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Biologia Molecular

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  • 1. Polymerase Chain Reaction (PCR) Prof. Msc. Eduardo Honda
  • 2. A invenção da PCR
    • 1983 Kary Mullis
    • 1985 1º paper
    • 1993 Nobel da Química
  • 3. PCR, a ferramenta do futuro
    • Grande quantidade de DNA em pouco tempo.
    • Baixo custo
    • A amostra de DNA não necessita de estar altamente purificada.
    • PCR pode amplificar uma única molécula de DNA / RNA.
    • O produto do PCR pode ser digerido com enzimas de restrição, sequenciado ou clonado.
  • 4. A reacção
  • 5. O que envolve a reacção?
    • DNA Template
    • Tampão da reacção (Tris, iões amónio (e/ou iões de potássio), iões de magnésio soro de albumina de bovino)
    • Nucleótidos (dNTPs)
    • Primers
    • DNA polymerase (pex: Taq, Pfu )
  • 6. Quantos ciclos?
  • 7. Fidelidade da reacção
    • A Taq comete ERROS
    • Qual a importância dos erros?
    • Como superá-los?
  • 8. Termo-Cicladores
  • 9. Funcionou?
    • Se não…o que fazer?
  • 10. Optimização da reacção de PCR
    • Temperatura
    • Tempos
    • Concentração de Mg 2+ na reacção.
    • Quantidade de template e de polymerase
  • 11. DNA polimerases..
    • E. coli
    • Taq
    • Pfu – proofreading
    • rTth DNA Polymerase
  • 12. Concepção dos PCR Primers
    • Comprimento: especificidade vs eficácia
    • Temp de annealing
    • Composição de bases
    • Extremidade 3’
    • Regiões repetitivas do DNA
    • Enzimas de restrição
    • Estrutura secundária
      • Homologias Intra e Inter-primer
  • 13. Primers a formar Hairpins e Dímeros
    • Complementaridade intra-primer – dobra em hairpin :
    • Dímero de primers (intra ou inter primer).
  • 14. Aplicações do PCR
    • Multiplex PCR
    • Real Time PCR
    • PCR na detecção de polimorfismos e mutações patológicas
    • PCR e a amplificação indiscriminada de sequências de DNA
    • PCR na amplificação de sequências de DNA desconhecidas
    • PCR assimétrico
    • PCR e clonagem de DNA genómico
    • PCR e clonagem de cDNA
    • PCR e DNA Fingerprinting: casos da Biologia Forense e da Filiação genética
  • 15. Multiplex PCR
  • 16. Real time PCR
  • 17. PCR usado na detecção de polimorfismos e mutações patológicas
  • 18. Para detectar polimorfismos de local de restrição
    • O que são polimorfismos?
    • Porque existem os polimorfismos?
    • Como se detectam esses polimorfismos?
  • 19. PCR específico para um alelo e detecção de mutações
    • Como se consegue discriminar entre duas sequências alvo que difiram num único nucleotídeo?
    • Um só nucleotídeo faz a diferença?
    • Como se interpretam os resultados?
  • 20.
    • Qual a vantagem?
    PCR permite amplificação indiscriminada de sequências de DNA
  • 21. Linker-primed PCR
    • Como decorre?
    • O que é o linker?
    • Que primers são usados?
  • 22.
    • Qual a vantagem?
    PCR usado para amplificar uma regiões desconhecidas que flanqueiam uma região previamente caracterizada
  • 23. PCR inverso
    • Quando se utiliza?
    • Como são os primers?
    • Como decorre o processo?
  • 24. Os produtos amplificados do PCR são usados na sequenciação de DNA
  • 25. PCR assimétrico
    • Com que fim se utiliza?
    • Porquê assimétrico?
  • 26. Clonagem de DNA genómico ↓ Clonagem de cDNA ↓
  • 27. PCR e DNA Fingerprinting Exemplo: “locus” D1S80
  • 28. PCR e DNA Fingerprinting
    • Suas principais aplicações:
    • Biologia forense (ex. confirmação do autor de um crime)
    • Filiação genética (ex. testes de paternidade)
  • 29.  
  • 30. PCR e Filiação genética Pai Mãe
  • 31. O futuro da PCR
    • PCR ↔ material genético
    • Fotocopiadora ↔ material escrito
    • tornando a cópia
    • fácil, barata, acessível
  • 32. O futuro da PCR
    • Com a técnica de PCR iremos desvendar o nosso passado genético, bem como abrir o caminho para um futuro geneticamente traçado.
  • 33. Referências
        • Tom Strachan, Andrew P. Read Human: Molecular Genetics ;BIOS Scientific Publishers Limited; 1996; USA
        • James D. Watson, Michael Gilman, Jan Witkwoski, Mark Zoller: Recombinant DNA; second edition ; 1992; New York,Scientific American Books
        • Geoffrey M Cooper: The Cell , a molecular approach; second edition
        • Alkami quick guide tm for PCR
        • Rui Pereira; Biologia forense; Nov 2004
        • A. Silva, A. Fonseca, C. Teixeira, E. Sousa; FCUP; Testes de paternidade
        • Raymond Dalgleish; Department of Genetics; The Polymerase Chain Reaction (PCR)