurs ?•  Le cadre juridique•  Brevets (environnement de concept pharmaco-industriel non durable)•  Solution : une démarche depuis la base et le renouveau de la recherche fondamentale !•  Déduction : cliniciens et patients, scientifiques et industriels de bonne foi, unissez-vous !
  30. 30. Activités en cours et perspectives•  Etude multicentrique pour décoloniser les porteurs de MRSA (UCL – Prof. Laterre/HMRA)•  Développement d’un cocktail contre A. baumannii (MHKA.UGent)•  Etudes scientifiques de base (isolement et caractérisation génomique et protéomique de phages et leurs interactions bactériennes – KUL/HMRA/UGent)•  Etudes de la co-évolution “in vitro” and “in vivo” (animal) Article en révision chez AEM (Prof. Buckling Exceter, UK)•  Le développement d’un cadre régulateur adéquat (thèse de doctorat, KUL/HMRA/ERM)•  Mise au point d’un protocole spécifique pour plaies chroniques (ULB, Prof. del Marmol)
  31. 31. Effect  of  bacteriophage  cocktail  BFC  1  on  nasal  and  pharyngeal  carriage  of  Pseudomonas  aeruginosa  and   Staphylococcus  aureus  in  ICU  patients   A  prospec)ve  ,  randomized,  double-­‐blind,  placebo-­‐ controlled,  mul)center  study     Forma)on  Candidat  Officier  Supérieur     (Med  Cdt  Sophie  De  Roock)     2  x  20  pa)ents  (14  up  )l  now)    
  32. 32. Study  MED  11:  “Evalua0on  of  the  impact  of   phage  –  bacterium  coevolu0on  on  phage   therapy”   WP1:  Evolu)on  of  resistance  to  mul)ple  phages:   simultaneous  versus  sequen)al  treatment         “Phage  cocktails     vs     sequen)al  applica)on  of  single  phages”   (in  coll.  With  Prof.  Buckling)    
  33. 33. Résultats,  après  100  généra0ons   bactériennes  in  vitro   Densité  de   Bactéries  traitées   Propor0on  de  bactéries   résistantes  au  phage   u0lisé   Propor0on  de  bactéries   résistantes  à  tous  les     phages   Two  phages  (red  circles)  applied  sequen)ally  can  be  beWer  than  a  4  phage  cocktail   (blue  circles):  same  growth  inhibi)on  but  less  resistance!  Hall et al, sub. AEM, 2012
  34. 34. Phages  can  prolong  survival  of  caterpillars     (larvae  of  the  waxmoth  Galleria  mellonella)  Hall et al, sub. AEM, 2012 Mixture  is  best  in  this  context!  
  35. 35. “EHEC”Enteroaggregative, Shiga toxin/verotoxin-producing E. coli (EAggECSTEC/VTEC) strain O104:H4 in Germany caused over 4,000 cases ofdiarrhea – 3,167 without the hemolytic-uremic syndrome (16 deaths)and 908 with the hemolytic-uremic syndrome (34 deaths)
  36. 36. Screening of phage collection against ’EHEC’ O104:H4 (in BSL 3 lab) K12   EHEC  O104:H4  
  37. 37. ‘EHEC’ phages§ Two potent phages were isolated§ DNA sequencing is nearly finished «  3S  »  Myovirus   «  NES  »  Myovirus  
  38. 38. L’équipe des phages•  Serge Jennes, Thomas Rose, Sophie Deroock, Patrick Soentjens, Pierre Neirinckx, Geert Laire. Burn Wound Centre, Queen Astrid Military Hospital, Brussels, Belgium.•  Gilbert Verbeken, Gunther Verween, Peter De Corte, Florence Bilocq, Véronique Cornu, Dirck Schoeters, Bruno Pascual, Daniel De Vos and Jean-Paul Pirnay. Laboratory for Molecular and Cellular Technology (LabMCT), Burn Wound Centre, Queen Astrid Military Hospital, Brussels, Belgium.•  Martin Zizi. Department of Physiology (FYSP), Vrije Universiteit Brussel, Brussels and Section Health of the Division Well-Being (Belgian Defence Staff), Queen Astrid Military Hospital, Brussels, Belgium.•  Luc Van Parys. Section Health of the Division Well-Being (Belgian Defence Staff), Queen Astrid Military Hospital, Brussels, Belgium.•  Maya Merabishvili, Nina Chanishvili, Marina Tediashvili, Nino Lashkhi, Thea Glonti and Revaz Adamia. Eliava Institute of Bacteriophage, Microbiology and Virology (EIBMV), Tbilisi, Georgia.•  Mario Vaneechoutte. Laboratory of Bacteriology Research (LBR), Ghent University Hospital, Gent, Belgium.•  Rob Lavigne, Wesley Mattheus and Guido Volckaert, Isabelle Huys,. Laboratory of Gene Technology (LoGT), and the Unit of pharmacy and Law ,Katholieke Universiteit Leuven, Leuven, Belgium.•  Victor Krylov and M. Yu Beburov. Laboratory of Bacteriophage Genetics, State Institute for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms (SIGSIM), Moscow, Russia.•  Jan Mast. Unit Electron Microscopy, Veterinary and Agricultural Research Centre (VAR), Brussels, Belgium.•  Angus Buckling, Evolutionary Biology Unit, Exeter University, UK
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