Your SlideShare is downloading. ×
Dr. Szakmár Katalin: A Microtester gyakorlati alkalmazásai
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Thanks for flagging this SlideShare!

Oops! An error has occurred.

×
Saving this for later? Get the SlideShare app to save on your phone or tablet. Read anywhere, anytime – even offline.
Text the download link to your phone
Standard text messaging rates apply

Dr. Szakmár Katalin: A Microtester gyakorlati alkalmazásai

688
views

Published on

Published in: Technology

0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total Views
688
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
1
Actions
Shares
0
Downloads
0
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

Report content
Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
No notes for slide

Transcript

  • 1. 1
  • 2. A MICROTESTER GYAKORLATI ALKALMAZÁSADr. Szakmár KatalinBudapest, 2012. február 15. 2
  • 3. A MICROTESTER ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉGEIMinőség ellenőrzés • Élelmiszerek • Víz • Felületek • LevegőMikroba-pusztulási és szaporodásgátlási vizsgálatok • Fertőtlenítőszerek hatékonyságának vizsgálata • Antibiotikumok szaporodásgátló hatásának vizsgálata • Tartósítószerek hatékonyságának vizsgálataFermentációs iparok • Táptalaj optimalizálásKörnyezetvédelem • Baktériumok aktivitásának vizsgálata 3
  • 4. MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS ÉLELMISZEREKTejipari alkalmazások:• Nyerstej összcsíraszámának (mezofil aerob és fakultatív anaerob baktériumszám) meghatározása• Nyerstej Enterobaktérium számának meghatározása A kétféle meghatározás – redox görbék eltérő alakja miatt – egyszerre, egy táptalaj alkalmazásával elvégezhető 4
  • 5. ENTEROBAKTÉRIUM ÉS ÖSSZCSÍRASZÁM EGYIDEJŰ MEGHATÁROZÁSA Nyerstej, 1/2 TSB (T=30 °C) 500 400 300 200 Eh (mV) 100 0 -100 -200 -300 -400 0 5 10 15 20 25 t (h) 0. hig. 1. hig. 2. hig. 3. hig. 4. hig 5. hig 6. hig 7. hig.
  • 6. ENTEROBAKTÉRIUM ÉS ÖSSZCSÍRASZÁM EGYIDEJŰ MEGHATÁROZÁSA Nyerstej belső kalibrációs görbe y = 2,6486x + 1,34 2 (1/2 TSB, T=30 °C) R = 0,9895 20 MPNÖsszcsíra=2,3x106/ml 15 TTD (h) 10 MPNEnterob. =2,3x102/ml 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Összcsira Enterobacter hígítás
  • 7. MÓDSZEREK IDŐIGÉNYÉNEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA Lemezöntés MicroTesterMinta lgN Időigény (h) lg MPN Időigény (h) 1. 5,18 5,36 2. 5,06 5,36 3. 4,93 72 4,36 18 4. 6,35 6,36 5. 6,79 6,36
  • 8. NYERSTEJ VIZSGÁLATA KÖZVETLENÜL A TEJTERMELŐNÉLMicrotester Mini készülék alkalmazása:• A készülék a termelőhöz kihelyezhető• Kezelése viszonylag egyszerű• Az adatok a tejbegyűjtés időpontjában leolvashatók 8
  • 9. MICROTESTER MINI KÉSZÜLÉK
  • 10. A MÓDSZER IDŐIGÉNYE Nyerstej összcsíra kalibrációs görbéje y = -1,5014x + 15,413 (1/2 TSB, 30 °C) R2 = 0,9596 14 12 10TTD (h) 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 lgN /ml tej 10
  • 11. SALMONELLA KIMUTATÁSA Salmonella, tej, sajt, RVS 20 15 y = -1.524x + 15.3TTD (h) 10 y = -1.400x + 12.4 5 y = -2.268x + 19.8 0 0 2 4 6 8 10 lgN (cfu/cell) sajt tej RVS 11
  • 12. AZ RVS SZELEKTIVITÁSA RVS RVS + 10% tej TSB Mikroba TTD (h) TTD (h) TTD (h)Klebsiella - - 6,5 oxytocaEscherichia - - 1,6 coliCitrobacter - - 2,5 freundii Proteus - - 14 vulgaris 12
  • 13. KÜLÖNBÖZŐ SALMONELLÁK KALIBRÁCIÓS GÖRBÉI Salmonella 25 y = -3.512x + 25.6 20TTD (h) 15 y = -4.604x + 35.8 10 5 y = -1.512x + 13.8 0 0 2 4 6 8 lgN (cfu/cella) Salmonella Tiphymurium Salmonella Enteritidis Salmonella Abony 13
  • 14. SALMONELLA KIMUTATÁSA• MicroTester készülékkel a Salmonellák RVS tápoldatban kimutathatók.• Elődúsítás nem szükséges.• A zavaró mikroflóra az RVS-ben nem szaporodik.• Élelmiszerek (tej, sajt, stb.) a tápoldathoz adása a kimutatási időt csökkenti, de a szelektivitást nem befolyásolja.• A Salmonella jelenlétének igazolása a MicroTesterrel végzett mérés után, a gyanús mintákból PCR-al elvégezhető.
  • 15. LISTERIÁK KIMUTATÁSA Listeriák redox görbéi (1/2 Fraser, 37 °C) 500 400 300 200Eh (mV) 100 0 -100 -200 -300 -400 0 5 10 15 20 25 t (h) L. monocytogenes L. innocua L. ivanovi
  • 16. EGYESÍTETT KALIBRÁCIÓS GÖRBE 1/2 FRASERBEN TEJJEL ÉS TEJ NÉLKÜL Listeria monocytogenes TTD = -4.218. lgN + 36.99 R2 = 0.9798 35 30 25TTD (h) 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 lgN (cfu/cella) 1/2 Fraser 1/2 Fraser, tejjel 16
  • 17. LISTERIA MONOCYTOGENES KIMUTATÁSA • Fraser levesben a listeriák jelenléte a szokásos módszernél gyorsabban kimutatható. • A táptalaj szelektivitását a hozzáadott élelmiszer (tej) nem befolyásolja. • A tejben leggyakoribb zavaró mikroba, az E. coli a tápoldatban nem szaporodik. • A Listeria monocytogenes jelenléte csak további vizsgálatokkal (PCR) igazolható.
  • 18. MINŐSÉGELLENŐRZÉS ÉLELMISZEREKHúsipari alkalmazások:• Nyershús összcsíraszámának (mezofil aerob és fakultatív anaerob baktériumszám) meghatározása• Húskészítmények gyártásközi mikrobiológiai minőségellenőrzése
  • 19. NYERSHÚS ÖSSZCSÍRASZÁMA Nyershús 25 y = -2.9427x + 20.293 R2 = 0.9897 20 y = -3.15x + 19.456 R2 = 0.965 15TTD (h) y = -2.6833x + 20.498 R2 = 0.9633 10 y = -3.6081x + 26.46 5 R2 = 0.9851 0 0 1 2 3 4 5 6 7 marha sertés csirke darálthús lgN (cfu/cella) 19
  • 20. 2073/2005 EK RENDELET ELŐÍRÁSAI Élelmiszer kategória Mikrobák n c m MHasított szarvasmarha, Aerob mikrobaszám lgN=3,5 lgN=5,0 juh, kecske, lóHasított sertés Aerob mikrobaszám lgN=4,0 lgN=5,0Darált hús Aerob mikrobaszám 5 2 5x105 5x106Mechanikusan lefejtett Aerob mikrobaszám 5 2 5x105 5x106 hús 20
  • 21. KIMUTATÁSI IDŐK ÖSSZEHASONLÍTÁSA Határértékek Kimutatási idők (h) (2073/2005 EK) (N=cfu/g) Klasszikus MicrotesterlgN=3,5 10lgN=4,0 Hús 9lgN=5 aerob mikrobaszám 72 6lgN=5,7 5lgN=6,7 2
  • 22. HÚSKÉSZÍTMÉNYEK GYÁRTÁSKÖZI ELLENŐRZÉSE Húspép y = -0,54x + 8,5 2 R = 0,9637 10 8lgN (cfu/cella) 6 4 2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 TTD (h)
  • 23. HÚSKÉSZÍTMÉNYEK GYÁRTÁSKÖZI ELLENŐRZÉSE Virsli gyártásközi vizsgálati eredményeinek összehasonlítása 10 8lgN (cfu/g) 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 Minatvételi pont Lemezöntés Microtester
  • 24. KIMUTATÁSI IDŐK ÖSSZEHASONLÍTÁSA Mikrobaszám Kimutatási idő (h) (N=cfu/g) Lemezöntés Microtester lgN=6,1 7 lgN=7,6 4 lgN=6,8 72 5 lgN=5,8 7 lgN=7,6 4 lgN=7,5 4
  • 25. MINŐSÉGELLENŐRZÉS ÜDÍTŐITALOK• Üdítőitalok penész- és élesztőgomba számának meghatározása: – Indirekt mérés (a szaporodás során képződő CO2-ot KOH oldatban nyeletjük el és a KOH oldat redox-potenciál változását mérjük)
  • 26. INDIREKT MÉRŐCELLA
  • 27. INDIREKT MÉRÉS REDOX-GÖRBÉI Saccharomyces cerevisiae 600 500 Eh (mV) 400 300 200 0 10 20 30 40 50 t (h) lgN=4.1 lgN=3.1 lgN=2.1 lgN=1.1 lgN=0.1 steril 27
  • 28. PENÉSZ- ÉS ÉLESZTŐGOMBA KALIBRÁCIÓS GÖRBÉI Aspergillus niger Saccharomyces cerevisiae . (detektációs kritérium: dE/dt=0.2 mV/min) TTD(h) = -7.569 lgN + 60.7 . TTD(h) = -7.2048 lgN + 41.3 (detektációs kritérium: dE/dt=0.2 mV/min) R2 = 0.9677 2 R = 0.9856 70 50 60 40 50TTD (h) 30 TTD (h) 40 20 30 10 20 0 1 2 3 4 5 0 lgN (cfu/cella) 0 1 2 3 4 5 lgN (cfu/cella) 28
  • 29. MINŐSÉGELLENŐRZÉS VÍZ• Ivóvíz mikrobiológiai szennyezettségének gyors kimutatása• Ásványvíz mikrobiológiai gyártásközi minőségellenőrzése• Kezelt víz (pl. ioncserélt víz, R.O. víz, stb.) gyors mikrobiológiai vizsgálata• Fürdővizek mikrobiológiai állapotának gyors vizsgálata• Szennyvizek gyors mikrobiológiai vizsgálata
  • 30. KIMUTATÁSI IDŐK ÖSSZEHASONLÍTÁSA VÍZ Kimutatási idők (h) Határértékek Klasszikus Microtester módszer (1000 ml)Összcsíra 22 oC (100 cfu/ml) 22 (1 ml) 15 72 37 oC (20 cfu/ml) 10 (1 ml) 4Coliform (1/100 ml) 10 (100 ml) 9 24Escherichia coli (1/100 ml) 11 (100 ml) 10Ps. aeruginosa (1/100 ml) 20 (100 ml) 18 48Enterococcus (1/100 ml) 14 (100 ml) 12
  • 31. ÁSVÁNYVÍZ VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI Egy sejt kimutatásához szükséges Mikroba vizsgálati idő (h)Escherichia coli 11Citrobacter freundii 23Pseudomonas aeruginosa 24Enterococcus faecalis 15 31
  • 32. ÜZEMI ELLENŐRZŐ VIZSGÁLATOK 1.TYLICZ (TÉTELMINŐSÍTŐ VIZSGÁLAT) Egy membránon 3 x 250 ml-t szűrtünk, egy mérőcellába 4 membránt tettünk (egy mérőcellában egyszerre 12 palack minőségét ellenőriztük)Palackoksorszáma 1-12. 13-24. 25-36. 37-48. 49-60. 61-72.Laboratóriumimérés negatív negatív negatív negatív negatív negatíveredményeMicrotestermérés negatív negatív negatív negatív negatív negatíveredménye 32
  • 33. ÜZEMI ELLENŐRZŐ VIZSGÁLATOK 2. (Zalaszentgrót, Hoffmanné & Tar-Géri, 2008) Összes Egyezés a Fals pozitív Fals negatív Vizsgált eredmény eredmény mérés szabványos mikroba (db) vizsgálattal (%) (%) (%)Escherichia coli 942 99,89 0,11 0,00 Coliform 4674 99,87 0,00 0,13Enterococcus 3000 99,93 0,00 0,07Pseudomonas 3372 99,82 0,06 0,12 aeruginosa 33
  • 34. TERMÉSZETES FÜRDŐVÍZ Velencei tó (Agárd strand) 3lgN (cfu/100 ml) 2 1 0 -1 0 5 10 15 20 y = -0.8416x + 11.565 TTD (h) y = -0.299x + 4.7342 R2 = 0.9871 Enterococcus E.coli R2 = 0.9917
  • 35. VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA Escherichia coli (Agárd strand) 3.5 3lgN (cfu/100 ml) 2.5 Microtester 2 Plate (Szfv.) 1.5 OKI 1 0.5 0 1 2 3 minta sorszáma 35
  • 36. VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA Enterococcus (Agárd strand) 3,0 2,5lgN (cfu/100 ml) 2,0 Microtester 1,5 Plate (Szfv.) 1,0 OKI 0,5 0,0 1 2 3 minta sorszáma 36
  • 37. TOVÁBBI LEHETŐSÉGEK• Szennyvíz (Coliform: 10 cfu/ml) – Nagyobb mennyiség (100, 1000 ml) szűrésével a vizsgálati idő lerövidíthető• Szennyvíziszap mikrobiológiai ellenőrzése 37
  • 38. MÉRŐCELLA KÉT MEMBRÁNNAL 38
  • 39. SZENNYVÍZ MÉRÉSI EREDMÉNYEI Szennyvíz, coliform y = -1,1554x + 9,7 R2 = 0,9788 10 8 6TTD 4 2 0 0 2 4 6 8 lgN 39
  • 40. MICROTESTER MÉRŐBERENDEZÉS (32 csatorna) 40
  • 41. MINŐSÉGELLENŐRZÉS HIGIÉNIAI VIZSGÁLATOK• Felületek ellenőrzése (tamponos vizsgálattal)• Levegő mikrobiológiai tisztaságának ellenőrzése (membránszűréssel)
  • 42. TAMPONOS VIZSGÁLATKALIBRÁCIÓS GÖRBE FELVÉTELE 42
  • 43. FELÜLETEK Kalibrációs görbe felvétele Kalibrációs görbe y = -0.2859x + 7.2672 R2 = 0.9574 6 5lgMPN/cella 4 3 2 1 0 0 5 10 15 20 25 TTD (h) 43
  • 44. MIKROBASZÁM MEGHATÁROZÁSA 44
  • 45. FELÜLETEK Mérési eredmények összehasonlítása Felületek összcsíraszáma 7lgN (cfu/100 cm2) 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Mintavételi pont Lemezöntés Microtester 45
  • 46. MIKROBA-PUSZTULÁSI ÉSSZAPORODÁSGÁTLÁSI VIZSGÁLATOK• Fertőtlenítőszerek• Antibiotikumok• Tartósítószerek• Egyéb mikrobaszaporodást gátló anyagok
  • 47. MIKROBA-PUSZTULÁSI ÉSSZAPORODÁSGÁTLÁSI VIZSGÁLATOK Antibiotikumok
  • 48. ANTIBIOTIKUMOK Amoxicillin y = 0.1759x - 0.0754 y = 0.6571x + 0.4263 R2 = 0.9949 Doxycyclin R2 = 0.9711 1.2 1.2 1 1 0.8 0.8lgTTD lgTTD 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 1 2 3 4 5 6 7 C (µ g/ml) C (µg/ml) Enrofloxacin y = 48.348x + 0.2886 R2 = 0.9946 1.40 1.20 1.00 lgTTD 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 C (µ g/ml)
  • 49. KÖRNYEZETVÉDELEM – BAKTÉRIUMOK AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA• Talajba került vegyszerek talaj-mikroflóra aktivitását befolyásoló hatásának vizsgálata – Például antibiotikumok hatása különböző típusú talajok mikrobiális aktivitására
  • 50. ANTIBIOTIKUM MIKROBA AKTIVITÁST CSÖKKENTŐ HATÁSA KÜLÖNBÖZŐ TALAJOKBAN Doxycyclin, talaj y = 8.8762x - 11.612 25 y = 6.5508x - 8.295 20 y = 4.4082x - 0.8414 TTD (h) 15 10 y = 13.362x - 20.614 5 y = 2.0662x + 4.0359 0 2.0 2.5 3.0 3.5 T1 T2 T3 T4 T5 lgc (µg/kg) 50
  • 51. ANTIBIOTIKUMOK LEGKISEBBSZAPORODÁS-GÁTLÓ KONCENTRÁCIÓI Antibiotikum Talaj Co (mg/kg) Doxycyclin Enrofloxacin Linkomycin T5 9 57 15 vulkanikus T3 18 - 57 hordalék T1 52 35 19 homok T2 70 47 41agyagos termőföld T4 108 - 56 vályog 51
  • 52. A MICROTESTER ELŐNYEI 1.• Egyszerű mérési technika• Nem igényel speciális mérőcellákat• Nincs szükség szigorú hőmérséklet-szabályozásra – 0,5 °C pontosságú laboratóriumi termosztátok alkalmasak – (Az impedimetriás technika 0,002 °C pontosságú szabályozást igényel)• Nincs szükség speciális táptalajokra – Alkalmazhatóak a szabványos, illetve egyéb táptalajok – (Az impedimetriás technika speciális tápleveseket igényel) 52
  • 53. A MICROTESTER ELŐNYEI 2.• Nincs szükség a minta hígítására – 100-108 cfu/mérőcella tartományban a minta hígítás nélkül mérhető• Alkalmas membránszűréssel koncentrált, illetve tamponos minták mikrobaszámának hígítás nélküli, közvetlen meghatározására – Egyetlen mérőcellába több membránszűrő is behelyezhető. – Egyetlen mérőcella eredménye akár több liter mintát reprezentálhat • Ásványvizek tétel-minősítése • Vízügyi haváriák gyors kimutatása• Direkt mérésnél eredmény általában néhány órán belül – Tenyésztéses vizsgálatok időigénye néhány nap 53
  • 54. A MICROTESTER ELŐNYEI 3.• Gyors és egyszerű módszer a szaporodás- és pusztulás-kinetikai, valamint táptalaj-optimalizálási vizsgálatokhoz• A módszer kellően szelektív – Különös előnyt jelent, hogy a táptalaj szelektivitásán túl a redox-görbe alakja is jellemző a szaporodó mikroba-csoportra. – Ezt a szelektivitást a PCR technikán kívül egyéb módszerek nem érik el 54
  • 55. A MICROTESTER ELŐNYEI 4.• A nagy mintamennyiségből kiinduló szelektív dúsítás révén a MicroTester kiválóan alkalmazható a PCR- technika elődúsító lépéseként – A célmikrobát tartalmazó mikrobacsoportra negatív mintát nem érdemes PCR-ral tovább vizsgálni – A mikrobacsoportra pozitív dúsítás PCR-ral közvetlenül vizsgálható, a mikrobaszám jelentősen meghaladja a 106/ml koncentrációt – Csak a pozitivitás esélyével bíró minták kerülnek PCR vizsgálatra, ami jelentős megtakarítást eredményez• A minta-mennyiségre vonatkoztatott fajlagos vizsgálati költség jelentősen alacsonyabb a tenyésztéses, valamint az impedimetriás gyorsmódszerek költségénél 55
  • 56. Köszönöm a figyelmet! szk@aquilanet.hu 56

×