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  • 1. Meios de cultura e colorações
  • 2. Preparação e distribuição de meios de cultura
    • Os meios comerciais devem ser hidratados;
    • Devem ser pesados  papel manteiga/alumínio;
    • Frasco;
    • Hidratar em pequena quantidade;
    • Depois deve-se acrescentar o restante da água;
    • Levar o meio para fundir  aquecer;
  • 3. Preparação e distribuição de meios de cultura
    • Usar sempre luvas térmicas;
    • Sempre que for usado o termo "esterilizar em autoclave" , o tempo de esterilização é de 15 minutos e a temperatura de 121ºC;
    • Sempre que for usado o termo "esterilizar por filtração", usar o filtro com porosidade de 0,22 micra, recomendado para partículas bacterianas;
    • Distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não precisam estar esterilizados;
    • Distribuir o meio após a autoclavação, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias  estéreis;
    • Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi-abertas, para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor;
  • 4. Meios de cultura - transporte
    • CARY BLAIR
    • Microrganismos patogênicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem neste meio;
    • A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microrganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles;
    • FUNÇÃO
    • Transporte de material fecal e conseqüente conservação dos microrganismos;
  • 5.  
  • 6. Meios de cultura - transporte
    • SALINA TAMPONADA
    • Meio líquido tamponado que mantém a bactéria viável;
    • FUNÇÃO
    • Meio de transporte de fezes.
  • 7. Meios de cultura - transporte
    • MEIO STUART
    • A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microorganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles;
    • FUNÇÃO
    • Transporte de diversos materiais e conseqüente conservação dos microorganismos;
    • Haemophilus spp., Pneumococcus , Salmonella spp., Shigella spp. entre outros.
  • 8. Meios de cultura - manutenção
    • ÁGAR NUTRIENTE
    • Meio simples, de fácil preparação e barato;
    • FUNÇÃO
    • Várias aplicações  análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras;
    • Conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente;
    • Usado para observar esporulação de espécies de bacilos Gram positivos;
  • 9. Meios para crescimento e isolamento
    • ÁGAR CHOCOLATE
    • Utilizado para o cultivo de microrganismos exigentes;
    • Cresce quase todos os tipos de microrganismos;
    • À base do meio  adiciona-se sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta  hemácias lisam  liberando hemina e hematina  compostos  crescimento dos m.o exigentes;
    • Observação : s e utilizar sangue de carneiro ou coelho no lugar do sangue de cavalo, adicionar os suplementos a base de NAD (coenzima I) e cisteína após resfriar a base achocolatada à aproximadamente 50ºC;
  • 10. Meios para crescimento e isolamento
    • THAYER-MARTIN CHOCOLATE
    • É um meio rico e superior a outros meios de cultivo destinados para o isolamento de Neisseria sp;
    • Contém em sua fórmula antibióticos;
    • Inibem o crescimento de outras bactérias, quando em amostras colhidas de sítios contaminados;
  • 11. Meios para crescimento e isolamento
    • ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS)
    • Possue componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio) que inibem
    • microrganismos Gram positivos;
    • Lactose ao meio  se o m.o é lactose positiva;
    • Tissulfato de sódio e o citrato férrico permitem a detecção de H²S evidenciado por formação de colônias de cor negra no centro.
    • FUNÇÃO
    • Selecionar e isolar espécies de Salmonella sp e Shigella sp , em amostras de fezes, alimentos e água.
  • 12.  
  • 13. Meios para crescimento e isolamento
    • CALDO SELENITO
    • Inibem coliformes e outras espécies da flora intestinal como estreptococos;
    • FUNÇÃO
    • Isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. em amostras de fezes, urina e alimentos...
  • 14. Meios para crescimento e isolamento
    • CALDO TETRATIONATO
    • Os sais de bile contidos no meio de tetrationato inibem microrganismos Gram positivos e a adição da solução de iodo inibe a flora intestinal normal de espécies fecais;
    • FUNÇÃO
    • Meio de enriquecimento para Salmonella spp.
  • 15.  
  • 16. Meios para crescimento e isolamento
    • ÁGAR MAC CONKEY
    • O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos;
    • A concentração de sais de bile é relativamente baixa em comparação com outros meios;
    • Não é tão seletivo para Gram negativos como, por exemplo, o ágar SS;
    • FUNÇÃO
    • BGN (enterobactérias e não fermentadores) e verificar a fermentação ou não da lactose;
  • 17. Meios para crescimento e isolamento
    • ÁGAR SANGUE
    • Base rica;
    • Ótimas condições de crescimento;
    • Formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. E Staphylococcus spp;
    • FUNÇÃO
    • Usado para o isolamento de microrganismos não fastidiosos;
    • Verificação de hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp;
  • 18. Meios para crescimento e isolamento
    • ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT
    • Microrganismos presentes em amostras urina;
    • A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus sp;
    • FUNÇÃO
    • Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras;
  • 19.  
  • 20. Meios para crescimento e isolamento
    • CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION
    • Nutrientes de cérebro e coração, peptona e dextrose;
    • A peptona e a infusão são fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas;
    • A dextose é um carboidrato que os microrganismos utilizam para fermentação;
    • Função
    • Cultivo de estreptococcos, pneumococos, meningococos, enterobactérias, não fermentadores, leveduras e fungos;
    • Pode ser utilizado na preparação do inóculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos;
    • Realização de teste de coagulase em tubo;
    • Teste de crescimento bacteriano a 42 e 44°C;
  • 21. Meios para crescimento e isolamento
    • LÖWENSTEIN JENSEN
    • A base do meio é constituída por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das Micobactérias;
    • FUNÇÃO
    • Isolamento primário das micobactérias;
  • 22.  
  • 23. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
    • ÁGAR CITRATO SIMMONS
    • Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono;
    • Sais de amônia  alcalinizando o meio;
    • FUNÇÃO
    • Diferenciar gêneros e espécies de Enterobactérias e não fermentadores.
  • 24.  
  • 25. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
    • ÁGAR BÍLE-ESCULINA
    • Capacidade de bactérias hidrolisarem esculina na presença  bile;
    • A esculina é um derivado glicosídico da cumarina;
    • A esculina é incorporada em um meio contendo 4% de sais biliares;
    • As bactérias Bile-Esculina POSITIVAS  crescem  presença de sais biliares;.
    • A hidrólise da esculina no meio resulta na formação de glicose e esculetina;
    • A esculetina reage com íons férricos (fornecidos pelo composto inorgânico do meio - o citrato férrico), formando um complexo negro;
    • FUNÇÃO
    • Identificação dos Enterococcus spp. , que são Bile-Esculina positiva;
  • 26.  
  • 27. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
    • ÁGAR FENILALANINA
    • Verifica a capacidade da bactéria de produzir ácido fenilpirúvico a partir da fenilalanina por ação enzimática;
    • FUNÇÃO
    • Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias;
  • 28. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
    • ÁGAR TSI – TRIPLO AÇÚCAR FERRO
    • Este meio contém três açúcares: 0,1%glicose, 1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de fenol para detecção da fermentação de carboidratos e sulfato de ferro para detecção da produção de sulfato de hidrogênio (indicado pela cor preta na base do tubo);
    • A fermentação é indicada pela mudança da cor do indicador de pH de vermelho para amarelo. O
    • ágar fundido é deixado solidificar, formando uma superfície inclinada;
    • Essa configuração origina duas câmaras de reação dentro do mesmo tubo;
    • A porção inclinada ou bico, exposta em toda sua superfície ao oxigênio atmosférico, é aeróbia. A porção inferior, denominada profundidade ou fundo, está protegida do ar e é relativamente anaeróbia;
    • FUNÇÃO
    • Diferenciar bacilos Gram negativos com base na fermentação de carboidratos, produção de sulfato de hidrogênio e gás.
  • 29. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
    • TSI - LEITURA
    • Reações ápice/base:
    • Púrpura/amarelo = fermentação apenas da glicose (lactose e sacarose negativos);
    • Amarelo/amarelo = fermentação da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 açucares);
    • Presença de gás (CO²) = bolhas ou meio fragmentado;
    • H²S positivo = presença de precipitado negro;
  • 30.  
  • 31. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
    • ÁGAR BASE URÉIA (CHRISTENSEN)
    • Determinar a habilidade do microrganismo de degradar a uréia em duas moléculas de amônia pela ação da enzima urease;
    • Positivo  na alcalinização do meio;
    • Função
    • BGN fermentadores e não fermentadores  Staphylococcus e Haemophilus.
  • 32. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
    • PARA PROVA DE GELATINASE
    • Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolíticas (gelatinases) que
    • liquefaz/hidrolisa gelatina;
    • FUNÇÃO
    • Identificar e classificar bactérias fermentadoras, não fermentadoras e bacilos Gram positivos esporulados.
  • 33. NEGATIVA POSITIVA
  • 34. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
    • PARA PROVA DE OXIDASE
    • O teste de oxidase é baseado na produção intracelular da enzima oxidase pela bactéria;
    • FUNÇÃO
    • Ajuda caracterizar espécies de Neisseria , distingui não fermentadores (oxidase positiva) de enterobactérias (oxidase negativa);
    • Diferencia algumas bactérias fermentadoras oxidase positiva entre elas Plesiomonas shigelloides, Aeromonas spp. e Vibrio spp .
  • 35. Interpretação
    • Oxidase positiva: roxo, bactéria não fermentadora;
    • Oxidase negativa: fermentadora, fazer testes bioquímicos (enterobactérias);
  • 36.  
  • 37. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
    • PARA TESTE DE MOTILIDADE
    • A bactéria é móvel  flagelo;
    • Flagelos ocorrem nos bacilos Gram negativos, poucas formas de cocos são móveis;
    • FUNÇÃO
    • Determinar se o microrganismo é o não móvel;
    • Meios associados a outros testes: Meios SIM (Sulfato, Indol, Motilidade);
    • MILI (Motilidade, Indol, Lisina);
    • MIO (Motilidade, Indol, Ornitina) utilizados para testes enterobactérias;
  • 38. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
    • PARA PROVA DE TOLERÂNCIA AO NaCl 6,5%
    • A tolerância ao NaCl a 6,5% é uma prova utilizada para verificar a capacidade de alguns microrganismos crescerem em presença do sal;
    • Meio base utilizado é o BHI caldo, que é um meio nutritivo de uso geral, empregado para o cultivo de muitas bactérias;
    • FUNÇÃO
    • Separa Enterococcus spp. , que são NaCl 6,5 % positivo dos demais Streptococcus spp., que são NaCl 6,5% negativos;
    • Na identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores.
  • 39. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
    • ÁGAR MUELLER HINTON
    • Ágar padronizado por Kirby e Bauer e pelo NCCLS que oferece condições de crescimento das principais bactérias;
    • FUNÇÃO
    • Meio utilizado para a realização do teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelos métodos de difusão em disco e E-test para enterobactérias;
    • Não fermentadores, Staphylococcus sp e Enterococcus sp .
  • 40. Intepretação de entebactérias
    • Identificação das enterobactérias
    • Meios IAL ou Rugai
    • Ápice
    • LTD: reação positiva = verde garrafa;
    • Sacarose fermentação: reação positiva = amarelo.
    • Base
    • Glicose fermentação: reação positiva = amarelo;
    • Produção de gás: reação positiva = formação de bolhas;
    • Hidrólise da uréia: ração positiva = azul intenso;
    • H2S (gás sulfidríco): reação positiva = negra.
    • Fundo
    • Lisina: reação positiva = qualquer cor diferente de amarelo; Reação negativa = amarelo;
    • Mobilidade: reação positiva = turvação do meio e ou qualquer crescimento além da picada ou arrebentamento do meio.
    • Tampa
    • Indol: reação positiva = rosa ou vermelha após a adição do reagente de Kovacs.
  • 41.  
  • 42. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
    • Kit EPM-MILI
    • Tubo EPM: após o inóculo, a tampa deve fica um pouco frouxa.
    • Provas
    • Glicose: prova positiva = base do tubo amarela;
    • H2S: prova positiva = cor negra.
    • Tubo MILI: após o inóculo, sua tampa deve ser bem fechada.
    • Provas
    • Mobilidade: reação positiva = crescimento para todos os lados;
    • Indol: reação positiva = negra;
    • Lisina: as enterobactérias capazes de descarboxilar a lisina presente no meio, primeiro descarboxila a glicose, onde reação positiva = qualquer cor diferente do amarelo; Reação negativo = amarelo claro.
    • Uréia: reação positiva = alcaliniza a base do tubo provocando viragem do indicador para azul.
  • 43.  
  • 44. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
    • Prova do VM: testa a capacidade da bactéria em produzir ácidos orgânicos a partir da fermentação da glicose. Leitura 48 – 72 horas.
    • VM: reação positiva = coloração avermelhada.
    • Prova do VP: as bactérias utilizam à glicose presente no meio liberando um produto que é a acetoína.
    • VP: reação positiva: turvação.
  • 45. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
    • TSI
    • Verifica se a bactéria degrada carboidratos específicos incorporados ao meiocom ou sem produção de gás.
    • Gás: positivo = formação de bolhas;
    • H2S: positivo = negra.
    • Resultados
    • Vermelho o ápice: fermentação apenas da glicose, lactose e sacarose negativa a base é amarela.
    • Amarelo o ápice: fermentação da glicose, lactose e ou sacarose a base é amarela.
  • 46. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
    • Caldo indol-uréia
    • Esse caldo tem por finalidade diferenciar as enterobactérias com base na capacidade de produção de indol e de hidrólse da uréia.
    • Interpretação dos resultados
    • Uréia positiva: reação alcalina = vermelha;
    • Uréia negativa = amarelo.
    • Indol: reação positiva = anel avermelhado;
    • Indol negativo = ausência de cor avermelhada.
  • 47. Testes necessários para a identificação de rotina dos BNFs
    • Tubo de OFglicose (com vaselina);
    • Oxidase;
    • PYR;
    • Lisina;
    • Arginina;
    • TSB para motilidade em lâmina;
    • Indol;
    • Esculina;
    • Disco de polimixina;
    • Tubo com TSI;
    • Placa de Mac Conkey;
    • Tubo com gelatina;
    • DNAse;
    • Tubo com caldo NaCl 6,5%
  • 48. COLORAÇÕES
  • 49. Colorações diferenciais
    • Reage de modo distinto em diferentes bactérias;
    • Servem para diferenciar as bactérias;
    • Ex.: Gram e BAAR;
  • 50. BAAR
    • BACILOS ÁLCOOL-ÁCIDO-RESISTENTES;
    • Coram fracamente pelo gram;
    • Ácido micólico de parede;
    • Circundados por uma parede celular hidrofóbica;
    • Resistem a descoloração;
    • Misturas de álcool-ácido usadas na identificação;
  • 51.  
  • 52. Coloração para cápsula
    • Chamada coloração negativa;
    • Método difícil;
    • Durante o procedimento  lavagem retira cápsula;
  • 53. Coloração para cápsula
    • Cápsulas geralmente não aceitam corantes biológicos;
    • Tinta nanquim;
  • 54.  
  • 55. Coloração de esporos
    • Verde malaquita  corante primário;
    • Lavagem;
    • Safranina  cora o restante da bactéria;
    • Bactéria  verde e rosa;
  • 56. Coloração dos flagelos
    • Estruturas muitos pequenas;
    • Procedimento delicado para coloração;
    • Usa-se mordente e carbolfucsina;
    • Aumenta o diâmetro dos flagelos  visível ao microscópio óptico;
  • 57. Recomendações
    • Toda amostra é potencialmente contaminada;
    • Manipulação de material biológico  EPI;
    • Procedimento com risco com respingos  cabine de segurança;
    • Não pipetar com a boca;
  • 58. Recomendações
    • Não reencapar agulhas;
    • Descartar em recipiente adequado;
    • Material contaminado deve ser descontaminado antes do descarte;
    • Determinar área limpa e contaminada;
  • 59. Recomendações
    • Limpar e desinfetar todas as áreas de trabalho;
    • Manter bancadas organizadas;
    • Não estocar material contaminado;
    • Tirar jaleco quando sair do setor;
  • 60. Recomendações
    • Lavar as mãos sempre;
    • Separar materiais em sacos de lixo;
    • Todos os reagentes identificados;
  • 61. Recomendações
    • Ter manual de procedimento;
    • Estocar inflamáveis  local adequado;
  • 62. Acidentes
    • Sempre pedir ajuda;
    • Não omitir fatos;
    • Material biológico  superfície  hipoclorito 2%;
  • 63. Acidentes
    • Material biológico  pele  sabão e álcool 70%;
    • Material biológico no jaleco  lavagem;

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