Estructura De Las Enzimas

Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) Tema 4 Enzimas 1

Esquema del Tema •Catalizadores biológicos •Nociones de cinética química –Enzimas •Cinética de la catálisis –Ribozimas enzimática •Centro activo –Modelo cinético de Michaelis- Menten –Especificidad •Estado preestacionario –Complementariedad •Estado estacionario –Interacciones débiles •Ecuación de Michaelis-Menten •El estado de transición •Representaciones gráficas –Inhibición enzimática •Modelos del complejo •Inhibición irreversible enzima-sustrato •Inhibición reversible –Llave y cerradura •Análisis gráfico de la inhibición Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) –Ajuste inducido •Mecanismos moleculares de •Clases de enzimas regulación enzimática •Cofactores enzimáticos 2

Catalizadores Biológicos • Catalizador: Ejemplos de reacciones catalizadas – Aumenta la velocidad de Anhidrasa reacción carbónica – No varía ΔG de la reacción – Facilita la reacción en condiciones no extremas – No se consume durante la • Convierte 6x105 moléculas por segundo reacción • 107 veces más rápida que sin enzima • Los catalizadores biológicos son: Proteasa – Casi siempre proteínas (enzimas) – Excepcionalmente RNA Péptido o Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) catalítico (ribozimas) proteína • 1011 veces más rápida • La especifidad depende de R1 3

El Centro Activo • Las enzimas son específicas por sus Uracilo sustratos (parte del Sustrato) – Interacción precisa enzima- sustrato – Sitio de interacción: “centro activo” Treonina • Hendidura tridimensional • Zona pequeña de la enzima vo cti Serina • Propiedades especiales para o a tr la unión y catálisis del C en sustrato – Sustrato y centro activo Ribonucleasa tienen formas Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) complementarias – Interacción a través de enlaces débiles 4

El Estado de Transición Explicación termodinámica • La reacción transcurre a través de un estado S S* P de transición (S*) – Intermedio entre S y P Estado de – Mayor energía que S transición S* Energía de activación • Barrera de energía de (No catali- activación zada) • La enzima facilita la (catalizada) formación de S* Sustrato (S) Energía libre – Reduce la energía de De activación reacción • Acelera la reacción Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) – S* es complementario Producto (P) con el centro activo Progreso de la reacción 5

Modelos del Complejo Enzima-Sustrato • La llave y la cerradura (Fischer, 1890) Sustrato – Centro activo y sustrato son perfectamente complementarios Complejo ES • Reconocimiento molecular Enzima • Ajuste inducido Estado de (Koshland, 1958) transición – La unión del sustrato Sustrato induce un cambio en el centro activo que aumenta Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) la complementariedad • Reconocimiento molecular Complejo ES dinámico Enzima 6

Clases de Enzimas • Oxidoreductasas • Liasas – Catalizan reacciones de – Catalizan la ruptura y oxidoreducción formación de enlaces • Deshidrogenasas, • Descarboxilasas, oxidasas, oxigenasas, deshidratasas, reductasas, peroxidasas desaminasas • Transferasas • Isomerasas – Catalizan transferencias de grupos – Catalizan reordenamientos • Fosfotransferasas moleculares • Transcarboxilasas, • Epimerasas, mutasas transaminasas, • Ligasas transmetilasas – Catalizan formaciones de • Hidrolasas enlace entre dos sustratos, – Catalizan la rotura de Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) con energía aportada por la enlaces por adición de agua hidrólisis de ATP • Esterasas, fosfatasas, peptidasas 7

Cofactores Enzimáticos • Componentes no proteicos requeridos para la actividad de la enzima – Apoenzima + cofactor = holoenzima – Dos tipos • Iones metálicos – Mg2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+, ... • Coenzimas – Moléculas orgánicas pequeñas, muchas son derivadas de las vitaminas Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) – Su carencia produce enfermedades 8

Nociones de Cinética Química • Velocidad de reacción • En condiciones de equilibrio k1 A B k -1 Consumo Formación de A de B En el equilibrio v = 0 Velocidad Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) [B] Constante de velocidad [A] 9

Nociones de Cinética Química • Reacciones sucesivas – La velocidad depende del paso más lento k1 k2 A B C B = Intermediario k Si k2 << k1, entonces B 2 C es el paso limitante de la reacción, y la velocidad depende sólo de k2 – Cuando la primera reacción es reversible, la llamamos preequilibrio k1 k2 A B C k -1 Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) Si k2 << k-1, entonces A y B pueden llegar virtualmente al equilibrio, y decimos que se alcanza un equilibrio rápido 10

Cinética de la Catálisis Enzimática Preequilibrio Producto k1 k2 E+S k -1 ES E+P Complejo enzima-sustrato (intermediario) Fase de afinidad: unión Fase de catálisis: de S al centro activo de E y transformación de S en P y formación del complejo ES recuperación de E Es el paso limitante Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) Constante de disociación del complejo ES Constante catalítica (kcat) 11

Modelo Cinético de Michaelis-Menten • Relaciona la velocidad de catálisis con la concentración de sustrato • Parte de los siguientes supuestos 1. P no se convierte en S – Es cierto cuando [P] es muy baja (al inicio de la reacción). Consideramos velocidades iniciales (V0) 2. k2< k-1 – Se alcanza el estado estacionario (velocidad de formación de ES igual a velocidad de descomposición de ES) – [ES] se considera constante Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) 3. [E] << [S] – [S] ≈ [S]inicial 12

Estado Estacionario Concentración Equilibrio Estado estacionario: d [ES] / d t ≈ 0 [E] Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) Estado Tiempo Pre-estacionario 13

Ecuación de Michaelis-Menten k1 k2 E+S k -1 ES E+P 1 Velocidad Inicial: 2 En el estado estacionario: Constante de Michaelis V0 alcanza el valor máximo cuando [ES]=[E]total Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) Ecuación de Michaelis (curva hiperbólica): 14

Representación de la Ecuación de Michaelis • Se representan valores de velocidad inicial , V0 , para distintos valores de concentración inicial de sustrato [S]1, [S]2, etc • V0 aumenta al aumentar [S], hasta llegar a la saturación ([ES] ≈ [E]total,se alcanza Vmax) • KM representa la [S] para la cual se alcanza la mitad de la Vmax • Vmax es un valor asintótico (se alcanza para [S] = ∞ ). No se puede obtener de la representación hiperbólica Equilibrio [S]4 Velocidad de reacción [S]3 Producto [S]2 Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) [S]1 Tiempo Concentración de sustrato [S] 15

Linealización de la Ecuación de Michaelis • Para determinar Vmax y KM con precisión la ecuación de Michaelis se transforma en una función lineal • Representación de Lineweaber-Burk (o de dobles inversos) Inverso Pendiente: 1/ V0 KM / Vmax 1/ Vmax Recta Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) Ordenada en Pendiente 1/ [S] el origen -1/ KM 16

Significado de la KM • Dos significados – KM es la [S] para cual V0 = ½Vmax • Representa la [S] necesaria para que ocurra una catálisis significativa – Cuando k2 << k-1, KM ≈ KS (constante de disociación del complejo ES) ≈ • Representa la inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato • KM Tiene unidades de concentración (M) • Para una enzima determinada Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) – KM varía según el sustrato y las condiciones (pH, temperatura, fuerza iónica, ...) 17

Significado de Vmax y k2 (kcat) • Vmax revela el número de recambio de la enzima – Número de recambio = kcat • número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo y por cada molécula de enzima, en condiciones de saturación k1 k2 E+S k -1 ES E+P 1 / kcat es el tiempo necesario para la Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) Unidades Unidades: Unidades: conversión de una molécula : M s-1 M s-1 de sustrato en producto (un ciclo catalítico) 18

Eficacia Catalítica (kcat / KM) • En condiciones fisiológicas las enzimas no se encuentran saturadas ([S] < KM) – En estas condiciones k [E] [S] [E]o [E] V = o cat o K +[S] M [S] despreciable vs KM k V = o cat [E ][S ] K M ! • Constante de velocidad para la interacción entre EyS Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) • Representa la eficacia catalítica de la enzima ! • Sirve para comparar la preferencia de una enzima por diferentes sustratos • Unidades: M-1s-1 19

Inhibición Enzimática • Inhibición: Disminución de la actividad de una enzima por acción de un inhibidor – Irreversible • El inhibidor se une fuertementa a la enzima – Ejemplos: » La ampicilina: Modifica covalentemente una transpeptidasa responsable de la síntesis de la pared celular bacteriana » La aspirina: Modifica covalentemente una ciclooxigenasa que produce señales inflamatorias – Reversible Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) • El inhibidor se une a la enzima por enlaces débiles, y el complejo EI se encuentra en equilibrio con las formas libres 20

Inhibición Reversible Competitiva Inhibidor Sustrato • El inhibidor se une a competitivo la enzima libre – Compite con el sustrato • Puede ser superada a [S] elevada. No afecta a la Vmax (ni a la kcat) • Afecta a la KM Sin inhibidor Velocidad de reacción – Aumenta (KM aparente > KM ) – Suelen ser moléculas similares al sustrato Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) o análogos del estado de transición [S] 21

Inhibición Reversible No Competitiva Sustrato Inhibidor no competitivo • El inhibidor se une tanto al E y como al complejo ES – Se une en un sitio distinto del sitio activo • No se supera con [S] Sin inhibidor elevada Velocidad de reacción • Vmax disminuye – Vmax aparente < Vmax Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) • No afecta a La KM [S] 22

Análisis Gráfico de la Inhibición Inhibición competitiva Inhibición no competitiva + Inhibidor + Inhibidor competitivo no competitivo Sin Sin inhibidor -1/Vmaxap 1/Vmax inhibidor -1/KM 1/Vmax -1/KMap -1/KM Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) 23

Mecanismos Moleculares de Regulación Enzimática • Permiten la adaptación de la actividad a necesidades fisiológicas, estados del desarrollo o condiciones ambientales – Regulación temporal/espacial • Utilización de isoenzimas – Regulación lenta • Control de la disponibilidad y de la vida media de la enzima – Regulación rápida • Control alostérico • Modificación covalente Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) – Reversible – Irreversible 24

Isoenzimas • Son distintas formas de una misma enzima – Enzimas homólogas presentes en un mismo organismo • Cada isoenzima en un tejido diferente o en un momento del desarrollo diferente • Catalizan la misma reacción, con pequeñas diferencias – Pequeñas diferencias en su secuencia » Diferencias en su estructura Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) » Distintos valores de KM y/o Vmax » Distintas propiedades reguladoras 25

Vida Media y Disponibilidad de las Enzimas • Muchas enzimas presentan una vida media corta – En las células existe un recambio proteico constante – La concentración de las enzimas se encuentra regulada • A través de la regulación de su síntesis – Regulación de la transcripción y de la traducción • A través de la regulación de su degradación Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) – Mediada por ubiquitina y ejecutada por el proteasoma 26

Enzimas Alostéricas • Contienen varios centros y varias subunidades V – Centros activos – Centro reguladores • Efecto alostérico – A través de cambios conformacionales [sustrato] • Efecto homotrópico – Entre centros equivalentes Estado R • Cooperatividad – Curvas sigmoides V – No siguen la cinética de Michaelis-Menten Estado T Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) • Efecto heterotrópico – De centros reguladores sobre centros activos sustrato 27

Ejemplo de Enzima Alostérica Primer paso de la ruta de síntesis de nucleótidos de pirimidina Aspartato transcarbamilasa ATCasa Ruta de 9 pasos + Carbamilfosfato Aspartato N-carbamilaspartato Re tro n ció -in iv a t Ac hib i Producto final de la ruta ció ATP n Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) Purinas Producción energética Citidin trifosfato CTP 28

Estructura de la ATCasa Estructura cuaternaria: dos trímeros catalíticos + tres dímeros reguladores Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) 29

Regulación Alostérica de la ATCasa Mecanismo de inhibición: Mecanismos de cooperatividad Los inhibidores estabilizan y de activación: las formas de baja afinidad Los sustratos y los activadores (o formas T) estabilizan las formas de alta afinidad (o formas R) Estado T Estado R (menos activo) (más activo) Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) Favorecido por la unión del Favorecido por la unión de Inhibidor (CTP) los sustratos y del activador (ATP) 30

Activación e Inhibición Alostérica Inhibición Activación Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) Menor actividad y curva menos Mayor actividad y curva más sensible a la concentración de sensible a la concentración de sustratos sustratos 31

Modificación Covalente • Irreversible • Reversible – Activación por – Unión covalente de rotura proteolítica un grupo químico de precursores que altera las inactivos propiedades (zimógenos) catalíticas de la • Enzimas de la enzima digestión • Fosforilación- • Cascada de desfosforilación coagulación • Oxidación-reducción • Activación de • Acetilación- Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) caspasas en desacetilación apoptosis 32

Cascada de la Coagulación Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) 33

Regulación por Fosforilación Reversible • Fosforilación – Transferencia de grupo fosforilo desde el ATP a grupos –OH de Ser Thr o Tyr – Catalizada por proteínas quinasa – A menudo desencadenan efectos amplificados • Una sola quinasa activa centenares de otras enzimas. A su vez cada una de ellas activará centenares de otras enzimas, ... • Desfosforilación – Eliminación de grupo fosforilo de proteína Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) fosforilada – Catalizada por proteína fosfatasa 34

Cascada de Fosforilación Reversible PKA phosphorylase phosphorylase kinase b kinase a P PP phosphorylase b phosphorylase a P PP glycogen n glycogen n-1 + glucose 1-P glucose-6-P Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) glucose glycolysis (liver) & TCA cycle (muscle) 35

Regulación de rutas Metabólicas • Control a nivel de sustrato – La acumulación de producto inhibe la acción de la enzima Glucosa + ATP Hexoquinasa Glucosa-6-P + ADP Inhibición • Control por retroinhibición – El producto final de una ruta inhibe el primer paso de la ruta Bioquímica gD Tema 4 (UVEG) A B C D N Retroinhibición 36

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Estructura De Las Enzimas

by leamotoya on Aug 11, 2009

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