Presentacion elisa

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Presentacion ELISA
Elaborada por: Leomar Alexandra Palacios

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Presentacion elisa

  1. 1. Elaborado por:Br. Leomar Palacios
  2. 2. • El nombre enzyme-liked immunosorbent assay, luego abreviado como ELISA, fue acuñado por los investigadores suecos Eva Engvall y Peter Perimann, los cuales describieron el procedimiento, publicado en 1971.• Las aplicaciones mas interesantes se iniciaron en el campo de la microbiología y parasitología.
  3. 3. Ensayo de InmunoAbsorción Ligado a Enzimas.• Se considera ligado a enzima porque una enzima se une químicamente a un anticuerpo en las dos versiones de la prueba (indirecta y directa)• El inmunoabsorvente, se refiere al hecho de que los antígenos o anticuerpos son adsorvidos a un plástico.ELISA puede investigar la presencia de un antígeno o de un anticuerpo.
  4. 4. DEFINICIÓN • El ELISA se basa e el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática.• Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico• El cual al actuar la enzima, producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
  5. 5. • Los antígenos son, por definición, generadores de anticuerpos.• Incluyen proteínas, polisacáridos y varias moléculas pequeñas, que estimulan la producción de anticuerpos.• Los antígenos son, a menudo, moléculas que se definen como <no propias> o extrañas, para el organismo.• Hay <antígenos propios> que actúan como etiquetas de identificación
  6. 6. • Son la respuesta del organismo ante la presencia de un agente infeccioso.• Los anticuerpos son moléculas proteicas secretadas por los plasmocitos, y tienen una altísima afinidad por sus antígenos correspondientes.• Anticuerpos se caracterizan por: – Ser Defensa natural – Tener Utilidad terapéutica – Tener Utilidad Diagnóstica Marcador de Infección o exposición. Detección de antígenos• Los anticuerpos utilizados en el método ELISA son de origen monoclonal o policlonal.
  7. 7. • Anticuerpos Policlonales Heterogéneos Reconocen epítopes diferentes del Ag Producidos por numerosos clones de Linfocitos B• Anticuerpos Monoclonales Homogéneos Especificidad única Producidos por un único clon de Linfocitos B
  8. 8. Se utilizan para asegurar que la pruebaesta funcionando correctamente• Control POSITIVO Incluyen una sustancia que se sabe quereaccionara positivamente, proporcionandoasí, un patrón sobre el cual basar losresultados.• Control NEGATIVO Incluyen sustancias que no debenreaccionar .
  9. 9. Ag o Ac Ag o Ac Conjugado:fijado a en la Ac unido a SUSTRATOuna fase Muestra ENZIMASólida CAMBIO DE COLOR
  10. 10. • FASE SÓLIDA• Antígeno o Anticuerpo• Conjugado: ENZIMA• SUBSTRATO
  11. 11. SE PUEDEN UTILIZAR DOS TIPOS DE SUSTANCIAS• Las que favorecen la adsorción física (por fuerzas electroestáticas) de las moléculas de Ags o Acs: poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, nylon y silicona.• Las que permiten la fijación covalente de esos reactivos: acrilamida, celulosa y isoticianato• Los mejores resultados se obtienen con el peliestireno y el polvinilo, por su rigidez, transparencia y propiedades adsortivas.
  12. 12. La enzima escogida como marcador debe: • Unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos, • Encontrarse en estado puro a un precio razonable y• Tener un substrato cromogénico o fluorogénico conveniente y de fácil preparación. Las enzimas más utilizadas son fosfatas alcalina, peroxidasa de rábano y ß- galactosidas
  13. 13. La elección del substrato es de gran importancia parala estandarización del método ELISA y hay que tener varios factores en cuenta, como son sensibilidad, especificidad, facilidad de lectura, así como estabilidad después de la reacción. Requerimientos del sustrato • Solubles en agua • Fácil de manipular • No tóxicos, no mutagénicos • Bajo costo
  14. 14. Los métodos de ELISA dependiendo de la actividadenzimática se dividen en dos tipos:• Competitivos• No competitivos• ELISA COMPETITIVO: En este método, el anticuerpo de la muestra va a competircon el conjugado por un número limitado de sitios de unión delantígeno. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido aque el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sidodesplazado por el anticuerpo presente en la muestra.
  15. 15. • ELISA NO COMPETITIVO: Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color Dentro de los no competitivos tenemos:• Los directos que detectan antígenos• Los indirectos que detectan anticuerpos
  16. 16. • Si la prueba se diseña para detectar un antígeno, es un ELISA DIRECTO porque esta buscando directamente, como su nombre lo dice, la sustancia extraña.• En cambio, un ELISA INDIRECTO, por su parte, se diseña para detectar los anticuerpos que el paciente ha creado contra el antígeno
  17. 17. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcadocontra el primario. La detección tienemayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario.
  18. 18. Materiales Orgánicos• Las Muestras del Paciente (Saliva, orina, heces, sangre, etc.)• Antígenos• Anticuerpos• Enzimas Materiales No Orgánicos• Microplacas de 96 pocillos de plástico con fondos de pocillo ópticamente claros, pipeta multicanal, pipeta de 100µ.• Espectrofotómetros de lectura de placas (lectores ELISA).
  19. 19. • Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
  20. 20. • Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado
  21. 21. Prueba ELISA IndirectaLeyenda Anticuerpo Antígeno Ligado a Enzima Anticuerpo Sustrato Primario
  22. 22. • Detección de antígenos o anticuerpos: Virus Hongos Parásitos Bacterias.• Detección de autoanticuerpos: IgG(Factor reumatoideo) DNA Proteína del núcleo
  23. 23. • Medición de Hormonas:Progesterona, estrógenos, cortisol, insulina, testosterona, gonadotropina coriónica humana, TSH.• Detección de antígenos tumorales: Antígeno prostáticoAlfa-fetoproteína Antígeno del ovario Antígeno carcinoembrionario
  24. 24. • En estudios serológicos, hematológicos, endocrinológicos, oncológicos, en los transplantes, la medicina forense y la antropología.• Con propósitos médicos se han aplicado en la determinación de hormonas y proteínas plasmáticas, antígenos tumorales, drogas, Ag y Ac de microorganismos (parásitos, hongos, bacterias, virus)• Los resultados aportan elementos diagnósticos, información de una enfermedad y coadyudan en la planificación del tratamiento

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