• Save
Dr. Reichart Olivér, Dr. Szakmár Katalin: MicroTester - Új módszer a mikrobiológiában
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×
 

Like this? Share it with your network

Share

Dr. Reichart Olivér, Dr. Szakmár Katalin: MicroTester - Új módszer a mikrobiológiában

on

  • 815 views

 

Statistics

Views

Total Views
815
Views on SlideShare
665
Embed Views
150

Actions

Likes
0
Downloads
0
Comments
0

4 Embeds 150

http://www.microtest.hu 109
http://www.microtest.co.hu 36
http://microtest.hu 4
http://131.253.14.66 1

Accessibility

Categories

Upload Details

Uploaded via as Microsoft PowerPoint

Usage Rights

CC Attribution License

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Processing…
Post Comment
Edit your comment

Dr. Reichart Olivér, Dr. Szakmár Katalin: MicroTester - Új módszer a mikrobiológiában Presentation Transcript

  • 1. 1
  • 2. MICROTESTER ÚJ TECHNIKA A MIKROBIOLÓGIÁBAN A redox-potenciál mérésen alapuló gyors vizsgálati módszer elméleti háttereDr. Reichart OlivérDr. Szakmár KatalinBudapest, 2012. február 15. 2
  • 3. MIKROBIOLÓGIAI MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS PROBLÉMÁI Probléma: • Klasszikus tenyésztéses módszerek időigénye nagy (1 -3 nap). • A nagy időigény miatt az eredmények nem csatolhatók vissza a technológiába. Cél: • Durva mikrobiológiai problémák gyors kiszűrése • Gyors tételminősítés • Átmeneti tárolási idő csökkentése Megoldás: • Gyors mikrobiológiai vizsgálati módszerek 3
  • 4. GYORS MÉRÉSI MÓDSZEREKÉlő és holt sejtek együttes számának meghatározása:• Direkt számlálás (csak tiszta folyadékban alkalmazható) • Számlálókamra • Flow cytometer• Turbiditásmérés (csak tiszta folyadékban alkalmazható)• ATP mérés (mikrobiális és élelmiszer eredetű ATP elkülönítése nehéz)Élősejtszám meghatározása:• Impedancia mérésen alapuló módszerek • Malthus • Rabit • Bactrac• Redox-potenciál mérése 4
  • 5. REDOXPOTENCIÁL MÉRÉSEN ALAPULÓ VIZSGÁLATI MÓDSZER A BCE ÉTK Fizika- és Automatizálás Tanszék és a SZIE ÁOTK Élelmiszer-higiéniai Tanszék kutatói által kifejlesztett és szabadalmaztatott eljárás. MicroTester
  • 6. MIT TUD A MICROTESTER?• Gyors módszer, különösen nagy mikroba-számú minták esetében.• Egyszerű mérési technika.• Szabványos táptalajok használhatók.• A redox-görbe alakjából következtetni lehet a mikroba- csoportra.• Nagyon széles (100-108) sejtszám-tartományban hígítás nélkül alkalmazható.• Különösen célszerű membrán-szűréses módszer kiértékelésére.
  • 7. A MICROTESTER ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉGEIDirekt mérés:• Szaporodás közvetlen detektálása a táptalaj redox- potenciál változása alapjánIndirekt mérés:• Szaporodás detektálása a CO2 termelés alapján 7
  • 8. DIREKT MÉRÉSElméleti alapok:• A szaporodás energiaforrása a biológiai oxidáció, ami a környezetben redukciót eredményez.• Biológiai rendszerekre jellemző általános redox reakció: [Oxidant] + [H+] + n e- [Reductant]• Nernst egyenlet: Eh = E0 + R ⋅T ⋅ ln [ ] [ oxidant ] ⋅ H + n⋅F [ reductant ]
  • 9. A REDOX-POTENCIÁL VÁLTOZÁSÁVAL A SZAPORODÁS NYOMON KÖVETHETŐ E. coli szaporodás 1/2 TSB-ben 400 8,5 300 8 200 7,5 lgN (N=cfu/ml) 100 7 Eh (mV) 0 6,5 -100 6 -200 5,5 -300 5 -400 4,5 0 60 120 180 240 300 t (min) Eh mV lgN 9
  • 10. KÜLÖNBÖZŐ BAKTÉRIUMOK REDOX-GÖRBÉI Redox görbék TSB-ben 400 200Eh (mV) 0 -200 -400 0 5 10 15 20 t (h) steril Ps.aer. E.coli St. aur. Ent. faec. B.subt. 10
  • 11. MICROTESTER MÉRŐBERENDEZÉS (16 csatorna) 11
  • 12. MICROTESTER MÉRŐCELLÁKdirekt mérőcella kémcső cella indirekt mérőcella 12
  • 13. A SZAPORODÁS DETEKTÁLÁSA TENYÉSZTÉSES MÓDSZEREKNÉLLemezöntés, szélesztés• Látható telepek kialakulása – Különálló (feltételezetten 1 telepképző egységből kiinduló), kb. 106 – 107 sejtből álló populáció.Határhígítás (MPN)• Látható zavarosodás kialakulása, steril csövek jelenléte. – Néhány (max. 10) sejtből kb. 107-108 sejt/ml sűrűségű populáció.
  • 14. A SZAPORODÁS DETEKTÁLÁSA REDOX-POTENCIÁL MÉRÉSNÉL• A redox-potenciál változásának sebessége haladja meg az előírt kritikus értéket.• Detektációs kritérium: pl: |dE/dt|> 0,5 mV/min Mikroorganizmustól és tápoldattól függően 0,4 – 1,0 mV/min közötti érték.
  • 15. A REDOX-GÖRBE JELLEMZŐ PARAMÉTEREI 15
  • 16. MICROTESTER DETEKTÁCIÓS KRITÉRIUMOKHOZ TARTOZÓ MIKROBASZÁMOK M ik r o b a T á p o ld a t k r it é r iu m M ik r o b a s z á m ( m V / m in ) lg N C F U /m l E . c o li T S B 3 7 °C - 1 ,0 6 ,2 1 , 6 ∙1 0 6 P s . a e r u g in o s a T S B 3 7 °C - 0 ,4 6 ,3 2 ,0 ∙ 1 0 6 E n t e r o c o c c u s f a e c a lis T S B 3 7 °C - 0 ,5 6 ,7 5 ,0 ∙ 1 0 6 S t a p h y lo c o c c u s a u r e u s T S B 3 7 °C - 1 ,0 6 ,4 2 ,5 ∙ 1 0 6 B a c illu s c e r e u s T S B 30 °C - 0 ,8 6 ,5 3 ,2 ∙ 1 0 6
  • 17. TENYÉSZTÉSES MÓDSZEREKHEZ TARTOZÓ DETEKTÁCIÓS IDŐK Detektációs idő (Time To Detection, TTD): a detektációs kritérium eléréséig szükséges idő. Lemezöntés, szélesztés • Látható telepek kialakulása (106–107 sejt) • 1 sejtből indulva Független a kiinduló mikrobaszámtól. Határhígítás (MPN) • Látható zavarosodás kialakulása (107-108 sejt/ml) • 1-10 sejtből indulva Független a kiinduló mikrobaszámtól.
  • 18. MICROTESTER DETEKTÁCIÓS IDŐK106–107 sejt/ml koncentráció elérése az inokulumrólindulva. A kiindulási sejtszám függvénye.Meghatározva a TTD és a kiindulási sejtkoncentráció közöttiösszefüggést, kalibrációs görbe alapján a kiindulásimikrobák száma (lgNo) TTD méréssel becsülhető.
  • 19. A KIINDULÁSI SEJTSZÁM HATÁSA A REDOX-GÖRBÉRE E. coli 1/2 TSB-ben 400 300 200Eh (mV) 100 0 -100 -200 -300 -400 0 2 4 6 8 10 12 14 t (h) steril lgN=0,09 lgN=2,38 lgN=3,39 lgN=4,25 lgN=4,80 19
  • 20. KALIBRÁCIÓS GÖRBE E. coli 1/2 TSB-ben y = -1,1736x + 8,4416 R2 = 0,9851 10 8TTD (h) 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 lgN (cfu/ml) 20
  • 21. MÉRÉSI MÓDSZEREK KALIBRÁCIÓS GÖRBE NÉLKÜLJelenlét/hiány próba:• Minta közvetlen beoltásaNagyságrendi becslés (Titer):• Hígítási sor készítése, mérés• Eredmény megadása nagyságrendkéntMPN módszer:• Hígítási sor készítése• Hígításonként beoltások• Kiértékelés automatikusan
  • 22. MÉRÉS ELŐZETESEN FELVETT (KÜLSŐ) KALIBRÁCIÓS GÖRBE ALAPJÁNKalibrációs görbe felvétele:• Telepszám és TTD összefüggés meghatározása.• Egyenlet betáplálása a gépbe.Mikroba (telepképző egység) szám meghatározás:• Közvetlenül a mintából.• Előzetesen hígított mintából.• Előzetesen koncentrált (membránszűrt) mintából.Probléma:• Csak akkor alkalmazható, ha a mikroflóra összetétele ismert és van kalibrációs görbénk.
  • 23. MÉRÉS MINTÁBÓL FELVETT (BELSŐ) KALIBRÁCIÓS GÖRBE ALAPJÁNMPN módszeren alapuló kiértékelés:• Hígítási sor készítése hígításonként egy, vagy több leoltással.• Redox-görbék felvétele.• A TTD értékek meghatározása. (Ha szükséges.)• Szaporodást mutató és nem mutató hígítási szintek alapján az MPN érték meghatározása.• Az MPN érték és a különböző hígítási szintekhez tartozó TTD értékek ismeretében a kalibrációs görbe felvétele.• A kalibrációs görbe alapján a hasonló minták mikrobaszámának kiszámítása.
  • 24. ESCHERICHIA COLI BELSŐ KALIBRÁCIÓS GÖRBÉJÉNEK FELVÉTELE 1. 24
  • 25. ESCHERICHIA COLI BELSŐ KALIBRÁCIÓS GÖRBÉJÉNEK FELVÉTELE 2. 25
  • 26. ESCHERICHIA COLI BELSŐ KALIBRÁCIÓS GÖRBÉJÉNEK FELVÉTELE 3. 26
  • 27. INDIREKT MÉRÉSElméleti alapok:• A szaporodás során keletkező CO2-ot lúgban elnyeletjük és az oldat redox-potenciál változását mérjük.• Az elnyelető oldatban a potenciál-meghatározó összefüggés: E = E0 + R ⋅T ⋅ ln [ ][ ] H + ⋅ HCO3− z⋅F [ ] CO32−
  • 28. INDIREKT MÉRÉS Saccharomyces cerevisiae 600 550 500 450Eh (mV) 400 350 300 250 200 0 10 20 30 40 50 t (h) lgN=4,1 lgN=3,1 lgN=2,1 lgN=1,1 lgN=0,1 Steril 28
  • 29. INDIREKT MÉRÉS KALIBRÁCIÓS GÖRBÉJE Saccharomyces cerevisiae . TTD(h) = -7.2048 lgN + 41.254 (detektációs kritérium: dE/dt=0.2 mV/min) 2 R = 0.9856 45 40 35 30 TTD (h) 25 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 lgN (cfu/cella) 29
  • 30. INDIREKT MÉRÉS• Kísérletileg beállított koncentrációkkal az összefüggés jól reprodukálhatóan mérhető.• Megfelelő koncentrációjú lúgoldat alkalmazásával a redox-potenciál változásából az elnyelt CO2 mennyisége számítható.• Alapul szolgálhat a képződő CO2 mennyiségi meghatározásához (BOI mérés).• Nagy BOI értékek esetén a predikció jelentős időmegtakarítást tesz lehetővé. 30
  • 31. BOI BECSLÉSE INDIREKT MÉRÉS ALAPJÁN Szennyvíz 350 300 Eh (mV) 250 200 150 0 50 100 150 BOI=400 mg/l BOI=200 mg/l BOI=100 mg/l t (h) 31
  • 32. BOI PREDIKCIÓ REDOX-POTENCIÁL MÉRÉS ALAPJÁN Nyers szennyviz y = 26,179x - 15,58 R2 = 1 100 80 BOI0 = 400 mg/lTTD (h) 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 BOI0/BOI 32
  • 33. MICROTESTER MÉRŐBERENDEZÉS (32 csatorna) 33
  • 34. MICROTESTER MÉRŐBERENDEZÉS (2 csatorna) 34
  • 35. A redox-potenciál mérésen alapuló gyors vizsgálati módszer validálva, validálva és élelmiszeripari vizsgálatokra akkreditálva van. 35
  • 36. Köszönöm a figyelmet! microtest1@t-online.hu Budapesti Corvinus EgyetemÉlelmiszertudományi Kar – Fizika-Automatika Tanszék Microtest Kft. 36