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Hibridación

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    Se emplea HIS: cuando no existen buenos Ac; cuando en IHQ se observa mucho fondo; cuando la proteína es segregada; cuando existen más ácidos nucleicos que proteínas en la célula (Leong, Atenas).
  • Las bases nitrogenadas son el elemento diferenciadro entre nucleótidos
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    Sales de Hg: hacen inaccesibles los ácidos nucleicos. Ácido pícrico reacciona con histonas fomando picratos que hacen inaccesibles los ácidos nucleicos.
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    Papovavirus que afecta SNC de pacientes inmunodeprimidos. Causa patología desmielinizante (leucoencefalopatía multifocal progresiva).
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    La tiramida es oxidada por la peroxidasa al reaccionar con H2O2. La tiramida activada (con radicales libres) se une covalentemente a residuos tirosina de las proteínas adyacentes a la peroxidasa. Ya que la vida media de los radicales libres de tiramida es muy corta, el depósito ocurre muy próximo a la enzima y por tanto al AN diana.
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    EBER= Epstein Barr earlier RNA
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    SIL bajo grado HPV 16,18
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    06B6838 20x
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    06B634 40x
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    04B9401: No amplificado x CISH (baja amplificación x FISH). 40x
    99B16079: Amplificado.40x
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    04B9401: No amplificado x CISH (baja amplificación x FISH). 40x
    99B16079: Amplificado.40x
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    Linfoma folicular
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  • Transcript

    • 1. Hibridación in situ Tomás García-Caballero BASES MOLECULARES DEL CÁNCER Xàtiva 2009
    • 2. HIBRIDACIÓN IN SITU I. Concepto II. Ácidos Nucleicos III. Sondas IV. Hibridación in situ V. Sistemas de Detección VI. HIS en Diagnóstico
    • 3. Concepto Técnica histológica que permite la detección in situ de ácidos nucleicos mediante el empleo de sondas.
    • 4. Concepto INMUNOHISTOQUÍMICA HIBRIDACIÓN in situ MM Anticuerpos Sondas Detectan proteínas Detectan ácidos nucleicos
    • 5. Concepto IHQ e HIS son técnicas complementarias IHQ + HIS + IHQ + HIS -
    • 6. Concepto IHQ – HIS + IHQ e HIS son técnicas complementarias
    • 7. Concepto IHQ e HIS son técnicas complementarias
    • 8. I. Concepto II. Ácidos Nucleicos III. Sondas IV. Hibridación in situ V. Sistemas de Detección VI. HIS en Diagnóstico
    • 9. Ácidos Nucleicos Concepto Tipos ADN (Ácido Desoxirribonucleico) ARN (Ácido Ribonucleico) ARNr (Ribosómico) ARNt (Transferencia) ARNm (Mensajero)
    • 10. Ácidos Nucleicos Estructura de los Ácidos Nucleicos Están constituidos por unidades elementales denominadas NUCLEÓTIDOS Composición de los nucleótidos Azúcar Grupo Fosfato Base Nitrogenada
    • 11. Ácidos Nucleicos Estructura de los Ácidos Nucleicos Nucleótidos CH2P OO OH OH O OHOH Ácido Fosfórico + Azúcar + Base Nitrogenada
    • 12. Ácidos Nucleicos Estructura de los Ácidos Nucleicos Azúcar O CHHC CH2 CHHC OHOH OH HO 1’ 2’3’ 4’ 5’ O CHHC CH2 CHHC HOH OH HO 1’ 2’3’ 4’ 5’ Ribosa (ARN) Desoxirribosa (ADN)
    • 13. Ácidos Nucleicos Estructura de los Ácidos Nucleicos Grupo Fosfato CH3 O OH CH2P OO O O- O OHO (H3PO4) P OHO OH OH 1’ 2’3’ 4’ 5’ 1’ 2’3’ 4’ 5’
    • 14. Ácidos Nucleicos Estructura de los Ácidos Nucleicos Bases Nitrogenadas Pirimidínicas Citosina C Uracilo (ARN) U Timina T Púricas Adenina Guanina A G
    • 15. Ácidos Nucleicos Estructura de los Ácidos Nucleicos Púricas Pirimidínicas CitosinaC Uracilo (ARN)U Timina (ADN)T Adenina A Guanina G Puentes de Hidrógeno Unión entre bases Nitrogenadas
    • 16. Ácidos Nucleicos Estructura de los Ácidos Nucleicos Sentido cadenas: 5´ 3´ CH3 O OH CH2P OO O O- O OHO 1’ 1’ 3’ 5’ 5’ 3’
    • 17. Ácidos Nucleicos Estructura de los Ácidos Nucleicos Cadenas antiparalelas 3’ 5’ CH2P OO O O- O H CH2P OO O O- O HO CH2 PO O O O- O H CH2 PO O O O- O H O 3’ 5’ TT AA CC GG
    • 18. Ácidos Nucleicos Estructura de los Ácidos Nucleicos Secuencia de Nucleótidos CCGG TT AA AA GG CCTT AA CCTT AA GGAA TT CCGG TT 3’5’ 5’ TAAgTCgCA 3’ 5’3’
    • 19. I. Concepto II. Ácidos Nucleicos III. Sondas IV. Hibridación in situ V. Sistemas de Detección VI. HIS en Diagnóstico
    • 20. Sondas Secuencia de nucleótidos complementaria de la secuencia diana a estudio MM
    • 21. Sondas Sondas antisentido y sentido • SONDA ANTISENTIDO (Antisense): Secuencia de nucleótidos complementaria de la secuencia diana • SONDA SENTIDO (Sense, control negativo): Secuencia de nucleótidos idéntica a la secuencia diana, por lo que no puede hibridarse con ella Secuencia diana Sonda antisentido T A A g gT C C A3’ 5’ A T T C CA g g T5’ 3’ A C g C AT g A T5’ 3’ A T T C CA g g T5’ 3’Sonda sentido
    • 22. Sondas Tipos de Sondas • Sondas bicatenarias (ADN) • Sondas monocatenarias Número de hebras • Sondas de ARN (Ribosondas) • Sondas de ADN Naturaleza • ARN • Oligonucleótidos
    • 23. Sondas Tipos de Sondas Sondas Bicatenarias MM MM • Permiten la detección de ambas hebras del ADN
    • 24. Sondas Tipos de Sondas Sondas Monocatenarias • En ADN, permiten la detección de una de las hebras MM • En ARN, es complementaria a su secuencia
    • 25. Sondas Marcadores Son moléculas que se incorporan a un nucleótido para permitir la detección de la sonda. MM
    • 26. Sondas Marcadores Tipos de marcadores • Antigénicos • Fluorescentes • Inmunohistoquímica • Visualización directa (FISH)
    • 27. Sondas Marcadores Marcadores antigénicos • Incorporan moléculas antigénicas acopladas a la base nitrogenada • Los más usadas son: Biotina, Digoxigenina y Fluoresceína (FITC) CH2 O OHOH P OO OH OH PO OH OH PO OH OH MM
    • 28. Sondas Marcadores Marcadores fluorescentes • Incorporan fluorocromos acoplados a la base nitrogenada • Los más usadas son: Fluoresceína, Rodamina, Texas red CH2 O OHOH P OO OH OH PO OH OH PO OH OH MM
    • 29. I. Concepto II. Ácidos Nucleicos III. Sondas IV. Hibridación in situ V. Sistemas de Detección VI. HIS en Diagnóstico
    • 30. Hibridación in situ Procesamiento de las muestras Fijación Permite preservar los ácidos nucleicos y la morfología tisular DNasas ¡RNasas! Degradación de ácidos nucleicos diana FIJACIÓNFIJACIÓN
    • 31. Hibridación in situ Procesamiento de las muestras Fijador FORMOL TAMPONADO 10%, pH 7.4, durante 24 horas Procesado rutinario de inclusión en parafina Evitar mezclas fijadoras que contengan Hg o ácidos Bouin Zenker B5 !
    • 32. Hibridación in situ Procesamiento de las muestras Secciones Secciones de 5 µm en portaobjetos tratados • Limpieza con alcohol (microtomo, baño, ...) • Esterilización en autoclave (pinzas, ...) Precauciones con las RNasas exógenas (condiciones de esterilidad): • Uso de agua destilada en el baño para recoger las secciones • Portaobjetos de caja recién abierta !
    • 33. Hibridación in situ Procesamiento de las muestras Secado de las secciones durante 1 Noche a 50-55 ºC Almacenamiento de las secciones desecadas a –20ºC Si no se realiza la HIS en los días siguientes Precauciones con las RNasas!
    • 34. Hibridación in situ Etapas • Pretratamiento • Desparafinado e hidratación • Deshidratación • Desnaturalización • Hibridación
    • 35. Hibridación in situ Desparafinado e Hidratación Se realizará de igual manera que la IHQ Llevar la hidratación hasta Agua Destilada Estéril Precauciones con las RNasas!
    • 36. Hibridación in situ Pretratamientos Calor Precauciones con las RNasas! 10 min, 95-99ºC Baño María Microondas
    • 37. Hibridación in situ Pretratamientos Medios Enzimáticos Precauciones con las RNasas! Enzimas proteolíticas PEPSINA (10 min TA / 5 min 37ºC ) PROTEINASA K (1 min TA)
    • 38. Hibridación in situ Deshidratación y secado Precauciones con las RNasas! Evita la dilución de la sonda La deshidratación se realiza con alcoholes de graduación creciente OH 70º OH 96º OH 100º El secado lo podemos realizar Al aire / campana En placa térmica a 45-50ºC
    • 39. Hibridación in situ Desnaturalización Permite la separación de las dos hebras de ADN para que pueda ser detectada la secuencia a estudio Sólo es necesaria cuando se pretenda detectar ADN y/o cuando la sonda sea bicatenaria
    • 40. Hibridación in situ Desnaturalización 95ºC durante 5’
    • 41. Hibridación in situ Hibridación La sonda se unirá a la secuencia diana bajo unas condiciones determinadas MM
    • 42. Hibridación in situ Hibridación Condiciones de hibridación [Na+ ]Temperatura MM MM MM
    • 43. Hibridación in situ Hibridación Temperatura de hibridación 37ºC / 45ºC noche Temperatura a la cual la sonda se hibridará con su diana
    • 44. Hibridación in situ Lavados de rigor (astringency) Permiten aumentar la especificidad de la reacción eliminando las uniones inespecíficas de la sonda con secuencias parcialmente homólogas SSC 2X SSC 1X SSC 0,5X SSC: Tampón citrato salino Se realizan los lavados a 72ºC, 65ºC, 42ºC, 37ºC
    • 45. I. Concepto II. Ácidos Nucleicos III. Sondas IV. Hibridación in situ V. Sistemas de Detección VI. HIS en Diagnóstico
    • 46. Sistemas de Detección • Biotina • Estreptavidina • Fluorocromos • Ac. anti-fluorocromo • Fluorescencia (FISH) • Digoxigenina • Ac. anti-digoxigenina
    • 47. Sistemas de Detección Sondas biotinadas BB 1. Detección mediante Estreptavidina unida a la enzima (Fosfatasa alcalina o Peroxidasa) EZ EZ E Diana 2. Revelado con el cromógeno de la enzima (NBT/BCIP o DAB)
    • 48. Sistemas de Detección Sondas biotinadas EA-Peroxidasa DABEA-Fosfatasa Alcalina NBT/BCIP Virus JC
    • 49. Sistemas de Detección Amplificación con tiramidas BB E P P 1. Detección de sonda biotinada con Estreptavidina-Peroxidasa
    • 50. Sistemas de Detección Amplificación con tiramidas BB E P P TT BB TT BB 2. Tiramida-biotina oxidada por la peroxidasa se une a residuos tirosina de proteínas próximas TT BB TT BB
    • 51. Sistemas de Detección Amplificación con tiramidas BB E P P TT BB E P P TT BB E P P TT BB E P P TT BB E P P 3. Detección de la biotina de las tiramidas con más Estreptavidina- peroxidasa 4. Revelado con DAB
    • 52. Sistemas de Detección Amplificación con tiramidas Técnica convencional Amplificación con tiramidas HPV
    • 53. Sistemas de Detección Amplificación con tiramidas Caski (600 copias HPV16) HPV
    • 54. Sistemas de Detección Amplificación con tiramidas SiHa (1-2 copias HPV16) HPV
    • 55. Sistemas de Detección Sondas antigénicas AA E 1. Detección mediante un anticuerpo unido a una enzima (Fosfatasa Alcalina o Peroxidasa) 2. Revelado con el cromógeno (NBT/BCIP o DAB) Antígeno • Digoxigenina • FITC Detección por Inmunohistoquímica
    • 56. Sistemas de Detección Sondas antigénicas EBV - EBER FITC–FA NBT/BCIP
    • 57. Sistemas de Detección Sondas marcadas con fluorocromos FITCFITC Iluminación con luz de alta frecuencia (Ultravioleta) Emisión de fluorescencia de frecuencia inferior Visualización directa de la fluorescencia (FISH)
    • 58. Sistemas de Detección Sondas Marcadas con Fluorocromos HER-2/neu Centrómero Gen HER2 FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)
    • 59. I. Concepto II. Ácidos Nucleicos III. Sondas IV. Hibridación in situ V. Sistemas de Detección VI. Aplicaciones
    • 60. Hibridación in situ Aplicaciones • INFECCIONES VÍRICAS  HPV, EBV, CMV • EXPRESIÓN GÉNICA EN DIAGNÓSTICO:  Indicaciones terapéuticas (HER2, EGFR, TOP2a)  Hematopatología (Translocaciones) • EXPRESIÓN GÉNICA NORMAL:  Confirmación síntesis proteica
    • 61. Expresión génica normal IHQ HIS Testículo – Protimosina
    • 62. HIS en Diagnóstico HPV • Virus ADN • Técnica más sensible que la IHQ • Permite el tipaje: HPV 6,11 HPV 31,33 HPV 16,18 (factor de riesgo) Cáncer de cérvix
    • 63. HIS en Diagnóstico / HPV IHQ HIS
    • 64. HIS en Diagnóstico / HPV IHQ HIS
    • 65. HIS en Diagnóstico / HPV HPV 6,11 HPV 31,33HPV 16,18
    • 66. HIS en Diagnóstico / HPV HPV 16,18
    • 67. HIS en Diagnóstico / HPV HIS-HR (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68)
    • 68. HIS en Diagnóstico EBV • Detección de su ARNm (elevado número de copias):  EBER: Epstein Barr Earlier RNA ¡Atención RNasas! • Asociado a Mononucleosis infecciosa Linfomas Carcinoma nasofaríngeo
    • 69. HIS en Diagnóstico / EBV Mononucleosis – EBER L. Burkitt – EBER
    • 70. HIS en Diagnóstico / EBV L. Hodgkin – EBER L. Hodgkin – EBER
    • 71. HIS en Diagnóstico / EBV Carcinoma Nasofaríngeo EBER – Px / DAB
    • 72. HIS en Diagnóstico / EBV Carcinoma Nasofaríngeo EBER – FA / NBT-BCIP
    • 73. HIS en Diagnóstico / EBV HIS - EBER IHQ - CK
    • 74. Controles EBER CONTROL Sin sonda Sonda sentido
    • 75. HIS en Diagnóstico CMV • Virus ADN • Infección oportunista en pacientes inmunodeprimidos
    • 76. HIS en Diagnóstico / CMV HIS - CMV
    • 77. FISH HER-2 / Carcinoma infiltrante de mama Gen HER-2 Receptor HER-2Receptor HER-2
    • 78. FISH HercepTest 0 3+1+ 2+
    • 79. FISH / HER-2 Algoritmo Carcinoma Infiltrante HercepTestHercepTest 00 1+1+ 2+2+ 3+3+ NegativoNegativo PositivoPositivo TrastuzumabTrastuzumab IndeterminadoIndeterminado HISHIS
    • 80. FISH / HER-2 Cromosoma 17 Centrómero Gen HER-2 Sonda Centromérica Sonda HER-2
    • 81. FISH / HER-2 Amplificado No Amplificado HercepTest 2+
    • 82. FISH / HER-2 Casos 2+ INDICACIONES
    • 83. FISH / HER-2 Casos 2+  Casos 1+/2+ INDICACIONES
    • 84. FISH / HER-2 Casos 2+  Casos 1+/2+  Casos 2+/3+ INDICACIONES
    • 85. ALGORITMO DE HERCEPTIN Carcinoma Infiltrante HercepTest 0 1+ 2+ 3+ Negativo Trastuzumab FISH / CISH No A A
    • 86. ALGORITMO DE HERCEPTIN INMUNOHISTOQUÍMICAINMUNOHISTOQUÍMICA Negativo (0, 1+)Negativo (0, 1+) Borderline (2+)Borderline (2+)Borderline (2+)Borderline (2+) Positivo (3+)Positivo (3+)Positivo (3+)Positivo (3+) Hibridación “in situ”Hibridación “in situ” POSITIVO HER2/CEN17 >2’2 POSITIVO HER2/CEN17 >2’2 BORDERLINE HER2/CEN17 1’8-2,2 BORDERLINE HER2/CEN17 1’8-2,2 NEGATIVO HER2/CEN17 <1’8 NEGATIVO HER2/CEN17 <1’8 Recuento adicional de núcleosRecuento adicional de núcleos BORDERLINE NO AMPLIFICADO HER2/CEN17: 1’8-1,9 BORDERLINE NO AMPLIFICADO HER2/CEN17: 1’8-1,9 BORDERLINE AMPLIFICADO HER2/CEN17: 2-2’2 BORDERLINE AMPLIFICADO HER2/CEN17: 2-2’2 TRASTUZUMABTRASTUZUMAB
    • 87. FISH / HER-2 - Polisomía
    • 88. FISH / HER-2 - Polisomía Centrómero del cromosoma 17 Gen Her-2 Amplificación del gen Múltiples copias del gen debido a polisomía del cromosoma 17 CEN 17 / Núcleo ≥3
    • 89. FISH / HER-2 - Polisomía • No tiene influencia en la expresión de HER-2 Downs-Kelly E et al., Am J Surg Pathol 29:1221-1227, 2005 • No tiene efecto sobre el contenido de la proteína ni del ARNm Dal Lago L et al., Mol Cancer Ther 5:2572-9, 2006 • En ausencia de amplificación no se asocia con sobreexpresión Van den Bempt I et al., Curr Opin Oncol 19:552-7, 2007
    • 90. FISH / HER-2 - Polisomía • Factor principal en la sobreexpresión de casos 3+ no amplificados Varshney D et al., Am J Clin Pathol 121:70-77, 2004 • Principal causa de respuesta a trastuzumab en casos 3+ FISH- Hofmann M et al., J Clin Pathol 61:89-94, 2008
    • 91. FISH / HER-2 - Monosomía CEN 17 / Núcleo <1,5
    • 92. FISH / HER-2 – Monosomía • Define un grupo de pacientes con menor respuesta a trastuzumab Risio et al., Oncol Rep 13:305-309, 2005 • En algunos casos con monosomía 17, la relación ≥ 2 es causada por 2 copias de HER2 y una copia simple del cromosoma 17 por lo que no deben ser interpretados como amplificados Persons DL et al, Arch Pathol Lab Med 130:325-331, 2006
    • 93. CISH / HER-2 DigDig PxPx Px Px Px PxPx DAB
    • 94. CISH / HER-2 HER-2 AmplificadoHER-2 No Amplificado
    • 95. Duo-CISH / HER-2 Cinco Laboratorios europeos:  Reino Unido • School of Molecular Medical Sciences. University of Nottingham • Medical School. Birmingham University  Alemania • Johannes Gutenberg Universitätsklinikum  Suecia • Universitetssjukhuset Lund  España • Universidad de Santiago de Compostela VALIDACIÓN
    • 96. Duo-CISH / HER-2 CISH HER2 CISH CEN-17 CISHCISH HER2 CEN-17 Número de copias dc-CISH CEN-17 HER2 dc-dc-CISHCISH Relación
    • 97. Duo-CISH / HER-2 AP P Sonda DNA – TRTR IndoliumFast red Hematoxylin Sonda PNA – FITCFITC Medio permanenteSecado
    • 98. Duo-CISH / HER-2 x40
    • 99. Duo-CISH / HER-2 x100
    • 100. Duo-CISH / HER-2 x100
    • 101. Duo-CISH / HER-2 x100
    • 102. Duo-CISH / HER-2 x100
    • 103. Duo-CISH / HER-2  Duo-CISH combina las ventajas de FISH y CISH • Evaluación objetiva ( IHC) • Contaje simultáneo de las señales de HER2 y CEN-17 ( CISH) • Campo claro ( FISH) • Las señales en células normales y tumorales representan un control interno positivo ubicuo que falta en IHC VENTAJAS
    • 104. Duo-CISH / HER-2  Campo claro • El componente invasivo puede ser fácilmente identificado, reduciendo el riesgo de analizar células no tumorales o no invasivas VENTAJAS
    • 105. Duo-CISH / HER-2  Campo claro • El componente invasivo puede ser fácilmente identificado, reduciendo el riesgo de analizar células no tumorales o no invasivas • Facilira la discusión de casos y la formación VENTAJAS
    • 106. Duo-CISH / HER-2  Campo claro • El componente invasivo puede ser fácilmente identificado, reduciendo el riesgo de analizar células no tumorales o no invasivas • Facilita la discusión de casos y la formación • Fácil evaluación del estado de HER2 en TMA VENTAJAS
    • 107. Duo-CISH / HER-2  No se requiere un microscopio especial de fluorescencia • Economía • No ambiente oscuro • No aceite de inmersión (40x-60x) FISH dc-CISH VENTAJAS
    • 108. Duo-CISH / HER-2  Archivo • Tiempo indefinido en el archivo general • Reevaluación de casos • Estudios retrospectivos VENTAJAS
    • 109. FISH / Translocaciones Cromosoma 14 Cromosoma 18 t(14;18) Señal de fusión
    • 110. FISH / Translocaciones FISH normal FISH t(14;18) IgH 14IgH 14 Bcl2 18Bcl2 18 Fusión Translocación 14;18
    • 111. FISH / Translocaciones Cromosoma A Cromosoma B Cromosoma A Cromosoma B Split t(A;B) Señal separación (split)
    • 112. FISH / Translocaciones Normal Translocación en Bcl2 Bcl 2Bcl 2 Split Translocación en Bcl2
    • 113. Agradecimiento
    • 114. ¡Muchas gracias!