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Meios De Cultura E ColoraçãO

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  • 1. Meios de cultura e colorações
  • 2. Preparação e distribuição de meios de cultura <ul><li>Os meios comerciais devem ser hidratados; </li></ul><ul><li>Devem ser pesados  papel manteiga/alumínio; </li></ul><ul><li>Frasco; </li></ul><ul><li>Hidratar em pequena quantidade; </li></ul><ul><li>Depois deve-se acrescentar o restante da água; </li></ul><ul><li>Levar o meio para fundir  aquecer; </li></ul>
  • 3. Preparação e distribuição de meios de cultura <ul><li>Usar sempre luvas térmicas; </li></ul><ul><li>Sempre que for usado o termo &quot;esterilizar em autoclave&quot; , o tempo de esterilização é de 15 minutos e a temperatura de 121ºC; </li></ul><ul><li>Sempre que for usado o termo &quot;esterilizar por filtração&quot;, usar o filtro com porosidade de 0,22 micra, recomendado para partículas bacterianas; </li></ul><ul><li>Distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não precisam estar esterilizados; </li></ul><ul><li>Distribuir o meio após a autoclavação, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias  estéreis; </li></ul><ul><li>Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi-abertas, para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor; </li></ul>
  • 4. Meios de cultura - transporte <ul><li>CARY BLAIR </li></ul><ul><li>Microrganismos patogênicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem neste meio; </li></ul><ul><li>A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microrganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Transporte de material fecal e conseqüente conservação dos microrganismos; </li></ul>
  • 5.  
  • 6. Meios de cultura - transporte <ul><li>SALINA TAMPONADA </li></ul><ul><li>Meio líquido tamponado que mantém a bactéria viável; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Meio de transporte de fezes. </li></ul>
  • 7. Meios de cultura - transporte <ul><li>MEIO STUART </li></ul><ul><li>A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microorganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Transporte de diversos materiais e conseqüente conservação dos microorganismos; </li></ul><ul><li>Haemophilus spp., Pneumococcus , Salmonella spp., Shigella spp. entre outros. </li></ul>
  • 8. Meios de cultura - manutenção <ul><li>ÁGAR NUTRIENTE </li></ul><ul><li>Meio simples, de fácil preparação e barato; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Várias aplicações  análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras; </li></ul><ul><li>Conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente; </li></ul><ul><li>Usado para observar esporulação de espécies de bacilos Gram positivos; </li></ul>
  • 9. Meios para crescimento e isolamento <ul><li>ÁGAR CHOCOLATE </li></ul><ul><li>Utilizado para o cultivo de microrganismos exigentes; </li></ul><ul><li>Cresce quase todos os tipos de microrganismos; </li></ul><ul><li>À base do meio  adiciona-se sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta  hemácias lisam  liberando hemina e hematina  compostos  crescimento dos m.o exigentes; </li></ul><ul><li>Observação : s e utilizar sangue de carneiro ou coelho no lugar do sangue de cavalo, adicionar os suplementos a base de NAD (coenzima I) e cisteína após resfriar a base achocolatada à aproximadamente 50ºC; </li></ul>
  • 10. Meios para crescimento e isolamento <ul><li>THAYER-MARTIN CHOCOLATE </li></ul><ul><li>É um meio rico e superior a outros meios de cultivo destinados para o isolamento de Neisseria sp; </li></ul><ul><li>Contém em sua fórmula antibióticos; </li></ul><ul><li>Inibem o crescimento de outras bactérias, quando em amostras colhidas de sítios contaminados; </li></ul>
  • 11. Meios para crescimento e isolamento <ul><li>ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS) </li></ul><ul><li>Possue componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio) que inibem </li></ul><ul><li>microrganismos Gram positivos; </li></ul><ul><li>Lactose ao meio  se o m.o é lactose positiva; </li></ul><ul><li>Tissulfato de sódio e o citrato férrico permitem a detecção de H²S evidenciado por formação de colônias de cor negra no centro. </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Selecionar e isolar espécies de Salmonella sp e Shigella sp , em amostras de fezes, alimentos e água. </li></ul>
  • 12.  
  • 13. Meios para crescimento e isolamento <ul><li>CALDO SELENITO </li></ul><ul><li>Inibem coliformes e outras espécies da flora intestinal como estreptococos; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. em amostras de fezes, urina e alimentos... </li></ul>
  • 14. Meios para crescimento e isolamento <ul><li>CALDO TETRATIONATO </li></ul><ul><li>Os sais de bile contidos no meio de tetrationato inibem microrganismos Gram positivos e a adição da solução de iodo inibe a flora intestinal normal de espécies fecais; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Meio de enriquecimento para Salmonella spp. </li></ul>
  • 15.  
  • 16. Meios para crescimento e isolamento <ul><li>ÁGAR MAC CONKEY </li></ul><ul><li>O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos; </li></ul><ul><li>A concentração de sais de bile é relativamente baixa em comparação com outros meios; </li></ul><ul><li>Não é tão seletivo para Gram negativos como, por exemplo, o ágar SS; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>BGN (enterobactérias e não fermentadores) e verificar a fermentação ou não da lactose; </li></ul>
  • 17. Meios para crescimento e isolamento <ul><li>ÁGAR SANGUE </li></ul><ul><li>Base rica; </li></ul><ul><li>Ótimas condições de crescimento; </li></ul><ul><li>Formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. E Staphylococcus spp; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Usado para o isolamento de microrganismos não fastidiosos; </li></ul><ul><li>Verificação de hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp; </li></ul>
  • 18. Meios para crescimento e isolamento <ul><li>ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT </li></ul><ul><li>Microrganismos presentes em amostras urina; </li></ul><ul><li>A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus sp; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras; </li></ul>
  • 19.  
  • 20. Meios para crescimento e isolamento <ul><li>CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION </li></ul><ul><li>Nutrientes de cérebro e coração, peptona e dextrose; </li></ul><ul><li>A peptona e a infusão são fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas; </li></ul><ul><li>A dextose é um carboidrato que os microrganismos utilizam para fermentação; </li></ul><ul><li>Função </li></ul><ul><li>Cultivo de estreptococcos, pneumococos, meningococos, enterobactérias, não fermentadores, leveduras e fungos; </li></ul><ul><li>Pode ser utilizado na preparação do inóculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos; </li></ul><ul><li>Realização de teste de coagulase em tubo; </li></ul><ul><li>Teste de crescimento bacteriano a 42 e 44°C; </li></ul>
  • 21. Meios para crescimento e isolamento <ul><li>LÖWENSTEIN JENSEN </li></ul><ul><li>A base do meio é constituída por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das Micobactérias; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Isolamento primário das micobactérias; </li></ul>
  • 22.  
  • 23. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO <ul><li>ÁGAR CITRATO SIMMONS </li></ul><ul><li>Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono; </li></ul><ul><li>Sais de amônia  alcalinizando o meio; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Diferenciar gêneros e espécies de Enterobactérias e não fermentadores. </li></ul>
  • 24.  
  • 25. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO <ul><li>ÁGAR BÍLE-ESCULINA </li></ul><ul><li>Capacidade de bactérias hidrolisarem esculina na presença  bile; </li></ul><ul><li>A esculina é um derivado glicosídico da cumarina; </li></ul><ul><li>A esculina é incorporada em um meio contendo 4% de sais biliares; </li></ul><ul><li>As bactérias Bile-Esculina POSITIVAS  crescem  presença de sais biliares;. </li></ul><ul><li>A hidrólise da esculina no meio resulta na formação de glicose e esculetina; </li></ul><ul><li>A esculetina reage com íons férricos (fornecidos pelo composto inorgânico do meio - o citrato férrico), formando um complexo negro; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Identificação dos Enterococcus spp. , que são Bile-Esculina positiva; </li></ul>
  • 26.  
  • 27. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO <ul><li>ÁGAR FENILALANINA </li></ul><ul><li>Verifica a capacidade da bactéria de produzir ácido fenilpirúvico a partir da fenilalanina por ação enzimática; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias; </li></ul>
  • 28. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO <ul><li>ÁGAR TSI – TRIPLO AÇÚCAR FERRO </li></ul><ul><li>Este meio contém três açúcares: 0,1%glicose, 1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de fenol para detecção da fermentação de carboidratos e sulfato de ferro para detecção da produção de sulfato de hidrogênio (indicado pela cor preta na base do tubo); </li></ul><ul><li>A fermentação é indicada pela mudança da cor do indicador de pH de vermelho para amarelo. O </li></ul><ul><li>ágar fundido é deixado solidificar, formando uma superfície inclinada; </li></ul><ul><li>Essa configuração origina duas câmaras de reação dentro do mesmo tubo; </li></ul><ul><li>A porção inclinada ou bico, exposta em toda sua superfície ao oxigênio atmosférico, é aeróbia. A porção inferior, denominada profundidade ou fundo, está protegida do ar e é relativamente anaeróbia; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Diferenciar bacilos Gram negativos com base na fermentação de carboidratos, produção de sulfato de hidrogênio e gás. </li></ul>
  • 29. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO <ul><li>TSI - LEITURA </li></ul><ul><li>Reações ápice/base: </li></ul><ul><li>Púrpura/amarelo = fermentação apenas da glicose (lactose e sacarose negativos); </li></ul><ul><li>Amarelo/amarelo = fermentação da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 açucares); </li></ul><ul><li>Presença de gás (CO²) = bolhas ou meio fragmentado; </li></ul><ul><li>H²S positivo = presença de precipitado negro; </li></ul>
  • 30.  
  • 31. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO <ul><li>ÁGAR BASE URÉIA (CHRISTENSEN) </li></ul><ul><li>Determinar a habilidade do microrganismo de degradar a uréia em duas moléculas de amônia pela ação da enzima urease; </li></ul><ul><li>Positivo  na alcalinização do meio; </li></ul><ul><li>Função </li></ul><ul><li>BGN fermentadores e não fermentadores  Staphylococcus e Haemophilus. </li></ul>
  • 32. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO <ul><li>PARA PROVA DE GELATINASE </li></ul><ul><li>Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolíticas (gelatinases) que </li></ul><ul><li>liquefaz/hidrolisa gelatina; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Identificar e classificar bactérias fermentadoras, não fermentadoras e bacilos Gram positivos esporulados. </li></ul>
  • 33. NEGATIVA POSITIVA
  • 34. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO <ul><li>PARA PROVA DE OXIDASE </li></ul><ul><li>O teste de oxidase é baseado na produção intracelular da enzima oxidase pela bactéria; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Ajuda caracterizar espécies de Neisseria , distingui não fermentadores (oxidase positiva) de enterobactérias (oxidase negativa); </li></ul><ul><li>Diferencia algumas bactérias fermentadoras oxidase positiva entre elas Plesiomonas shigelloides, Aeromonas spp. e Vibrio spp . </li></ul>
  • 35. Interpretação <ul><li>Oxidase positiva: roxo, bactéria não fermentadora; </li></ul><ul><li>Oxidase negativa: fermentadora, fazer testes bioquímicos (enterobactérias); </li></ul>
  • 36.  
  • 37. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO <ul><li>PARA TESTE DE MOTILIDADE </li></ul><ul><li>A bactéria é móvel  flagelo; </li></ul><ul><li>Flagelos ocorrem nos bacilos Gram negativos, poucas formas de cocos são móveis; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Determinar se o microrganismo é o não móvel; </li></ul><ul><li>Meios associados a outros testes: Meios SIM (Sulfato, Indol, Motilidade); </li></ul><ul><li>MILI (Motilidade, Indol, Lisina); </li></ul><ul><li>MIO (Motilidade, Indol, Ornitina) utilizados para testes enterobactérias; </li></ul>
  • 38. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO <ul><li>PARA PROVA DE TOLERÂNCIA AO NaCl 6,5% </li></ul><ul><li>A tolerância ao NaCl a 6,5% é uma prova utilizada para verificar a capacidade de alguns microrganismos crescerem em presença do sal; </li></ul><ul><li>Meio base utilizado é o BHI caldo, que é um meio nutritivo de uso geral, empregado para o cultivo de muitas bactérias; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Separa Enterococcus spp. , que são NaCl 6,5 % positivo dos demais Streptococcus spp., que são NaCl 6,5% negativos; </li></ul><ul><li>Na identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores. </li></ul>
  • 39. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO <ul><li>ÁGAR MUELLER HINTON </li></ul><ul><li>Ágar padronizado por Kirby e Bauer e pelo NCCLS que oferece condições de crescimento das principais bactérias; </li></ul><ul><li>FUNÇÃO </li></ul><ul><li>Meio utilizado para a realização do teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelos métodos de difusão em disco e E-test para enterobactérias; </li></ul><ul><li>Não fermentadores, Staphylococcus sp e Enterococcus sp . </li></ul>
  • 40. Intepretação de entebactérias <ul><li>Identificação das enterobactérias </li></ul><ul><li>Meios IAL ou Rugai </li></ul><ul><li>Ápice </li></ul><ul><li>LTD: reação positiva = verde garrafa; </li></ul><ul><li>Sacarose fermentação: reação positiva = amarelo. </li></ul><ul><li>Base </li></ul><ul><li>Glicose fermentação: reação positiva = amarelo; </li></ul><ul><li>Produção de gás: reação positiva = formação de bolhas; </li></ul><ul><li>Hidrólise da uréia: ração positiva = azul intenso; </li></ul><ul><li>H2S (gás sulfidríco): reação positiva = negra. </li></ul><ul><li>Fundo </li></ul><ul><li>Lisina: reação positiva = qualquer cor diferente de amarelo; Reação negativa = amarelo; </li></ul><ul><li>Mobilidade: reação positiva = turvação do meio e ou qualquer crescimento além da picada ou arrebentamento do meio. </li></ul><ul><li>Tampa </li></ul><ul><li>Indol: reação positiva = rosa ou vermelha após a adição do reagente de Kovacs. </li></ul>
  • 41.  
  • 42. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO <ul><li>Kit EPM-MILI </li></ul><ul><li>Tubo EPM: após o inóculo, a tampa deve fica um pouco frouxa. </li></ul><ul><li>Provas </li></ul><ul><li>Glicose: prova positiva = base do tubo amarela; </li></ul><ul><li>H2S: prova positiva = cor negra. </li></ul><ul><li>Tubo MILI: após o inóculo, sua tampa deve ser bem fechada. </li></ul><ul><li>Provas </li></ul><ul><li>Mobilidade: reação positiva = crescimento para todos os lados; </li></ul><ul><li>Indol: reação positiva = negra; </li></ul><ul><li>Lisina: as enterobactérias capazes de descarboxilar a lisina presente no meio, primeiro descarboxila a glicose, onde reação positiva = qualquer cor diferente do amarelo; Reação negativo = amarelo claro. </li></ul><ul><li>Uréia: reação positiva = alcaliniza a base do tubo provocando viragem do indicador para azul. </li></ul>
  • 43.  
  • 44. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO <ul><li>Prova do VM: testa a capacidade da bactéria em produzir ácidos orgânicos a partir da fermentação da glicose. Leitura 48 – 72 horas. </li></ul><ul><li>VM: reação positiva = coloração avermelhada. </li></ul><ul><li>Prova do VP: as bactérias utilizam à glicose presente no meio liberando um produto que é a acetoína. </li></ul><ul><li>VP: reação positiva: turvação. </li></ul>
  • 45. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO <ul><li>TSI </li></ul><ul><li>Verifica se a bactéria degrada carboidratos específicos incorporados ao meiocom ou sem produção de gás. </li></ul><ul><li>Gás: positivo = formação de bolhas; </li></ul><ul><li>H2S: positivo = negra. </li></ul><ul><li>Resultados </li></ul><ul><li>Vermelho o ápice: fermentação apenas da glicose, lactose e sacarose negativa a base é amarela. </li></ul><ul><li>Amarelo o ápice: fermentação da glicose, lactose e ou sacarose a base é amarela. </li></ul>
  • 46. MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO <ul><li>Caldo indol-uréia </li></ul><ul><li>Esse caldo tem por finalidade diferenciar as enterobactérias com base na capacidade de produção de indol e de hidrólse da uréia. </li></ul><ul><li>Interpretação dos resultados </li></ul><ul><li>Uréia positiva: reação alcalina = vermelha; </li></ul><ul><li>Uréia negativa = amarelo. </li></ul><ul><li>Indol: reação positiva = anel avermelhado; </li></ul><ul><li>Indol negativo = ausência de cor avermelhada. </li></ul>
  • 47. Testes necessários para a identificação de rotina dos BNFs <ul><li>Tubo de OFglicose (com vaselina); </li></ul><ul><li>Oxidase; </li></ul><ul><li>PYR; </li></ul><ul><li>Lisina; </li></ul><ul><li>Arginina; </li></ul><ul><li>TSB para motilidade em lâmina; </li></ul><ul><li>Indol; </li></ul><ul><li>Esculina; </li></ul><ul><li>Disco de polimixina; </li></ul><ul><li>Tubo com TSI; </li></ul><ul><li>Placa de Mac Conkey; </li></ul><ul><li>Tubo com gelatina; </li></ul><ul><li>DNAse; </li></ul><ul><li>Tubo com caldo NaCl 6,5% </li></ul>
  • 48. COLORAÇÕES
  • 49. Colorações diferenciais <ul><li>Reage de modo distinto em diferentes bactérias; </li></ul><ul><li>Servem para diferenciar as bactérias; </li></ul><ul><li>Ex.: Gram e BAAR; </li></ul>
  • 50. BAAR <ul><li>BACILOS ÁLCOOL-ÁCIDO-RESISTENTES; </li></ul><ul><li>Coram fracamente pelo gram; </li></ul><ul><li>Ácido micólico de parede; </li></ul><ul><li>Circundados por uma parede celular hidrofóbica; </li></ul><ul><li>Resistem a descoloração; </li></ul><ul><li>Misturas de álcool-ácido usadas na identificação; </li></ul>
  • 51.  
  • 52. Coloração para cápsula <ul><li>Chamada coloração negativa; </li></ul><ul><li>Método difícil; </li></ul><ul><li>Durante o procedimento  lavagem retira cápsula; </li></ul>
  • 53. Coloração para cápsula <ul><li>Cápsulas geralmente não aceitam corantes biológicos; </li></ul><ul><li>Tinta nanquim; </li></ul>
  • 54.  
  • 55. Coloração de esporos <ul><li>Verde malaquita  corante primário; </li></ul><ul><li>Lavagem; </li></ul><ul><li>Safranina  cora o restante da bactéria; </li></ul><ul><li>Bactéria  verde e rosa; </li></ul>
  • 56. Coloração dos flagelos <ul><li>Estruturas muitos pequenas; </li></ul><ul><li>Procedimento delicado para coloração; </li></ul><ul><li>Usa-se mordente e carbolfucsina; </li></ul><ul><li>Aumenta o diâmetro dos flagelos  visível ao microscópio óptico; </li></ul>
  • 57. Recomendações <ul><li>Toda amostra é potencialmente contaminada; </li></ul><ul><li>Manipulação de material biológico  EPI; </li></ul><ul><li>Procedimento com risco com respingos  cabine de segurança; </li></ul><ul><li>Não pipetar com a boca; </li></ul>
  • 58. Recomendações <ul><li>Não reencapar agulhas; </li></ul><ul><li>Descartar em recipiente adequado; </li></ul><ul><li>Material contaminado deve ser descontaminado antes do descarte; </li></ul><ul><li>Determinar área limpa e contaminada; </li></ul>
  • 59. Recomendações <ul><li>Limpar e desinfetar todas as áreas de trabalho; </li></ul><ul><li>Manter bancadas organizadas; </li></ul><ul><li>Não estocar material contaminado; </li></ul><ul><li>Tirar jaleco quando sair do setor; </li></ul>
  • 60. Recomendações <ul><li>Lavar as mãos sempre; </li></ul><ul><li>Separar materiais em sacos de lixo; </li></ul><ul><li>Todos os reagentes identificados; </li></ul>
  • 61. Recomendações <ul><li>Ter manual de procedimento; </li></ul><ul><li>Estocar inflamáveis  local adequado; </li></ul>
  • 62. Acidentes <ul><li>Sempre pedir ajuda; </li></ul><ul><li>Não omitir fatos; </li></ul><ul><li>Material biológico  superfície  hipoclorito 2%; </li></ul>
  • 63. Acidentes <ul><li>Material biológico  pele  sabão e álcool 70%; </li></ul><ul><li>Material biológico no jaleco  lavagem; </li></ul>

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